Вплив сполук важких металів на перебіг фітовірусної інфекції в модельних системах

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ШЕВЧЕНКО ОЛЕКСІЙ ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 578.85/.86

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ сполук ВАЖКИХ МЕТАЛІВ НА ПЕРЕБІГ ФІТОВІРУСНої ІНФЕКЦІї В МОДЕЛЬНИХ СИСТЕМАХ

03.00.06 - вірусологія

КИЇВ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Поліщук Валерій Петрович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функцій білків та пептидів;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Жук Іван Петрович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, старший науковий співробітник відділу фітопатогенних вірусів.

Провідна організація: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ. вірус інфікований рослина цинк

Захист дисертації відбудеться „20” квітня 2004 р. о 16⁰⁰ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, ауд.433.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська 58.

Автореферат розісланий „16” березня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Молчанець.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Поширеність захворювань рослин вірусної етіології в агро- та біоценозах України набуває все загрозливіших форм та наслідків. Культивування одного виду сільськогосподарських рослин протягом тривалого проміжку часу створює оптимальні умови для збільшення різноманітності і накопичення вірусів рослин в агроценозах, що становить загрозу подальшого неконтрольованого поширення вірусних інфекцій на інші території. Відсутність систематичного моніторингу за фітовірусними інфекціями призводить до неможливості прогнозування розповсюдження захворювань та врахування спричинених ними втрат врожаю. Разом з цим, однією з важливих сучасних проблем є підвищення рівня антропогенного забруднення навколишнього середовища важкими металами, які потрапляють в оточуюче середовище, де депонуються, головним чином, у ґрунті. Рослини можуть накопичувати важкі метали, а тому є проміжною ланкою потрапляння важких металів до організму людини та тварин.

Враховуючи вищесказане, агроценози є оптимальним місцем сумісної дії двох стресових чинників на рослини: вірусної інфекції як фактора біотичної природи та важких металів абіотичної. Відомо, як організм рослин відповідає на кожен з даних факторів окремо. Але в умовах сьогодення реакція рослин на сумісну дію обох стресорів є непередбачуваною. З одного боку, можна припустити, що дія двох факторів мала б чинити більш значний негативний вплив на рослину. З іншого, можливою є ситуація, коли вплив одного із стресових факторів індукує таку захисну відповідь рослини, яка потенційно може бути ефективною проти дії стресорів іншої, зокрема вірусної, природи. Тому актуальним постає розуміння механізмів взаємодії вірусної інфекції та сполук важких металів в організмі рослин як стресових факторів біотичної та абіотичної природи. Є принципово важливим показати, як впливає знаходження важких металів у ґрунті на розвиток фітовірусної інфекції та здатність рослин накопичувати вірус, а також на загальний фізіологічний стан рослин при сумісній дії вірусної інфекції та важких металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках наукової теми кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур” (реєстраційний номер №01БФ036-01).

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень було вивчити перебіг вірусної інфекції рослин на прикладі вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) та Х-вірусу картоплі (XВК) під впливом різних концентрацій важких металів у ґрунті.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

оцінити вплив сполук свинцю, цинку та міді на час та ступінь розвитку вірус-індукованих симптомів у інфікованих рослин;

методом імуноферментного аналізу дослідити часову динаміку концентрації вірусу у дослідних рослинах, вирощених у ґрунті з додаванням важких металів;

колориметричними методами оцінити сумісний вплив вірусної інфекції та важких металів на фізіологічні показники стану рослин (вміст сумарного хлорофілу та співвідношення концентрацій хлорофілу a до хлорофілу b) та порівняти його з окремим впливом вірусної інфекції або важких металів;

дослідити вплив важких металів на морфологічні властивості вірусів рослин;

з допомогою люмінесцентної мікроскопії визначити вплив свинцю, цинку та міді у різних концентраціях на здатність інфікованих рослин утворювати вірусні включення.

Об'єкт дослідження - Х-вірус картоплі (Potato virus X, PVX), вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus, TMV), рослини тютюну (Nicotiana tabacum L. cv. trapeson), томатів (Lycopersicon esculentum L. сv. Miliana), картоплі (Solanum tuberosum L. сорт Повінь).

