Системний аналіз взаємозв’язків біоселективних елементів із мініатюрними електрохімічними перетворювачами в біосенсориці

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Біосенсорика - це новітня галузь аналітичної біотехнології, одним із основних напрямків якої є розробка електрохімічних біосенсорів. Найважливішими з характерних ознак біосенсорів є їхня висока чутливість та селективність, простота у використанні та швидкість аналізу, а також широкий діапазон речовин, що можуть бути детектовані. Це визначає можливість, а скоріше, необхідність, їхнього застосування практично в усіх галузях людської діяльності, включаючи медицину, фармацевтичне, харчове, біотехнологічне та хімічне виробництва, сільське господарство, охорону довкілля, тощо. Порівняно з існуючими аналітичними методами вони можуть забезпечити швидкий, надійний, чутливий та дешевий аналіз різноманітних сполук.

Біосенсор завжди складається з двох основних частин - біоселективного елемента, що відповідає за розпізнавання і трансляцію інформації із біологічного домену в хімічний чи фізичний вихідний сигнал з відповідною чутливістю, та перетворювача, який відповідає за трансляцію цього сигналу в електричний домен та його перетворення в аналітично доступну інформацію. Електрохімічні перетворювачі поділяють на потенціометричні, амперометричні та кондуктометричні. Останнім часом основну увагу приділяють перетворювачам, для виготовлення яких застосовують сучасні досягнення мікроелектронної технології. Інтерес до використання таких перетворювачів обумовлений високою чутливістю та селективністю, відсутністю необхідності у технологічно складному електроді порівняння, здатністю до мініатюризації та високого рівня інтеграції, можливості створення мультисенсорів та розміщення на одному кристалі перетворювача разом зі схемою обробки інформаціі; а головне - низькою собівартістю при масовому виробництві. Це робить економічно вигідним навіть одноразове використання таких датчиків та значно розширює сферу застосування біосенсорів, зокрема в польових умовах, і може дати значний економічний ефект при подальшому їхньому впровадженні в практику.

Незважаючи на швидке зростання протягом останніх 20 років кількості робіт у галузі створення біосенсорів, більшість із них є емпіричними і тому основні переваги біосенсорів не завжди використовуються з максимальною ефективністю. О.П. Солдаткін один із перших започаткував роботи з розробки загальних науково-технологічних засад створення біосенсорів. Ці дослідження запровадили більш системний підхід до розробки біосенсорів, але стосувалися переважно біологічної частини сенсорів.

На початку досліджень із розробки якогось конкретного біосенсора перед науковцями завжди постає питання про вибір найефективнішого типу перетворювача для забезпечення найкращих аналітичних характеристик отриманих датчиків та можливості подальшої роботи розроблених приладів у реальних умовах проведення аналізів. У більшості випадків цей вибір відбувається без ґрунтовного аналізу можливостей різних систем перетворення сигналу, специфічних особливостей перетворювачів та біоселективного матеріалу.

Таким чином проведення системного теоретичного та експериментального аналізу роботи різних електрохімічних мініатюрних перетворювачів та застосування їх у біосенсорах залежно від поставлених завдань та вибраного біологічно-чутливого елемента, а також різностороннє вивчення прикладних аспектів практичного застосування створених біоаналітичних приладів є актуальним.

Метою роботи було проведення системного теоретичного та експериментального аналізу взаємозв'язків біоселективних елементів з мініатюрними електрохімічними перетворювачами для їхнього ефективного застосування в біосенсориці та подальшого практичного використання.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі наукові завдання:

ь Вивчити особливості роботи різних типів перетворювачів та порівняти їхню ефективність для реєстрації фізико-хімічних сигналів, генерованих при взаємодії біоселективного елемента з аналізованою сполукою, залежно від матеріалу, форми і розмірів електродів та умов проведення експериментів.

ь Проаналізувати функціонування різноманітних біоселективних елементів біосенсорів з точки зору їхнього застосування з різними типами електрохімічних перетворювачів та здійснити пошук закономірностей в процесах формування біоселективних шарів і шляхів оптимального поєднання біологічного матеріалу з поверхнями електрохімічних перетворювачів.

ь Створити лабораторні прототипи деяких біосенсорних пристроїв і розробити оптимальні алгоритми проведення аналізу. Відібрати серед розроблених біосенсорних прототипів такі, що найповніше відповідають вимогам практичного застосування для їхнього технологічного опрацювання та подальшого впровадження.

ь Розробити фундаментальні та технологічні засади створення мультисенсорних і мультиферментних систем, вивчити шляхи математичної обробки масивів даних з метою розпізнавання образу складної біологічної або хімічної суміші.

1. Матеріали і методи дослідження

В роботі використoвували такі препарати: глюкозооксидаза з Penicillium vitale з активністю 130 од.акт./мг виробництва фірми “Діагностикум” (Львів, Україна); ацетилхолінестераза з електричного вугря з активністю 292 од.акт./мг та бутирилхолінестераза з сироватки крові коня з активністю 13 од.акт./мг виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany); уреаза із бобів сої з активністю 31 од.акт./мг виробництва фірми „Fluka” (Germany); алкогольоксидаза з Hansenula pоlymorpha з специфічною активністю 6 од.акт/мг білка, люб'язно надана д-ром Т. Гібсоном (Університет м. Лідс, Англія); тирозиназа з грибів з активністю 6680 од. акт./мг виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany). Також в роботі використовували сироватковий альбумін бика (БСА) та 25 % розчин глутарового альдегіду фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).

Субстрати глюкоза, сечовина, ацетилхолін хлорид, бутирилхолін хлорид, параформальдегід, 4-хлорофенол, фенол, катехол були виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).

