Генетичні механізми регуляції біосинтезу ландоміцину Е у штаму Streptomyces Globisporus 1912

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Проблема пошуку нових антибіотичних речовин є однією з найактуальніших у сучасній біотехнології. В першу чергу це зумовлено поширенням явища множинної лікарської резистентності серед мікроорганізмів та ракових клітин. Перспективними в цьому плані є полікетиди, зокрема ті, що належать до групи ангуциклінів (Мацелюх і співав., 1998; Поліщук і співав., 1996; Henkel et al., 1990). Представниками цих природних сполук є ландоміцини - основні продукти вторинного метаболізму штамів S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912 (Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996). Ці антибіотики активні проти ряду ракових клітин, в тому числі карциноми Герена та аденоми простати (Поліщук і співав., 1996; Depenbrock et al., 1996). Окрім того, ландоміцини пригнічують ріст антрациклін-резистентних пухлин, що є їхньою унікальною властивістю (Panchuk et al., 2004). Значною перешкодою у вивченні цих антибіотиків є низький рівень їхньої продукції, обмеженість даних щодо мішеней дії ландоміцинів у клітинах та їхня висока загальна цитотоксичність. Це стимулює використання підходів комбінаторного біосинтезу для створення нових похідних, одержання штамів з високим рівнем продукції цих антибіотиків. Однак такі експерименти неможливі без розуміння регуляторних процесів, що контролюють продукцію ландоміцинів у S. cyanogenus S136 та S. globisporus 1912.

Висока вартість протипухлинних антибіотиків, у тому числі ландоміцинів, зумовлена, насамперед, низьким рівнем їхнього біосинтезу та нестабільністю штамів-продуцентів, отриманих в результаті багаторазових етапів індукованого мутагенезу. Окрім того, методи класичної селекції в багатьох випадках є неефективними щодо промислових штамів-надпродуцентів. Розуміння процесів генетичного контролю продукції антибіотиків у стрептоміцетів дозволить розробити нові підходи до раціонального отримання штамів з високим рівнем біосинтезу антибіотиків за рахунок маніпуляцій з окремими генами чи елементами регуляторних систем.

Регуляція біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів є об'єктом інтенсивних досліджень багатьох вчених. Відомі різноманітні регуляторні елементи та механізми, задіяні у контролі вторинного метаболізму в цих бактерій. Однак, існує мало даних стосовно регуляції продукції сполук групи ангуциклінів. Незрозумілим залишається питання про взаємозв'язок окремих регуляторних процесів між собою. Вивчення регуляції біосинтезу ландоміцинів сприятиме глибшому розумінню загальних аспектів генетичного контролю продукції антибіотиків та ангуциклінів зокрема. Окрім того, досі погано розроблені раціональні підходи до створення штамів із високим рівнем продукції антибіотиків, що базуються на знаннях про регуляцію вторинного метаболізму у актиноміцетів. Дані, отримані під час таких досліджень, можуть бути використані і щодо інших стрептоміцетів - продуцентів антибіотиків.

Перелічені проблеми є особливо актуальними для України, де відсутнє промислове виробництво антибіотиків та протипухлинних препаратів, зокрема.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення генетичних механізмів регуляції біосинтезу ландоміцинів. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) виявити, клонувати та секвенувати гени шлях-специфічних регуляторів, задіяних у контролі продукції ландоміцинів;

2) отримати та вивчити мутанти S. globisporus та S. cyanogenus із пошкодженнями у виявлених генах;

3) вивчити особливості експресії генів шлях-специфічних регуляторів біосинтезу ландоміцинів;

4) дослідити механізми функціонування білків, що кодуються клонованими генами;

5) встановити роль регуляторної bldA-тРНК у контролі біосинтезу ландоміцинів;

6) дослідити ділянки, що фланкують кластери генів біосинтезу ландоміцинів з метою пошуку нових регуляторних елементів, задіяних у контролі продукції антибіотиків у S. globisporus та S. cyanogenus;

7) розробити підходи отримання штамів з надпродукцією ландоміцинів на основі отриманих даних щодо регуляції їхнього біосинтезу.