Предмет дослідження - перебіг вірусних інфекцій під впливом важких металів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстровано, що наявність у ґрунті важких металів у високих концентраціях може призводити до більш суворих симптоматичних проявів вірусного інфікування рослин. Показано, що наявність важких металів у ґрунті сприяє накопиченню рослинами вірусів. Вперше встановлено, що за дуже високих концентрацій важких металів у ґрунті відбувається пригнічення утворення вірус-індукованих включень в інфікованих рослинах. Продемонстровано, що сумісний вплив вірусної інфекції та важких металів не справляє синергічного або адитивного ефекту на вміст сумарного хлорофілу та співвідношення концентрацій хлорофілу a до хлорофілу b в рослинах у порівнянні з окремим впливом кожного з факторів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані статистично обґрунтовані результати, які свідчать про значне накопичення сільськогосподарськими рослинами вірусів під впливом важких металів у ґрунті, що становить безпосередню загрозу неконтрольованого поширення вірусів у агроценозах. За отриманими результатами можуть бути розроблені рекомендації щодо контролю вмісту важких металів у ґрунті та нормативів внесення добрив для зменшення різноманітності та розповсюдженості вірусів рослин в агроценозах. Результати досліджень включені в матеріали для написання навчального посібника “Вплив важких металів на перебіг вірусних інфекцій рослин”, який рекомендовано для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів, фахівців з захисту рослин та вірусологів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Інформаційний пошук, опрацювання літературних джерел, розробка схем експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретація автором дисертації здійснені особисто. Підготовку публікацій за отриманими результатами та представлення результатів на наукових конференціях здійснено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на 6-й Міжнародній конференції Європейського товариства фітопатологів „Стійкість до захворювань у фітопатології” (Прага, Республіка Чехія, вересень 2002 р.); Конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (Київ, Україна, грудень 2002 р.); Днях науки у Національному Університеті Києво-Могилянська Академія (Київ, Україна, січень 2003 р.); ІІІ-му З'їзді з Радіаційних Досліджень (Київ, Україна, травень 2003 р.); 1-му Міжнародному Конгресі європейських мікробіологів (Любляна, Словенія, червень-липень 2003 р.); 11-му Міжнародному Конгресі з вивчення молекулярних взаємовідносин рослина-мікроорганізм (Санкт-Петербург, Росія, липень 2003 р.); 6-му Міжнародному Симпозіумі з забруднення навколишнього середовища у Центральній та Східній Європі та СНД (Прага, Республіка Чехія, вересень 2003 р.).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 8 робіт, з них 3 - статті у фахових наукових журналах, 1 - навчальний посібник, 4 - матеріали конференцій.

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 147 сторінок машинописного тексту і складається зі вступу, трьох розділів, узагальнення, висновків, списку літератури, який містить 165 посилань (з яких 138 іноземних авторів). Робота містить 1 таблицю та 49 рисунків.

ЗАГАЛЬНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури наведено сучасні відомості стосовно забруднення важкими металами території України, ролі метал-іонів у структурі вірусних часток, впливу металів на вектори та передачу вірусів рослин. Висвітлені питання перебігу фітовірусної інфекції під дією важких металів, транспорту вірусів у рослині та пост-транскрипційного мовчання генів під впливом важких металів. Також обговорюються наслідки контамінації ґрунтів важкими металами з огляду на різноманіття та розповсюдження вірусів рослин у агроценозах.

Матеріали та методи досліджень

Об'єктами дослідження були Х-вірус картоплі, вірус тютюнової мозаїки, а також рослини Nicotiana tabacum, Lycopersicon esculentum та Solanum tuberosum. Накопичення вірусів здійснювали на рослинах N. tabacum сv. trapeson. Виділення вірусного матеріалу проводили методом диференційного центрифугування (Dorokhov et al., 1983). Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично. Важкі метали - мідь, цинк та свинець - вносилися у ґрунт окремо у формі водорозчинних солей (CuSO₄x5H₂O, ZnSO₄, PbNO₃) (Bonnet et al., 2000). Вміст сумарного хлорофілу та співвідношення концентрацій хлорофілу a до хлорофілу b визначали за методом Арнона та з диметилсульфоксидом (Wellburn, 1994). Для визначення концентрації вірусу в дослідних рослинах застосовували непрямий імуноферментний аналіз (Crowther, 1995). Вірусспецифічні включення у рослинах виявляли методом люмінесцентної мікроскопії з допомогою забарвлення акридиновим оранжевим (Константинова-Шлезингер, 1961). Морфологічні властивості вірусів досліджували методом трансмісивної електронної мікроскопії шляхом негативного контрастування (Hill, 1984). Електрофоретичне дослідження капсидних білків вірусів проводили по Лемлі. Для визначення молекулярних мас білків використовували набір маркерних білків (“Sigma”, США) (кДа): 45, 36, 29, 24, 20.1, 14.2. Статистичний аналіз експериментальних даних проводили за параметричними критеріями нормального розподілу варіант. Стандартне відхилення середніх значень обчислювалися за загальноприйнятою методикою з допомогою програми MS Excel XP (Лакин, 1980).

