Вуглеводи поверхневих структур клітин молікутів та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вуглеводи поверхневих структур клітин молікутів та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Філогенетична класифікація організмів звичайно розглядається в зв`язку з їх еволюційним походженням. Так, сучасні уявлення про походження молікутів і їх можливих філогенетичних зв`язків з іншими прокаріотами частково обгрунтовані за даними повних структур консервативних ділянок молекул ДНК і РНК (Fox et al., 1980; Neimark, 1979). Також було показано відносну близкість первинних структур 16S рРНК молікутів і бактерій родів Clostridium, Bacillus, Lactobacillus та Streptococcus (Woese et al., 1980). Проте, остаточно це питання так і не вивчено. Тому важливим завданням є пошук додаткових ознак диференціації мікробних культур. Для достовірної їх ідентифікації, а також для встановлення взаємовідносин між видами всередині родів необхідне вивчення якомога більшої кількості властивостей. При порівнянні різних видів пропонується брати до уваги комплекс ознак, оскільки діагностичне значення окремих властивостей мікроорганізмів дискутується.

До таких фенотипних ознак, які б підтверджували спільність філогенетичних попередників у тих чи інших груп мікроорганізмів, що еволюційно віддалились одна від одної, не остання роль відводиться поверхневим структурам мікроорганізмів. Як свідчать дані літератури, поверхневий клітинний поліглікановий комплекс (глікокалікс) відіграє значну роль у функціонуванні бактерій. Так, він обумовлює здатність мікроорганізму взаємодіяти з поверхнями інших клітин і адгезуватись на тканинах живих організмів. Адгезія мікроорганізмів - збудників інфекцій до клітин макроорганізму розглядається як початковий етап патологічного процесу, що забезпечує колонізацію слизових оболонок або шкіри і передує інвазивним ушкодженням. Оскільки в розвитку інфекційного процесу вирішальна роль належить етапу адгезії, то цукри привертають до себе увагу як антиадгезивні засоби, які в тій чи іншій мірі мімікрують рецептори і тим самим можуть попередити інфекцію або навіть вилікувати захворювання.

Як свідчать дані літератури, глікокалікс мікроорганізмів філогенетично стабільний (Скрипаль та ін., 1995). При з`ясуванні моноcахаридного складу вуглеводної частини глікокаліксу бактерій можна не тільки виявити ймовірні родинні зв`язки, а й уточнити афінність мікроорганізмів до поверхонь об`єктів взаємодії. Всебічне вивчення складу вуглеводів глікокаліксу молікутів і споріднених з ними бактерій відкриває нові можливості пізнання тонких механізмів взаємодії мікро- і макроорганізмів, що в подальшому можна використовувати при відборі і конструюванні принципово нових екологічно безпечних пробіотиків з чітко спрямованою дією.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно плану наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України м. Київ (ІМВ) за темою «Пошук фенотипових ознак, спільних для представників класу Mollіcutes та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus», номер держреєстрації 0196V0.18114 (1998-2002 р.), яка була включена в програму «Підтримка та розвиток Української Колекції Мікроорганізмів».

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виділити глікокалікс у окремих представників класу Mollicutes та бактерій, що відносяться до родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, дослідити його моносахаридний склад та вивчити імунохімічні властивості поверхневих клітинних антигенів представників цих родів.

Для досягнення зазначеної мети були сформульовані такі задачі:

1. Вивчити приклітинні вуглеводні компоненти за допомогою лектинів рослин, мічених колоїдним золотом.

2. Отримати глікокалікс окремих представників молікутів, бацил та молочнокислих бактерій.

3. Дослідити поверхневий клітинний вуглеводний склад у представників класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus за допомогою біохімічних методів для відображення їх загального походження.

4. Вивчити певні імунохімічні властивості глікокаліксів деяких представників бацил, молочнокислих бактерій та молікутів.

Об`єктом дослідження були: Mycoplasma fermentans PG - 18, Achleplasma laidlawii PG - 8, A. laidlawii var. granulum 118, Bacillus licheniformis 49, B.licheniformis 31, B.subtilis 1/2, B. subtilis 3, В. subtilis 668, B.cereus 89, B.cereus ДМ 423 та представники молочнокислих бактерій - Lactobacillus plantarum 11/16, Streptococcus thermophilus S1, S. thermophilus S5 й Enterococcus faecium К-50.