1. Матеріали та методи

У роботі використали штами Escherichia coli DH5б, ET12567 (pUB307), BL21(DE3) та 51 штам актиноміцетів, а також 75 плазмід. Вони отримані дисертантом та співпрацівниками з кафедри генетики та біотехнології Львівського національного університету імені Івана Франка, де виконувалась робота, а також люб'язно надані колегами з інших установ.

Трансформацію E. coli проводили згідно стандартної методики (Sambrook et al., 2001). Кон'югаційні схрещування між E. coli та штамами стрептоміцетів проводили згідно методики, описаної в роботі (Лужицький і співавт., 2000). Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення сумарної та плазмідної ДНК, електрофорез ДНК в агарозному гелі та елюювання фрагментів ДНК, обробку ДНК ендонуклеазами рестрикції, фрагментом Кленова, лігування ДНК Т-4 ДНК-лігазою, ДНК-ДНК-гібридизацію, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), визначення послідовності нуклеотидів у ДНК, термінальне мічення ДНК флуоресцеїном) проводили згідно стандартних методик (Sambrook et al, 2001) та рекомендацій виробника відповідних ферментів. Аналіз нуклеотидних та амінокислотних послідовностей виконували за допомогою комп'ютерних програм DNAsis, GENETYX-MAC8, DNA-Star, BLASTP, CODONPREFERENCE, CLUSTAL W, SIGNALP. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми STATGRAPHICS та електронних таблиць Microsoft Excel.

Аналіз продукції антибіотиків проводили методами тонкошарової рідинної хроматографії (ТШХ) та високоефективної рідинної хроматографії, згідно методик (Henkel et al., 1990; Мацелюх і співавт., 1999).

Для експресії білків використовували векторні системи pET23c, що передбачає введення 6 залишків гістидину, та pTYB, яка передбачає одержання гібридного білка злитого з хітин-зв'язувальним доменом. Очищення білків проводили методами афінної хроматографії на Ni2+ чи хітиновому носії. Аналіз концентрації білка здійснювали за (Lawry, 1951) чи методом BCA (bicinchoninic acid). ДСН-ПАГЕ проводили відповідно до Laemmli (Sambrook et al, 2001). Визначення змін електрофоретичної рухливості фрагментів ДНК після інкубації з LndI білком (Mobility Shift Assay - MSA) проводили згідно стандартних методик з використанням фрагментів ДНК, мічених флуоресцеїном (Taylor et al., 1994).

Аналіз експресії репортерного гена зеленого флуоресцентного білка (EGFP) та отриманих на його основі генетичних конструкцій здійснювали за рівнем флуоресценції міцелію згідно (Sun et al., 1999). Вивчення експресії гібридів LndI-EGFP проводили імунологічно з використанням анти-GFP-антитіл.

