Зміна рівня нервово-специфічних білків у мозку щурів під впливом експериментального соматогенного післяопераційного болю та фармакокорекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

УДК 612.82-884 + 577.112

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент Ушакова Галина Олександрівна, Дніпропетровський національний університет, доцент кафедри біофізики та біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович, головний науковий співробітник відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України;

доктор біологічних наук, професор Шевцова Алла Іванівна професор кафедри біохімії та загальної хімії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії.

Захист відбудеться 4 квітня 2005 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат дисертації розіслано 3 березня 2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

Актуальність теми. Феномен болю цікавив людство ще з античних часів. На сьогоднішній день особливої актуальності набувають дослідження саме центральних механізмів болю.

Патофізіологія соматогенного болю це ряд послідовних подій, результатом яких є посилення ноцицептивного сигналу з периферії та сенситизація центральних аферентів (Лиманский Ю.П., 1990). На хімічному рівні провідна роль у передачі ноцицептивного сигналу відводиться рецепторам збуджуючих амінокислот, особливо глутаматним, а також Са²⁺ (Костюк О.П. та ін., 2001). Структура та особливості функціонування глутаматних рецепторів добре описані у роботах Grumet T.I., 1994 та багатьох інших дослідників. Оскільки рецептори є мембранними структурами, а робота синапсу залежить не тільки від активності каналів та рецепторів, а й, насамперед, від мікрооточення синаптичного бутону та стану мембран, що його утворюють, то важливо було прослідити участь білків, що входять до складу цих структур, у процесах ноцицепції.

Молекула адгезії нервових клітин NCAM відіграє важливу роль у синаптичній пластичності не тільки ембріонального, але і дорослого мозку (Beresin V., Bock Е., 2000). Доведена участь цього білку у таких важливих процесах як міграція, диференціація нервових клітин та відростання нейритів. Завдяки своїм адгезивним властивостям NCAM здатний регулювати розмір синаптичної щілини, що, в свою чергу, є одним з чинників, який визначає ефективність передачі нервового імпульсу (Kiselyov V.V. et al., 2003). Останнім часом також приділяється велика увага здатності NCAM (зокрема його розчинних форм) впливати на процеси пластичності через запуск каскадів внутрішньоклітинних подій (Soroka V. et al., 2003).

У роботах останніх років астрогліальний Са²⁺-зв'язуючий білок S-100 визначається як модулятор нейрональної пластичності та сили сигналу (Nishiyama H., 2003). Завдяки здатності S-100 регулювати енергетичний гомеостаз нервових клітини він втягнений у процеси модуляції збудливості, мембранного потенціалу та синаптичної трансмісії, які мають особливе значення у ході набуття ноцицептивної сенситизації (Melani R. et al., 1999).

Морфологія синаптичного бутону у значній мірі залежить від морфології астроцитів, що його охоплюють. Однією з молекул, що мають вагомий внесок у структурну організацію астрогліальних клітин, є ГФКБ (гліальний фібрилярний кислий білок). Хоча структура та функції цього білку досліджені не достатньо, доведена його участь у формуванні цитоскелету астроцитів (Menet V. et al., 2003).

Важливе значення для формування синаптичного контакту та його пластичних змін у ході функціонування має міжклітинний матрикс і, зокрема, його глікозаміноглікан-зв'язуючі компоненти. Сьогодні велика увага приділяється не тільки здатності цих агентів регулювати міжклітинні взаємодії, а також їх впливу на структурну організацію самої клітини. Завдяки взаємодії зі специфічними рецепторами на клітинній поверхні протеоглікани міжклітинного матриксу впливають на організацію цитоскелету клітини та її поведінку (Schachner M., 2003).

Незважаючи на досить докладну дослідженість згаданих вище компонентів нервової тканини, залишається невідомою їх роль у процесах передачі та аналізу ноцицептивного сигналу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках договору про спільну діяльність із Міжнародним центром молекулярної фізіології НАН України (№ 1167, 2001-2003 рр.) за темою “Дослідження механізмів формування неоднорідних розподілів мембранних макромолекул та їх ролі у морфо- та електрогенезі нейронів” та договору про науково-технічне співробітництво між ДНУ та Дніпропетровською державною медакадемією (№ 1194, 2002-2004 рр.) за темою “Дослідження центральних механізмів болю та впливу на них різноманітних типів анальгетиків та анестетиків”. Мета та задачі дослідження. Метою роботи було дослідження зміни рівня окремих нервовоспецифічних білків та загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків міжклітинного матриксу у мозку щурів під впливом експериментального соматогенного післяопераційного болю та фармакокорекції. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1) викликати стан експериментального соматогенного післяопераційного болю;

2) підтвердити наявність післяопераційної гіпералгезії та відсутність інфекційного запалення;

3) в умовах післяопераційного болю в мозку та сироватці крові щурів визначити:

- активність глікозидаз;

- рівень розчинної та мембранної форм N-CAM;

- вміст S-100 та ГФКБ;

- загальну гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючу активність білків мозку;

4) дослідити вплив агоністів та антагоністів N-метил-D-аспартат (НМДА) рецепторів на вміст вказаних білків у післяопераційний термін;

5) визначити вплив нестероїдного протизапального препарату на вміст нервовоспецифічних білків в умовах гіпералгезії;

6) провести кореляційний аналіз та аналіз відсоткового вмісту різних форм вказаних білків, специфічних для нейронів та астроглії й глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків міжклітинного матриксу в умовах післяопераційного болю та впливу визначених препаратів.