Як токсичні речовини, що використовували для аналізу через інактивацію ферментів, були фосфорорганічні пестициди: трихлорфон [(dimethyl-2,2,2-trichlor-1-hydroxyethyl)-phosphonat], діізопропіл-фторфосфат, параоксон-етил [diethyl-p-nitrophenyl phosphate], параоксон-метил [O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphate], паратіон-метил [(O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphorothiate] фірми „Riedel-de-Haen (Швейцарія)”; карбаматний пестицид карбофуран [2,3-dihydro-2,2-dimethylbenzofuran-7-yl N-methylcarbamate] фірми „Riedel-de-Haen” (Швейцарія), глікоалкалоїди -чаконін, -соланін з паростків картоплі, томатін, демісидін, езерін та аглікони соланідин з паростків картоплі, томатідін (3-Hydroxy-5-tomatidane), соласодін (Solasod-5-en-3-ol), атразин (2-хлор-4-етиламін-6-ізопропіламін-1,3,5-триазин), діурон (3-(3,4-дихлорофеніл)-1,1-диметилуреа), бромоксиніл (3,5-дибром -4-гідроксибензонітрил), дезетилатразин (2-амін-4-хлор-6-ізопропіламін-1,3,5-триазин) і дезізопропілатразин (6-хлор-N-етил-1,3,5-триазин-2,4-діамін) фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany). Для інактивації уреази іонами важких металів використовували водні розчини таких солей: Hg(NO3)2, Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, Co(NO3)2, Cd(NO3)2, AgNO3, Sr(NO3)2.

Матеріали для створення біоселективних та додаткових мембран: нафіон - катіонообмінний полімер (5 % в суміші низько-молекулярних аліфатичних спиртів та 10 % води, продукт № 27.470-4) та полі(4-вінілпіридин-ко-стирен) полімер (ПВП), продукт № 19,207-4) були поставлені фірмою „Aldrich Chem. Co.” (США).

Як робочий буфер використовували калій-фосфатний розчин (КН2РО4-NaOH) вітчизнянного виробництва. Всі інші реактиви були вітчизняного та імпортного виробництва і мали кваліфікацію “ос.ч.” чи “х.ч.”.

2. Результати досліджень та обговорення

Технологічні та методологічні основи розробки електрохімічних перетворювачів. Дуже важливим питанням розробки біосенсорів після вибору необхідного типу перетворювача є, перш за все, вибір найбільш ефективного для нього дизайну, розмірів і матеріалу. Було досліджено аналітичні характеристики та ефективність роботи різних електрохімічних перетворювачів. Ці дослідження були спрямовані як на розробку найбільш чутливих перетворювачів, так і на пошук можливості зниження їхньої собівартості.

Найефективнішим перетворювачем для створення кондуктометричних біосенсорів є гребінчастий тонкоплівчастий електрод - мініатюрний датчик на основі двох гребінчастих металевих електродів для вимірювань провідності шару розчину, який знаходиться безпосередньо біля поверхні електродів та визначається їхніми характеристичними розмірами. В роботі було розроблено та досліджено цілу низку кондуктометричних перетворювачів.

Дуже важливим моментом при виробництві перетворювачів є підбір оптимального матеріалу самих гребінок. З одного боку, він повинен бути дешевим, а з іншого - мати необхідну чутливість до зміни провідності розчину. Використовуючи метод імпедансної спектроскопії, проведено серію експериментів, в яких порівнювали датчики, гребінки яких були виготовлені з різних металів.

Отримано ряд пріоритетності різних матеріалів для створення кондукто-метричних біосенсорів: платина > золото > нікель > мідь > хром > титан > алюміній.

Проведено також експерименти для дослідження структур, виготовлених на різних підкладинках. Показано, що матеріал підкладинки не впливає на чутливість датчика до зміни провідності середовища. Основна вимога, що повинна до нього висуватися, - це його електронепровідність. З технологічної точки зору найзручніше використовувати скло, тому що це, з одного боку, найдешевший матеріал, а з іншого - найменш крихкий.

Наступна важливе завдання - визначення характеристичних розмірів електродів. Для цього проведено експерименти з дослідження впливу розмірів „пальців” гребінок та відстані між ними на чутливість датчиків. Зроблено висновок, що мініатюризація не потребує технологічно складного збільшення кількості „пальців” на електроді за рахунок зменшення їхніх розмірів. Мініатюризацію доцільно проводити шляхом рівномірного зменшення як робочої поверхні електроду, так і характеристичних розмірів електродів. Основну роль при виборі розмірів сенсора відіграє співвідношення між товщиною мембрани, характеристичними розмірами електродів та їхньою активною площею.

Результати досліджень використано при виробництві кондуктометричних перетворювачів у різних установах. Кращі характеристики продемонстрували перетворювачі, які виготовлені на Київському радіозаводі та в Інституті хемо- і біосенсорики (м. Мюнстер, Німеччина). Саме перетворювачі такого дизайну запропоновано для створення серійних кондуктометричних біосенсорів.

Наступна частина роботи присвячена дослідженню різних перетворювачів для створення амперометричних біосенсорів, а саме - різноманітних вуглецевих та металевих електродів, виготовлених за сучасними технологіями, а також їхньому порівняльному аналізу. В основі роботи амперометричного біосенсора лежить вимірювання сили струму через електрохімічну комірку при постійному потенціалі за наявності в зразку електрохімічно активних речовин.

Перший крок при здійсненні пошуку оптимальних матеріалів і оцінки технології виготовлення електродів - вивчення серійної стабільності різних типів амперометричних перетворювачів. Адже погана відтворюванність електрохімічних властивостей від електроду до електроду може зробити малоперспективною подальшу розробку біосенсора на його основі, навіть при непоганих характеристиках окремих представників серії.

Показано, що майже всі розглянуті графітові перетворювачі мають досить великий розкид значень та невелике співвідношення “відгук/фон”. Найкращі співвідношення “відгук/фон” отримано для платинових дискових електродів. Зроблено висновок про небажаність використання більшості розглянутих перетворювачів для створення амперометричних ферментних біосенсорів через низьке співвідношення “відгук/фон”. Особливо це стосується графітових електродів, які, до того ж, мають погану серійну стабільність. В той же час наведені результати не нівелюють переваг графіту як електродного матеріалу, бо графітові перетворювачі досить часто потребують попередньої хімічної та/або електрохімічної обробки. Така процедура покращує їхні електрохімічні характеристики, але деяким чином ускладнює роботу з ними. Іншим можливим рішенням є використання диференційного режиму вимірювань, що дозволяє значно підвищити відношення “відгук/фон”. Встановлено, що платина є більш придатним електродним матеріалом, ніж графіт. Але необхідно було знайти на її основі більш ефективніший перетворювач сигналу, бажано виготовлений за допомогою високотехнологічного промислового виробництва, оскільки в більшості випадків саме лабораторне ручне виготовлення електродів є причиною низьких електрохімічних якостей розглянутих перетворювачів.