Предметом дослідження були склад та деякі властивості глікокаліксів (серологічні та здатність до антитілоутворення) перелічених вище штамів мікроорганізмів.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, біохімічні, імунологічні та біометричні методи.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше виділено глікокалікси бацил, молочнокислих бактерій та молікутів;

вперше охарактеризовано різними методами (біохімічними, імунохімічними та за допомогою рослинних лектинів, мічених колоїдним золотом) полігліканові комплекси (глікокалікси) представників філогенетично споріднених мікроорганізмів родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus та класу Mollicutes. Доведено, що для глікокаліксів всіх досліджених мікроорганізмів характерна присутність досить широкого спектру вуглеводів (рамнози, фукози, рибози, арабінози, ксилози, манози, галактози, глюкози, галакозаміну, глюкозаміну), з певними відмінностями в їх кількісному складі;

вивчено склад нейтральних моносахаридів полігліканових комплексів як фенотипну ознаку представників зазначених вище родів. Показано, що якісний склад нейтральних моносахаридів глікокаліксів у всіх вивчених мікроорганізмів майже був однаковим і містив переважно глюкозу та галактозу;

вперше за допомогою імунохімічних методів досліджено серологічні властивості глікокаліксів мікроорганізмів, що вивчалися. Показано, що вони містять спільні поверхневі антигени;

вперше досліджено вплив глікокаліксу на індукцію антитілоутворення представників класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus - Lactobacillus - Streptococcus. Доведено, що поліглікановий комплекс лактобацил індукує антитілоутворення в два рази з вищим титром, ніж подібні імуногени бацил та ахолеплазм.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в результаті проведених досліджень дані про вуглеводний склад глікокаліксу та вивчення деяких його властивостей можуть бути використані для:

пошуку нових фенотипних ознак;

визначення систематичних положень мікроорганізмів.

Глибоке вивчення складу термінальних вуглеводів глікокаліксу молікутів і споріднених з ними бактерій створює можливості пізнання тонких механізмів взаємодії мікро- і макроорганізмів, і в подальшому ці результати можна буде використовувати при вирішенні фундаментальних питань філогенії мікроорганізмів, що вивчалися, їх систематики і класифікації та при відборі і конструюванні принципово нових екологічно безпечних пробіотиків з чітко спрямованою дією.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Автором дисертації критично опрацьовані дані літератури, проведено більшість експериментальної роботи (особисто виконано експериментальні дослідження по виділенню глікокаліксу молікутів та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus, визначено поверхневий склад моносахаридів цих бактерій біохімічними методами, проведено електронно-мікроскопічний метод візуалізації поверхневих вуглеводів клітин за допомогою мічених колоїдним золотом рослинних лектинів, а також проведено імунізацію кролів глікокаліксами бацил, молочнокислих бактерій та ахолеплазм, отримано антисироватки проти даних антигенів та для з`ясування серологічної спорідненості вивчених представників і титру антисироваток застосовано реакцію преципітації в гелі методом подвійної дифузії за Оухтерлоні та зворотню реакцію радіальної імунодифузії), проаналізовано та узагальнено результати досліджень, здійснена статистична обробка експериментальних даних, проведена підготовка публікацій за результатами досліджень і здійснено їх представлення на наукових конференціях. Дослідження вуглеводного складу глікокаліксу за допомогою мічених колоїдним золотом рослинних лектинів проведено спільно з к.б.н. А.М. Онищенко. Планування експериментів, методичні підходи, обговорення результатів та написання наукових статей здійснювалося під керівництвом член-кореспондента НАН України, д.б.н., проф. І.Г. Скрипаля.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на конференції молодих вчених ІМВ НАН України (Київ, 25-26 листопада 2003 р.); Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених «Шевченківська весна» (Київ, 13-14 травня 2004 р.); ІІІ (Х) з`їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 15-17 вересня 2004 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в 4 статтях, опублікованих у профільних журналах та в 2 тезах, опублікованих за матеріалами з`їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 129 сторінках машинописного тексту і складається з розділів «Вступ», «Огляд літератури», «Матеріали та методи досліджень», «Результати досліджень», «Обговорення результатів досліджень», «Висновки», «Список використаних джерел», який містить 155 посилань (з них 85 іноземних авторів). Робота містить 8 таблиць та 12 рисунків.