Об'єкт дослідження. Біохімічні механізми передачі та аналізу ноцицептивної інформації.

Предмет дослідження. Вміст білків N-CAM, S-100, ГФКБ та глюкозаміноглікан-зв'язуюча здатність компонентів міжклітинного матриксу мозку щурів.

Методи дослідження. У роботі використовували фракціонування тканини мозку методом ультрацентрифугування, методи вуглевод-ферментного та імуноферментного кількісного твердофазного аналізу, електрофорез у ПААГ з ДСН, імуноблотинг, визначення активності глікозидаз, тестування фізіологічної активності у відкритому полі.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше наводяться дані про вплив соматогенного післяопераційного болю, а також агоністів та антагоністів глутаматних рецепторів на рівень нейрональної молекули клітинної адгезії, білків S-100, ГФКБ, а також загальної гепарансульфат-зв'язуючої та загальної гіалуронат-зв'язуючої активності білків таламусу/гіпоталамусу та довгастого мозку щурів. Встановлено, що під впливом післяопераційної гіпералгезії протягом першої доби відбувається вірогідне (від 43 до 119%) підвищення рівня адгезивних та астрогліальних білків та незначні (10-27%) різноспрямовані зміни глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків мозку щурів. Для відносно раннього післяопераційного періоду характерне підвищення рівня розчинних форм білків S-100 та N-CAM у сироватці крові щурів. Показано, що на сьому добу післяопераційного терміну рівень досліджуваних білків наближається до показників норми.

Отримані в роботі дані істотно доповнюють сучасні уявлення про центральні механізми ноцицепції. Встановлені закономірності змін рівню адгезивних, астрогліальних білків та глікозаміноглікан-зв'язуючих компонентів міжклітинного матриксу протягом післяопераційного періоду мають загальнотеоретичне значення для оцінки ролі даних компонентів нервової тканини у процесах ноцицепції. Аналіз вказаного відсоткового вмісту дозволяє зробити припущення про участь кожного з компонентів у відповіді довгастого мозку та таламусу/гіпоталамусу на соматогенні больові стимули.

Практичне значення отриманих результатів. Дані про вплив нестероїдного протизапального препарату Кетанов на рівень досліджуваних білків у мозку щурів в умовах післяопераційної гіпералгезії доповнюють його фармакодинамічні характеристики та мають значення для вибору схеми застосування препарату у лікарській практиці. Уперше показано, що застосування нестероїдного протизапального препарату Кетанов запобігає змінам вмісту білку S-100, при одночасному підвищенні рівня гіалуронат-зв'язуючої здатності у білків (на 76-128%) та незначному підвищенні вмісту інших досліджуваних компонентів (N-CAM - на 37-41% та ГФКБ - на 74%) у мозку оперованих щурів. Мікрометод визначення активності глікозидаз у сироватці крові можна застосувати для контролю післяопераційного стану.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз даних літератури, проведені експериментальні дослідження та статистична обробка отриманих результатів. Розробка методології та обговорення результатів проведені сумісно з науковим керівником. Консультативна допомога у проведенні експерименту (оперативне втручання) надана Кобеляцьким Ю.Ю.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були апробовані на щорічних наукових підсумкових конференціях Дніпропетровського національного університету (Дніпропетровськ, 2000-2003), Міжнародній науково-практичній конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини” (Тернопіль, 2004), 29^th Meeting of FEBS (Варшава, Польща, 2004), FENS/IBRO European Pain School 2003 “Chronic Pain a Disease: Novel Scientific Concepts” (Сьена, Італія, 2003), VII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), 10^th World Congress on Pain (Сан-Дієго, Каліфорнія, США, 2002), International summer workshop “Pharmacology of the synaptic transmission in the nervous system” (Київ, 2002), FEBS Advanced Course “Glycoconjugate: Versatile structures - intriguing functions” (Дубровник, Хорватія, 2001), ISN/ASN Joint Meeting (Буенос Айрес, Аргентина, 2001), Міжнародній науковій конференції студентів і молодих вчених (Дніпропетровськ, 2001), ІІ конференції Українського товариства нейронаук, присвяченій 70-річчю кафедри фізіології ДонДМУ ім. М.Горького (Донецьк, 2001).

Публікації. Результати досліджень подані у 5 статтях та 9 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних та закордонних журналах та матеріалах з'їздів й конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, обговорення отриманих результатів та висновки. Робота ілюстрована 8 таблицями та 43 рисунками. Перелік використаної літератури включає 194 найменування цитованої літератури.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури представлені сучасні уявлення про механізми проведення та аналізу ноцицептивного сигналу. Представлені дані щодо властивостей та функцій окремих нервовоспецифічних білків, а також їх участі у процесах синаптичної пластичності.

Експериментальну частину роботи було проведено на щурах лінії Wistar 4 місячного віку (98 самців). Тварини знаходилися в стандартних умовах із циклічністю доби: світло - 12 год., ніч - 12 год. Для досліджень використовували мозок та сироватку крові щурів. Декапітацію тварин проводили під швидким ефірним наркозом.

Дослідження були проведені з використанням хімічно чистих реагентів фірм Sigma (США), Serva (США), Fluka (Швейцарія), ANAWA (Німеччина), Ranbaxy (Індія), Medix Biochemica (Фінляндія), Реагент (Дніпропетровськ, Україна).