2. Результати досліджень

1. Вивчення функції генів lndI та lanI у регуляції синтезу ландоміцинів. Проведено секвенування та подальший аналіз нуклеотидної послідовності кластеру генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер) S. globisporus 1912 у 5'-напрямі від гена lndE. В результаті було ідентифіковано три відкриті рамки зчитування. Одна з них, ORF1, відповідає раніше описаному гену lndI. Розмір кодуючої послідовності гена становить 783 п.н., та кодує білок з 261 амінокислотного залишку. Ймовірний продукт lndI виявляє високий ступінь гомології до білків-регуляторів біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів, що належать до SARP-родини. Аналіз нуклеотидної послідовності, що передує старт-кодону гена lndI виявив ймовірну промоторну послідовність, близьку до консенсусної (Bourn et al., 1996). Вона складається з -10 ділянки 5'-TAGTTT (положення 235-240 п.н), що передує старт кодону гена lndI на 48 п.н, та -35 послідовності 5'-TTGACA (211-216 п.н.). Аналіз 5'- ділянки від ідентифікованого промотора показав існування трьох гептамерних повторів з консенсусною послідовністю 5'-T1C2G3C4(G/C)5 (G/A)6(C/A)7-3', які характерні для сайтів зв'язування транскрипційних факторів (Wietzorrek et al., 1997). Кластер генів біосинтезу ландоміцину А S. cyanogenus S136 було отримано з космідної бібліотеки генів цього штаму та секвеновано групою професора А. Бехтольда (Westrich et al., 1999). Аналіз нуклеотидної послідовності lan-кластеру виявив деякі відмінності від lnd-кластеру S. globisporus, зокрема в складі lan-кластеру не було знайдено гена, що кодує транскрипційний регулятор структурних генів біосинтезу. Нами проведено додаткове секвенування ділянки 4839 п.н. lan-кластеру S. cyanogenus S136 у 3'-напрямку від гена lanZ6, що виявило три відкриті рамки зчитування. Аналіз нуклеотидної послідовності однієї з них показав, що вона кодує ймовірний транскрипційний регулятор, гомологічний продукту гена lndI S. globisporus 1912. Даний ген, позначений нами як lanI, зі старт-кодоном GTG, кодує білок з 261 амінокислотних залишків.

Порівняння ймовірних продуктів генів lndI та lanI показав високий ступінь їхньої гомології між собою та до транскрипційних факторів прокаріотів. На основі аналізу ймовірної амінокислотної послідовності білків з послідовністю осморегулятора E. coli OmpR, для якого відомі елементи вторинної структури, було виявлено послідовності LndI та LanI, які ймовірно задіяні у розпізнаванні та зв'язуванні з ДНК мішенню та активації РНК-полімерази. Дані порівняння показали також, що регуляторні білки, які походять із кластерів генів біосинтезу ангуциклінових полікетидних антибіотиків становлять окрему від інших SARP регуляторів філогенетичну групу.

Ген lndI було зруйновано в хромосомі штаму S. globisporus 1912 шляхом заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до канаміцину. Факт заміщення було підтверджено ДНК-ДНК гібридизацію. Одержаний мутантний штам S. globisporus I2-1 характеризувався повною відсутністю синтезу ландоміцину Е та його попередників. Продукція антибіотика відновлювалась при введенні гена lndI у складі плазмід. Ген lanI також зруйновано у хромосомі штаму S. cyanogenus S136 шляхом заміщення на мутантний алель з інерцією гена стійкості до спектиноміцину. Одержаний мутант характеризувався подібним до S. globisporus I2-1 фенотипом.

Проведено комплементацію мутацій у генах lndI та lanI з використанням генів-регуляторів біосинтезу антибіотиків у різних штамів стрептоміцетів. В результаті було виявлено, що всі використані регулятори можна розділити на дві групи - ті, які відновлюють продукцію ландоміцинів, та такі, що відновлюють синтез антрациклінових полікетидів у відповідних регуляторних мутантів S. coelicolor та S. argillaceus. Одержані дані показали близьку спорідненість та взаємну замінність регуляторів біосинтезу ангуциклінових антибіотиків jadR1, lanI та lndI, що підтверджує дані, отримані під час аналізу амінокислотних послідовностей відповідних білків.

При введені у штам S. globisporus 1912 додаткових копій гена lndI спостерігається зростання рівня продукції ландоміцину Е. У випадку використання плазміди pSI2-9 на основі інтегративного вектора, що дає 2-3 копії клонованого гена на геном, рівень продукції зростав у 11 разів, тоді як при введенні висококопійної плазміди pSOI1112 (200-300 копій на геном) штам продукував у 12 разів більше ландоміцину Е порівняно із вихідним.