Ми зосередили увагу на металевих гребінчастих планарних електродах, виготовлених методом вакуумного напилення. Було визначено, що оптимальним матеріалом для виробництва таких електродів є платина, для підкладинки - кремній, а найоптимальніша ширина „пальців” та відстань між ними - 10 мкм.

Для створення ультрамікробіосенсорів для визначення in vivo одними із найперспективніших є амперометричні мікроелектроди на основі вуглецевого волокна. Показано, що для таких електродів необхідна обов'язкова електрохімічна передобробка, після якої чутливість і стабільність таких перетворювачів різко збільшується.

Окрім того, досліджено перетворювачі на основі рН-чутливих польових транзисторів. Для цього необхідно було дослідити роботу напівпровідникових структур при розміщенні їх у водних розчинах, вибрати кращий матеріал, з огляду на його рН-чутливість і стабільність, а після отримання рН-чутливих польових транзисторів, - вивчити їхні аналітичні характеристики та вибрати кращі варіанти для подальшої розробки потенціометричних біосенсорів на їхній основі.

Найкращі результати отримано для діелектрика, що складається з термічної плівки SiO2 товщиною біля 40 нм і плівки Si3N4 товщиною близько 100 нм. Необхідно також підкреслити, що деякі інші недоліки діелектрика впливають на стабільність системи, збільшуючи дрейф і унеможливлюючи проведення тривалих досліджень. Але найкращі результати також були отримані для діелектрика, що складається з термічної плівки SiO2 і плівки Si3N4.

З урахуванням отриманих нами даних, в НДІ "Мікроприлад" (м. Київ, Україна) було розроблено та виготовлено сенсорний чіп на основі рН-чутливих польових транзисторів (рН-ПТ). Крім того, в роботі були досліджені рН-ПТ інших виробників, деякі з них розроблені згідно наших рекомендацій.

Було показано, що найкращу рН-чутливість мають перетворювачі, які виготовлені в НДІ “Мікроприлад” (рН-чутливість близько 50 мВ/рН). Крім того, вони також мали кращу стабільність при роботі та невеликий дрейф вихідного сигналу з часом. Саме ці датчики і були, в основному, використані для створення потенціометричних біосенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів.

Таким чином, з точки зору технології виробництва найпростішими є кондуктометричні і амперометричні перетворювачі. Технологія виробництва рН-чутливих польових транзисторів є більш складною та специфічною. Але амперометричні перетворювачі потребують використання електроду порівняння, а це ускладнює систему аналізу. А якщо мати на увазі інтегральний електрод порівняння, то це значно ускладнює технологію виробництва перетворювачів. Тому з точки зору тільки технології виробництва та складності системи вимірювань кращими є кондуктометричні перетворювачі. Основні наукові результати опубліковано в працях.

Біоселективні елементи електрохімічних сенсорів: принципи роботи, вибір перетворювача, іммобілізація та оптимізація аналітичних характеристик. Друга важлива і невід'ємна частина кожного біосенсора - це біоселективний елемент. Основну увагу, перш за все, було зосереджено на вивченні роботи низки ферментів (глюкозооксидоза, ацетилхолінестераза, бутирилхолінестераза, уреаза, -лактамаза, алкогольоксидаза, тирозиназа, трипсин, тощо) з метою отримання загальних закономірностей та обмежень використання різних типів електрохімічних перетворювачів при розробці відповідних біосенсорів. Крім того, пильну увагу приділяли пошуку закономірностей в процесах формування біоселективних шарів і шляхів оптимального поєднання біологічного матеріалу з поверхнями електрохімічних перетворювачів з точки зору простоти та технологічності виконання самої процедури, максимального збереження активності біомолекул, забезпечення високої щільності та просторової орієнтації їх на поверхні.

Можливості використання різних перетворювачів при створенні біосенсорів можна продемонструвати на прикладі реакції ферментативного перетворення глюкози, яка лежить в основі роботи біосенсорів для визначення глюкози.

Із наведеної схеми можна бачити, що використовуючи різні етапи та складові однієї і тієї ж ферментативної реакції гідролізу глюкози, ми можемо застосовувати амперометричні датчики на основі як визначення кисню, так і перекису водню, чи кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності, а також потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів.

Розроблені біосенсори на основі глюкозооксидази і різних перетворювачів продемонстрували подібні аналітичні характеристики. Динамічний діапазон роботи кондуктометричного та потенціометричного біосенсорів був дещо вужчим за діапазон роботи амперометричного біосенсора. До того ж, на відміну від амперометричного біосенсора, їхні відгуки більше залежать від умов вимірювання.

Вузький діапазон роботи глюкозних біосенсорів на основі всіх типів електрохімічних перетворювачів пояснюється лімітуванням ферментативної реакції киснем - косубстратом цієї реакції. Було запропоновано та перевірено цілий ряд можливих шляхів розширення динамічного діапазону роботи глюкозного біосенсора. Наприклад, використання фериціаніду калію як окислювального реагенту в біокаталітичному окисленні глюкози забеспечує збільшення відгуку біосенсора в 10 - 100 разів та значне розширення його динамічного діапазону.

При використанні додаткових мембран різної природи, які наносяться зверху ферментативної мембрани для модифікації сенсора, кондуктометричний та потенціометричний глюкозні біосенсори розширюють динамічний діапазон роботи датчика до 10 мМ з незначним зменшенням чутливості до субстрату та стають менш чутливими до зміни буферної ємності та іонної сили середовища. Використання додаткової нафіонової мембрани у випадку амперометричного глюкозного біосенсора значно зменшує чутливість біосенсора до аскорбінової кислоти, яка присутня в багатьох біологічних рідинах і спричиняє неспецифічний відгук сенсора. Це є великою перевагою, бо дозволяє проводити аналіз глюкози в реальних зразках in vitro та in vivo.