Кількісне визначення нервовоспецифічних білків у фракціях тканини мозку та сироватці крові проводили згідно з стандартними методиками конкурентного та неконкурентного непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (Нго Т.Т., Ленхофф Г., 1988), з використанням моноспецифічних поліклональних антитіл до N-CAM, S-100 та ГФКБ, відповідно, стандартних білків та антитіл до IgG кролів, мічених пероксидазою хрону.

Для визначення загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуючої активності білків був використаний твердофазний вуглевод-ферментний аналіз (Dolzhenko M.I. et al., 1994). Цей метод є модифікацією твердофазного імуноферментного аналізу. Його особливість полягає у використанні кон'югату, що складається з гепарину (гіалуронової кислоти), що кон'югований з пероксидазою хрону. Кількісна оцінка глікозаміноглікан-зв'язуючої активності білків у пробі визначалась, як відношення кількості гепарану (гіалуронової кислоти), що зв'язався із сорбованими білками проби, до кількості загального білку у даній пробі (нг зв'яз. ГП (ГК)/мг ЗБ).

Фракції білків були отримані за допомогою послідовної екстракції з тканини головного мозку в буфері А (трис-НCl - 25 мМ; рН 7,4; ЕДТО - 1 мМ; в-меркаптоетанол - 2 мМ; ФМСФ - 0,2 мМ; мертіолят - 0,01 %) - фракція розчинних білків; у буфері А, що містив 2% тритон Х-100 - фракція мембранних білків; у буфері А, що містив 4 М сечовини - фракція цитоскелетних/екстацелюлярних білків. Кількість загального білку визначали за методом Бредфорд (Bradford M., 1985).

Електрофорез у поліакриламідному гелі з ДСН проводили відповідно до методики, яка була запропонована Леммлі (Lemmli U.K., 1970). По завершенні електрофорезу гель фарбували іонами срібла за методикою Мерріл (Merril C.R., 1986).

Імуноблотинг проводився згідно методики Стотт (Stott D.I., 1989).

Активності глікозидаз визначали з використанням відповідних субстратів: 2 мМ розчинів 2-нітрофеніл-N-ацетил--глюкозамініду, 2-нітрофеніл--D-галактопіранозиду та 2-нітрофеніл--глюкопіранозиду (Sigma) на 50 мМ ацетатному буфері рН 5,4.

Дослідження фізіологічної активності щурів проводили за допомогою тестування у відкритому полі (Буреш Я. та ін., 1991).

Модель експериментального соматогенного післяопераційного болю була створена за модифікацією моделі Бреннана та співавторів (Brennan T.J. et al., 1996).

Для статистичної обробки результатів використовували критерій вірогідності Ст'юдента (t) та Манн-Уітні (U). Вірогідними вважали результати, якщо р<0,05. Був також проведений кореляційний аналіз отриманих результатів з використанням програми “Excel”.

Перевірка адекватності експериментальної моделі післяопераційного соматогенного болю, створеної за модифікацією моделі Бреннана. З метою підтвердження наявності гіпералгезії у щурів у післяопераційний період необхідно було прослідити динаміку поведінкових реакцій протягом семи днів для чого використовували тестування у “відкритому полі”.

Результати дослідження фізіологічної активності першої групи щурів (інтактні, не оперовані) продемонстрували відсутність вірогідних змін усіх показників протягом семи діб післяопераційного періоду. Можна виділити деякі коливання локомоторної активності, але ці зміни теж не були достовірними (табл. 1).

Таблиця 1 Результати тестування у відкритому полі інтактних не оперованих щурів (n = 7-8)

Тестування у відкритому полі оперованих (без фармакокорекції) щурів виявило у них значні зміни фізіологічної активності. Друга година післяопераційного періоду характеризується достовірним зниженням всіх досліджуваних показників: локомоторна активність на 37%, дослідницька активність на 64%, тривалість грумінгу на 62%, кількість актів дефекації на 82%, порівняно з початковою. На 24 год. після операції спостерігалося підвищення рівня всіх досліджуваних показників, однак, якщо показники емоційного стану виходили на нормальний рівень, то локомоторна та дослідницька активність залишалася достовірно нижчими порівняно з вихідними значеннями, на 31% та 48%, відповідно. Протягом наступних 6 діб рівень майже всіх вказаних показників стабілізувався але на сьому післяопераційну добу локомоторна активність ще була нижче від нормального рівня на 60%, дослідницька активність - на 64%, тривалість грумінгу - на 34%. Представлені дані свідчать про наявність гіпералгезії протягом раннього післяопераційного періоду та відсутність хронічного болю протягом відносно пізнього післяопераційного терміну.

З метою виключення гострого чи хронічного запального процесу в післяопераційний період ми перевірили активність глікозидаз (-глюкозидази, -галактозидази та N-ацетилглюкозамінідази) у сироватці крові оперованих щурів. Результати проведеного аналізу вказують на те, що питома активність глікозидаз у сироватці крові щурів не зазнала вірогідних змін на 24 год. після операції (табл. 2), що свідчить про відсутність інфекційного запалення у оперованих щурів.

Таблиця 2 Питома активність ферментів у сироватці крові щурів через 24 години після операції (МО/мг ЗБ, n=7-8)

Представлені вище результати підтверджують адекватність експериментальної моделі післяопераційного соматогенного болю, створеної за модифікацією моделі Бреннана.

Зміна концентрації нейрональних молекул клітинної адгезії під час гіпералгезії. Вплив гіпералгезії призвів до значних змін вмісту як розчинної так і мембранної форм NCAM у довгастому мозку та таламусі/гіпоталамусі щурів.

