Розробка біосенсора для визначення концентрацій стероїдних глікоалкалоїдів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології та генетики

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

РОЗРОБКА БІОСЕНСОРА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ

КОНЦЕНТРАЦІЙ СТЕРОЇДНИХ ГЛІКОАЛКАЛОЇДІВ

НАЗАРЕНКО Олена Анатоліївна

КИЇВ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

Корпан Ярослав Ізидорович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, заступник директора з наукової роботи.

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Соломко Олександр Петрович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу біохімічної генетики;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Верьовка Сергій Вікторович,

Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, старший науковий співробітник відділу структури і функції білка.

Провідна установа - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “_27_” вересня 2005р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ 26 ” серпня 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом стероїдні глікоалкалоїди (СГА) привернули особливу увагу вчених у зв'язку з отриманням даних щодо їхньої токсичності. Основним резервуаром цих природних токсинів є рослини родини Пасльонових, зокрема, картопля, широко вживана в їжу мільйонами людей. Споживання картоплі та продуктів з неї може бути потенційно небезпечним, оскільки високі концентрації СГА призводять до отруєння, іноді навіть з летальним кінцем як людей, так і тварин (Morgan et al., 1987). СГА спричиняють подвійну токсичну дію: по-перше, як детергенти, руйнуючи мембрани клітин, по-друге, інгібуючи холінестерази, що виконують ключову роль у передачі нервових імпульсів і детоксикаційній функції деяких ксенобіотиків (Morris et al, 1984).

Доведено, що СГА є тератогенними, ембріо- та генотоксичними сполуками (Poswillo et al., 1972; Swinyard et al., 1973; Chaube et al., 1976; Pierro et al., 1977; Renwick J, 1984; Baker et al., 1987; Keeler et al., 1990). Дослідження останніх років також свідчать, що СГА спричиняють збільшення ризику захворювання на рак мозку, молочної залози, легень та щитовидної залози (http:ntp-server.niehs.nih.gov/htdocs/Chem_Background).

Враховуючи це, надзвичайно актуальним є здійснення постійного контролю рівня СГА у харчових продуктах, особливо зважаючи на той факт, що досі не існує єдиного токсикологічно обґрунтованого стандарту безпечної концентрації СГА для людини (Korpan et al., 2004). Більш того, наукові дані є суперечливими й базуються тільки на дослідженнях дії СГА в гострих експериментах. Тому було дуже важливо дослідити дію СГА у субхронічному експерименті.

На сьогодні методи для визначення загального вмісту СГА та концентрації кожного з них окремо базуються на використанні колориметрії (Clement et al., 1989); високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) (Crabbe et al., 1980; Jonker et al., 1992; Houben et al., 1994; Simonovska et al., 2000; Sotelo et al., 2000), тонкошарової хроматографії (Ferreira et al., 1993), газової хроматографії - мас-спектрометрії (Herb et al., 1975; Chen, 1994), радіоімунологічного аналізу (Harvey et al., 1985) та твердофазового імуноферментного аналізу (ELISA) (Morgan et al., 1983).

Кожний із цих методів має певні недоліки, з яких найбільш суттєвими є дорожнеча обладнання, тривалий час попередньої обробки зразків та проведення самого аналізу. Дуже перспективною видається розробка альтернативних підходів до визначення вмісту СГА за допомогою біосенсорів. Інтерес до розробки біосенсорів обумовлений низкою їхніх потенційних переваг: дешевизною, простотою використання, можливістю їхньої мініатюризації, експресністю аналізу, низькою собівартістю при масовому виробництві - і все це із забезпеченням необхідного рівня чутливості та селективності (Sze, 1994; Korpan et al., 2002). Для розробки біосенсорів як чутливий елемент використовували бутирилхолінестразу (БуХЕ), яка, з одного боку, є чутливою до СГА (Nigg et al., 1996), з іншого - широко застосовується в біосенсорних системах, зокрема, на основі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ), для аналізу бутирилхоліну, іонів важких металів, фосфорорганічних і карбаматних пестицидів (Новиков и др., 1992; Jaffrezic et al., 1996; Солдаткін, 1997). Внаслідок ферментативної реакції утворюються протони, що й обумовлює вибір рН-ПТ як перетворювачів. Досі у світі не існує жодного сенсорного пристрою для визначення концентрації СГА, тому актуальною є розробка біосенсора для аналізу цих токсинів із використанням рН-ПТ як перетворювачів та іммобілізованої БуХЕ як чутливого елемента.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем Інституту молекулярної біології та генетики НАН України № 2.2.4.22 „Розробка нетрадиційних підходів до створення селективних елементів у біоелектронних системах” (№ державної реєстрації 0199U000660, 1999-2002 рр.), № 2.2.4.18 „Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для аналізу забруднення навколишнього середовища та харчових продуктів” (№ державної реєстрації 0103U008008, 2001-2004 рр.) та міжнародних грантів INTAS № 00-0151 і NATO Linkage № LST.CLG 977342, де дисертантка виконувала окремі розділи згідно з планом науково-дослідних робіт.

Мета та завдання дослідження. Основною метою роботи була розробка потенціометричного біосенсора на основі БуХЕ для кількісного аналізу СГА та відпрацювання методик вимірювання цих токсинів у модельних і реальних зразках.

Для реалізації мети вирішували такі завдання:

1.Створення експериментальної моделі субхронічної інтоксикації СГА на щурах та характеристика її біохімічних показників.

2.Вивчення шляхів ефективної іммобілізації БуХЕ на поверхні польових транзисторів.

3.Дослідження механізму(ів) інгібування БуХЕ, іммобілізованої на поверхні рН-ПТ, деякими СГА.

4.Створення лабораторного прототипу біосенсора для визначення концентрацій б-соланіну та б-чаконіну в модельних та реальних зразках, дослідження і оптимізація його аналітичних характеристик.

5.Розробка методик вимірювання СГА біосенсором як в модельних, так і в реальних зразках.

6.Порівняння розробленого біосенсорного методу аналізу СГА з класичним методом тонкошарової хроматографії.

Об'єкт дослідження - інгібування ферменту БуХЕ стероїдними глікоалкалоїдами спіростанового типу б-соланіном і б-чаконіном.