Зміст роботи

бактерія лектин вуглеводень молікут

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури представлений двома підрозділами, які містять сучасні уявлення щодо філогенетичних зв`язків представників класу Mollicutes із спорідненими їм мікроорганізмами, а також викладена інформація останніх років щодо структури, властивостей, значення поверхневих клітинних антигенів.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Для досліджень нами використано окремі представники роду Bacillus:

B. licheniformis 31, B. subtilis 3, які входять до складу пробіотика «Біоспорин» (Україна); B. cereus ДМ 423, який є компонентом біопрепарату «Цереобіоген» (Китай) та B. licheniformis 49, B. cereus 89, B. subtilis 1/2 отримані з колекції відділу антибіотиків ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАН України; штам B.subtilis 668, отриманий з колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів ІМВ, виділений з шлунково-кишкового тракту щойно народженого здорового теляти. Бацили вирощували при 37 ⁰С на качалках (160 об/хв) протягом 19-20 год на рідкому середовищі Гаузе, що містило 1% гліцерину як джерело вуглецю. Клітини збирали центрифугуванням при 8000g протягом 20 хв.

В роботі використано культури молочнокислих бактерій одержані з колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, які відносяться до різних таксономічних груп. Штам Lactobacillus plantarum 11/16 є мешканцем епіфітної мікрофлори дикорослих рослин Центральної Азії, належить до роду Lactobacillus і використовується у складі біоконсерванта «Літосил». Штам Enterococcus faecium K-50 був виділений з травного тракту курчат, належить до роду Enterococcus і використовується у складі пробіотичного препарату «Лактин». Два штами належать до роду Streptococcus - S.thermophilus S1 (неслизова раса) і S.thermophilus S5 (слизова раса), і є компонентами бактеріальної закваски «Геросан». Молочнокислі бактерії вирощували на середовищі МРС при 37⁰С протягом 72 год (Коваленко и др., 1990), потім збирали центрифугуванням при 5000g протягом 20 хв.

Об`єктами досліджень були також штами молікутів, одержані з колекції Інституту медичної мікробіології м. Орхус (Данія): Mycoplasma fermentans PG-18, Acholeplasma laidlawii PG-8 та A.laidlawii var. granulum шт. 118 - фітопатогенний збудник блідо-зеленої карликовості зернових, виділений у відділі мікоплазмології ІМВ НАНУ. Молікути вирощували на середовищі СМ ІМВ-72 протягом 72 годин при 33^оС (Cкрипаль и др., 1984). Клітини збирали центрифугуванням при 10000g протягом 20 хв.

Біомасу всіх досліджених мікроорганізмів збирали в фазі експоненційного росту. Виділення глікокаліксу проводили за наступною схемою. Нарощену біомасу бацил та молочнокислих бактерій центрифугували 10 хв при 6000 об/хв, а молікутів - 20 хв при 10000 об/хв; осад відмивали двічі b-буфером (NaCl 0.156 M; Tris 0.05 M; 2-меркаптоетанол 0.01 М; дистильована вода; pH 7.4) (Razin et al., 1965). До осаду додавали b-буфер в співвідношенні клітини: буфер - 1: 5 і трипсин з розрахунку 0.1 мг/г осаду, контролюючи рН середовища, яке повинно бути 8,0, і ставили на 2 год при 37⁰С на качалки (160 об/хв). Потім центрифугували при певному режимі відповідні штами мікроорганізмів, як описано вище. Осад знову промивали двічі b-буфером, безклітинні рідини об`єднували і ліофільно висушували.

Склад приклітинних вуглеводів вивчали електронно-мікроскопічним методом за допомогою рослинних лектинів мічених колоїдним золотом (Скрипаль та ін., 1994). Інтенсивність взаємодії поверхневих моносахаридів у складі глікополімерів мікроорганізмів з відповідними лектинами оцінювали в умовних балах від 0 до 5 залежно від кількості часточок золота на поверхні клітин. Нейтральні моносахариди у вигляді ацетатів поліолів ідентифікували на газовому хроматографі марки «Chrom-5» (Чехія). Визначення вмісту амінокислот глікокаліксів проводили на аналізаторі амінокислот KLA-5 («Hitachi», Японія). Імунохімічні властивості приклітинних вуглеводних комплексів вивчали, застосовуючи метод подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні (Ouchterloni, 1962) (для визначення серологічної їх активності) та зворотню реакцію радіальної імунодифузії (Кэтти, 1991) (для вивчення титру та специфічності антисироваток), де виділені з клітин глікокалікси досліджуваних штамів бактерій, були використані як антигени, а антисироватки кролів, отримані до цих компонентів, як антитіла. У дослідах використовували самців кролів віком 6 місяців та вагою 1,8 кг.