На 24 год. післяопераційного періоду у довгастому мозку щурів спостерігається значне підвищення вмісту розчинної форми NCAM на 119% і мембранної форми NCAM на 77% у порівнянні з контролем (тут і далі контролем вважати першу групу щурів, які не були прооперовані і не отримали жодного з препаратів). Відомо, що підвищення вмісту розчинної форми NCAM є наслідком активації процесів протеолізу, а на функціональному рівні пов'язане з необхідністю підвищення пулу NCAM, як сигнальної молекули. У таламусі/гіпоталамусі вплив гіпералгезії призвів до зниження вмісту розчинної форми та підвищення вмісту мембранної форми NCAM, відповідно на 27% та 43%. Зміни такого характеру можуть свідчити про перерозподіл у таламусі/гіпоталамусі загальної кількості NCAM між розчинною та мембранною формами на рахунок мембранної, яка бере участь у формуванні адгезивних взаємодій клітина-клітина та клітина-матрикс.

Одноразове введення агоністу НМДА рецепторів глутамату у дозі 1 мг/кг маси тіла викликало аналогічні зміни вмісту як розчинної так і мембранної форми NCAM у довгастому мозку та таламусі/гіпоталамусі інтактних щурів. Такі результати підтверджують провідну роль глутамату у процесах передачі ноцицептивного сигналу не тільки на рівні периферичної, але й на рівні центральної нервової системи. Вплив препарату на фоні оперативного втручання посилив описані зміни, що також свідчить на користь висловленого припущення. Однак, аналіз відсоткового вмісту NCAM в нормі, за умов дії післяопераційної гіпералгезії та/або глутамату вказує, на те, що механізм глутаматної нейротрансмісії, хоча і є основним у формуванні ноцицептивного сигналу, однак не тільки він визначає наслідки болю.

Вплив неконкурентного антагоніста НМДА рецепторів МК-801, введеного у дозі 0,5 мг/кг маси тіла, не викликав вірогідних змін вмісту мембранної форми NCAM, як у довгастому мозку так і у таламусі/гіпоталамусі, а також запобігав змінам вмісту даної форми білку за умов дії післяопераційної гіпералгезії. Проте спостерігалося підвищення на 174% вмісту розчинної форми NCAM у довгастому мозку, а за умов дії післяопераційного болю - на 120%. У таламусі/гіпоталамусі вплив МК-801 призвів до зниження вмісту розчинної форми на 67%, сумісна дія препарату та операції викликала зниження рівня даної форми білку на 53%. Ми припускаємо, що завдяки дії МК-801 негативні наслідки гіпералгезії були значно зменшені: торкалися лише процесів трансдукції сигналу (у яких бере участь розчинна форма NCAM), тоді як адгезивні процеси (за які відповідає мембранна форма NCAM) залишились без змін, що підтверджується також відсутністю змін відсоткового вмісту NCAM у мозку щурів в результаті впливу МК-801.

Отримані дані вказують на те, що підвищення вмісту мембранної форми NCAM, яке спостерігається під впливом розглянутих вище чинників, відбувається за рахунок високомолекулярних форм N-CAM 180 та 140 кДа, особливо у тварин яким вводили глутамат. Роботи E. Bock та співробітників її лабораторії (2003, 2004 рр.) доводять важливість саме цих форм білку у формуванні та пластичності нейрональних контактів.

У сироватці крові щурів, протягом раннього післяопераційного періоду спостерігалося підвищення вмісту розчинної форми NCAM.

Вплив операції призвів до підвищення вмісту даного білку на 40%, введення глутамату - на 30%, дія глутамату на фоні операції - на 19%. Введення ж МК-801 оперованим щурам викликало зниження вмісту розчинного NCAM на 27%, проти контрольного рівня. Виявлення підвищеного вмісту розчинної форми NCAM у сироватці крові щурів може свідчити про послаблення гематоенцефалічного бар'єру, як наслідок впливу після операційного болю та глутамату.

Реакція астрогліальних білків на післяопераційний біль та фармакокорекцію. Влив післяопераційної гіпералгезії призвів до змін вмісту астрогліальних білків S-100в та ГФКБ. На 24 год. післяопераційного періоду спостерігалося підвищення вмісту S-100в у довгастому мозку на 86%, у таламусі/гіпоталамусі на 52%.

Введення глутамату викликало підвищення вмісту S-100в лише у довгастому мозку. Дія даного препарату на фоні оперативного втручання призвела до значного підвищення вмісту S-100в у обох відділах мозку: у довгастому мозку на 174%, у таламусі/гіпоталамусі на 90%, порівняно з контролем. Ми припускаємо, що рівень Са²⁺-звязуючого білку S-100в безпосередньо пов'язаний з силою збудження, викликаного дію болю та/або глутамату. Дані процеси реалізуються за безпосередньою участю такого вторинного посередника, як Са²⁺ що відіграє важливу роль у формуванні та передачі ноцицептивного сигналу (Кришталь А.П., 2000). Дія МК-801 протягом 24 год. викликала зміни вмісту S-100в лише у довгастому мозку. У не оперованих тварин вміст даного білку був вищим від контрольного рівня на 48%, у оперованих - на 65%. Отримані дані не дають відповіді на питання, чому блокування іонних каналів, які є частиною НМДА рецепторів не запобігає підвищенню вмісту S-100в у довгастому мозку. Можна лише припустити, що рівень внутрішньоклітинного Са²⁺ (який є причиною підвищення вмісту S-100в), змінюється завдяки роботі інших механізмів, наприклад, за участю металопротеаз або NK рецепторів. На сьому добу післяопераційного періоду вміст S-100в у досліджуваних відділах мозку оперованих тварин та тих, що отримали глутамат наближався до контрольного рівня. Вміст даного білку у таламусі/гіпоталамусі щурів, що отримали глутамат за 5 хв. до операції, на сьому добу післяопераційного терміну залишався вищим від норми на 138%. Аналіз відсоткового вмісту досліджуваних білків протягом семи діб експерименту виявляє цікаву залежність: чим сильнішою була дія збуджуючих факторів (гіпералгезія та/або глутамат), тим вищі значення відсоткового вмісту S-100в на першу добу та NCAM на сьому післяопераційного періоду.