Предмет дослідження - розробка біосенсорів для визначення концентрацій СГА.

Методи дослідження - біохімічні та електрохімічні методи визначення ферментативних реакцій, тонкошарова хроматографія, методи визначення токсичної дії глікоалкалоїдів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено експериментальну модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації за низкою критеріально значимих показників та охарактеризовано її. Показано, що введення

щурам перорально паростків картоплі з концентрацією глікоалкалоїдів у дозі 1/20 від LD₅₀ спричиняє зниження активності холінестераз крові майже вдвічі порівняно з контрольною групою тварин.

Показано, що СГА картоплі - б-соланін та б-чаконін - конкурентно і зворотньо інгібують БуХЕ, іммобілізовану на поверхні рН-ПТ.

Вперше у світі розроблено лабораторний прототип біосенсорного пристрою на основі рН-ПТ та БуХЕ для визначення концентрації СГА у модельних розчинах та у соку бульб картоплі.

Вперше запропоновано підходи, що дозволяють за допомогою розроблених біосенсорів селективно визначати СГА у присутності в дослідних зразках іонів важких металів та фосфорорганічних пестицидів.

Практичне значення одержаних результатів. Створено лабораторний прототип потенціометричного біосенсора, який може бути основою комерційного пристрою для експресного аналізу загального вмісту СГА, зокрема, у картоплі як існуючих сортів, так і отриманих внаслідок селекції або генетичної модифікації, та в продуктах харчування.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи авторкою проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертанткою разом із керівником розроблено програму проведення експериментів та підібрано методи вирішення поставлених завдань. Здобувачем особисто розроблено лабораторний прототип потенціометричного біосенсора, підібрано оптимальні умови проведення аналізу СГА та визначено механізм інгібування БуХЕ цими токсинами. За безпосередньої участі дисертантки підібрано оптимальні умови визначення СГА за допомогою тонкошарової хроматографії, виконано роботу з отримання тіней еритроцитів та визначення токсичної дії СГА на тимоцити. Обговорення та аналіз результатів досліджень проведено з науковим керівником.

Здобувач висловлює слова глибокої вдячності д.б.н., професору, академіку НАН України Єльській Г.В., д.б.н., професору Солдаткіну О.П., к.б.н., с.н.с. Дзядевичу С.В. за постійну увагу до дисертаційної роботи та обговорення отриманих експериментальних результатів.

Авторка щиро вдячна завідувачеві відділу біохімії Інституту екогігієни і токсикології імені Медведя МЗ України д.б.н., професору Дмитренку М.П за можливість проведення токсикологічних досліджень та допомогу при аналізі отриманих експериментальних даних; співробітникам к.б.н. Кішко Т.О. та Шандренко С.Г. за допомогу при підборі оптимальних умов проведення тонкошарової хроматографії та в проведенні біохімічних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на: 1-st Black Sea Basin Conf. On Analytical Chemistry (Odessa, Ukraine, 2001), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, Україна, 2002), “Eurosensors XVI” (Prague, Czech Republic, 2002), V Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених гігієністів, токсикологів, хіміків-аналітиків (Київ, Україна, 2003), Conference for students and young scientists on Molecular Biology and Genetics dedicated to the 30^th anniversary of the Institute of Molecular Biology and

Genetics NAS of Ukraine (Kyiv, Ukraine, 2003), The 17^th European Conference on Solid-State Transducers (Guimeraes, Portugal, 2003), VIII International Meeting on Cholinesterases (Perugia, Italy, 2004), 10^th International Congress of Toxicology (Tampere, Finland, 2004), MADICA 2004 (Tunise, Tunis, 2004), II З'їзді токсикологів України (Київ, Україна, 2004), Конференції-звіті з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій” (Київ, Україна, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 експериментальні статті у фахових виданнях, 2 огляди та тези 13 доповідей на науково-практичних конференціях та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, експериментальної частини, яка має три розділи, аналізу та узагальнення результатів досліджень, а також висновків та списку використаних джерел, який охоплює 135 найменувань. Роботу викладено на 114 сторінках машинописного тексту. Фактичний матеріал дисертації подано у вигляді 29 рисунків та 7 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. При розробці біосенсорів використовували такі реактиви: БуХЕ з сироватки крові коня (КФ 3.1.1.7.), виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH” (Німеччина), з активністю 13 од. акт./мг препарату та БуХЕ з сироватки крові людини (КФ 3.1.1.7.) виробництва фірми “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH” (Німеччина), з активністю 6,4 од. акт./мг препарату; субстрат БуХЕ - бутирилхолінхлорид (“Sigma”- “Aldrich Chemie GmbH”); фосфотриестеразу з Pseudomonas diminuta (КФ 3.1.8.1.) з активністю 2000 од. акт./мл препарату було люб'язно надано для досліджень проф. Фраком Раушелом (США); субстрат фосфотриестерази - параоксонметил (“Sigma”- “Aldrich Chemie GmbH”). Для іммобілізації ферментів застосовували: 25% водний розчин глутарового альдегіду фірми “Serva” (Німеччина) та фотополімер полі(вініл)алкоголь із вмістом стирилпіридину (PVA/SbQ) (SPP-H-13, Toyo Gosei Kogyo Co.Ltd, Японія). Для стабілізації біоматриць додавали сироватковий альбумін бика (БСА) фірми “Serva”. Для інгібіторного аналізу використовували кристалічні -соланін та -чаконін з пагонів Solanum tuberosum від “Sigma”-“Aldrich Chemie GmbH”.

Решта реактивів були вітчизняного виробництва і мали кваліфікацію „осч” та „хч”.

У роботі використовували рН - чутливі польові транзистори виробництва НДІ Мікроприлад (м. Київ). Їхні конструкції та характеристики описано в роботі (Shul'ga et al., 1996). Створення ферментних біоматриць на поверхні електродів проводили згідно (Wan et al., 1998; Soldatkin et al., 2002). Визначення СГА за допомогою біосенсора проводили шляхом інгібіторного аналізу (Архипова и др., 2001).

Вивчення впливу вживання проростків картоплі на організм щурів. Активність аспартатамінотрансферази (АСТ) та аланінамінотрансферази (АЛТ) визначали за методом Райтмана-Френкеля (Raitman et al., 1957) з використанням стандартних наборів.