Статистичне опрацювання проводили з використанням комп`ютерної програми - прикладний пакет Microsoft Excel 2000 та Sigma Stat 2.0 за загальноприйнятими методиками, використовуючи коефіциент Ст`юдента (Плохинский, 1978).

Розділ 3. Візуалізація приклітинних вуглеводів за допомогою мічених колоїдним золотом лектинів рослин

Розмір частинок колоїдного золота складав близько 12 нм. Використання лектинів, кон`югованих з колоїдним золотом дозволив виявити локалізацію окремих моносахаридів на поверхні бактеріальних клітин деяких представників родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus та класу Mollicutes.

У дослідах були використані лектини з певною специфічністю: арахісу підземного (Arachis hypogaea L.) - до в-D-галактози; купини багатоквіткової (Polygonatum multiflorum L./A 11.) - до б-D-манози; золотого дощу (Laburnum anagyroides Medik.) - до L-фукози; сої щетинистої (Glycine hispida Moenh./Maxim.) - до б-N-ацетил-D-галактозаміну та до б-D- i в-D-галактози; гороху посівного (Pisum sativum L.) - до б-D-глюкози і б-D-манози; зародків пшениці (Triticum vulgare L.) - до N-ацетил - D-глюкозаміну і сіалової кислоти; бузини чорної (Sambucus nigra L.) - до сіалової кислоти (специфічність наведена за інструкцією фірми виробника лектинів). Лектини, мічені колоїдним золотом, були одержані з науково-виробничого кооперативу «Лектинотест» (м. Львів, Україна).

За даними електронно-мікроскопічних досліджень показано, що за якісним вуглеводним складом глікокалікси молікутів, бацил, молочнокислих бактерій майже не відрізнялися і були представлені широкою палітрою цукрів (a-D-глюкозою, a-D - не відрізнялися і були представлені широкою палітрою цукрів (a-D-глюкозою, a-D- і b-D - галактозою, a-D - манозою, L-фукозою, ?-N-ацетил-D-галактозаміном, N-ацетил-D-глюкозаміном та сіаловою кислотою), проте можна спостерігати і незначні родові, видові та штамові відмінності. Залежно від наявності певних моносахаридів у складі полісахаридних комлексів глікокаліксу мікроорганізму, кожен штам молікута чи бактерії реагував індивідуально з відповідним лектином (Табл. 1).

Так, встановлено, що для приклітинних вуглеводів глікокаліксу окремих молікутів (Mycoplasma fermentans PG-18, Acholeplasma laidlawii PG-8, A.laidlawii var.granulum 118) характерна взаємодія із всіма досліджуваними лектинами та чітко можна спостерігати родові та штамові відмінності. Відомо, що прикріплення мікроорганізмів до поверхневих клітин тканин уражуваних органів забезпечує їм колонізацію і захищає їх від видалення з органів під час природних процесів (Скрипаль та ін., 1996). Можна допустити, що такий склад реакційноздатних груп вуглеводів може бути частиною молекул гліколіпідів або глікопротеїнів, які мають особливе значення у формуванні поверхневих антигенів молікутів.

Є дані, що залишки сіалових кислот у складі глікополімерів мембран клітин теплокровних проявляють себе як специфічні рецептори для деяких молікутів (Скрипаль із співавт. 1993, 1994). Згідно одержаних нами даних, A.laidlawii PG-8 i M.fermentans PG-18 утворюють значну кількість глікополімерів, які містять кінцеві сіалові кислоти та L-фукозу. У порівняно меншій кількості ці цукри виявлені у складі глікокаліксу A.laidlawii var.granulum 118. Слід зазначити, що наявність сіалових кислот та фукози у складі глікокаліксу патогенних та умовно-патогенних молікутів свідчать про їх додаткову роль у стабілізації адгезії цих мікроорганізмів на поверхні уражуваних тканин (Коробкова із співавт., 2001).

