Роль іонів кальцію, калію, натрію і транспортних АТФаз у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

РОЛЬ ІОНІВ КАЛЬЦІЮ, КАЛІЮ, НАТРІЮ І ТРАНСПОРТНИХ АТФАЗ У ЗБЕРЕЖЕННІ БІОЛОГІЧНОЇ ПОВНОЦІННОСТІ СПЕРМАТОЗОЇДІВ

Спеціальність: Біохімія

МАКСИМ'ЮК ГАННА ВАСИЛІВНА

Львів, 2004 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Питання збереження біологічної повноцінності сперматозоїдів в умовах постійно зростаючого шкідливого впливу чинників техногенного походження на організм чоловіків сьогодні особливо актуальне. Загальноприйняті методи діагностики неплідності, а саме: клініко-морфологічні, цитологічні, імунологічні, бактеріологічні та інші не завжди вказують на причину зниження життєздатності і біологічної повноцінності сперматозоїдів, не розкривають механізму змін, а також недостатньо точно і повно його відображають (Дубоссарская З.М., 1990, Leijonhufvud K.G., 1997, 1998, Николаев А.А., 1998, Неймарк А.И., 1998, 2000). У цьому зв'язку відомо, що внутрішньоклітинний гомеостаз Са2+, К+, Na+ досягається завдяки складній і координованій системі їх пасивного та активного транспорту, а Na+, K+- та Са2+, Мg2+, АТФази належать до систем, які здійснюють первинний активний транспорт іонів та формують на мембрані електрохімічні градієнти. Їх енергія використовується для забезпечення життєдіяльності клітин і підтримання гомеостазу іонів (Ljulko А.V., 1997, Кравцов О.В., 2000, 2001). До того ж іони кальцію як внутрішньоклітинні месенджери регулюють процеси, які ініціюють рухливість, капаситацію і акросомну реакцію сперматозоїдів (Breitbart H., 1985, 1997).

Ймовірно також, що зміна активності Са2+-транспортувальних систем, зокрема Са2+, Mg2+, АТФаза, повинна впливати не лише на внутрішньоклітинний гомеостаз Са2+, але й на інші іонтранспортувальні системи і гомеостаз К+ та Na+. Тому дослідження спрямовані на вивчення механізмів енергозалежного і незалежного трансмембранного переміщення іонів, повинні привести до встановлення закономірностей, які лежать в основі рухливості, акросомної реакції і запліднювальної здатності сперматозоїдів. Якщо виходити з даної точки зору, то пізнання ролі концентрації іонів макроелементів у збереженні життєздатності і біологічної повноцінності сперматозоїдів дозволить розробити методи корекції їх динамічної рівноваги в системі "клітина-середовище". З огляду на важливу роль біологічної повноцінності сперматозоїдів у репродукції людини проведені нами дослідження, які спрямовані на вивчення іонного гомеостазу і змін життєво важливих процесів, що пов'язані з перерозподілом катіонів з обох сторін цитоплазматичної мембрани та активністю АТФаз, мають не лише теоретичне, але і практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у рамках двох тем: "Роль іонів кальцію, калію, натрію і транспортних АТФаз у збереженні біологічної повноцінності сперматозоїдів" (шифр державної реєстрації № 0196И024411) і "Вивчити механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних органах, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції процесів відтворення. Удосконалити склад інкубаційних середовищ для запліднення in vitro" (шифр державної реєстрації № 198U009013), в яких автор вивчала вплив ендо- і екзогенних чинників на гомеостаз Са2+, К+, Na+ та активність транспортних АТФаз.

Мета і задачі дослідження. З'ясування значення показників концентрації катіонів та їх співвідношень для диференційного діагностування патологічних процесів, що ведуть до змін якості сперми.

Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:

- в еякулятах різної якості, які поділили на групи з низьким (НВК), середнім (СВК) і високим (ВВК) вмістом іонів калію, визначити рівні концентрації Са2+, К+, Na+ і співвідношень одно- (Са2+, Са2+, К+, К+, Na+, Na+) та різноіменних (Na+, Ca2+, Na+, K+, K+, Ca2+) пар іонів у плазмі, сперматозоїдах та між плазмою і сперматозоїдами;

- встановити зв'язки між показниками вмісту іонів і активності Na+, K+- та Ca2+, Mg2+, АТФаз з показниками якості сперми при нормо- та олігозооспермії;

- встановити зв'язки між іонами Са2+, К+, Na+ залежно від тривалості зберігання (0-24 год.) сперми в умовах нормо- (37°С) і гіпотермії (2°С);

- визначити ступінь змін структури і форми сперматозоїдів;

- визначити рівні концентрації і співвідношень іонів, які здатні забезпечити збереження максимально можливої кількості життєздатних і біологічно повноцінних сперматозоїдів в еякулятах.

Об'єкт дослідження. Вміст, розподіл, співвідношення і транспорт Са2+, К+, Na+ та активність Na+, К+-, Са2+, Мg2+, АТФаз у спермі чоловіків.

Предмет дослідження. Особливості змін гомеостазу іонів та активності транспортних АТФаз у системі "клітина-середовище" при нормо- і олігозооспермії.

Методи дослідження. Визначення активності Са2+, Mg2+- та Nа+, K+-АТФаз, концентрації Са2+, К+, Na+, білка і вмісту неорганічного фосфату. Сперктрофотометрія, полум'яна фотометрія, електрофотоколориметрія, рН-метрія, світлова та електронна мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше біологічну повноцінність сперматозоїдів у спермі чоловіків визначено за індивідуальними показниками низького, середнього та високого вмісту К+, який обумовлює асиметричний розподіл, або високу концентрацію іонів у плазмі і низьку у сперматозоїдах.

Визначений в умовах нормозооспермії асиметричний розподіл Са2+, К+, Na+ підтверджено зворотним зв'язком для співвідношень одноіменних пар Са2+, Са2+, К+, К+, Nа+, Nа+ між плазмою та сперматозоїдами і прямим зв'язком для різноіменної пари Са2+, К+ у плазмі та сперматозоїдах.

Доведено негативний вплив ендо- (олігозооспермія) і екзогенних (температура і тривалість зберігання сперми) чинників на гомеостаз іонів у системі "клітина-середовище". В еякулятах дослідних груп виявлено неоднакову активність транспортних АТФаз і різну стійкість сперматозоїдів до дії екстремальних чинників.

Практичне значення роботи. Результати досліджень вказують на можливе значення концентрацій і співвідношеннь одно- і двовалентних катіонів у плазмі та сперматозоїдах еякулятів хворих чоловіків (олігозооспермія) для діагностики патологічних процесів та розробки способів корекції функціонального стану сперматозоїдів в еякулятах. У цьому зв'язку можна також ставити питання про використання нових фармакологічних препаратів, здатних регулювати інтенсивність входу у сперматозоїди і виходу з них іонів з метою збереження або відновлення відповідного рівня їх динамічної рівноваги у системі "клітина-середовище".

Матеріали досліджень можуть бути використані як теоретичний, практичний і демонстраційний матеріал на лекціях з біохімії, нормальної і патологічної фізіології у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно, за винятком електронномікроскопічних досліджень, освоїла і використала методи, виконала експериментальну частину, провела статистичний аналіз, сформулювала основні висновки і підготувала до друку матеріали роботи.

Визначення завдань роботи, аналіз і обговорення результатів проведених досліджень здійснено спільно з науковим керівником.

При виконанні морфометричних досліджень автор співпрацювала з лабораторією електронної мікроскопії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.

Апробація результатів досліджень.

Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: Міжнародній конференції студентів та молодих вчених (Львів, 7-9.10.1999 р.), Міжнародній конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, 27-29.01.2000 р.), Міжнародній конференції "С. З. Гжицький і сучасна аграрна наука" (Львів, 4-6.05.2000 р.), 3-й Міжнародній Парнасівській конференції "Механізми передачі клітинного сигналу та комунікацій" (Львів, 14-18.10.2000 р.).

Публікації. Результати досліджень висвітлено у 10 друкованих роботах, з них: 5 - у фахових наукових виданнях, що відповідають вимогам ВАК України до публікацій основних результатів дисертацій, 3 - у наукових журналах, 2 - у тезах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, методів і результатів досліджень, їх аналізу й обговорення, а також списку використаної літератури з 259 джерел. Матеріал надруковано на 148 сторінках, ілюстровано 33 рисунками і 18 таблицями. Загальний обсяг ілюстрацій і таблиць - 24 сторінок, списку використаних джерел - 23.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідили 263 еякуляти пацієнтів Львівської обласної клінічної лікарні віком 27-31 року. Еякуляти ділили на дві групи - високої та низької якості.