Бутирилхолінестеразну активність у сироватці крові щурів визначали методом Елмана (Ellman, 1961) за допомогою наборів „RANDOX U.K.”

Ацетилхолінестеразну (АцХЕ) активність визначали за (Roddick et al., 1989).

5'-нуклеотидазну активність тіней еритроцитів визначали за методом Чена (Chen, 1956).

Процеси перекисного окислення ліпідів у печінці визначали по утворенню малонового діальдегіду за методом Гацко (Кузьминская и др., 1989).

Осмотичну резистентність еритроцитів визначали відносно ряду гіпотонічних розчинів хлориду натрію за методом Дейчі (Тодоров, 1963).

Цитотоксичну дію СГА вивчали на суспензії тимоцитів, які отримували за методикою Клауса (Клаус, 1990). Кількість життєздатних тимоцитів підраховували в камері Горяєва після забарвлення їх трипановим синім.

Солюбілізовану лактатдегідрогеназу (ЛДГ) в позаклітинне середовище розраховували у відсотках щодо загальної ЛДГ активності лізованих 0,01% дигітоніном клітин.

Методика визначення СГА за допомогою тонкошарової хроматографії. СГА екстрагували з дегідратованої картоплі сумішшю киплячого метанолу з оцтовою кислотою (95+5, v/v). Надосадову рідину випарювали до кінцевого об'єму 1 мл. Соланін та чаконін розділяли на активованих метанолом пластинках сумішшю хлороформ : метанол : 2% NH₄OH (70:30:5). Для візуалізації аналізів пластинку занурювали в 20% розчин SbCl₃ у суміші оцтова кислота : дихлорметан (1+3, v/v), висушували в повітрі впродовж 10 хв. Яскраво-рожеві плями на безбарвному фоні хроматограми сканували через 5 хв після проявлення. Для кінцевого етапу хроматограми сканували та здійснювали комп'ютерний розрахунок із використанням програми “ДенситоАналіз”.

Результати дослідження та їхнє обговорення.

Експериментальна модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації на щурах. Для розробки моделі глікоалкалоїдної інтоксикації були створені агравовані умови, за яких щурам лінії Wistar щоденно (перорально) протягом 2-х місяців вводили паростки картоплі з вмістом СГА 22,5 мг/кг ваги тварини. Після цього досліджували загально-токсичні показники: вагу та вагові коефіцієнти, аланінамінотрансферазну, аспартатамінотрансферазну та бутирилхолінестеразну активності сироватки крові, інтенсивність перекисного окислення ліпідів у печінці, ацетилхолінестеразну та 5'-нуклеотидазну активності у тінях еритроцитів, кількість білка в безклітинній фракції тимусу, осмотичну резистентність еритроцитів.

У дослідної групи щурів спостерігали деякі клінічні прояви загально-токсичних інтоксикацій, таких як діарея та адинамія. Але вони не супроводжувались змінами ані ваги та вагових коефіцієнтів, ані АСТ та АЛТ активностей, що, можливо, пов'язано з тим, що доза СГА в паростках картоплі не перевищувала 1/20 від ЛД_50.

Проте, і при цих дозах ми виявили зміни, що відображають вибіркову токсичність самих СГА. В тимусі, що є найбільш уразливим до дії ксенобіотиків

органом, кількість білка в безклітинній фракції значно зростає і становить 112,7 ± 10,7 мг/г тимусу у дослідної групи та 84,9 ± 6,6 мг/г тимусу - у контрольної групи. Окрім того, відзначено зменшення життєздатності тимоцитів при їхньому інкубуванні в середовищі Хенкса протягом 7 год: воно становить 8,4 ± 0,8% та 18,2 ± 1,8% у дослідної та контрольної груп, відповідно.

Встановлено, що чаконін виявляє майже вдвічі більшу цитотоксичність щодо тимоцитів щурів порівняно з соланіном (рис.1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

А

Размещено на http://www.allbest.ru/

Б

Рис.1. Вплив соланіну (А) та чаконіну (Б) на життєздатність тимоцитів

При дослідженні впливу СГА на тимоцити за двома показниками - загибеллю клітин та вивільненню лактатдегідрогенази (ЛДГ) в позаклітинне середовище внаслідок руйнування мембран - виявлено синергізм спільної біологічної дії соланіну (10 мкг/мл) та чаконіну (5 мкг/мл) (рис.2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.2. Вплив соланіну та чаконіну на життєздатність тимоцитів та вивільнення лактатдегідрогенази в позаклітинне середовище через 5 годин інкубації

Про певні зміни мембран також свідчить зростання в 1,5 рази в тінях еритроцитів 5ґ-нуклеотидазної активності, яка є одним з найвживаніших маркерів для вивчення стану цитоплазматичних мембран (ЦПМ) клітини, оскільки активний центр цього інтегрального білка знаходиться із зовнішнього боку ЦПМ.

Нами виявлено зниження ацетилхолінестеразної (АцХЕ) активності тіней еритроцитів (у дослідних щурів) на 45% порівняно з контрольною групою тварин. Це пояснює зниження активності в поведінці дослідної групи. Відомо, що фізіологічною особливістю СГА є їхня здатність впливати на передачу нервових імпульсів, специфічно блокуючи фермент АцХЕ (Кинтя и др., 1979; Roddick et al., 1989; Nigg et al., 1996). Механізм інгібування АцХЕ не з'ясований повністю, але вважають (Friedman et al., 2004), що, можливо, він пов'язаний з типом стероїдної частини СГА.

Виходячи з даних стосовно дії СГА на щурів, отриманих у субхронічному експерименті, можна зробити таке припущення: тривале вживання картоплі навіть із незначною кількістю цих токсинів може бути вкрай небезпечним для людини, особливо зважаючи на той факт, що значення LD₅₀ для людини 3-6 мг/кг ваги людини (Morris et al., 1984) значно нижчі у порівнянні з LD₅₀ - 590 мг/кг ваги для щурів (Gull et al., 1970). Показано значне зниження активностей ферментів БуХЕ та АцХЕ, що вказує на послаблення детоксикаційної функції печінки та пригнічення передачі нервових імпульсів. Продемонстровано також мембранотропну та цитотоксичну дію СГА. У той же час не виявлено суттєвих змін ваги та вагових коефіцієнтів органів тварин, а також АЛТ та АСТ активностей. Інтоксикація не набуває значних розмірів через те, що не всі СГА паростків всмоктуються в шлунково-кишковому тракті та отримана доза СГА не перевищує 1/20 від LD₅₀.