На даному етапі спостережень виявлені такі наслідки впливу МК-801: у не оперованих щурів у довгастому мозку вміст S-100в був нижчим від контрольного рівня на 78%, у таламусі/гіпоталамусі - вищий на 93%, у оперованих щурів у довгастому мозку нижчий на 45%, у таламусі/гіпоталамусі - вищий на 91%, що, ймовірно, є наслідком специфічної дії даного препарату. Таке припущення також підкріплюється тим фактом, що відсотковий вміст досліджуваних білків у тварин, які були прооперовані після отримання МК-801, на 7 добу після операції практично не відрізняється від контрольного.

Вплив експериментального післяопераційного соматогенного болю та фармакокорекції викликав значні зміни вмісту розчинної форми S-100в у сироватці крові щурів. Наявність операційного болю супроводжувалася значним на 177% підвищенням вмісту даного білку на 24 год. після операції. Дія глутамату призвела до підвищення рівня S-100в на 165%, а у оперованих щурі, які отримали глутамат - на 168%. Введення МК-801 викликало підвищення вмісту S-100в у сироватці крові щурів на 150%, а у оперованих тварин - на 151%. Такі результати підтверджують висловлене вище припущення про послаблення проникливості гематоенцефалічного бар'єру в результаті впливу післяопераційного болю. Необхідно відзначити, що на 7 добу післяопераційного періоду вміст S-100в у сироватці крові оперованих щурів все ще залишався вищим від контрольного рівня на 81%. Вплив фармпрепаратів не викликав таких довготривалих змін. В ході роботи було встановлено, що підвищення вмісту ГФКБ пов'язане з перебудовою цитоскелету астроцитів, викликаного активацією роботи глії внаслідок впливу післяопераційного болю та дії фармпрепаратів. Вплив післяопераційної гіпералгезії протягом 24 год. спричинив підвищення вмісту філаментної форми білку ГФКБ: у довгастому мозку на 43% у таламусі/гіпоталамусі на 17%. Введення глутамату викликало аналогічні зміни - підвищення вмісту ГФКБ у довгастому мозку та таламусі/гіпоталамусі. Дія глутамату на фоні операції посилила вплив останньої. Введення МК-801 призвело до незначних змін вмісту даного білку лише у довгастому мозку - підвищення проти контрольного рівня склало 34%, як у не оперованих так і у оперованих щурів.

На сьому добу післяопераційного періоду було виявлено зміни вмісту філаментної форми ГФКБ лише у довгастому мозку щурів. Тривала дія післяопераційної гіпералгезії не викликала вірогідних змін вмісту даного білку. Сумісна дія даних факторів призвела до зниження вмісту філаментної форми ГФКБ на 60%. Введення МК-801 призвело до аналогічних змін. Цікавим є той факт, що на сьому добу післяопераційного періоду у мозку та сироватці крові щурів визначалася крім філаментної форми ГФКБ, також і розчинна. Що, ймовірно, є наслідком дії Са²⁺-залежного кальпаїну ІІ, та викликане необхідністю подальшої структурної перебудови цитоскелету астроцитів й участі їх у процесах пластичності.

Рівень загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків мозку щурів під час післяопераційної гіпералгезії та фармакокорекції. Вплив експериментального соматогенного післяопераційного болю призвів до змін загальної гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язучої здатності білків мозку щурів. На 24 год. після операції виявлено зниження гепарансульфат-зв'язуючої здатності (ГпЗАБ) розчинних білків довгастого мозку на 11%, таламусу/ гіпоталамусу на 19%, цитоскелетних білків таламусу/гіпоталамусу на 10%.

Введення глутамату та його дія на фоні оперативного втручання призвели до аналогічних за спрямованістю, але дещо більш виражених (до 24%) змін ГпЗАБ у досліджуваних відділах мозку. Дія антагоніста НМДА рецепторів МК-801 не викликала вірогідних змін даного показника. На сьому добу післяопераційного періоду будь-яких вірогідних змін ГпЗАБ у мозку щурів усіх дослідних груп не було виявлено. Тому, можна припустити, що такі незначні коливання носять адаптаційний характер.

Зміни гіалуронат-зв'язуючої здатності білків (ГіЗАБ) на 24 год. післяопераційного періоду спостерігалися лише у довгастому мозку. Так вплив післяопераційної гіпералгезії призвів до зниження ГіЗАБ у розчинній фракції білків на 28% та до одночасного підвищення у цитоскелетній фракції на 27%, ймовірно, такі зміни є наслідком перерозподілу пулу гіалуронат-зв'язуючих білків з розчинного у цитоскелетний. Введення глутамату та його сумісна з операцією дія спричинила аналогічні зміни ГіЗАБ (у межах 30-41%). Дія МК-801 викликала зниження ГіЗАБ розчинних білків довгастого мозку на 23%, на фоні оперативного втручання - на 18%. Як зазначалося вище, дані зміни можуть мати пристосувальний характер.