Стабільність глюкозного сенсора не залежить від перетворювача, а визначається, в першу чергу, стабільністю ферментної мембрани. Біосенсори продемонстрували хорошу операційну стабільність протягом кількох днів, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози на одному датчику. Зниження величини відгуку з часом складало близько 4 % за добу. При зберіганні біосенсора у сухому вигляді при температурі 4 С, він демонстрував стабільність протягом більше, ніж 3 місяців.

Наступним предметом дослідження були біосенсори на основі холінестераз. В основі їхньої роботи лежать такі ферментативні реакції:

Під час цих двох реакцій генеруються протони, що призводить до зміни рН чи провідності мембрани. Це дає змогу використовувати кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності, чи потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Стосовно амперометричних біосенсорів, то під час цих реакцій не продукуються електроактивні сполуки. Це унеможливлює використання амперометричних перетворювачів для створення сенсорів.

Перш за все було показано, що за допомогою холінестеразних біосенсорів можна визначати концентрацію ацетилхоліну і бутирилхоліну як субстратів та цілої низки інгібіторів - таких, як фосфорорганічні пестициди та стероїдні глікоалкалоїди. Видно, що біосенсор на основі БуХЕ значно чутливіший до -чаконіну, ніж біосенсор на основі АцХЕ. Для інших типів стероїдних алкалоїдів, таких як -соланін, соланідін та томатін були отримані подібні результати. На противагу цьому, потенціометричний біосенсор на основі АцХЕ більш чутливий до фосфорорганічних пестицидів, ніж сенсор на основі БуХЕ. Аналогічні результати були отримані і для кондуктометричних біосенсорів.

Проведено оптимізацію роботи кондуктометричного і потенціометричного біосенсорів на основі холінестераз для визначення концентрацій токсичних речовин на основі зворотнього і незворотнього механізмів інгібування. Обидва типи розроблених біосенсорів демонстрували аналітичні характеристики, придатні для практичного застосування при кількісному визначенні фосфорорганічних і карбаматних пестицидів (табл. 1) та глікоалкалоїдів.

Таблиця 1. Динамічний діапазон розроблених біосенсорів для визначення пестицидів

Досліджені пестициди можна розмістити за силою їхнього інгібування у такий ряд: діізопропілфторфосфат > параоксон-етил > трихлорфон > параоксон-метил > карбофуран > паратіон-метил.

Також було показано, що БуХЕ інгібується різними стероїдними глікоалкалоїдами в діапазоні концентрацій від 1 мкМ до 100 мкМ з мінімальною границею їхнього визначення, що складала 0,2 мкМ.

Всебічно досліджено відтворю-ваність біосенсорів на основі холінестераз, операційну стабільність та стабільність при зберіганні. Відгуки біосенсора добре відтворювані, відносне стандартне відхилення складає 3 %. Дослідження операційної стабільності показало, що біосенсор залишається стабільним протягом доби з відносним зменшенням сигналу близько 1 % за день. При зберіганні сенсора в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,5 при температурі 4 C, біосенсор залишається стабільним більше, ніж 5 місяців.

Наступним етапом дослідження було продовження робіт з розробки біосенсорів на основі уреази.

Під час цієї реакції йде поглинання протонів, що призводить до зміни рН, а також генерації додаткових іонів (амоній та HCO3-), що разом із поглинанням протонів призводить до зміни провідності мембрани. Це дозволяє використовувати кондуктометричні перетворювачі для визначення зміни провідності чи потенціометричні біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Стосовно амперометричних біосенсорів, то під час цієї реакції не продукуються електроактивні речовини. Це унеможливлює використання амперометричних перетворювачів для визначення сечовини.

Динамічні діапазони роботи потенціометричних і кондуктометричного уреазних сенсорів для визначення сечовини майже збігаються і їхня верхня межа не перевищує 3 мМ. Показано, що величина відгуку сенсорів залежить від умов середовища, а саме - буферної ємності, рН, іонної сили. Це є певним недоліком, бо потребує врахування цих критеріїв при розробці протоколів аналізу. В табл. 2 наведено динамічні діапазони біосенсорів на основі уреази для аналізу важких металів. Визначення більш низьких концентрацій іонів важких металів можливе при збільшенні часу преінкубації біосенсора з інгібітором.

Таблиця 2. Динамічний діапазон розроблених уреазних біосенсорів для аналізу важких металів

Аналітичні характеристики біосенсорів на основі двох перетворювачів практично однакові як з точки зору мінімальної границі визначення, так і динамічного діапазону роботи. Досліджені іони важких металів можна розмістити за силою їхнього інгібування уреази у ряд: Hg2+ > Ag+ > Cu2+ > Pb2+ > Cd2+ > Co2+ > Sr2+.

Розглянуто кілька підходів для розширення динамічного діапазону роботи кондуктометричних та потенціометричних уреазних біосенсорів та поліпшення їхніх аналітичних характеристик, а саме - використання напівпроникних додаткових мембран різної природи, застосування специфічного реагенту тетраборату натрію, який є конкурентним інгібітором уреази, використання препарату уреази з генетично модифікованим активним сайтом.

Видно, що при збільшенні концентрації тетраборату натрію в розчині, зменшується величина відгуку біосенсора для низьких концентрацій субстрату та збільшується його динамічний діапазон роботи до 25 мМ сечовини. Мінімальна границя визначення в цьому випадку зсувалася з 0,05 мМ до 1 мМ сечовини. Ефект інгібування зворотній і біосенсор повністю відновлює свої характеристики після відмивання його фосфатним буфером.

Дуже цікавим завданням було спробувати використати у біосенсорі новий фермент - рекомбінантну уреазу з E.coli з генетично модифікованим активним сайтом.