Оскільки існуючі методи визначення СГА дорогі, потребують значних затрат часу та зусиль, привабливою видається розробка альтернативного методу визначення цих токсинів за допомогою сенсорного приладу.

Розробка біосенсорної системи для визначення СГА на основі рН-ПТ та іммобілізованої БуХЕ. До біоселективних мембран, що є чутливим елементом при створені біосенсорів, ставиться ряд вимог, а саме: забезпечення адгезії мембрани до поверхні перетворювача, дифузійної проникливості щодо молекул субстратів та інгібіторів, рівня включення ферментів у мембрану та збереження їхньої активності при іммобілізації (Rolfe et al.,1988). Процедура виготовлення мембран повинна бути простою, малочутливою до випадкових відхилень умов навколишнього середовища та дешевою. Було показано (Dawson et al., 1990), що цим вимогам відповідають біосенсори з ферментом, іммобілізованим методом зшивки глутаровим альдегідом та фотополімеризацією за допомогою PVA/SbQ у білковій мембрані (Wan, 1998; Soldatkin et al., 2002). Тому було запропоновано створити біочутливу мембрану для визначення концентрацій б-соланіну та б-чаконіну двома методами іммобілізації бутирилхолінестерази: ковалентного зв'язування у насичених парах глутарового альдегіду та фотополімеризацією у PVA/SbQ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

А

Размещено на http://www.allbest.ru/

Б

Рис.3. Залежність активності БуХЕ від концентрацій -соланіну та -чаконіну при іммобілізації ферменту в фотополімері PVA/SbQ (А) та БСА мембрані зшивкою глутаровим альдегідом (Б)

Як видно з рис.3, обидва способи формування ферментних мембран забезпечують досить високий та приблизно однаковий рівень їхньої чутливості до СГА. При розробці лабораторного прототипу біосенсора для визначення СГА в подальших дослідженнях було обрано іммобілізацію БуХЕ у білковій мембрані завдяки простішій процедурі іммобілізації в лабораторних умовах. Але для масового виробництва фотополімеризація є більш технологічним методом іммобілізації, оскільки у такому випадку виробництво перетворювачів, включаючи інтегральні схеми обробки даних та нанесення мембран, можна здійснювати в одному технологічному циклі.

Оскільки принцип роботи сенсора на основі іммобілізованої БуХЕ полягає у локальній зміні рН середовища, яка відбувається під час ферментативного процесу, то сигнал, що реєструється, очевидно, залежатиме від концентрації буферного розчину. При аналізі СГА було встановлено незалежність рівня інгібування від буферної ємності (рис. 4), а тому контроль буферної ємності при аналізі реальних зразків не є обов'язковим, як у випадку більшості раніше створених сенсорів на основі рН-ПТ (Arkhipova, 2002).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.4. Залежність рівня інгібування БуХЕ 2 мкМ б-чаконіном (1) та 5 мкМ б-чаконіном (2) від концентрації буферного розчину. Вимірювання проводились в калій-фосфатному буфері, рН 7,3

Ми проводили серію експериментів із вивчення механізму інгібування БуХЕ, іммобілізованої на поверхні рН-ПТ, соланіном та чаконіном. Використовуючи широковживаний у біохімічній практиці метод Діксона (рис.5), нами було встановлено, що СГА інгібують іммобілізовану БуХЕ конкурентно. Отримано непрямі докази конкурентного механізму інгібування, а саме: незалежність інгібування від часу інкубування та збільшення рівня інгібування при зменшенні концентрації субстрату - БуХХл. Згідно з (Nigg et al., 1996), незалежність рівня інгібування від часу інкубування, безпосередньо свідчить також про зворотність взаємодії між досліджуваними інгібіторами і БуХЕ. Ще одним доказом зворотності інгібування є також факт повного відновлення активності ферменту після відмивання мембран лише робочим буферним розчином без застосування додаткових реагентів. Отже, отримані експериментальні дані свідчать про те, що іммобілізована БуХЕ інгібується СГА конкурентно та зворотньо.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.5. Визначення механізму інгібування за методом Діксона Концентрація БуХХл: 0,5 мМ (1), 1 мМ (2), 2 мМ (3). Вимірювання проводились в 5 мМ калій-фосфатному буфері, рН 7,3

Як видно із наведених на рис.3 результатів, чутливість БуХЕ знаходиться в діапазоні 2-100 мкМ. Це повністю забезпечує аналіз картоплі на вміст СГА, але є недостатнім для визначення СГА у сироватці крові. Відомо, що ферменти залежно від джерела їхнього отримання відрізняються деякими кінетичними характеристиками та чутливістю до інгібіторів. Тому замість БуХЕ з сироватки коня як чутливий елемент сенсора ми використали БуХЕ з сироватки людини. Встановлено, що біосенсор на основі БуХЕ з сироватки людини був значно чутливішим до СГА порівняно з сенсором на базі БуХЕ з сироватки коня (порівняти рис.3 та рис.6), а лінійний динамічний діапазон визначення СГА становив 0,03-5 мкМ. Таким чином, заміна БуХЕ коня на БуХЕ людини дасть можливість аналізувати вміст СГА в сироватці крові та інших біологічних рідинах.

Загальновідомо, що фермент БуХЕ має порівняно низьку специфічність щодо різних типів інгібіторів, окрім СГА фермент суттєво інгібується фосфорорганічними пестицидами та іонами важких металів. Тому було проведено низку досліджень з вивчення можливості селективного визначення СГА картоплі за допомогою створеного потенціометричного бісенсора за наявності інших інгібіторів.