Результати досліджень та їх обговорення

1. Дослідження перебігу вірусної інфекції у модельній системі PVX-Nicotiana tabacum cv. trapeson. Проводилися лабораторні експерименти у системі PVX-Nicotiana tabacum cv. trapeson. Метали вносилися у концентраціях, які відповідали гранично допустимій концентрації (ГДК) - 1 ГДК. Внесення важких металів у ґрунт не призводило до появи морфологічних змін рослин. Рослини демонстрували нормальний темп росту та розвитку. Встановлено, що, незалежно від додавання важких металів у ґрунт, симптоми у вірус-інфікованих рослин з'являлися на 16 день після інфікування і були типовими для інфекції тютюну Х-вірусом картоплі: м'яка мозаїка з наступним переходом до чорних некротичних дрібних круглих плям на більш дорослих листках.

Для оцінки фізіологічного стану рослин проводилося визначення вмісту хлорофілу. Аналіз динаміки вмісту хлорофілу показав, що, за умов відсутності впливу важких металів, для уражених Х-вірусом картоплі рослин тютюну була характерною менша концентрація хлорофілу у порівнянні зі здоровими інтактними рослинами.

Характерним було незначне підвищення концентрації сумарного хлорофілу, викликане вірусною інфекцією рослин на 14 день після інфікування. На більш пізніх етапах розвитку вірусної інфекції уражені рослини демонстрували значне зниження вмісту хлорофілу у порівнянні з контрольними рослинами, що було особливо характерним для 21 дня після інфікування рослин. Інфіковані Х-вірусом картоплі рослини тютюну, які вирощувалися у ґрунті з додаванням окремої сполуки важкого металу, продемонстрували вищу концентрацію хлорофілу у порівнянні з інтактними рослинами та, особливо, вірус-інфікованими рослинами, які вирощувалися у ґрунті без додавання важких металів. Таким чином, присутність окремих важких металів у концентрації 1 ГДК в даному випадку є фактором, який здатен компенсувати вплив стресу біотичної природи, спричиненого вірусною інфекцією рослин.

2. Дослідження перебігу вірусної інфекції у модельній системі TMV-Lycopersicon esculentum. Оскільки відомо, що віруси рослин можуть використовувати різні механізми системного транспорту, то доцільно було б порівняти розвиток інфекції, індукованої Х-вірусом картоплі, з вірусною інфекцією, спричиненою ВТМ. Метою роботи було прослідкувати зміни у перебігу вірусної інфекції в умовах високого вмісту окремих важких металів в ґрунті. Мідь, цинк та свинець вносилися у ґрунт у формі розчинних солей у концентрації 10 ГДК. Причиною вибору високої концентрації важких металів була необхідність відстежити розвиток вірусної інфекції в рослинах, які знаходяться під впливом стресу абіотичної природи.

Проведені дослідження показали, що в інфікованих контрольних рослинах симптоми з'явилися на 19 день після інфікування. Така ж картина спостерігалася у випадку інфікованих рослин, які вирощувалися у ґрунті з додаванням солей міді або цинку. На відміну від цього, симптоми вірусного ураження рослин, які вирощувалися у ґрунті з додаванням свинцю, розвинулися лише на 26 день. Індуковані на рослинах симптоми вірусної інфекції не залежали від наявності чи відсутності металу у ґрунті і були типовими для інфікування томатів вірусом тютюнової мозаїки: мозаїка листків з наступним розвитком їх деформації. Відмінностей у типі індукованих вірусною інфекцією симптомів чи їх суворості в залежності від внесеного у ґрунт важкого металу не було відмічено.

Надалі проводився аналіз вмісту сумарного хлорофілу для оцінки фізіологічного стану рослин під впливом обох стресових чинників. Аналіз динаміки вмісту сумарного хлорофілу в неінфікованих рослинах томатів, вирощених з додаванням важких металів, показав, що важкі метали призводять до помітного зменшення концентрації хлорофілу у порівнянні зі здоровими інтактними рослинами.

Одночасна дія вірусної інфекції та солей важких металів на дослідні рослини призводила до збільшення амплітуди коливань концентрації сумарного хлорофілу, що особливо помітно у випадку інфікованих рослин, оброблених свинцем або міддю, для яких було характерним найсуттєвіше зменшення концентрації.

Крім вмісту сумарного хлорофілу, використовується також інший спектрометричний показник фізіологічного стану рослин - співвідношення між концентраціями хлорофілу a та хлорофілу b, який дозволяє окремо оцінити чутливість кожного з двох компонентів до дії стресових чинників. У інтактних рослин томатів це співвідношення характеризувалося наявністю двох максимумів - на 7 та 22 день після внесення металів у ґрунт та одним мінімумом на 14 день. При додаванні у ґрунт солей цинку та свинцю за відсутності вірусної інфекції значення першого максимуму зменшувалося у півтора рази. Оскільки концентрація сумарного хлорофілу в даний період часу практично не відрізнялася від його вмісту в інтактних рослинах, то наведені результати свідчать про часткову деградацію хлорофілу a, але не хлорофілу b під впливом цинку та свинцю.