Біосенсор функціонував в широкому діапазоні визначення сечовини з 1 мМ до 80 мМ в розчині. Це цілком покриває рівень сечовини в крові як при нормальному стані людини, так і при дисфункції нирок. Крім того, біосенсор демонструє дуже високу відтворюванність результатів і високу стабільність. Аналітичні характеристики біосенсора дозволяли зробити висновок про можливість його застосування в медицині для прямого безперервного визначення сечовини в плазмі крові чи діалізному розчині.

Наступна завдання - створення біосенсора на основі іммобілізованої алкогольоксидази (АОХ). У присутності кисню (косубстрату ферментативної реакції) відбувається окислення етанолу з утворенням продуктів реакції ацетальдегіду та перекису водню, який можна визначати за допомогою амперометричного перетворювача.

Для створення біосенсора для визначення формальдегіду можна також використати алкогольоксидазу.

Під час реакції генеруються протони, що призводить до зміни рН чи провідності мембрани, тому можна використовувати кондуктометричні датчики для визначення зміни провідності чи біосенсори на основі рН-чутливих польових транзисторів. Також генерується перекис водню, що дозволяє використовувати амперометричні електроди.

Калібрувальні криві для визначення формальдегіду лінійні в діапазоні концентрацій 5 - 300 мМ для всіх типів перетворювачів. Але абсолютні значення величин відгуків у випадку потенціометричного сенсора дуже низькі, близькі до межі визначення таким перетворювачем. Це може ускладнити роботу біосенсорів. Також показано, що тільки потенціометричний і кондуктометричний біосенсори мають високу селективність до формальдегіду і не відповідають на додавання метанолу, етанолу, глюкози та гліцеролу.

Подальші дослідження були спрямовані на оптимізацію аналітичних характеристик кондуктометричного формальдегідного біосенсора як найбільш перспективного в плані прикладного використання.

Показано, що основні робочі характеристики формальдегідного кондуктометричного біосенсора на основі алкогольоксидази можна змінювати завдяки використанню різних буферних розчинів та різного часу іммобілізації алкогольоксидази в парах глутарового альдегіду. Калібрувальні криві для формальдегідного біосенсора, отримані в буферних розчинах з різною буферною ємністю, демонструють однакову верхню, але різну нижню межу визначення формальдегіду. Нижня межа визначення в 1 мМ фосфатному буфері складає 0,05 мМ (0,15 ppm) формальдегіду, що є достатнім для використання в екологічному моніторингу.

Для різного часу іммобілізації алкогольоксидази спостерігали зсув калібрувальних кривих біосенсора як для низьких, так і високих концентрацій формальдегіду. У випадку тривалого часу іммобілізації зменшення величини відгуку та розширення діапазону роботи сенсора для високих концентрацій субстрату може бути пов'язане з формуванням великої кількості ковалентних зв'язків між глутаровим альдегідом та молекулами ферменту, що може призвести до блокування деякої частини активних центрів ферменту. До того ж така щільна мембрана може зменшити дифузію субстрату та продуктів біохімічної реакції і тим самим розширити діапазон визначення формальдегіду до 500 мМ. З іншого боку, для короткого часу іммобілізації ми отримуємо більш чутливий сенсор, який здатний вимірювати низькі концентрації формальдегіду.

Таким чином, лінійний діапазон роботи кондуктометричного біосенсора на основі алкогольоксидази може складати 0,05 - 500 мМ формальдегіду і може бути адаптований для реальних прикладних потреб, використовуючи різні умови іммобілізації ферменту та різні протоколи вимірювань. Розроблений формальдегідний кондуктометричний біосенсор демонструє високу відтворюваність результатів з відносним стандартним відхиленням 5-10 %. Операційна стабільність біосенсора не менша 20 годин, стабільність при зберіганні - не менша одного місяця.

Стосовно біосенсора на основі алкогольоксидази для визначення етанолу, то в цьому випадку можливе використання тільки амперометричного перетворювача, тому що величини відгуків інших біосенсорів були дуже низькі, на межі визначення кондуктометричним чи потенціометричним перетворювачами.

Визначено оптимальне співвідношення компонентів для отримання активної мембрани з алкогольоксидазою при електрохімічному нанесенні. Видно, що найбільшу активність має сенсор, на поверхню якого нанесено мембрану, яку створено із суміші компонентів №1, і яку було використано у подальших експериментах. Були також підібрані оптимальні умови електрохімічного нанесення ферменту, що міститься у полімерній плівці. Найкращою була полімерна плівка, яку отримали при 20 послідовних імпульсах потенціалу +1900 мВ протягом 0,3 с та -300 мВ протягом 0,5 с.

Вивчено операційну стабільність алкогольного біосенсора та показано, що величина відгуку падає на 4% за добу безперервної роботи. Також було продемонстровано достатню стабільність при зберіганні алкогольного амперометричного біосенсора та відтворюванність результатів, отриманих за його допомогою, що дає змогу говорити про застосування сенсорів у промислових умовах.

Наступним біосенсором, що розроблявся, були датчики на основі тирозинази. Тирозиназа в присутності молекулярного кисню каталізує дві різні реакції: (1) трансформацію o-монофенолу в катехол (частина 1, крезолазна активність) і (2) окислення катехолу в o-квінон (частина 2, катехолазна активність).

У першій стадії реакції спостерігається зменшення концентрації протонів у мембрані, тому ми можемо використовувати потенціометричний та кондуктометричний метод вимірювань для створення біосенсора для визначення фенолів. З іншого боку, використовуючи ефект інгібування тирозиназної активності, можна створювати біосенсори для визначення триазину і фенілуреазних гербіцидів.

Визначено оптимальні умови іммобілізації на поверхні перетворювачів тирозинази та умови проведення експерименту. Максимальний відгук біосенсора спостерігали в розчині з рН 6,0. Також показано, що чутливість біосенсора є вищою при використанні іммобілізаційної суміші з рН 6,0, тобто в діапазоні, де тирозиназна активність є оптимальною. Досліджено вплив складу іммобілізаційної суміші на відгук тирозиназного сенсора до 4-хлорфенолу. Вивчали різні співвідношення тирозиназа/(БСА + тирозиназа). Найкращим було співвідношення близько 0,4 із загальним вмістом білка 10 %. При цьому значенні отримано найкращу комбінацію операційної стабільності сенсора і величини відгуку.