На сьому добу післяопераційного періоду гіалуронат-зв'язуюча здатність білків мозку щурів усіх дослідних груп вірогідно не відрізнялася від норми.

Вплив препарату Кетанов на рівень нервовоспецифічних білків за умов дії післяопераційної гіпералгезії. Нестероїдний протизапальний препарат Кетанов запобігає значним змінам вмісту нервовоспецифічних білків та має власну специфічну дію. Введення Кетанова у дозі 0,5 мг/кг маси тіла щурів викликало підвищення вмісту розчинної форми білку NCAM у довгастому мозку на 71%, зниження даної форми білку у таламусі/гіпоталамусі на 37%. У тварин яким вводили препарат за 5 хв. до операції на 24 год. післяопераційного періоду у довгастому мозку вміст розчинної форми NCAM був вищим від норми на 152%, вміст мембранної форми вірогідно не відрізнявся від такого у не оперованих щурів; у таламусі/гіпоталамусі вміст розчинної форми був нижчим від норми на 37%, вміст мембранної форми вищим від норми на 102%, що на 41% вище ніж рівень відповідного показника у оперованих щурів, які не отримали Кетанов.

Дія даного препарату викликала зміни вмісту розчинної форми NCAM у сироватці крові щурі. У не оперованих тварин даний показник був нижчим від норми на 42% у оперованих - на 34%. Аналізуючи описані зміни можна помітити, що дія препарату запобігала підвищенню рівня розчинної форми NCAM у сироватці крові і не мала такої позитивної дії на метаболізм NCAM в мозку оперованих тварин.

Ін'єкція Кетанов у тій же дозі як не оперованим, так і оперованим тваринам не викликала вірогідних змін вмісту розчинної форми S-100 у довгастому мозку й таламусі/гіпоталамусі щурів за 24 год.

Порівнюючи вміст S-100 в мозку оперованих тварин без фармакокорекції та за умов впливу Кетанова, можна говорити про результативний вплив цього препарату на метаболізм S-100 в мозку оперованих тварин. Введення Кетанова не викликало вірогідних змін концентрації розчинної форми S-100 в сироватці крові не оперованих щурів. Аналізуючи дію Кетанова на фоні оперативного втручання можна бачити, що застосування даного препарату запобігало збільшенню концентрації S-100, як в мозку, так і в сироватці крові щурів.

Введення нестероїдного протизапального препарату викликало вірогідні зміни вмісту філаментної форми ГФКБ лише у довгастому мозку, де у не оперованих щурів він був вищим від норми на 118%, у оперованих - на 95%, що в середньому на 75% вище від рівня даного показника для тварин оперованих без фармакокорекції, що може свідчити про активацію процесів перебудови цитоскелету астроцитів під впливом даного препарату.

Цікавою особливістю дії Кетанову було значне збільшення загальної гіалуронат-зв'язуючої здатності у фракції цитоскелетний білків як довгастого мозку так і таламусу/гіпоталамусу на 127% і 129%, відповідно. У оперованих щурів відповідні зміни склали 176% та 81%. Описані результати можуть бути пов'язані з впливом Кетанову на метаболізм арахідонової кислоти, яка відіграє важливу роль у регуляції обміну гіалуронової кислоти. Відтак, дія нестероїдного протизапального препарату Кетанов запобігає значним змінам Са²⁺-зв'язуючого білку S-100в та має власна специфічну дію, яка проявляється у підвищенні рівня гіалуронат-зв'язуючої здатності у фракції цитоскелетний білків мозку.

Результати кореляційного аналізу вказують на відсутність лінійних зв'язків між вмістом досліджуваних нервовоспецифічних білків у нормі та за умов впливу післяопераційного болю та фармакокорекції.

ВИСНОВКИ

1. Гіпералгезія внаслідок оперативного втручання на задній кінцівці щура призводить до зміни рівня та співвідношення нейрональних молекул клітинної адгезії (NCAM), S-100 і ГФКБ астроцитів та загальної глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності білків міжклітинного матриксу в мозку та сироватці крові.

2. Для першої доби після операції характерні:

- підвищення кількості мембранної та розчинної NCAM в середньому на 77% та 119%, відповідно; S-100 - на 86%, філаментного ГФКБ - на 17% та гіауронат-зв'язуючої здатності білків міжклітинного матриксу в середньому на 27%, при одночасному зниженні гепарансульфат-зв'язуючої здатності цитозольних та позаклітинних білків у довгастому мозку, що проводять ноцицептивні сигнали

- у таламусі/гіпоталамусі, аналізуючому відділі, збільшення мембранної NCAM в середньому на 43%, S-100 - на 52%, філаментної ГФКБ - на 43%, про одночасному зниження розчинної NCAM в середньому на 27%, гепарансульфат-зв'язучої здатності білків в середньому на 10-19% та нормальному рівні гіалуронат-зв'язуючої здатності білків.

- послаблення гематоенцефалічного бар'єру та поява розчинних форм NCAM, S-100 у сироватці при збереженні нормального рівня глікозидаз.

3. Для сьомої доби після оперативного втручання характерна тенденція наближення до нормального рівня досліджуваних білків, хоча відсотковий вміст ще залишається зміненим, на фоні нормалізації поведінкових реакцій щурів.