При вивченні вуглеводних складових глікокаліксу молочнокислих бактерій (Lactobacillus plantarum 11/16, Streptococcus thermophilus - штами S1 і S5, Enterococcus faecium K-50) була зареєстрована наявність сіалових кислот, N-ацетил-D-глюкозаміну, a-N-ацетил-D-галактозаміну, a-D-, b-D-галактози, a-D-глюкози, a-D-манози, L-фукози. Показано, що для поверхневих вуглеводів глікокаліксу молочнокислих бактерій характерна відносно висока активність взаємодії з лектинами, специфічними до b-D-галактози, L-фукози та сіалових кислот. Це узгоджується з даними Sakellaris із співавт. (1988). Біологічна роль сіалових кислот, на думку авторів, полягає у впливові на фізико-хімічні властивості цих макромолекул або регуляції тривалості їх існування (Sakellaris et al., 1988).

L-фукоза, як відомо, має велике значення при захисті глікокаліксів мікроорганізмів від дії ферментів організму-хазяїна, що дозволяє молочнокислим бактеріям пристосовуватись до існування у порожнині шлунково-кишкового тракту людини чи теплокровних тварин. Присутність всіх інших тестованих моносахаридів у складі глікокаліксу молочнокислих бактерій, можливо, свідчить про додаткову роль їх у процесі підсилення адгезії мікроорганізмів на слизовій оболонці кишкового тракту людей та тварин і забезпеченні її специфічності. Це узгоджується з припущенням, що наявність певних вуглеводів у складі поверхневих глікополімерах молочнокислих бактерій пов`язано з їх адгезивними властивостями та умовами існування (Коробкова та ін., 2001).

Для представників роду Bacillus (Bacillus subtilis 1/2, B. subtilis 3, В.subtilis 668, B.licheniformis 31, B.licheniformis 49, B.cereus 89, B.cereus DM423) властива наявність у глікополімерах всіх зазначених моносахаридів, окрім a-D-глюкози, що є родовою ознакою цієї групи мікроорганізмів. Отримані нами дані, показали, що для поверхневих вуглеводів умовно-патогенних штамів роду Bacillus (B.licheniformis 49, B.cereus 89) найбільша взаємодія відзначалась з лектинами, специфічними до a-N-ацетил-D-галактозаміну,--a-D-,--b-D-галактози, сіалової кислоти. Можливо, дані моносахариди в складі рецепторів вище зазначених бацил є додатковим фактором адгезії на епітелію шлунково-кишкового тракту теплокровних. Наявність значної кількості сіалових кислот в глікокаліксі B.licheniformis 49, B.cereus 89 дає можливість припустити головну роль даного кінцевого моносахариду в механізмі захисту цих мікроорганізмів від дії імунної системи людини, оскільки відомо, що сіалові кислоти здатні маскувати поверхневі рецептори бактерій від розпізнавання макрофагами при ендоцитозі. Можливо наявність сіалових кислот в складі глікокаліксу цих бацил корелює з ознакою патогенності. У порівнянні з ними, штами бацил, які є основою біопрепаратів, (B. subtilis 3, B.licheniformis 31, B.cereus DM423) відзначались наявністю слабкої взаємодії лектинів специфічних до сіалової кислоти, L-фукози, a-N-ацетил-D-галактозаміну,----N-ацетил-D-глюкозаміну, a-D-,--b-D-галактози у складі вуглеводів поверхневих структур їх клітин, що свідчить про відсутність патогенних властивостей у даних культур. Оскільки адгезивні властивості бацил слабко виражені, вони не формують біоплівки, і їх активність в кишечнику пов`язана, перш за все, не з конкурентним взаємовідношенням за місця прикріплення до слизової, а з високою антагоністичною активністю у відношенні багатьох патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів. В той же час бактерії роду Bacillus не виявляють пригнічуючої дії на мікрофлору, що є визначальним при створенні нових біопрепаратів на основі живих культур бацил для медицини та ветеринарії.

Таким чином, в результаті порівняльного аналізу, отримані нами дані про наявність певних моносахаридів у складі поверхневих глікополімерів філогенетично близьких груп мікроорганізмів, досліджених за допомогою лектинів мічених колоїдним золотом, - молікутів, бацил і молочнокислих бактерій вказують на присутність одних і тих самих моносахаридів. Це узгоджується з даними Скрипаля із співавт. (1995), Онищенко із співавт. (1999), які показали, що виявлені цукри є фенотиповим проявом спільних генетичних зв'язків зазначених мікроорганізмів. Дані наших досліджень про моносахаридний склад поверхневих вуглеводів споріднених видів мікроорганізмів можуть бути використані як додаткова ознака при визначенні таксономічного положення цих мікроорганізмів, а також при відборі і конструюванні принципово нових екологічно безпечних пробіотиків з чітко спрямованою дією.