Паралельно з аналізом хлорофілу, проводилося дослідження накопичення ВТМ у рослинах томатів. При аналізі вмісту вірусу у рослині з часом помітно, що для контрольних інфікованих рослин характерним є збільшення концентрації вірусу до 14-16 дня після інфікування з наступним поступовим зменшенням його концентрації до 28 дня. Максимум концентрації вірусу у контрольних необроблених металами рослинах становив 70 мкг/г сирої маси. Максимальна концентрація вірусу у рослинах під впливом іонів міді становила лише 21 мкг/г і досягала цього значення на 22 день. При обробці інфікованих рослин свинцем та цинком вміст вірусу сягав значень 192 та 163 мкг/г, відповідно, з максимумом на 22-24 день.

Узагальнюючи отримані результати, потрібно зауважити, що одночасний вплив вірусної інфекції та високих концентрацій солей важких металів (10 ГДК), особливо свинцю і міді, призводив до зменшення вмісту сумарного хлорофілу шляхом деградації хлорофілу a у дослідних рослинах томатів, більш значного при порівнянні з окремим впливом кожного з чинників.

Обробка рослин токсичними концентраціями важких металів затримувала розвиток системної вірусної інфекції, але не перешкоджала йому в цілому. Цинк та свинець, на відміну від міді, суттєво інтенсифікували процес накопичення вірусу рослинами, призводячи до збільшення його концентрації у два та більше разів.

3. Дослідження перебігу вірусної інфекції у модельній системі PVX-Solanum tuberosum. Метою подальших експериментів був аналіз динаміки вірусної інфекції рослин, які вирощувалися у ґрунті з різним рівнем контамінації важкими металами, від середнього (5 ГДК) до високого (10 ГДК) та надвисокого (50 ГДК).

Рослини, що підлягали впливу важких металів, не відрізнялися від інтактних у ступені розвитку пагону та листків. Однак, додавання солей цинку, міді або свинцю у ґрунт у концентраціях 5, 10 та 50 ГДК призводило до появи симптомів токсикозу на рослинах картоплі, які характеризувалися хлоротичним пожовтінням нижніх листків з наступним розвитком бурих некротичних плям, розташованих переважно уздовж жилок та на кінчиках листків.

При дослідженні динаміки появи вірус-індукованих симптомів було виявлено, що в інфікованих Х-вірусом картоплі контрольних рослинах симптоми з'явилися на 14 день після інфікування. Вірус-індуковані симптоми характеризувалися розвитком помірної мозаїки листків. Значної деформації листків не спостерігалося. Внесення важких металів у ґрунт суттєво впливало на час появи симптомів вірусного ураження на рослинах. У рослин, які вирощувалися у ґрунті, контамінованому цинком, міддю або свинцем (5, 10 або 50 ГДК), спостерігався розвиток вірус-специфічних симптомів лише на 21 день після інфікування. На відміну від контрольних інфікованих рослин, внесення будь-якого з важких металів у концентрації 10 ГДК призводило до розвитку більш суворої мозаїки молодих листків на 28 день після інфікування.

Листки також характеризувалися меншим розміром, скрученістю та значною деформацією, що було особливо характерним для інфікованих рослин, які оброблялися цинком або міддю.

Аналіз вмісту сумарного хлорофілу у неінфікованих рослинах картоплі, вирощених з додаванням важких металів, показав, що важкі метали індукують зменшення концентрації хлорофілу. Найбільш суттєві зміни мали місце при внесенні металів у концентрації 10 та 50 ГДК.

Дослідження вмісту хлорофілу у вірус-інфікованих рослин свідчить, що на початкових етапах вірусна інфекція індукує незначне підвищення рівня пігменту у рослинах картоплі.

На 14-22 день після інфікування ХВК концентрація хлорофілу в рослинах зменшувалася. Сумісна дія вірусної інфекції та металів також індукувала зменшення вмісту хлорофілу.

Проводився також аналіз співвідношення між концентраціями хлорофілу a та хлорофілу b (С_А/С_В). Співвідношення С_А/С_В інтактних рослин картоплі характеризувалося двома максимумами (на 7 та 28 день після внесення металів у ґрунт) та мінімумом на 14 день.

Внесення будь-якого з важких металів у ґрунт у будь-якій з дослідних концентрацій призводило до збільшення мінімуму на 14 день після внесення металів у ґрунт. Оскільки важкі метали викликали зменшення вмісту сумарного хлорофілу на 14 день після внесення металів у ґрунт, то збільшення даного мінімуму співвідношення С_А/С_В спостерігалося внаслідок зменшення питомої концентрації хлорофілу b. Аналогічна ситуація мала місце при внесенні металів у ґрунті у концентрації 5, 10 та 50 ГДК.