Рис.6. Інгібування БуХЕ людини -соланіном, -чаконіном та їхньою сумішшю. Вимірювання проводились в 5 мМ калій-фосфатному буфері, рН 7,3 біосенсор стероїдний глікоалкалоїд бутирилхолінестераза

Було проведено визначення концентрацій СГА на фоні деяких важких металів та пестицидів. Встановлено, що застосування етилендіамінтетраацетату (ЕДТА) (специфічний комплексон іонів важких металів) та фосфотриестерази (фермент, що здатний розщеплювати винятково фосфорорганічні пестициди) перешкоджає інгібуванню іммобілізованої БуХЕ ртуттю, свинцем (до концентрацій 500 мкМ) і параоксоном (до 100 мкМ), але не впливає на здатність СГА картоплі інгібувати фермент. Це дозволяє аналізувати досліджувані складні суміші на наявність СГА (рис.7).

Практичне використання біосенсорів лімітується їхньою стабільністю при роботі та зберіганні, тому в наступній серії експериментів ми вивчали ці характеристики розробленого біосенсора.

Слід зазначити, що для сенсорних систем на основі іммобілізованих біологічно активних молекул умовно розрізняють два види стабільності: операційну стабільність та стабільність при зберіганні. Ці два види стабільності якісно відрізняються між собою тим, що для дослідження стабільності при функціонуванні застосовується так званий квазібезперервний режим роботи (використання одного і того ж датчика для проведення аналізів щонайменше 10 разів на день протягом певного проміжку часу), а стабільність при зберіганні досліджується, використовуючи той самий датчик для аналізу періодично, зберігаючи його в проміжках за відповідних умов. Тест на операційну стабільність показав, що стабільні відгуки для створених біосенсорів суттєво не зменшувались впродовж принаймні 10 годин його безперервного використання.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.7. Вплив важких металів (Hg2+, Pb2+, Co2+) та параоксону на відгук біосенсора на 2 мкМ б-чаконін. Визначення здійснювали в 10 мМ трис-NO3 буфері у присутності 1 мМ ЕДТА. Біоселективна мембрана містила БуХЕ і фосфотриестеразу. Чаконін (1), Co2+ (2), Hg2++ Pb2+(3), Hg2++Pb2++Co2+(4), 10 мкМ параоксон + 100 мкМ (Hg2+,Pb2+) (5), 100 мкМ параоксон + 100 мкМ (Hg2+,Pb2+) (6), 10 мкМ параоксон + 250 мкМ (Hg2+,Pb2+) (7)

Нами було встановлено, що після двох тижнів роботи біосенсора у квазібезперервному режимі активність біоселективної мембрани зменшувалась на 30% у випадку іммобілізації БуХЕ у глутаровому альдегіді. При тривалому зберіганні (більше 1,5 місяця) біосенсорних приладів при температурі 4⁰С активність БуХЕ, іммобілізованої у глутаровому альдегіді, знижувалась на 40%.

Відгук біосенсора на субстрат та інгібітор мав високу відтворюваність, стандартне відхилення не перевищувало 5% (рис.8).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.8. Відтворюваність відгуку бутирилхолінестеразного сенсора при додаванні субстрату - 1 мМ БуХХ (1) та 10 мкМ б-чаконіну (2)

Порівняльний аналіз біосенсорного методу визначення СГА та класичного методу тонкошарової хроматографії. Як контрольний метод для аналізу СГА було використано класичний метод тонкошарової хроматографії (ТШХ).

Принциповою відмінністю хроматографічних методів від інших фізико-хімічних методів аналізу є можливість чіткого розділення близьких за властивостями речовин. Після розділення компонентів аналізованої суміші можна ідентифікувати окремі компоненти та кількісно визначати їхню концентрацію будь-якими хімічними, фізичними та фізико-хімічними методами. Для роздільного визначення соланіну та чаконіну в різних сортах картоплі було доцільним використати класичний метод на базі площинної адсорбційної хроматографії та відпрацювати умови визначення СГА за допомогою цього методу.

На прикладі чаконіну було отримано лінійну залежність оптичної інтенсивності плями від кількості чаконіну в межах 0,04-0,3 мкМ (рис.9). Як специфічний барвник на стероїди використовували хлорид сурми, при цьому для визначення соланіну чи чаконіну може бути використана одна й та ж сама калібрувальна крива.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.9. Калібрувальна крива для визначення СГА картоплі методом ТШХ

За допомогою методу ТШХ було протестовано 14 сортів картоплі, виведеної методом традиційної селекції співробітниками Інституту картоплярства Української академії аграрних наук, серед яких: ранні (Повінь, Серпанок, Бородянська рожева), середньоранні (Світанок київський, Водограй, Обрій, Купава, Забава), середньостиглі ( Слов'янка, Явір, Луговська) та середньопізні (Ракурс, Зарево, Промінь) врожаю 2003 року.

Паралельно було проаналізовано картоплю біосенсорним методом із використанням лабораторного прототипу потенціометричного біосенсора. Показано добру кореляцію даних, отриманих за допомогою біосенсорного методу та класичного методу ТШХ при визначенні СГА (рис.10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.10. Загальний вміст СГА у бульбах картоплі 14 сортів, визначений за допомогою біосенсорів та ТШХ

Застосування класичного методу ТШХ дало можливість порівняти вміст б-соланіну та б-чаконіну в досліджених сортах (рис.11). Оскільки результати демонструють добру кореляцію даних, то за допомогою біосенсора можна проводити швидкий попередній скринінг картоплі на вміст СГА, а при необхідності більш детального аналізу СГА визначати співвідношення соланіну та чаконіну за допомогою ТШХ. Порівняльний аналіз методом ТШХ вмісту б-соланіну та б-чаконіну показав, що вміст чаконіну у картоплі в більшості випадків переважає над вмістом соланіну, що узгоджується з науковими даними.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.11. Вміст б-соланіну та б- чаконіну у 14 сортах картоплі визначений методом ТШХ

Таким чином, розроблено лабораторний прототип біосенсора для експресного аналізу концентрацій СГА у реальних зразках, зокрема для оцінки якості різних сортів картоплі. Порівняння з класичним методом ТШХ показало добру кореляцію, в той же час перевагами біосенсорного методу є експресність, низька затратність та простота використання.

ВИСНОВКИ

Розроблено біосенсор на основі рН-чутливи польових транзисторів та іммобілізованої БуХЕ для експресного визначення концентрації СГА, що не потребує застосування дорогого обладнання, а аналіз може бути проведений за межами спеціалізованої лабораторії.