Розділ 4. Вивчення складу нейтральних моносахаридів глікокаліксу мікроорганізмів біохімічними методами

Спорідненість досить віддалених гілок філогенетичного древа бактерій роду Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus і класу Mollicutes, а також те, що клостридіальна гілка є їх спільним попередником - питання цікаве, дискусійне і ще досі до кінця не вивчене. Тому в нашій роботі було проведено пошук нових таксономічних підходів та критеріїв, а саме пошук спільних консервативних філогенетичних маркерів, які могли б відбиватись у спільних фенотипних ознаках. На наш погляд, серед комплексу таких ознак, які б підтверджували спільність філогенетичних попередників (бацил, лактобацил та стрептококів) з молікутами може виступати поверхневий поліглікановий клітинний комплекс - глікокалікс, який вважається консервативною частиною клітин (Онищенко та ін., 1999).

За методикою, розробленою нами, було виділено глікокалікси B.subtilis 3, B.subtilis 668, B.licheniformis 31, L.plantarum 11/16, S.thermophilus S1, S.thermophilus S5, E.faecium K-50, M.fermentans PG-18, A. laidlawii PG-8, A. laidlawii var. granulum 118.

Біохімічні методи досліджень ізольованих глікокаліксів зазначених вище представників групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus, як і електронно-мікроскопічні дослідження, показали, що поверхневі полігліканові комплеки вміщують широку палітру цукрів: рамнозу, фукозу, рибозу, арабінозу, ксилозу, манозу, галактозу, глюкозу, галактозамін та глюкозамін (Рис. 1).

а) б) в)

Рис. 1. Моносахаридний склад глікокаліксів:

а) B.subtilis 3; б) L.plantarum 11/16; в) E.faecium K-50.

Звертає увагу на себе той факт, що для всіх вивчених штамів мікроорганізмів характерна наявність в значних кількостях галактози (31.7-49.4%) та глюкози (17.9-41.3%), за виключенням бацил, у яких кількість глюкози лише 10.1-13.7%, і незначний вміст аміноцукрів: глюкозаміну (0.85-1.6%) та галактозаміну (0.5-2.3%), хоча штам L.plantarum 11/16 містив їх майже у тричі більше, ніж S.thermophilus S1 і майже у 6 разів більше, в порівнянні з іншими представниками.

E.faecium K-50 глюкозамінів зовсім не виявлено. За даними літератури (Скрипаль та ін., 1995; Онищенко та ін., 1999), було висунуто припущення, що певні поверхневі цукри, які присутні у значній кількості різних споріднених груп бактерій, можуть бути спільними філогенетичними маркерами. Наші дані узгоджуються з даними літератури щодо наявності в домінуючих кількостях глюкози та галактози у глікокаліксі всіх зазначених штамів бактерій, що може свідчити про консервативність цієї ознаки і можливість використання її як додаткового філогенетичного маркеру при вивченні еволюційних зв`язків.

Щодо вивчених представників молочнокислих бактерій, то згідно наших даних, їх глікокалікс бідніший за різноманітністю моносахаридів в порівнянні з глікокаліксом бацил. Так, в поверхневому поліглікановому комплексі лактобацил і ентерококів не виявлено рамнози і у останніх - глюкозаміну, а ксилоза складала лише 2% від загального складу нейтральних моносахаридів. Відмінності у моносахаридному складі саме цих двох родів, на нашу думку, пояснюються, з одного боку, різними екологічними нішами існування, а з іншого - їх різною біологічною активністю, що знайшло відображення в практичному застосуванні зазначених штамів.

Вуглеводний склад поверхневого полігліканового комплексу представників роду Streptococcus виявився ще більш одноманітним. Так, у останніх не виявлено рибози, арабінози і ксилози, а вміст манози не перевищував 4%. Причому, при порівнянні двох їх представників, слизового і неслизового штамів, можна побачити, що для останнього (S.thermophilus S1) всі показники вищі, за виключенням вмісту галактози, глюкози, галактозаміну та глюкозаміну. Більша кількість глюкози і глюкозаміну у глікокаліксі штаму S. thermophilus S5, може бути пов`язана із здатністю останнього утворювати слизову оболонку (капсулу) на поверхні клітин, а наявність рамнози, фукози і манози можна використовувати для уточнення філогенетичної класифікації і ідентифікації бактерій, що узгоджується з даними літератури (Ряпис и др., 2002).