Інфікування дослідних рослин Х-вірусом картоплі також призводило до значного підвищення мінімуму співвідношення С_А/С_В на 14 день після внесення металів у ґрунт, у порівнянні з інтактними рослинами. Оскільки вірусна інфекція призводила до зменшення вмісту сумарного хлорофілу у той же проміжок часу, то підвищення співвідношення С_А/С_В на 14 день після інфікування також є наслідком зменшення питомої концентрації хлорофілу b, а не хлорофілу a. У випадку сумісної дії вірусної інфекції та важких металів у надвисоких концентраціях (50 ГДК) спостерігалися подібні зміни у динаміці співвідношення концентрацій хлорофілу a та хлорофілу b. У порівнянні з інтактними рослинами, досліджувані метали та вірусна інфекція викликали підвищення співвідношення С_А/С_В на 14 день після інфікування через зменшення питомої концентрації хлорофілу b.

Паралельно проводився аналіз накопичення Х-вірусу картоплі у рослинах картоплі. Продемонстровано, що для вірус-інфікованих рослин, які вирощувалися без додавання важких металів у ґрунт, є характерною максимальна акумуляція вірусу на 14-21 день після інфікування.

Максимальне накопичення вірусу даними рослинами становило 25 мкг/г тканини і співпадало у часі з появою та розвитком перших симптомів ураження.

Внесення будь-якого з досліджуваних металів у ґрунт у концентрації 5 ГДК призводило до більш значного накопичення вірусу рослинами у порівнянні з контрольними у весь проміжок часу. Так, під впливом свинцю спостерігалася акумуляція вірусу до 32 мкг/г тканини (14-21 день після інфікування), міді - 36 мкг/г (18-22 день після інфікування). Динаміка накопичення вірусу рослинами під впливом міді та свинцю (5 ГДК) була подібною до динаміки інфікованих контрольних рослин. На противагу цьому, цинк у даній концентрації не призводив до падіння вмісту вірусу у рослинах пізніше 21 дня після інфікування, а індукував подальше накопичення PVX, концентрація якого в рослинах на 42 день після інфікування перевищувала 40 мкг/г тканини.

На відміну від свинцю, внесення цинку та міді у концентрації 10 ГДК індукувало значні зміни в акумуляції вірусу рослинами. Головною відмінністю була відсутність фази „плато” у динаміці накопичення рослинами S. tuberosum PVX, за якою в нормі мав би спостерігатися спад вмісту вірусу.

Навіть на 42 день після інфікування рослин не відмічалося достовірних зменшень у концентрації Х-вірусу картоплі в рослинах, оброблених міддю або цинком. Навпаки, вміст вірусу з часом збільшувався і на день останнього виміру його концентрація становила 62 мкг/г тканини під дією кожного з металів.

У порівнянні з індукуючим впливом середніх (5 ГДК) та високих (10 ГДК) концентрацій важких металів, надвисокі концентрації цинку, міді та свинцю у ґрунті (50 ГДК) не індукували інтенсивного накопичення Х-вірусу картоплі дослідними рослинами. Максимальний вміст вірусу у рослинах, що були оброблені важкими металами, становив 25 мкг/г тканини, що відповідає значенню контрольних рослин.

Таким чином, обробка рослин середніми (5 ГДК) та високими (10 ГДК) концентраціями важких металів сприяла розвитку симптомів системної вірусної інфекції та накопиченню рослинами картоплі ХВК. Особливо суттєво накопичення Х-вірусу картоплі стимулювали цинк та мідь у концентрації 10 ГДК. Внесення важких металів у надвисоких концентраціях (50 ГДК) не призводило до інтенсифікації накопичення рослинами вірусу.

4. Дослідження вірус-індукованих включень у модельній системі PVX-Solanum tuberosum. Аналізувалися вірус-інфіковані рослини картоплі, які вирощувалися у ґрунті з додаванням свинцю, цинку та міді у концентрації 10 та 50 ГДК, у порівнянні з інтактними рослинами. Вибір концентрацій металів базувався на тому, що всі досліджувані метали у концентрації 10 ГДК індукували значне накопичення Х-вірусу картоплі, чого не спостерігалося у випадку підвищення вмісту металів у ґрунті до 50 ГДК.

Було продемонстровано, що інтактні рослини не утворювали РНК-вмісних включень в клітинах нижнього листкового епідермісу. На противагу цьому, інфікування рослин картоплі Х-вірусом картоплі призводило до утворення цитоплазматичних РНК-вмісних включень, забарвлених у оранжевий колір. Внесення у ґрунт важких металів у концентрації 10 ГДК не впливало на розвиток включень у вірус-інфікованих рослинах картоплі. Відмінностей при порівнянні інфікованих контрольних рослин та інфікованих рослин, які вирощувалися у ґрунті з додаванням свинцю, цинку або міді у концентрації 10 ГДК, виявлено не було. На противагу цьому, внесення у ґрунт важких металів у надвисоких концентраціях (50 ГДК) призводило до повної відсутності вірус-специфічних включень у клітинах рослин S. tuberosum, інфікованих ХВК.