1.Створено експериментальну модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації на щурах та охарактеризовано деякі аспекти цієї інтоксикації. Показано, що інтоксикація супроводжується значним зниженням активностей холінестераз та ушкодженням клітинних мембран, яке обумовило вибір БуХЕ для розробки біосенсорів.

2.Встановлено, що іммобілізована БуХЕ інгібується соланіном та чаконіном зворотньо та конкурентно.

3.Розроблено лабораторний прототип біосенсора для визначення СГА з такими робочими характеристиками:

· Діапазон роботи 0,03-100 мкМ СГА;

· Стандартне відхилення не вище 5%;

· Операційна стабільність протягом 10 годин;

· Стабільність при зберіганні - 1,5 місяці.

4.Показано можливість адаптації аналітичних характеристик розроблених біосенсорів шляхом використання БуХЕ різного походження та варіюванням часу іммобілізації ферменту.

5.Виявлено, що додавання ЕДТА в комірку з аналізованою сумішшю та фосфотриестерази у біочутливу мембрану дозволяє селективно визначати СГА на тлі важких металів та фосфорорганічних пестицидів при аналізі складних сумішей.

6.Апробація розробленого біосенсора при аналізі соку різних сортів картоплі показала добру кореляцію даних із класичним методом ТШХ

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Korpan Y.I., Volotovsky V.V., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., Nazarenko E.A., El'skaya A.V., Soldatkin A.P. A novel enzyme biosensor for steroidal glycoalkaloids detection based on pH-sensitive field effect transistors // Bioelectrochemistry.-2002.-№55.-P. 9-11. Особистий внесок здобувача - вивчення шляхів ефективної іммобілізації бутирилхолінестерази на поверхні перетворювачів.

2.Назаренко Е.А., Кишко Т.О., Скрышевская И.В., Шандренко С.Г., Корпан Я.И., Дмитренко Н.П. Токсическое действие проростков картофеля на организм крыс // Современные проблемы токсикологии.-2004.-№4.-С.12-17. Особистий внесок здобувача - постановка субхронічного експерименту з глікоалкалоїдної інтоксикації на щурах, визначення активностей ацетилхолінестерази та бутирилхолінестерази, визначення впливу стероїдних глікоалкалоїдів in vitro на тимоцити.

3.Назаренко О.А., Солдаткін О.П., Сосовська І.В., Бенілова І.В., Корпан Я.І. Потенціометричний біосенсор для визначення глікоалкалоїдів картоплі: керована зміна аналітичних характеристик, порівняння з методом тонкошарової хроматографії // Біополімери і клітина.-2005.-Т.21, №3.-С. 275-282. Особистий внесок здобувача - проведення лабораторних досліджень щодо створення селективної мембрани до глікоалкалоїдів шляхом використання додаткових реагентів, визначення чутливості холінестераз різного походженння щодо стероїдних глікоалкалоїдів, підбір оптимальних умов проведення тонко-шарової хроматографії для визначення стероїдних глікоалкалоїдів та підготовка тексту до друку.

4.Назаренко Е.А., Скрышевская И.В, Корпан Я.И. Гликоалкалоиды картофеля: распространение, физико-химические свойства, токсичность и методы определения // Біополімери і клітина.-2002.-Т.18, №6.-С. 478-484. Особистий внесок здобувача - узагальнення та аналіз наукових даних, формулювання висновків та підготовка тексту до друку.

5.Korpan Y.I., Nazarenko E.A., Skryshevskaya I.V., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., El'skaya A.V. Potato glycoalkaloids: true safety or false sense of security? // Trends in Biotechnology.-2004.-Vol.22, №3.-P.147-151. Особистий внесок здобувача - узагальнення та аналіз наукових даних, формулювання висновків та підготовка тексту до друку.

6.Korpan Y., Arkhipova V., Nazarenko E., El'skaya A., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., Soldatkin A. Novel Electrochemical Biosensors for Steroidal Glycoalkaloids Detection Based on Butyrylcholinesterase // Abstr of 1-st Black Sea Basin Conf. On Analytical Chemistry.-Odessa (Ukraine).-2001.-P. 38-39. Особистий внесок здобувача - проведення експериментів з вибору ферментів, чутливих до стероїдних глікоалкалоїдів.

7.Arkhipova V.N., Dzyadevych S.V., Nazarenko E.A., Korpan Y.I., Soldatkin A.P., El'skaya A.V., Martelet C., Jaffrezic-Renault N. Development of potentiometric biosensors for detection of glycoalkaloids in potatoes and their application for studying the enzyme inhibition mechanisms // The 16^th European Conference on Solid-State Transducers.-Prague (Czech Republic).-2002.-P. 1155-1158. Особистий внесок здобувача - дослідження механізму інгібування іммобілізованої бутирилхолінестерази стероїдними глікоалкалоїдами, вивчення операційної стабільності та стабільності при збереженні біосенсорів.

8.Назаренко О.А., Корпан Я.І., Архипова В.М., Солдаткін О.П., Мартле К., Жафрезік-Рено Н. Застосування бутирилхолінестерази з метою створення потенціометричного сенсора для аналізу стероїдних глікоалкалоїдів у картоплі // Матеріали VIII Українського Біохімічного з'їзду, Чернівці (Україна).-2002.-Т.74, №4б.-C. -132. Особистий внесок здобувача - визначеня діапазону чутливості іммобілізованої бутирилхолінестерази до стероїдних глікоалкалоїдів та обробка експериментальних даних.

9.Скришевська І.В., Назаренко О.А. Кількісне роздільне визначення -соланіну та -чаконіну в картоплі уніфікованим методом тонкошарової хроматографії // Материалы 5-й Всеукр. науч. конф. молодых ученых гигиенистов, токсикологов, химиков-аналитиков.-Киев (Украина).-2003.-С. 109-110. Особистий внесок здобувача - підбір оптимальних умов проведення тонко-шарової хроматографії для визначення стероїдних глікоалкалоїдів, аналіз експериментальних даних, формулювання висновків.