Показано відсутність впливу високих концентрацій глюкози на продукцію ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912. Найвищий рівень синтезу спостерігали на середовищах з 5% цього вуглеводу, тоді як на середовищах із 10% та 15% рівень продукції дещо зменшувався. У випадку штаму S. globisporus 1912 pSI2-9+ найвищий рівень синтезу ландоміцину Е спостерігався на середовищах з 15% глюкози. При цьому в екстрактах основну частину становив ландоміцин Е, тоді як його попередники були відсутні. Також виявлено, що штам S. globisporus 1912 є типовим нейтрофілом, який краще переносить лужні умови культивування, ніж кислі. Відповідний характер має і залежність продукції ландоміцину Е від значення рН середовища.

2. Вивчення ДНК-зв'язувальних властивостей білка LndI. Отримані дані вказують на те, що продукт гена lndІ задіяний у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцину Е. Відомо, що такі білки функціонують як фактори транскрипції і реалізують свою функцію через взаємодію з ДНК промоторів регульованих ними генів. З метою вивчення ДНК-зв'язувальних властивостей білка LndI було проведено експерименти з його титрування in vivo на промоторах генів lndI та lndE клонованих у складі висококопійних плазмід pSOH (містить РlndI) та pSOE (містить РlndE) у штамі S. globisporus 1912. Отримані рекомбінантні штами продукували на 20-60% менше ландоміцину Е порівняно із штамом дикого типу. Таке зменшення продукції, очевидно, зумовлене титруванням регуляторного білка на клонованих у складі плазмід фрагментах ДНК за рахунок конкуренції за зв'язування з відповідними промоторами у складі хромосоми.

Ген lndI було клоновано у вектори експресії у E. coli та очищено відповідний рекомбінантний білок методами афінної хроматографії (рис.4). Одержаний білок LndI було використано в експериментах із вивчення зміни електрофоретичної рухливості ДНК-фрагментів (MSA - mobility shift assay) промоторів генів lndI, lndE.

В результаті цих експериментів було виявлено, що електрофоретична рухливість мічених флуоресцеїном фрагментів ДНК, що відповідали промоторам генів lndI та lndE, різко змінюється після інкубації з очищеним білком LndI, порівняно із вільними фрагментами ДНК. Очевидно, що це зумовлено активним формуванням ДНК-білкових комплексів між LndI та відповідними промоторами. Така зміна електрофоретичної рухливості має конкурентний характер і залежить від кількості немічених фрагментів ДНК, що додавали до інкубаційної суміші. Таким чином, дані титрування та МSА показали, що lndI кодує ДНК-зв'язувальний білок, який активно взаємодіє із промоторами структурних генів біосинтезу ландоміцину Е, зокрема промотором гена lndE, що забезпечує транскрипцію ключових генів біосинтезу антибіотика, які входять до складу lndEFABCD оперону. Окрім того, LndI взаємодіє із промотором власного гена.

3. Вивчення особливостей експресії генів біосинтезу ландоміцину Е у S. globisporus 1912. Промоторні ділянки генів lndI та lndE було клоновано у репортерний вектор pIJ8660 в орієнтації, при якій їхня активність забезпечувала транскрипцію гена зеленого флуоресцентного білка EGFP. Отримані плазміди, pIJ8660H та pIJ8660E відповідно, було перенесено у штам S. globisporus 1912 та активність відповідних промоторів вивчали за інтенсивністю зеленої флуоресценції міцелію. Виявлено, що ініціація транскрипції lndEFABCD оперону відбувається лише після 24 години росту культури, а її максимум припадає на 60 годину, що збігається з часом максимального нагромадження ландоміцину Е. Ініціація транскрипції гена lndI відбувалась на 12 годину росту штаму S. globisporus 1912 pIJ8660Н+. Інтенсивність флуоресценції міцелію досягає максимуму на 60 годину росту культури в період найвищого рівня продукції антибіотика. Після цього спостерігається зменшення синтезу EGFP, що відображає зменшення активності промотора гена lndI та продукції ландоміцину Е зокрема. Причиною цього є частковий автоліз культури після 60-72 годин росту, що було підтверджено фарбуванням пропідій-йоддидом. Використання плазмід pIJ8660H та pIJ8660E показало, що обидва промотори PlndI та PlndE є активними лише у субстратному міцелії, тоді як у повітряному міцелії та спорах досліджувані гени не експресуються. Таким чином, існує чітка регуляція активності гена lndI та структурних генів не лише в часі, а й у різних частинах колонії S. globisporus 1912.