Таким чином, присутність у ґрунтах важких металів у дуже високих концентраціях здатна пригнічувати утворення вірус-інфікованими рослинами цитоплазматичних РНК-вмісних включень.

5. Вивчення впливу високої концентрації важких металів у рослинах на характеристики вірусних часток. З метою вивчення впливу високої концентрації важких металів у рослині на морфологію віріонів вірусу тютюнової мозаїки проводився електронно-мікроскопічний аналіз вірусу, виділеного з рослин томатів. Було показано, що внесення свинцю, міді чи цинку (10 ГДК) у ґрунт не впливало на морфологічні властивості даного вірусу. Віріони ВТМ характеризувалися типовою морфологією та розмірами, які становили 300±2 Х 18±0.5 нм. Аналогічно до ВТМ, показано, що високий вміст металів у рослинах також не впливає на морфологію ХВК, розміри якого відповідали літературним даним і становили 515±3 х 13±1 нм.

Проводилося дослідження капсидних білків вірусу тютюнової мозаїки та Х-вірусу картоплі, виділених з рослин Lycopersicon esculentum та Solanum tuberosum, відповідно, які вирощувалися з додаванням у ґрунт міді, цинку або свинцю у концентрації 10 ГДК. Продемонстровано, що вирощування інфікованих рослин при високих концентраціях важких металів у ґрунті не впливає на масу капсидного білка ВТМ, яка становила 18±0.5 кДа. Маса капсидного білка Х-вірусу картоплі також відповідала літературним даним і становила близько 30±0.5 кДа.

Отже, висока концентрація важких металів у ґрунті не впливає на молекулярні маси капсидних білків ВТМ та ХВК.

ВИСНОВКИ

Вперше встановлено, що внесення у ґрунт важких металів у високих концентраціях призводить до затримки появи вірусспецифічних симптомів, індукованих ВТМ та ХВК. Високий вміст важких металів (10 ГДК) викликає розвиток більш суворих симптомів у вигляді значної деформації листків інфікованих рослин у порівнянні з контрольними рослинами.

Показано, що наявність важких металів у ґрунті сприяє накопиченню рослинами вірусів. Так, внесення свинцю або цинку у ґрунт у концентрації 10 ГДК індукувало підвищення концентрації ВТМ у рослинах томатів у 2.7 та 2.3 рази, відповідно. При інфікуванні рослин картоплі ХВК, контамінація ґрунту міддю та цинком (10 ГДК) призводила до збільшення концентрації ХВК в рослинах у 2.5 рази.

Встановлено, що вплив вірусної інфекції на рослини компенсується внесенням важких металів у ґрунт у нетоксичних концентраціях. Протекторна дія міді, цинку та свинцю проявляється у вигляді збільшення вмісту сумарного хлорофілу в рослинах, які підлягали впливу металів та вірусної інфекції, у порівнянні з окремим впливом вірусної інфекції.

Вірусна інфекція, індукована ВТМ або ХВК, та важкі метали у токсичних концентраціях (5-50 ГДК) викликають зменшення вмісту сумарного хлорофілу у рослинах томатів та картоплі при окремій та комбінованій дії. Виявлено, що сумісна дія обох факторів індукує суттєвіше зменшення вмісту хлорофілу, однак не має адитивного чи синергічного характеру.

Продемонстровано, що зменшення вмісту сумарного хлорофілу у рослинах томатів та картоплі під впливом вірусної інфекції та важких металів відбувається внаслідок зменшення питомої концентрації хлорофілу a та b, відповідно, але не за рахунок обох типів хлорофілу.

Встановлено, що вплив важких металів не індукує змін морфологічних властивостей ВТМ та ХВК, а також маси їх капсидних білків.

Вперше показано, що контамінація ґрунту важкими металами у надвисоких концентраціях (50 ГДК) перешкоджає утворенню вірусспецифічних цитоплазматичних включень в епідермальних клітинах рослин картоплі, інфікованих ХВК, в той час як метали у концентрації 5 та 10 ГДК не впливають на їх утворення.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шевченко О.В., Будзанівська І.Г., Шевченко Т.П., Поліщук В.П. Вплив важких металів на перебіг вірусної інфекції тютюну // Наукові Записки НаУКМА. Серія: Біологія та Екологія. -2002. -Т.20. -С. 20-23.

2. Шевченко О.В., Будзанівська І.Г., Шевченко Т.П., Бойко А.Л., Патика В.П., Поліщук В.П. Вплив забруднення довкілля важкими металами на розвиток вірусної інфекції рослин // Агроекологічний журнал. -2002. -Спец. вип. -С. 62-72.

3. Shevchenko A.V., Budzanivska I.G., Shevchenko T.P., Polischuk V.P. Stress Caused by Plant Virus Infection in Presence of Heavy Metals // Plant Protection Science. -2002. -V.38, Issue 2. -P. 455-457.