10.Назаренко О.А., Скришевська І.В. Особливості спектрофотометричного визначення глікоалкалоїдів картоплі // Материалы 5-й Всеукр. Науч. Конф. Молодых ученых гигиенистов, токсикологов, химиков-аналитиков.-Киев (Украина).-2003.-С. 98-99. Особистий внесок здобувача - розробка схеми вимірювань стероїдних глікоалкалоїдів за допомогою спектрофотометра.

11.Arkhypova V., Dzyadevych S., Nazarenko E., Korpan Y., Soldatkin A., El'skaya A., Gravoueille J.-M., Martelet C., Jaffrezic-Renault N. Application of biosensors based on ENFETs for fast detection of total solanaceous glycoalkaloids in potatoes samples // The 17th Europian Conference on Solid-State Transducers.-Guimaraes (Portugal).-2003.-P. 592-593. Особистий внесок здобувача - проведення лабораторних досліджень з визначення залежності рівня інгібування іммобілізованої бутирилхзолнестерази від співвідношення соланіну та чаконіну, формулювання висновків.

12.Skryshevskaya I.V., Nazarenko E.A., Kishko T.O., Osipchuk A.A., Korpan Y.I., Dmitrenko N.P. Comparative analysis of alpha-solanine and alpha-chaconine content by thin-layer chromatography in potatoes breeded in Ukraine // Proc. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics dedicated to the 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine.-2003.-P. 214. Особистий внесок здобувача - проведення лабораторних досліджень з визначення стероїдних глікоалкалоїдів методом тонкошарової хроматографії, узагальнення та аналіз експериментальних даних, формулювання висновків.

13.Nazarenko E.A., Skryshevskaya I.V., Kishko T.O., Dmitrenko N.P., Soldatkin A.P., Korpan Y.I. Comparative evaluation of total glycoalkaloids content in potatoes detected by biosensor and thin-layer chromatography // Proc. Conference for Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics dedicated to the 30 anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine.-2003.-P. 183. Особистий внесок здобувача - проведення порівняльного аналізу методом тонкошарової хроматографії та за допомогою біосенсорів при визначенні стероїдних глікоалкалоїдів.

14.Назаренко О.А., Сосовська О.Ф., Корпан Я.І. Природні токсини картоплі - стероїдні глікоалкалоїди та методи їх визначення // Матеріали II З'їзду токсикологів України, Київ.-2004.-С. 102. Особистий внесок здобувача - визначення розробленими біосенсорами вмісту стероїдних глікоалкалоїдів у соку картоплі різних сортів.

15.Nazarenko E.A., Sosovs'ka O.P., Arkhypova V.N., Dzyadevych S.V., Korpan Y.I., El'skaya A.V., Gravoueille J.-M., Jaffrezic-Renault N., Martelet C., Soldatkin A.P. Comparative evaluation of total glycoalkaloids contents in potato breeded in Ukraine and France // MADICA.-Tunise (Tunis).-2004.-P. 59. Особистий внесок здобувача - проведення за допомогою розроблених біосенсорів порівняльного аналізу картоплі, що вирощується в Україні та Франції.

16.Benilova I.V., Nazarenko E.A., Kishko T.O., Korpan Y.I., Dmitrenko N.P. Cytotoxic and membrane-acting effects of glycoalkaloids on erythrocytes and thymocytes of rats // Abstr. 10^th International Congress of Toxicology.-Tampere (Finland).-2004.-P.312. Особистий внесок здобувача - проведення лабораторних досліджень з визначення токсичної дії стероїдних глікоалкалоїдів на мембрани клітин.

17.Arkhypova V.N., Dzyadevych S.V., Nazarenko E.A, Soldatkin A.P., El'skaya A.V., Martelet C., Jaffrezic-Renault N. Cholinesterase-based biosensor for glycoalkaloids analysis in potatoes and tomatoes // Book of abstracts of the VIII International Meeting on Cholinesterases.-Perugia (Italy).-2004.-P. 9. Особистий внесок здобувача - проведення лабораторних досліджень з визначення впливу стероїдних глікоалкаоїдів картоплі та томатів на іммобілізовані холінестерази.

18.Назаренко О.А., Корпан Я.І., Архипова В.М., Дзядевич С.В., Солдаткін О.П., Єльська Г.В. Розробка біосенсора на основі іммобілізованої бутирилхолінестерази та рН-чутливих польових транзисторів для аналізу стероїдних глікоалкалоїдів картоплі // Конференція-звіт з комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України „Дослідження у галузі сенсорних систем та технологій”, Київ (Україна).-2005.-С. 83. Особистий внесок здобувача - підбір оптимального часу іммобілізації бутирилхолінестерази на поверхні перетворювача для збільшення діапазону чутливості до стероїдних глікоалкалоїдів.

АНОТАЦІЯ

Назаренко О.А. Розробка біосенсора для визначення концентрацій стероїдних глікоалкалоїдів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено розробці потенціометричного біосенсора на основі іммобілізованої бутирилхолінестерази (БуХЕ) для кількісного аналізу стероїдних глікоалкалоїдів (СГА) у межах 0,03-100 мкМ.

Для підтвердження небезпеки споживання продуктів із високим рівнем СГА та обґрунтування необхідності створення біосенора створено експериментальну модель субхронічної глікоалкалоїдної інтоксикації на щурах.

Встановлено, що СГА інгібують іммобілізовану БуХЕ зворотньо та конкурентно. Запропоновано декілька шляхів цілеспрямованої зміни аналітичних характеристик розробленого біосенсора. Показано, що використання фосфотриестерази та етилендіамінтетраацетат дозволяє проводити селективне визначення СГА розробленим біосенсором у присутності іонів важких металів та пестицидів.

14 сортів картоплі було протестовано методом тонкошарової хроматографії та за допомогою розробленого біосенсора. Порівняльний аналіз двох методів показав добру кореляцію результатів.

Ключові слова: біосенсор, рН-чутливий польовий транзистор, стероїдні глікоалкалоїди, бутирилхолінестераза.

АННОТАЦИЯ

Назаренко О.А. Разработка биосенсора для определения концентраций стероидных гликоалкалоидов.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20-биотехнология.- Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2005.