Отримані результати дозволяють виявити лише особливості роботи досліджуваних промоторів, але не показують характер експресії генів загалом. Тому було створено злиття кодуючих ділянок генів lndI та EGFP. Така конструкція pIJlndI була перенесена у штам S. globisporus I2-1. При цьому спостерігалось часткове відновлення біосинтезу ландоміцину Е мутантним штамом, що свідчить про функціональну активність гібридного білка LndI-EGFP. Плазміду pIJlndI було перенесено у штам дикого типу S. globisporus 1912 та вивчено експресію даного гена. Гібрид було виявлено в сумарному лізаті клітин S. globisporus 1912 pIJlndI+ імунологічно, як білок, розміром 56 кДа. Використання цієї системи показало, що протягом перших 12-24 годин росту в клітинах відсутній продукт гена lndI-GEFP. Слабка флуоресценція з'являлась на 24 годину росту культури і досягала максимуму інтенсивності між 48 та 60 годинами. Такий характер експресії гена lndI в загальному збігається з даними, отриманими при вивченні активності його промотора. Однак було виявлено існування певного лаг-періоду між ініціацією транскрипції гена lndI та трансляції його мРНК. Причиною цього може бути присутність в кодуючій ділянці гена lndI регуляторного лейцинового ТТА-кодону. Було створено мутантний алель гена, у якого цей кодон замінено на синонімічний СТС. Одержаний ген lndICTC було злито з кодуючою ділянкою гена EGFP та досліджено його експресію у S. globisporus 1912. Виявлено відсутність лаг-періоду між початком транскрипції гена lndICTC та трансляції його мРНК. Таким чином, очевидно, що експресія lndI регулюється на рівні трансляції за рахунок використання рідкісного ТТА кодону, що транслюється bldA- тРНК.

4. Створення гібридних генів регуляторів на основі lndI та lanI. Подібність нуклеотидних та амінокислотних послідовностей генів lndI та lanI та їхніх продуктів вказують на їхню близьку структурну та функціональну спорідненість. Окрім того, відомо, що S. cyanogenus характеризується підвищеним рівнем продукції ландоміцину А порівняно із S. globisporus 1912. Причини такого надсинтезу невідомі, проте однією з них можуть бути відмінності в амінокислотних послідовностях білків LanI та LndI. Найбільше відмінностей зосереджено у їхній N-кінцевій ділянці, тоді як С-кінцева ділянка є більш консервативною та відповідає за зв'язування з ДНК-мішені і активацію РНК-полімерази. Найбільше відмінностей між білками знайдено в ділянці б-петлі, яка розміщена між б2 та б3 спіралями. Саме ця структура, розміром 9 амінокислотних залишків, найбільш вірогідно, взаємодіє з РНК-полімеразою та активує її. Відповідні ділянки LndI та LanI відрізняються 5 амінокислотними залишками, що, ймовірно, відображається на ступені активації РНК-полімерази та, відповідно, на рівні продукції антибіотиків.