Відгук тирозиназного біосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів був відтворюваним; відносне стандартне відхилення відгуків одного сенсора становило близько 3 %, міжсенсорних відгуків - близько 7 %. Тест на операційну стабільність показав, що відгуки біосенсорів зменшувались до 50 % впродовж принаймні 15 годин.

Для вибору оптимальних умов визначення пестицидів було побудовано калібрувальні криві тирозиназного кондуктометричного біосенсора для визначення 4-хлорфенолу до і після інкубації атразином. Видно, що рівень інгібування тирозинази діуроном є вищим, ніж атразином, і що в обох випадках може бути досягнута гранична величина визначення - близько 1 ppb, яка є суттєво нижчою, ніж отримана за допомогою амперометричних біосенсорів.

Таким чином, функціонування різних біоселективних елементів біосенсорів проаналізовано з точки зору їхнього застосування з різними типами електрохімічних перетворювачів. Результати власних досліджень з можливості застосування електрохімічних перетворювачів для роботи з різними ферментами просумовано в табл. 3.

Таблиця 3. Можливості використання різних перетворювачів для створення біосенсорів

Для кожного з досліджених ферментів створено діючі лабораторні прототипи електрохімічних біосенсорів та розроблено протоколи експериментального визначення концентрацій глюкози, сечовини, ацетилхоліну, бутирилхоліну, пеніциліну, формальдегіду, етанолу, хлорофенолу, іонів важких металів, органофосфорних пестицидів, карбаматних та триазинових гербіцидів, стероїдних глікоалкалоїдів. Основні наукові результати опубліковано в працях, наведених в табл. 3.

Прикладні аспекти застосування біосенсорів на основі різних електрохімічних перетворювачів. Одним із основних завдань створення біосенсорів залишається їхня робота в реальних умовах, що накладає деякі обмеження на використання того чи іншого перетворювача. Досить часто лабораторні прототипи біосенсорів добре працюють в модельних розчинах, а при переході до роботи з реальними зразками науковці стикаються з труднощами, які ускладнюють, а іноді й унеможливлюють роботу розроблених систем. Тому важливим завданням роботи було протестувати частину розроблених лабораторних прототипів біосенсорів у реальних умовах проведення аналізу та порівняти результати з даними, які отримано за допомогою загальноприйнятих методів аналізу.

Перш за все, було запропоновано використати біосенсори для аналізу загальної токсичності водних зразків. Попри те, що ряд робіт вже було присвячено використанню біосенсорів для визначення інгібіторів, лише небагато авторів вивчають їхню поведінку в присутності суміші токсичних речовин, як це відбувається в природі. Для тестування придатності використання біосенсорів для такого аналізу було вибрано фосфорорганічний пестицид метил-паратіон і продукти його фотодеградації, оскільки вони досить добре вивчені за допомогою класичних методів.

Розроблені кондуктометричні ферментні біосенсори є більш придатними для вимірювань токсичності забруднювачів, тому саме вони були застосовані для оцінки токсичності метил-паратіону і продуктів його фотодеградації у воді.

Застосування HPLC системи “Shimadzu”, обладнаної фотодіодним детектором, як контрольного методу уможливило ідентифікацію метил-паратіону і його фотопродуктів. Для аналізу токсичності розчинів використовували обладнання для вимірювання токсичності Lumistox (Dr. Lange, Дюсельдорф, Німеччина), основою роботи якого є люмінесцентні бактерії Vibrio fischeri.

Подано кореляцію між ступенем фотодеградації метил-паратіону, яка супроводжується формуванням метил-параоксону (результати HPLC), і токсичністю цього розчину (результати, отримані на кондуктометричному АцХЕ біосенсорі та системі Lumistox). Оцінювали токсичність сумішей, які відповідали метил-паратіону і продуктам його деградації, що з'являються або зникають в міру того, як проходить опромінювання.

При максимальному інгібуванні (близько 90 % зменшення відгуку сенсора при 55-хвилинному опроміненні), концентрації метил-паратіону і метил-параоксону майже однакові, близько 2,010-5 M (5,8 ppm і 4,9 ppm відповідно). При таких концентраціях рівні інгібування АцХЕ цими речовинами, взяті окремо, становили приблизно 2 і 25 % відповідно. Ці результати далекі від 90 %, які спостерігаються для аналізованої суміші, що свідчить про синергічність дії цих сполук на іммобілізовану АцХЕ. Цю гіпотезу було експериментально підтверджено за допомогою штучних сумішей метил-паратіону і метил-параоксону.

Важливо також зазначити, що коли майже всі молекули метил-паратіону зникають (t > 160 хв.), розчин виявляє все ще досить високу токсичність, яка пов'язана з дією метил-параоксону. Внаслідок цього комерційні імунотести, які призначені тільки для визначення метил-паратіону (наприклад, Microwell Plate Assay EnviroLogix Inc., Portland, США), не можна вважати придатними для проведення тестів на загальну токсичність, оскільки при цьому не береться до уваги токсичність продуктів фотодеградації. Цей висновок також стосується і Lumistox-тесту. Результати, отримані за допомогою такої системи, демонструють поступове зменшення токсичності розчину метил-паратіону при його фотодеградації (крива 5), що є зрозумілим, зважаючи на те, що саме метил-паратіон є більш токсичним для Vibrio Fischeri.

Раніше було показано, що за допомогою електрохімічних біосенсорів можна з успіхом проводити кількісний аналіз глюкози в реальних зразках. Основна галузь, де необхідний такий аналіз, - це медична діагностика. Виходячи з цього, було запропоновано застосувати розроблені біосенсори для аналізу концентрацій глюкози в сироватці крові.