4. Вплив агоніста НМДА рецепторів глутамату підсилює ще більше ефект післяопераційної гіпералгезії.

5. Застосування неконкурентного антагоніста НМДА рецепторів МК-801 за 5 хв. до операції запобігає значним змінам вмісту нейроспецифічних білків у мозку щурів.

6. Нестероїдний протизапальний препарат Кетанов запобігає змінам вмісту Са²⁺-зв'язуючого білка S-100 в мозку оперованих щурів при одночасній модуляції зміни цитоскелету астроцитів та активації глікозаміноглікан-зв'язуючої здатності цитозольних та позаклітинних білків.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Козубенко Н.В., Кобеляцкий Ю.Ю., Ушакова Г.А. Содержание S-100b в мозге и сыворотке крови в условиях послеоперационной гипералгезии // Архив клинической и экспериментальной медицины, 2001, Т. 10, № 3. С. 301-304.

2. Козубенко Н.В., Кобеляцкий Ю.Ю., Ушакова Г.А. Изменение экспрессии белков астроглии в условиях послеоперационной гипералгезии // Нейрофизиология/ Neurophysiology. 2001. Т. 33, № 6. С. 393-398.

3. Ushakova G.A., Kozubenko N.V., Kobeliatsky Y.Y. Ketanov prevents changes in the level of calcium-binding protein S-100-beta under postoperation pain // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2002. V. 34, № 2/3. P. 262-263.

4. Козубенко Н.В., Кобеляцкий Ю.Ю., Ушакова Г.А. Гликозаминогликан-связывающая способность белков мозга крыс в послеоперационный период // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2004. Т. 36, № 1. С. 20-26

5. Ушакова Г.О., Козубенко Н.В., Кобеляцький Ю.Ю. Активність глікозидаз у сироватці крові та мозку щурів у післяопераційний період // Медична хімія. 2004. Т. 6, № 3. С. 91-94.

6. Kozubenko N., Ushakova G. N-CAM in the rat model of postoperative pain // FEBS Advanced Course “Glycoconjugate: Versatile structures - intriguing functions”, Dubrovnik, Croatia, 24-30 September 2001.

7. Kozubenko N., Kobeliatsky Y., Ushakova G. Elevation of S-100b level in rat brain and blood serum under postoperative pain // J. Neurochem. 2001. V. 78 (Supl. 1) P. 16

8. Козубенко Н., Кобеляцкий Ю., Ушакова Г. Активность лизосомальных гликозидаз в сыворотке крови крыс при послеоперационной гипералгезии и фармакологической коррекции // Тези Міжнародної наукової конференції студентів і молодих вчених. 27-29 вересня 2001, Дніпропетровськ, Україна. С. 146-147.

9. Кобеляцкий Ю.Ю., Козубенко Н.В., Ушакова Г.А. Механизмы действия нестероидного противовоспалительного средства: препарат Кетанов // Архив клинической и экспериментальной медицины. 2001. Т.10, № 2, С. 164.

10. Kobeliatsky Y.Y., Kozubenko N.V., Ushakova G.A. Astroglial reaction to postoperative pain and glutamate and MK-801 effect // Procceding of the 10th World Congress on pain, August 17-22, 2002, San Diego, USA. IASP Press. P. 365.

11. Ushakova G.A., Kozubenko N.V., Kobeliatsky Y.Y. Glycosidase activity in the serum of rats under postoperative hyperalgesia and Ketanov application // Procceding of the 10th World Congress on pain, August 17-22, 2002, San Diego, USA. IASP Press. P. 153.

12. Ушакова Г.А., Козубенко Н.В., Кобеляцкий Ю.Ю. Влияние препарата “КЕТАНОВ” на уровень нейроспецифических белков в условиях послеоперационной гипералгезии // Укр. біохім. журн. 2002. Т. 74, № 4а. С. 185-186.

13. Kozubenko N.V., Ushakova G.A., Kobeliatsky Y.Y. Rat brain glial cell proteins change in concentration under postoperative pain // FENS-EFIC-IBRO European Pain School 2003 “Chronic Pain a Disease: Novel Scientific Concepts” Siena, Italy, 25-31 October 2003.

14. Kozubenko N.V., Ushakova G.A. NCAM as a neuronal plasticity marker under postoperative pain // 29th Meeting of FEBS, Warsaw, Poland, 26 June-1 July 2004. FEBS J., V. 271, Sup. 1, P. 155.

АнотаціЇ

Козубенко Н.В. Зміна рівня нервовоспецифічних білків у мозку щурів під впливом експериментального соматогенного післяопераційного болю та фармакокорекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Робота присвячена вивченню впливу експериментального соматогенного післяопераційного болю на рівень окремих нервовоспецифічних білків у мозку щура. У оперованих щурів стан гіпералгезії (перша доба після операції) супроводжується зниженням локомоторної та дослідницької активності. Одночасно у мозку цих тварин визначено підвищення вмісту мембранної та розчинної форм адгезивного білка NCAM, розчинної форми Са²⁺-звязуючого білку S-100в та філаментної форми білка проміжних філаментів астроцитів ГФКБ. Дані білки приймають активну участь у процесах синаптичної та нейрональної пластичності. Гепарансульфат- та гіалуронат-зв'язуюча здатність розчинних та цитоскелетних білків у результаті впливу післяопераційного болю зазнає незначних (до 20%) змін. Соматогенна післяопераційна гіпералгезія спричиняє збільшення вмісту розчинних форм NCAM та S-100в у сироватці крові оперованих щурів (на 40% та 177%, відповідно), що може свідчити про послаблення гематоенцефалічного бар'єру. Дія агоністу НМДА рецепторів глутамату викликає одно направлені зміни вмісту даних білків, як і гіпералгезія; на фоні оперативного втручання посилює вплив болю. Застосування неконкурентного антагоністу НМДА рецепторів МК-801 запобігає значним змінам нервовоспецифічних білків у мозку та сироватці крові щурів. На сьому добу після оперативного втручання відбувається наближення вмісту досліджуваних білків до показників норми. Отримані результати свідчать про активну участь даних білків у центральних механізмах передачі та обробки ноцицептивного сигналу за рахунок регуляції рівня Са²⁺, міжклітинної адгезії та форми астроцитів.