У центральній частині lndI та lanI було знайдено сайт розпізнавання рестриктазою PstI, що розщепляє кодуючі ділянки генів у ідентичних місцях, таким чином, що при об'єднанні 5'-частини lndI та 3'- послідовності lanI в даному сайті відбувається відновлення рамки зчитування. Використовуючи цю особливість було створено два нові регуляторні гени ladR1, продукт якого складається із сигнального домену LndI та регуляторного домену LanI, та ladR2, який кодує білок із сигнальним доменом LanI та регуляторним доменом LndI. Ще один варіант гібридного lndI/lanI було отримано методом ПЛР. ladI кодує білок LndI з його N-кінцевим сигнальним доменом та ділянкою регуляторного домену до б2 спіралі включно, у якого б-петля та наступні б3, в6 і в7 структури замінені на відповідні ділянки білка LanI. Одержані гени ladR1, ladR2 та ladI було клоновано у вектор експресії pKC1212E, таким чином, що в отриманих рекомбінантних плазмідах pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI, відповідно, їхня експресія забезпечується промотором гена стійкості до еритроміцину. pKCEladR1, pKCEladR2 та pKCElаdI було перенесено у lndI- мутант S. globisporus I2-1. Однак у жодному з випадків відновлення біосинтезу антибіотика не спостерігалось. Таким чином, незважаючи на взаємну функціональну замінність білків LndI та LanI, гібриди, отримані в результаті комбінування їхніх доменів чи окремих фрагментів, які кодують ділянки активних центрів, призводять до утворення нефункціональних регуляторів, що не здатні відновлювати біосинтез ландоміцину Е у штамі S. globisporus I2-1.

5. Вивчення функції гена prx у регуляції продукції ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912. Під час секвенування 5'-фланкуючої послідовності lnd-кластера і аналізу отриманої нуклеотидної послідовності у 5'-напрямі від гена lndI на відстані 700 п.н. було виявлено ORF, названу згодом prx, розміром 1605 п.н. Ймовірним продуктом цього гена є білок з молекулярною масою 49,76 кДа, який складається із 534 амінокислотних залишків. Порівняння ймовірного продукту гена prx з білками із бази даних показали його високий ступінь гомології до білків імовірних протеїназ та ендопептидаз стрептоміцетів. У 5' напрямі від prx було ідентифіковано ще одну ORF, яка кодує тимідилат-фосфотрансферазу, що, очевидно, задіяна у первинному метаболізмі S. globisporus 1912. Для дослідження функції гена prx було сконструйовано плазміду для його спрямованого руйнування pKC1139Ma. Дана конструкція на основі вектора pKC1139 з термочутливим репліконом містила мутантний алель гена prx з інерцією генної касети стійкості до спектиноміцину aadA. В результаті отримано штам S. globisporus Pro6, в якого ген prx було заміщено на його мутантний алель. Аналіз продукції ландоміцину Е показав, що мутантний штам синтезує у 5 разів менше ландоміцину Е, порівняно із штамом S. globisporus 1912. Біосинтез антибіотика відновлювався до рівня вихідного штаму при введенні у S. globisporus Pro6 інтактного гена prx у складі плазміди pKCX2. При збільшенні числа копій гена prx у штамі дикого типу за рахунок введення плазміди pKCX2 спостерігали значне зростання рівня продукції антибіотика порівняно із вихідним. Одержані дані дозволяють стверджувати, що продукт гена prx задіяний у позитивній регуляції біосинтезу ландоміцину Е у S. globisporus 1912.

Таким чином, в результаті проведених досліджень було виявлено, клоновано та вивчено гени, що контролюють продукцію ландоміцинів Е та А у S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136 на рівні шлях-специфічної регуляції структурних генів та пост-трансляційної модифікації ферментів, задіяних у біосинтезі цих антибіотиків. Одержані дані було використано для створення підходів до отримання штамів із підвищеною продукцією ландоміцинів за рахунок генно-інженерних маніпуляцій із ідентифікованими регуляторними генами. Однак багато питань щодо контролю біосинтезу ангуциклінових полікетидів залишаться незрозумілими. Невідомими є елементи глобального контролю вторинного метаболізму та морфологічної диференціації, їхня подібність до таких, що були виявлені та вивчені у продуцентів інших груп полікетидних антибіотиків. Однак, перш за все потребує відповіді питання про зв'язок між системами глобального контролю продукції антибіотиків та шлях-специфічних регуляторів, досі не виявлено білки та гени, що об'єднують ці два рівні, невідомими залишаються генетичні та молекулярні механізми їхньої взаємодії. Розв'язання цих питань дозволить більш глибше зрозуміти логіку експресії генів вторинного метаболізму стрептоміцетів, розробити нові, досконаліші методи одержання штамів-надпродуцентів біологічно-активних речовин, та в кінцевому результаті стане базою для подальшого створення нових антибіотичних речовин за рахунок генно-інженерних маніпуляцій.