До групи високої якості відносили еякуляти об'єм яких не виходив за межу 2-4 мл., концентрація сперматозоїдів становила 60-120 млн/мл сперми, рухливість - 70-80%, а кількість патологічних форм - 20-30% (Юнда И.Ф., 1973, WHO, 1992). Якщо показники якості сперми виходили за межу наведених параметрів, то еякуляти зараховували до групи низької якості.

Для пермеабілізації мембран сперматозоїдів та розкриття латентної активності транспортних АТФаз використовували методики (Воробець З.Д., 1984, Орлов С.Н., 1989).

Активність Na+, K+- та Ca2+, Mg2+, АТФаз визначали за методикою (Ткачук В.А., 1999). При дослідженні АТФазних активностей визначення вмісту неорганічного фосфату проводили за методикою (Fiske С.H., Subbarow J., 1925), концентрацію білка - за методикою (Lowry O., 1951).

За встановленими у плазмі і сперматозоїдах концентраціями Са2+, К+ і Na+ еякуляти додатково ділили на три групи - з низьким (НВК), середнім (СВК) і високим (ВВК) вмістом калію (Звєрєва Г.В., 1991, 1992).

Оцінку особливостей переміщення іонів у системі "клітина-середовище" здійснювали за методикою описаною (Максим'юк В.М., 1995). Контроль за станом структури і форми сперматозоїдів проводили за допомогою електронного мікроскопа (Goldin S.M., 1977, Карупу В.Я., 1984, Звєрєва Г.В., 1992). Результати досліджень аналізували методом варіаційної статистики (Плохинский Н.А., 1970) з використанням пакета програм Microsoft Excel для персонального комп'ютера типу Pentium.

Зв'язок іонів з показниками якості сперми. Проведені у 1998-2001 р. дослідження сперми пацієнтів Львівської обласної клінічної лікарні показали, що із 263 еякулятів проаналізованої вибірки 123, або 46%, містять низький (13 мм.), 65, або 25%, - середній (21 мм.), а 75, або 29%, - високий (31 мм.) сумарні (плазма + сперматозоїди) рівні концентрації іонів калію.

При цьому концентрація Са2+, К+, Nа+ у плазмі еякулятів усіх дослідних груп вища, ніж у сперматозоїдах. Це дозволяє стверджувати, що в еякулятах для співвідношень іонів одноіменних пар Са2+, Са2+, К+, К+ і Na+, Na+ між плазмою і сперматозоїдами встановлено зворотний зв'язок. Однак якщо на одну частину вмісту кальцію у сперматозоїдах припадає 3-6, то калію і натрію - лише 3-4 частини їх вмісту у плазмі (табл. 1).

Крім того, при збільшенні концентрації іонів калію у сперматозоїдах збільшується вміст іонів кальцію. Тобто у чоловічих статевих клітинах для співвідношень іонів різноіменної пари К+, Са2+ встановлено прямий зв'язок.

Дане співвідношення є також найбільш стабільним. У плазмі всіх трьох груп воно становить 3:1, а у сперматозоїдах - 3-4:1. Значно ширшим є інтервал змін співвідношень іонів різноіменної пари Na+, К+, який у плазмі становить 3-7:1, але у сперматозоїдах він зменшується до 4-6:1. Для співвідношень пари Na+, Са2+ характерні не лише найбільші його значення, але і найширші межі: у плазмі - 10-19:1, а у сперматозоїдах - 13-20:1.