Ключові слова: нервовоспецифічні білки, мозок, післяопераційний біль, гіпералгезія.

Козубенко Н.В. Изменение уровня нейроспецифических белков в мозге крыс под влиянием экспериментальной соматогенной послеоперационной боли и фармакокорекции. - Рукопись.

Создана модель экспериментальной соматогенной послеоперационной боли. Состояние гипералгезии подтверждается снижением локомоторной и исследовательской активности оперированных животных. Влияние соматогенной послеоперационной боли в течение 24 часов вызвало повышение уровня нейроспецифических белков в продолговатом мозгу и таламусе/гипоталамусе крыс. В течение раннего послеоперационного периода в продолговатом мозге крыс содержание как мембранной, так и растворимой формы адгезивного белка NCAM повысилось почти в 2 раза. По результатам иммуноблотинга повышение мембранной формы NCAM произошло за счет высокомолекулярных его форм с молекулярной массой 140 и 180 кДа. Для раннего послеоперационного периода характерно также значительное, в 1,5-2 раза повышение, содержания растворимой формы астроглиального Са²⁺-связывающего белка S-100в в исследуемых отделах мозга крыс. Влияние послеоперационной гипералгезии привело к повышению сожержания филаментной формы ГФКБ в продолговатом мозге и таламусе/гипоталамусе крыс. В результате влияния послеоперационной боли гепарансульфат- и гиалуронат- связывающая способность растворимых и цитоскелетных белков мозга крыс изменилась в течение суток незначительно (до 25%). Влияние операции приводит к значительному повышению процентного содержания S-100в и NCAM, что указывает на важную роль данных белков в процессах передачи и анализа ноцицептивных сигналов. Действие соматогенной послеоперационной боли вызывает также повышение концентрации растворимых форм нейроспецифических белков NCAM и S-100в в сыворотке крови крыс (на 40% и 177%, соответственно), что может свидетельствовать об ослаблении гематоэнцефалического барьера.

Действие агониста НМДА рецепторов глутамата приводит к изменениям содержания исследуемых белков, аналогичным тем, что были вызваны послеоперационной гипералгезией как в мозгу, так и сыворотке крови крыс. Введение глутамата за 5 мин. до операции усиливало действие последней.

На седьмые сутки послеоперационного периода содержание большинства исследуемых нейроспецифических белков приближался к показателям нормы. Процентное содержание белков в этот период остается измененным в основном за счет повышенного содержания NCAM. Результаты ИФА указывают на то, что такие изменения происходят за счет мембранной формы NCAM. В сыворотке крови оперированных крыс, на седьмые сутки еще наблюдается незначительное повышение уровня растворимой формы S-100в. Результаты корреляционного анализа не выявили какой-либо линейной зависимости между изменениями содержания нейроспецифических белков в результате действия послеоперационной боли и/или фармакокоррекции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные белки принимают активное участие в центральных механизмах передачи и обработки ноцицептивной информации за счет регуляции уровня Са²⁺, межклеточной адгезии и формы астроцитов.

Ключевые слова: нейроспецифические белки, мозг, послеоперационная боль, гипералгезия.

Kozubenko N.V. Neurospecific proteins level changes in the rat brain under experimental somatogenic postoperative pain and pharmacocorrection. - Manuscript. The thesis for a scientific degree of (Doctor of Philosophy) candidate of biological sciences by specialty 03.00.04 - biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2005.

The work investigates the experimental somatogenic postoperative pain influence for some neurospecific proteins level in the rat brain. The presence of postoperative pain in the created experimental model checked with the help of testing of physiological activity in the open field. Hyperalgesia influence during 24 hours of postoperation time caused the considerable increasing of all investigating proteins level: NCAM soluble and membrane forms, S-100в soluble form and GFAP filament form in hindbrain and thalamus/hypothalamus, excepting NCAM soluble form in thalamus/hypothalamus, where its level was decreased. As the result of postoperative pain influence, heparansulfate- and hyaluronate- binding properties of soluble and cytoskeletal proteins undertook changes (up to 20%). NCAM and S-100в soluble forms increased level (to 40% and 177%, accordingly) was registered in the rat blood serum. That may testify about the weakening of blood-brain barrier. NMDA receptor agonist glutamate action evokes changes that are same evoking by postoperative hyperalgesia. The action of glutamate and operation together intensifies pain influence. NMDA receptor noncompetitive antagonist MK-801 using prevents considerable neurospecific protein level changes in rat brain and in blood serum of rats. The investigated protein level is approximate to normal on the 7^th day after operation. Our results testify that these proteins play active role in central mechanisms of nociceptive information transduction.

Key words: neurospecific proteins, brain, postoperative pain, hyperalgesia.