Висновки

ландоміцин генний клонований біосинтез

В результаті виконаної роботи показано, що біосинтез ландоміцинів у штамів S. globisporus 1912 та S. cyanogenus S136 регулюються на рівні експресії структурних генів шлях-специфічними транскрипційними факторами, що кодуються генами lndI та lanI. Важлива роль у контролі продукції цих антибіотиків належить bldA-тРНК та протеїназі, що кодується геном prx.

1. Виявлено, клоновано та секвеновано гени шлях-специфічних регуляторів біосинтезу ландоміцинів lndI та lanI, продукти яких гомологічні факторам транскрипції інших прокаріотичних організмів. Гени, що контролюють продукцію ангуциклінових полікетидних антибіотиків, становлять окрему групу в межах SARP-родини.

2. Спрямоване руйнування генів lndI та lanI призводить до повного припинення біосинтезу ландоміцинів у мутантних штамів S. globisporus та S. cyanogenus, відповідно. Продукція антибіотиків відновлюється після введення in trans генів lndI, lanI та jadR1, що свідчить про їхню близьку філогенетичну та функціональну спорідненість.

3. Показано, що lndI кодує ДНК-зв'язувальний білок, який взаємодіє із промоторами структурних генів біосинтезу ландоміцину Е та промотором власного гена.

4. Вивчено особливості часової та просторової регуляції експресії гена lndI. Показано, що ініціація транскрипції його промотора припадає на 12 годину росту, а максимум активності збігається із часом ефективного синтезу антибіотика. Виявлено існування лаг-періоду між початком транскрипції гена lndI та трансляції його мРНК. Він зумовлений присутністю у кодуючий послідовності гена мінорного ТТА-кодону, що транслюється регуляторною лейцил-bldA-тРНК.

5. Секвеновано ділянки ДНК, що фланкують lnd- та lan- кластери. У S. globisporus виявлено ген трансмембранної ендопептидази prx, руйнування якого призводить до зменшення рівня продукції ландоміцину Е, тоді як надекспресія стимулює надсинтез антибіотика. Ймовірно функцією продукту гена prx є пост-трансляційний процесинг білків зв'язаний з їхньою секрецією.

6. Розроблено спосіб отримання надпродуцентів ландоміцинів на основі рекомбінантних штамів, що несуть клоновані гени lndI та prx.

Література

1. Ostash B.O., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Rebets Yu.V., Fedorenko V.O. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin E biosynthesis // Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна. - 2001. - Вип. 27. - С.106-112.

2. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Mik U., Basiliya L., Fedorenko V. Resistance of recombinant Streptomyces albus CEST114 and Streptomyces globisporus strains to landomycin E // Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна.-2003. - Вип. 33. - С.47-54.

3. Ostash B., Rebets Yu., Samborskiy M., Salas J.A., Fedorenko V. Sequencing and analysis of putative 3rd -4th ring cyclase gene lndF from Streptomyces globisporus 1912 landomycin E biosynthetic gene cluster // Вісник Львів. Ун-ту., Серія біологічна. -2003. - Вип. 32. - С.89-94.

4. Ostash B., Rebets Yu., Yuskevich V., Luzhetskyy A., Tkachenko V., Fedorenko V. Targeted disruption of Streptomyces globisporus 1912 lndF and lndL cyclase genes involved in antitumor landomycin E biosynthesis // Folia Microbiologica. - 2003. - Vol.48,N4. - P.484-488.

5. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Braтa A., Mendez C., Salas J.A., Bechthold A., Fedorenko V. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol.222. - P.149-153.

6. Gromyko O., Rebets Yu., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuhara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it's initial characterization// J. of Antibiotics. - 2004. - Vol. 57,N6. - P.383-389.

Размещено на Allbest.ru