Щодо представників роду Bacillus, то значної різноманітності в кількісному складі цукрів досліджуваних глікокаліксів не відмічено. Вони містили у домінуючих кількостях глюкозу та галактозу. Проте, слід зазначити, що для штаму B.subtilis 668 відмічено низький вміст в глікокаліксі арабінози та рибози, а для штаму B.subtilis 3 - незначний вміст манози та рамнози, в порівнянні з іншими досліджуваними бактеріями.

Результати наших досліджень показують, що для бацил, які знайшли застосування у складі пробіотичних препаратів, характерно більше розмаїття поверхневих клітинних моносахаридів порівнянно з іншими штамами досліджуваних бактерій. Такий факт ще раз підтверджує вірний вибір B.subtilis 3, B.licheniformis 31 для виготовлення пробіотику.

У поверхневих структурах вивчених нами молікутів були виявленні певні моносахариди, кількісний склад яких дещо відрізнявся в залежності від штаму. Слід зазначити, що за якісним складом картина їх розподілу була досить різноманітна така ж, як і для бацили та молочнокислих бактерій, до якої входили: галактозамін, глюкозамін, рамноза, фукоза, рибоза, арабіноза, ксилоза, маноза, галактоза, глюкоза та неідентифіковані цукри (Рис. 2; Табл. 3.).

Рис. 2. Моносахаридний склад глікокаліксу M. fermentans PG-18.

З даних таблиці 3 видно, що для представників класу Mollicutes характерно присутність у домінуючій кількості галактози та глюкози. Наявність останніх є підтвердженням припущення, що певні цукри можуть вважатися додатковими філогенетичними маркерами при вивченні еволюції молікутів (Скрипаль та ін., 1994).

Таким чином, аналіз вуглеводного складу глікокаліксу всіх вивчених нами представників класу Mollicutes та бактерій родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, за виключенням роду Streptococcus, досить різноманітний і представлений широким спектром цукрів. Одержані результати сприяють відбору мікроорганізмів з заданими властивостями при створенні нових пробіотиків та лікувально-профілактичних продуктів харчування. Крім того, відомості про моносахаридний склад мікроорганізмів надають можливість впливати на хід інфекційного процесу. При відомій вуглеводній специфічності рецепторів етіологічних агентів захворювань з`являється можливість блокувати проявлення адгезивних властивостей патогенів шляхом внесення природних або синтетичних аналогів лектинів-адгезинів.

Моносахаридний склад глікокалісу деяких представників класу Mollicutes

Розділ 5. Вивчення імунохімічних властивостей глікокаліксів молікутів та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus

Виділені глікокалікси із штамів B. subtilis 668, L. plantarum 11/16 та A. laidlawii var. granulum 118 використовували в якості антигенів, а антитілами були антисироватки кролів, одержані при імунізації відповідними антигенами. Необхідною умовою вивчення динаміки гуморальної імунної відповіді є підбір оптимальної дози антигену для імунізації кролів. Тому, нами було підібрано оптимальну дозу імуногену, яка складала 200 мкг на тварину (Табл).

Підбір оптимальної дози антигену для імунізації кролів

Застосування реакції преципітації в гелі методом подвійної дифузії за Оухтерлоні дозволило нам виявити спільні антигени серед представників бацил, лактобацил та ахолеплазм, які полідетермінантні, а антитіла, у відповідь на них - поліклональні. Також антисироватки проти глікокаліксів L. plantarum 11/16,

B. subtilis 668 i A. laidlawii var. granulum 118 неповністю ідентичні і поліспецифічні, а контрольні антисироватки (одна проти бичачого імуноглобуліну, друга - неімунізованого кроля) не реагували взагалі.

Для подальшого з`ясування питання щодо серологічної активності антигенів та антитіл використовували зворотню реакцію радіальної імунодифузії, в результаті якої підтвердили виявлену раніше антигенну спорідненість між молекулами в розчині. Також, ми отримали дані, при проведенні вище вказаного методу, котрі показали, що поліглікановий комплекс лактобацил індукує антитілоутворення з вищим титром (1: 512), ніж подібні імуногени бацил та ахолеплазми, титр сироваток до яких становив 1: 256 (Табл.).

Характеристика імунних сироваток, отриманих до глікокаліксів окремих представників бацил, молочнокислих бактерій та ахолеплазм

За результатами серологічних методів виявлено наявність одних і тих же вуглеводних компонентів (які перехресно реагують та мають серологічну спорідненість) на поверхні клітин представників різних мікроорганізмів (родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus та класу Mollicutes) і тим самим доводять їх можливу філогенетичну спорідненість.