Всі три типи перетворювачів можуть бути використані у складі ферментного біосенсора для визначення глюкози. Але з точки зору технології виробництва більш придатними є кондуктометричні та потенціометричні перетворювачі. Порівнюючи роботу цих двох типів біосенсорів було показано, що кондуктометричний глюкозний біосенсор більш чутливий до неспецифіки при додаванні аліквот крові ніж потенціометричний, а це може призвести до похибок у визначенні концентрацій глюкози в реальних зразках. У цьому випадку необхідно використовувати деякі додаткові маніпуляції, а саме - використання ряду додаткових мембран, ускладнення процедури аналізу, використання додаткового математичного апарату обробки даних, що є недоліком методу. Тому в даному конкретному випадку більш придатним є потенціометричний глюкозний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів.

Біосенсори продемонстрували хорошу операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло провести на одному датчику 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках.

Далі досліджено можливості використання розроблених біосенсорів на основі БуХЕ для аналізу реальних зразків картоплі та помідорів. Культивована картопля та помідори є одними з основних сільськогосподарських культур, які щоденно споживають мільйони людей з різних верств населення. Але вони також можуть акумулювати нейротоксичні речовини глікоалкалоїди в процесі росту та зберіганні, які необхідно контролювати.

Порівнюючи роботу біосенсорів на основі двох типів перетворювачів у реальних зразках, встановлено, що кондуктометричний біосенсор більш чутливий до неспецифіки при додаванні зразків соку у вимірювальну комірку, ніж потенціометричний. Це може призвести до похибок при інтерпретації даних. Тому для аналізу зразків картоплі та помідорів краще використовувати ферментний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів, для якого і було розроблено протокол визначення і проведено кількісний аналіз глікоалкалоїдів у різних сортах картоплі та помідорів.

Таким чином, розроблений біосенсор можна використовувати для дослідження вмісту глікоалкалоїдів у різних пасльонових культурах. Аналіз простий, швидкий та не потребує багато часу на його проведення.

Використовуючи глюкозний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів, також проведено експерименти з визначення концентрацій глюкози в зразках соків тих же самих сортів картоплі, що використовувалися для аналізу глікоалкалоїдів. Було отримано зворотню відносну кореляцію даних щодо складу глюкози і глікоалкалоїдів у картоплі. Зразки картоплі з високими концентраціями глікоалкалоїдів мають дуже низькі концентрації глюкози. Це цілком логічно, тому що саме глюкоза використовується при синтезі глікоалкалоїдів.

У попередньому розділі було зроблено висновок про те, що за допомогою розроблених лабораторних прототипів ферментних біосенсорів на основі алкогольоксидази можна проводити кількісний аналіз глюкози і етанолу в реальних зразках. Однією з можливих галузей такого застосування є контроль та оптимізація біотехнологічних процесів при виробництві вина в харчовій промисловості. Виходячи з цього, основну увагу було зосереджено на можливості застосування біосенсорів для контролю біотехнологічних процесів при виробництві вина.

Перш за все проводили експерименти з аналізу глюкози у різних зразках вина. Використовували такі зразки вин: 1 - „Gewurztraminer”, 1999, 12,5% спирту, „Bestheim”, Франція; 2 - „Букет Молдавії”, червоний, 16% спирту, Молдова; 3 - Горіховий лікер, солодкий, 20 % спирту, м. Одеса, Україна; 4 - „Вермут церковний”, 17% спирту, „Агро-Прод”, Крим, Україна; 5 - „Кокур десертний”, марочне, 16% спирту, Масандра, Крим, Україна. З рисунка чітко видно кореляцію результатів, отриманих за допомогою біосенсора, з даними, які отримано з використанням набору „Діаглюк” та вмістом цукру, заявленим виробником.

Визначення етанолу в процесі ферментації вина проводили за допомогою трьох різних методів: за допомогою розробленого нами амперометричного біосенсора з іммобілізованою алкогольоксидазою, стандартного ферментного набору „Алкотест” та методу денситометрії дистиляту.

Перш за все слід зазначити високу кореляцію результатів, отриманих за допомогою біосенсора, з даними, які отримані за допомогою стандартного ферментного набору „Алкотест” (коефіцієнт кореляції R =0,9893) та методу денситометрії дистиляту (коефіцієнт кореляції R = 0,995). Також з рисунку видно кінетику збільшення концентрації етанолу в суслі у процесі ферментації.

Таким чином, функціонування частини розроблених лабораторних прототипів ферментних біосенсорів на основі різних електрохімічних перетворювачів проаналізовано з точки зору їхнього практичного застосування в реальних умовах та з реальними зразками. Результати власних досліджень з цього питання наведено в табл. 4.

Таблиця 4. Використання різних електрохімічних біосенсорів для аналізу реальних зразків

Із отриманих результатів можна зробити висновок, що розроблені кондуктометричні ферментні біосенсори є більш придатними для інгібіторного аналізу в екології для вимірювань токсичності забруднювачів та якості води, потенціометричні ферментні біосенсори на основі рН-ПТ більш придатні в медичній діагностиці для аналізу в крові та в сільскому господарстві для вимірювань концентрацій глікоалкалоїдів в картоплі, амперометричні ферментні біосенсори показали високі результати при використанні їх у харчовій промисловості для контролю процесу ферментації при виробництві вина. Основні наукові результати розділу опубліковані у працях, наведених в табл. 4.

Використання мультисенсорних та мультиферментних систем - перспективи біомолекулярної електроніки. У попередніх розділах було описано низку біосенсорів на основі різних електрохімічних перетворювачів. Проте за допомогою розроблених біосенсорів можна визначати тільки якийсь один певний тип речовини, тоді як будь-який зразок може містити їхню суміш. Цю проблему можна вирішити шляхом створення мультисенсорної системи, коли використовується кілька сенсорів, селективних до різних речовин за рахунок використання різних ферментів.

Важливим завданням є створення мультибіосенсора для визначення різноманітних токсичних речовин на основі ферментного інгібіторного аналізу. Використовували такі ферменти як уреазу, ацетил- і бутирилхолінестеразу. Вони мають приблизно однакові кінетичні характеристики і пригнічуються токсичними речовинами різних класів.