4. Шевченко О.В., Будзанівська І.Г., Патика В.П., Бойко А.Л., Поліщук В.П. Вплив важких металів на перебіг вірусних інфекцій рослин. -К.: Фітосоціоцентр. -2003. -224 с.

5. Polischuk V.P., Budzanivska I.G., Shevchenko T.P., Shevchenko A.V. Occurrence of plant virus infections in radioactively contaminated biocenoses // Матеріали ІІІ-го З'їзду з Радіаційних Досліджень. 21-25 травня 2003, Київ, Україна. -С. 418.

6. Shevchenko A.V., Budzanivska I.G., Shevchenko T.P., Polischuk V.P. Changes in the course of plant viral infection under the influence of elevated level of various heavy metals in soil // Abstract Book of The 1^st FEMS Congress of European Microbiologists. 29 June - 3 July 2003, Ljubljana, Slovenia. -Р. 484.

7. Shevchenko A.V., Budzanivska I.G., Shevchenko T.P., Polischuk V.P. Tobacco mosaic virus content is variously affected in tomato plants by heavy metals amended in soil // Volume of Abstracts of The 11^th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. 18-26 July 2003, St.Petersburg, Russia. -P. 174.

8. Budzanivska I.G., Shevchenko A.V., Polischuk V.P. Medium content of heavy metals in soil may partially compensate development of viral infections in plants // Abstract Book of The 6^th International Symposium & Exhibition on Environmental Contamination in Central and Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States. 1-4 September 2003, Prague, Czech Republic. -P. 99.

АНОТАЦІЯ

Шевченко О.В. Вплив сполук важких металів на перебіг фітовірусної інфекції в модельних системах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2004.

Дисертація присвячена вивченню розвитку фітовірусної інфекції, індукованої вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ) та Х-вірусом картоплі (ХВК), під впливом важких металів. Встановлено, що контамінація ґрунту металами призводить до затримки появи вірусспецифічних симптомів на 5-7 діб. Високий вміст металів (10 гранично допустимих концентрацій, ГДК) викликає розвиток більш суворих симптомів у вигляді значної деформації листків.

Продемонстровано, що наявність важких металів у ґрунті у середніх та високих концентраціях (5 та 10 ГДК, відповідно) призводить до суттєвого підвищення вмісту вірусу у рослинах. Так, свинець або цинк у концентрації 10 ГДК індукували підвищення концентрації ВТМ у рослинах томатів у 2.7 та 2.3 рази, відповідно. Внесення свинцю, міді або цинку (5 ГДК) призводило до збільшення вмісту ХВК у рослинах картоплі у 1.3, 1.4 та 1.6 рази, відповідно. Підвищення вмісту міді або цинку до 10 ГДК індукувало збільшення вмісту ХВК у 2.5 рази.

Встановлено, що контамінація ґрунтів важкими металами у надвисоких концентраціях (50 ГДК) перешкоджає утворенню вірусспецифічних цитоплазматичних включень в епідермальних клітинах рослин картоплі, інфікованих ХВК.

Продемонстровано, що одночасний вплив вірусної інфекції та важких металів у нетоксичних концентраціях (1 ГДК) викликають підвищення вмісту сумарного хлорофілу рослин тютюну, на відміну від інгібуючого впливу вірусної інфекції, викликаної ХВК, що свідчить про компенсацію впливу вірусної інфекції важкими металами у нетоксичних концентраціях. Важкі метали у токсичних концентраціях (5-50 ГДК) викликають зменшення вмісту хлорофілу у рослинах томатів і картоплі при окремій та комбінованій дії з вірусною інфекцією (ВТМ та ХВК, відповідно). Сумісна дія обох чинників індукує суттєвіше зменшення вмісту хлорофілу, однак не має адитивного чи синергічного характеру. Показано, що зменшення вмісту сумарного хлорофілу у рослинах томатів та картоплі відбувається внаслідок зменшення питомої концентрації хлорофілу a та b, відповідно, але не за рахунок обох типів хлорофілу.

Продемонстровано, що вплив важких металів не індукує змін морфологічних властивостей ВТМ та ХВК, а також маси їх капсидних білків.

Ключові слова: вірус тютюнової мозаїки, Х-вірус картоплі, включення, важкі метали, ГДК, хлорофіл.

АННОТАЦИЯ

Шевченко А.В. Влияние соединений тяжелых металлов на развитие фитовирусной инфекции в модельных системах. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению развития фитовирусной инфекции, индуцированной вирусом табачной мозаики (ВТМ) и Х-вирусом картофеля (ХВК), под влиянием тяжелых металлов. Установлено, что контаминация почвы металлами приводит к задержке появления вирусспецифических симптомов на растениях на 5-7 дней. Высокое содержние металлов (10 предельно допустимых концентраций, ПДК) вызывает развитие более суровых симптомов в виде значительной деформации листьев.