Стероидные гликоалкалоиды (СГА) - природные токсины, основным источником которых являются растения семейства Пасленовых, в том числе картофель. Фракция СГА обычного картофеля Solanum tuberosum на 95% состоит из б-соланина и б-чаконина. Употребление картофеля с высоким содержанием СГА приводит к отравлениям, иногда с летальным исходом. Известно, что интоксикация СГА приводит также к отдаленным негативным последствиям, таким как нарушение репродуктивной функции. Кроме этого, СГА обладают генотоксичными и канцерогенными свойствами.

Одним из многообещающих подходов для определения разнообразных токсинов является использование аналитических приборов - биосенсоров. Интерес к биосенсорам вызван их потенциальными преимуществами в сравнении с традиционными методами биохимического анализа: относительной дешевизне и простоте использования при высокой чувствительности и специфичности.

Целью диссертации была разработка биосенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора (рН-ПТ) в качестве преобразователя и иммобилизованной бутирилхолинестеразы (БуХЕ) в качестве чувствительного элемента для количественного определения СГА в модельных и реальных образцах.

Для подтверждения токсических свойств СГА и обоснования необходимости разработки биосенсора создана экспериментальная модель субхронической гликоалкалоидной интоксикации на крысах. Исследованы общие показатели влияния токсичности проростков картофеля на животных опытной группы (22 животных) по сравнению с животными контрольной группы (8 животных). Проведены биохимические исследования активностей следующих ферментов: аланинаминотрансферазной, аспартатаминотрансферазной и бутирилхолинестеразной активностей сыворотки крови, перекисного окисления липидов печени, ацетилхолинестеразной и 5'-нуклеотидазной активностей теней эритроцитов. Исследовано мембранотропное действие СГА.

Наряду с некоторыми клиническими проявлениями общетоксической интоксикации, таких как диарея и адинамия, отмечена неизменность массы животных и массовых коэффициентов органов, аланин- и аспартатаминотрансферазных активностей, что, вероятно, связано с незначительной дозой введенных с проростками СГА (1/20 от LD₅₀). Вместе с тем показано падение почти вдвое по сравнению с контрольной группой животных активностей холинестераз, что указывает на ослабление детоксикационной функции печени и угнетение передачи нервных импульсов. На примере тимоцитов показано цитотоксическое действие СГА по уменьшению жизнеспособности клеток тимуса при инкубировании и выходу белка в бесклеточную фракцию в результате разрушения клеточных мембран. Продемонстрировано увеличение 5'-нуклеотидазной активности теней эритроцитов, что указывает на мембранотропное действие СГА. На основании полученных результатов биохимических исследований на крысах сделан вывод о необходимости контроля этих соединений в пищевых продуктах.

Для количественного определения СГА разработан биосенсор на основе рН-ПТ и иммобилизированной БуХЕ, подобраны оптимальные условия проведения анализов этих токсинов. Предложены два варианта иммобилизации БуХЕ на поверхности рН-ПТ: формированием белковой мембраны в парах глутарового альдегида и фотополимерацией с использованием PVA/SbQ. Оба способа формирования мембраны обеспечивают достаточно высокий уровень чувствительности к СГА. В лабораторных условиях использовали иммобилизацию БуХЕ в белковой мембране в связи с более простой процедурой иммобилизации фермента. В тоже время, при массовом производстве приборов более подходящим методом является фотополимеризация, поскольку изготовление преобразователей и нанесение мембран можно проводить в одном технологическом цикле.

Показана возможность варьирования пределов чувствительности к СГА используя БуХЕ различного происхождения. Диапазон чувствительности разработанного биосенсора составляет 2-100 мкМ и 0,03-5 мкМ при использовании БуХЕ сыворотки коня и человека, соответственно. Чувствительности биосенсора с иммобилизованной БуХЕ сыворотки человека достаточно для определения СГА в крови.

Для селективного определения СГА предложено использование фосфотриэстеразы (фермент, расщепляющий фосфорорганические пестициды) и этилендиаминтетраацетата (специфический комплексон ионов тяжелых металлов), которые препятствуют ингибированию иммобилизованной БуХЕ ртутью, свинцом и параоксаном и не влияют на способность СГА картофеля ингибировать фермент.

Проведена серия экспериментов по определению механизма ингибирования БуХЕ, иммобилизованной на поверхности рН-ПТ, соланином и чаконином. Установлено, что СГА ингибируют иммобилизованную БуХЕ конкурентно и обратимо. Разработанный биосенсор характеризуется хорошей операционной стабильностью (10 часов непрерывной работы), стабильностью при хранении (более 1,5 месяца) и предназначен для многократного использования.

Проведен сравнительный анализ данных, полученных при определении СГА с помощью биосенсора и методом тонкослойной хроматографии, в 14 различных сортах картофеля, показана хорошая корреляция результатов.

Разработанный биосенсор может быть успешно использован для определения общего содержания СГА в образцах пищевых продуктов. Преимуществами биосенсорного метода в сравнении с общепринятыми методами определения является его экспрессность, дешевизна и простота использования.

Ключевые слова: биосенсор, рН-чувствительный полевой транзистор, стероидные гликоалкалоиды, бутирилхолинестераза.

SUMMARY

Nazarenko O.A. Development of biosensor for determination of steroid glycoalcaloids.-Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (Ph.D.) degree in Biology by speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2005.

The thesis is devoted to the development of butyryl cholinesterase-based potentiometric sensor for quantitative analysis of steroid glycoalcaloids (SGA) in the range 0.03-100 мМ.

To confirm the risk of food consumption with high level of SGA and the necessity of elaborating biosensor to control their concentration an experimental model of subchronic SGA intoxication of rats has been developed.

The SGA inhibition effect on immobilized BuChE proved to be reversible and competitive. Several approaches to the directed variation in analytical characteristics of the developed biosensor have been proposed. Utilization of phosphotriesterase and ethylendiaminetetracetate is shown to enable the specific SGA detection in the presence of heavy metal ions and pesticides.

14 potato varieties cultivated in Ukraine have been tested by thin-layer chromatography and the biosensor developed. The comparative analysis of two methods has shown good correlation of the results.

Key words: biosensor, pH-sensitive field effect transistor, solanaceous glycoalkaloids, butyryl cholinesterase.

Размещено на Allbest.ru