Ферменти АцХЕ, БуХЕ й уреаза в різний спосіб пригнічуються різними видами токсичних речовин. Як видно, холінестерази інгібуються пестицидами (трихлорфоном і карбофураном) різною мірою, уреаза ж взагалі не інгібується. В той же час спостерігається значне інгібування уреази іонами ртуті (табл. 5). Зворотньою є картина для БуХЕ. Фермент зберігає повну активність при дії на нього іонів ртуті і срібла при концентрації 50 мкМ, але інгібується трихлорфоном. Подібна картина спостерігається й для інших пестицидів і важких металів із цими ферментами.

Таблиця 5. Ступінь інігібування ферментів різними токсинами, %

Примітки: Вміст токсинів у сумішах:

Суміш № 1 10 мкМ Ag+ + 10 мкМ Hg2+ + 10 мкМ трихлорфон + 10 мкМ карбофуран.

Суміш № 3 50 мкМ Ag+ + 20 мкМ Hg2+ + 50 мкМ трихлорфон + 20 мкМ карбофуран.

Суміш № 4 50 мкМ Ag+ + 50 мкМ Hg2+ + 50 мкМ трихлорфон + 50 мкМ карбофуран.

Суміш № 2 - умовно невідома суміш токсичних речовин.

Які саме важкі метали присутні в пробі можна визначити, порівнюючи ступінь інгібування уреази та АцХЕ. Наприклад, Ag+ пригнічує уреазу меншою мірою, аніж Hg2+, а АцХЕ - навпаки. Пестициди можна класифікувати, порівнюючи ступінь інгібування БуХЕ - та АцХЕ- сенсорів. Наприклад, АцХЕ більш стійка до дії карбофурану (концентрація пестициду 100 мкМ, інгібування 50 %), аніж БуХЕ (інгібування - 100%). Отже, маючи всього 3 датчики з різними ферментами, ми можемо не тільки якісно вказати на тип токсичної речовини, що його містить аналізований зразок, а й наблизитися до напівкількісного аналізу.

Для кількісного визначення суміші токсичних речовин у досліджуваній пробі користувалися дискримінантним функціональним аналізом. У цьому випадку виконували попередні експерименти з інгібування ферментів не тільки окремими токсичними речовинами, але й різними їхніми сумішами. Отримані результати заносили до таблиці-матриці (табл. 5), що містила дані стосовно ступеня інгібування ферментів різними токсичними речовинами та їхніми сумішами. Змінними для математичної обробки в цьому випадку є ферменти. Спершу необхідно було нормалізувати дані. Для цього застосовується дискримінантна функція - лінійна комбінація векторів ознак, що характеризують об'єкт і якнайкраще розрізняють сукупність вибраних точок.

Видно, що суміш 2 за своїм складом є близькою до суміші 1. Дійсно, вона складалася з 30 мкM Ag+, 10 мкM Hg2+, 20 мкM трихлорфону і 10 мкM карбофурану, тобто була близькою до суміші 1. Як видно, попри дуже невелику кількість реперних точок для окремих токсичних речовин та їхніх сумішей, даний метод уможливлює проведення напівкількісного аналізу невідомої за своїм складом проби з великою мірою вірогідності. Безумовно, за більшої кількості різних сенсорів (ферментів) і реперних точок для кожного з них точність і якість представлення даних зростає.

Маючи структури з кількома перетворювачами (більше чотирьох) та використовуючи розроблений протокол вимірювань і запропоновану математичну обробку даних, можна виконувати якісний і напівкількісний аналіз токсичних речовин у розчині. Перевагами такої схеми є її здатність до навчання, самоорганізації, генерації внутрішніх сигналів і тренінгу, толерантність до шумів і похибок, наявність асоціативної пам'яті, а найголовніше - придатність до реальних задач моніторингу довкілля.

Але створення таких мультисенсорів - це дуже складне завдання, тому що всі ферменти, які використовуються, повинні функціонувати одночасно в одних і тих же умовах. Також існує проблема стабільності кожного окремого ферменту. До того ж, ціна окремих препаратів ферментів залишається дуже високою.

Використання мікроорганізмів при створенні біосенсорів може вирішити частину проблем, що існують для ферментних біосенсорів. Перш за все вони можуть бути використані як природні мультиферментні системи, за допомогою яких після оптимізації їхніх характеристик можна визначати токсичні речовини. При цьому функціонують вони в своїх природних оптимальних умовах. До того ж, можлива оцінка впливу на їхні властивості різних токсинів.

Як приклад було вибрано зелені мікроводорості Chlorella vulgaris, що можуть бути використані для аналізу фосфатазної активності. Фосфор необхідний для росту мікрофітів, більш того, він є фактором, що лімітує цей процес. Деякі види мікроводоростів можуть існувати за умов гострого дефіциту фосфору. Ці мікрооорганізми здатні зберігати значні кількості фосфору, для цього ферменти фосфатази гідролізують фосфоровмісні сполуки.

Під час реакції продукуються протони та іони, що дає можливість використати для створення біосенсорів кондуктометричні чи потенціометричні перетворювачі.

Значно кращі попередні результати було отримано для кондуктометричного біосенсора на основі мікроводоростів порівняно з потенціометричним. Це може бути пов'язано з тим, що у випадку кондуктометричного перетворювача ми вимірюємо не тільки зміну рН, як у випадку потенціометричного перетворювача на основі рН-чутливих польових транзисторів, але і зміну провідності розчину, до якої призводять інші процеси. Тому подальші дослідження було спрямовано на розробку саме кондуктометричного біосенсора на основі Chlorella vulgaris.

Оскільки лужну фосфатазну активність можна також вимірювати флуоресцентним біометодом з використанням 4-метилумбеліферил-фосфату (MUP), можливе порівняння цього методу з біосенсором. Такі вимірювання базувались на визначенні флуоресценції із застосуванням спектрофлуориметру (Fluostar, BMG).

Проведено оптимізацію роботи біосенсора, вибрано метод іммобілізації клітин, досліджено залежності відгуку біосенсора від концентрації водоростів у мембрані, тривалості витримки датчиків у парах глутарового альдегіду, вибраного субстрату тощо. Біосенсори зберігалися протягом 20 днів у культуральному середовищі без фосфатів при температурі 4 С. Відносне стандартне відхилення відгуків сенсора не перевищувало 8 %.