Таким чином, підсумовуючи дані, отримані при використанні імунохімічних методів, можна сказати, що вони є підтвердженням та доповненням електронно-мікроскопічних та біохімічних досліджень щодо спільних, подібних поверхневих клітинних полігліканових комплексів у еволюційно віддалених груп бактерій і можуть бути використані, як ще одна додаткова ознака при вивченні їх філогенетичного походження.

Висновки

1. Вперше отримано та охарактеризовано різними методами поліглікановий комплекс (глікокалікс) клітин окремих представників молікутів та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus.

2. За допомогою мічених колоїдним золотом лектинів рослин вивчено вуглеводний склад поверхневих структур клітин представників молікутів, бацил та молочнокислих бактерій і встановлено, що він варіював залежно від роду, виду та штаму мікроорганізмів. Наявність у глікокаліксі всіх досліджених представників b-D - галактози, L-фукози, a-D-манози і сіалових кислот є новою фенотипною ознакою у спільних генетичних зв`язках цих мікроорганізмів.

3. Біохімічними методами досліджено глікокалікси представників молікутів та філогенетично споріднених з ними родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus і вперше показано присутність в їх складі рамнози, фукози, рибози, арабінози, ксилози, манози, галактози, глюкози, галакозаміну і глюкозаміну. У кількісному складі домінуючими були глюкоза (10.1 - 41.3%) та галактоза (27.4 - 49.4%).

4. Вперше досліджено індукцію антитілоутворення глікокаліксами представників класу Mollicutes та бактерій групи Bacillus - Lactobacillus - Streptococcus. Доведено, що поліглікановий комплекс лактобацил індукує антитілоутворення у два рази з вищим титром, ніж подібні імуногени бацил та ахолеплазм.

5. Вперше за допомогою імунохімічних методів досліджено серологічні властивості глікокаліксів бацил, молочнокислих бактерій та молікутів. Встановлено, що ці мікроорганізми мають спільні поверхневі антигени, що свідчить на користь їх філогенетичної спорідненості

6. На основі порівняльного вивчення електронно-мікроскопічним, біохімічними та імунохімічними методами вуглеводних компонентів глікокаліксу представників класу Mollicutes та родів Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus встановлено подібний їх склад. Показано, що вони можуть виступати як додаткові фенотипні ознаки при виявленні ймовірних родинних зв`язків.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Січкар С.В. Склад нейтральних моносахаридів глікокаліксу бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus // Мікробіол. журн. - 2004. - Т. 66, №2. - С. 57-62.

2. С.В.Січкар, А.М. Онищенко. Порівняльне вивчення складу моноцукрів глікокаліксу бактерій групи Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus біохімічними та електронномікроскопічним методами // Мікробіол. журн. - 2004. - Т. 66, №5. - С. 40-47. (Здобувач особисто провів експериментальні дослідження по виділенню та визначенню моносахаридного складу глікокаліксів бацил та молочнокислих бактерій, безпосередньо приймав участь в підготовці зразків мікроорганізмів для проведення електронно-мікроскопічних досліджень, підготовлено матеріали статті до друку).

3. Січкар С.В. Поверхневий моносахаридний склад деяких молікутів // Мікробіол. журн. - 2004. - Т. 66, №6. - С. 18-23.

4. Січкар С.В. Вивчення імунохімічних властивостей глікокаліксів представників молікутів та бактерій групи Bacillus-Lactobacillus - Streptococcus // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія: Медицина. - 2005. - Випуск 25. - С. 48-52.

5. Січкар С.В. Вивчення вуглеводних компонентів глікокаліксу Mollicutes та філогенетично спорідненої групи бактерій Bacillus-Lactobacillus - Streptococcus / Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених, присвяченої 190-річчю з дня народження Тараса Шевченка та 170-річчю заснування Київського університету. (13-14 травня 2004 р., м. Київ). - С. 23-24.

6. С.В.Січкар, А.М. Онищенко. Приклітинні вуглеводні компоненти глікокаліксу деяких молікутів та філогенетично споріднених їм бактерій /Тези доповідей учасників Х (ІІІ) з`їзду Товариства мікробіологів України. (15-17 вересня 2004 р., м. Одеса). - С. 237.

Размещено на Allbest.ru