Продемонстрировано, что наличие тяжелых металлов в почве в средних и высоких концентрациях (5 и 10 ПДК, соответственно) ведет к существенному повышению содержания вируса в растениях. Так, свинец или цинк в концентрации 10 ПДК индуцировали повышение концентрации ВТМ в растениях томатов в 2.7 и 2.3 раза, соответственно. Внесение свинца, меди или цинка (5 ПДК) приводило к повышению концентрации ХВК в растениях картофеля в 1.3, 1.4 и 1.6 раза, соответственно. Повышение содержания меди и цинка до 10 ПДК индуцировало увеличение концентрации ХВК в растениях в 2.5 раза.

Установлено, что контаминация почвы тяжелыми металлами в сверхвысоких концентрациях (50 ПДК) препятствует образованию вирусспецифических цитоплазматических включений в эпидермальных клетках растений картофеля, инфицированных ХВК.

Продемонстрировано, что одновременное влияние вирусной инфекции и тяжелых металлов в нетоксических концентрациях (1 ПДК) вызывают повышение концентрации суммарного хлорофилла растений табака, в отличие от ингибирующего влияния вирусной инфекции, вызванной ХВК, что говорит о компенсации влияния вирусной инфекции тяжелыми металлами в нетоксических концентрациях. Тяжелые металлы в токсических концентрациях (5-50 ПДК) вызывают уменьшение содержания хлорофилла в растениях томатов и картофеля при отдельном и совместном влиянии с вирусной инфекцией (ВТМ и ХВК, соответственно). Совместное действие обоих факторов индуцирует более значительное уменьшение концентрации хлорофилла, однако не имеет аддитивного или синергического характера. Показано, что уменьшение содержания суммарного хлорофилла в растениях томатов и картофеля происходит вследствие уменьшения удельной концентрации хлорофилла a и b, соответственно, но не за счет обоих типов хлорофилла.

Продемонстрировано, что влияние тяжелых металлов не индуцирует изменений морфологических свойств ВТМ и ХВК, а также массы их капсидных белков.

Ключевые слова: вирус табачной мозаики, Х-вирус картофеля, включения, тяжелые металлы, ПДК, хлорофилл.

SUMMARY

Shevchenko O.V. Influence of heavy metal compounds on the development of plant virus infection in model systems. - Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2004.

The thesis is concerned on investigation of plant virus infection induced by tobacco mosaic virus (TMV) and potato virus X (PVX) under effect of heavy metals. Obtained results of virus infection symptoms' development demonstrated that soil contamination with heavy metals copper, lead or zinc lead to 5-7 day delay in the appearance of virus-specific symptoms. High content of heavy metals in soil (10 maximum permissible concentrations, MPC) induces the development of more severe symptoms, i.e. significant leaves' deformation of virus-infected plants.

Using ELISA technique it's been demonstrated that presence of medium and high concentrations of heavy metals in soil (5 and 10 MPC, respectively) results in considerable increase of virus content in plants. Amendment of soil with lead or zinc in 10 MPC induced 2.7- and 2.3-fold respective increase of TMV concentration in tomato plants. Similarly, input of lead, copper or zinc in soil (5 MPC) resulted in 1.3-, 1.4- and 1.6-fold correspondent increase in PVX content in potato plants. Raise of copper and zinc content in soil to 10 MPC induced the 2.5-fold increase of PVX concentration in potato plants.

According to the achieved results of luminescent microscopy, soil contamination with heavy metals in superhigh concentrations (50 MPC) prevents the development of virus-specific cytoplasmic inclusion bodies in epidermal cells of PVX-infected potato plants.

Colorimetric analysis of total chlorophyll content showed that heavy metals amended in non-toxic concentrations (1 MPC) induce an 1.1-1.3-fold increase in chlorophyll content of tobacco plants, contrary to inhibiting effect of PVX infection (1.1-fold decrease). Simultaneous influence of both factors resulted in 1.1-1.2-fold increase in tobacco plants comparing to intact ones, which proves a fact of possible compensation of negative effect of virus infection on plants by heavy metals amended in soil in 1 MPC. Being amended in toxic concentrations (5-50 MPC), heavy metals lead to decrease of total chlorophyll content in tomato and potato plants (infected by TMV and PVX, respectively, or not). It's shown that combined effect of both stress factors induces more significant decrease in total chlorophyll content, yet not possessing additive or synergistic character. The results of the investigation demonstrated that the decrease of total chlorophyll content in tomato and potato plants is due to the decrease of chlorophyll a and chlorophyll b specific concentration, respectively, but not to the decrease of both types of chlorophyll.

It's been revealed that heavy metals do not induce changes in morphological characteristics of TMV and PVX, or mass of their coat proteins.

Key words: tobacco mosaic virus, potato virus X, inclusion bodies, heavy metals, MPC, chlorophyll.

Размещено на Allbest.ru