Зв'язок іонів з об'ємом плазми. При неоднакових концентраціях Са2+, К+, Na+ та об'ємі плазми (1-5 мл. і більше) в еякулятах дослідних груп відхилення показників від оптимальних рівнів диференційовані щодо плазми і сперматозоїдів. Якщо у сперматозоїдах еякулятів групи НВК та у плазмі еякулятів групи ВВК між вмістом іонів в еякулятах малого та великого об'єму встановлено тенденцію до змін (Р < 0,05), то у плазмі і сперматозоїдах еякулятів групи СВК - суттєво вищий ступінь їх вірогідності (Р < 0,01 і 0,001). Для вмісту калію у плазмі всіх дослідних груп характерна пряма лінійна залежність, а саме: малий об'єм плазми - низька концентрація К+, великий - висока. Однак у сперматозоїдах, виділених з еякулятів малого і великого об'єму, встановлено незначну розбалансованість їх вмісту.

Якщо характер змін вмісту Са2+ і К+ у сперматозоїдах та плазмі еякулятів усіх дослідних груп приблизно однаковий, то Na+ - має свої особливості. У сперматозоїдах групи НВК із збільшенням об'єму від 3 до 5 мл. і більше концентрація іонів знижується. Це означає, що для еякулятів групи НВК характерна зворотна залежність між об'ємом плазми і концентрацією іонів у сперматозоїдах, а саме: малий об'єм - висока концентрація або великий об'єм - низька концентрація.

При збільшенні об'єму плазми зміни концентрації Na+ у сперматозоїдах еякулятів груп СВК і ВВК різноспрямовані. У групі СВК їх вміст поступово знижується, але у групі ВВК - зростає.

Зміни вмісту Na+ у плазмі дещо інші. Неоднаковий об'єм плазми (1-5 мл. і більше) майже не впливає на концентрацію іонів в еякулятах групи НВК. Але в еякулятах групи СВК малого об'єму (1-2 мл.) їх вміст знижується, а великого (3 мл. і більше) - зростає. У плазмі еякулятів групи ВВК зміни вмісту іонів протилежні до групи СВК, а саме: при малому об'ємі спермальної плазми в еякулятах встановили високу концентрацію Na+, при великому - низьку.

Таким чином, аналіз змін вмісту Са2+, К+, Na+ в дослідних групах еякулятів свідчить про те, що зменшення (1-2 мл.) і збільшення (4 мл. і більше) об'єму спермальної плазми зменшується або збільшується рівень концентрації іонів у сперматозоїдах та плазмі.

Але слід зауважити, що інтервал змін вмісту Са2+ і К+ у сперматозоїдах та плазмі значно менший, ніж Nа+.

Зв'язок іонів з концентрацією сперматозоїдів. Дослідження еякулятів, концентрація сперматозоїдів у яких становила 0-98 млн/мл сперми, показали, що неоднакова кількість клітин (Сv = 76%) не впливає на вміст іонів кальцію у плазмі та сперматозоїдах. Вірогідні зміни характерні лише для еякулятів груп СВК і ВВК з дуже низькими і високими рівнями концентрації клітин.

Аналогічну залежність встановлено для іонів калію. Однак зміни вмісту іонів натрію - дещо інші. Про їх суттєве накопичення у сперматозоїдах еякулятів з високою концентрацією клітин можна говорити лише щодо груп НВК і ВВК. У групі СВК з низькою концентрацією сперматозоїдів вміст іонів натрію високий, а з високою - низький.

Зв'язок іонів з рухливістю сперматозоїдів. Аналіз результатів досліджень не дає однозначної відповіді на питання про вплив різних концентрацій іонів на рухливість сперматозоїдів. З високою частотою повторень вірогідні результати отримано лише щодо низьких і високих концентрацій Са2+ і К+ у плазмі та сперматозоїдах еякулятів груп НВК і СВК. Тому логічно припустити, що саме ці компоненти іонної рівноваги є найбільш чутливими до змін, які пов'язані із розвитком патологічних процесів у статевих органах. Очевидно, вони також можуть бути важливою ланкою зв'язку між складними біохімічними механізмами, які забезпечують високий рівень життєздатності і біологічної повноцінності сперматозоїдів.

Зв'язок іонів з кількістю патологічних форм сперматозоїдів. У сперматозоїдах еякулятів дослідних груп при низькій (< 20%), середній (21-40%) і високій (> 41%) кількості патологічних форм клітин для іонів кальцію встановлено такі схеми накопичення їх вмісту: у групі НВК - "низький-високий-низький", або 1-1,5-1 мм., у СВК - "високий-середній-низький", або 1,3-1,2-1,1 мм., а у ВВК - "низький-середній-високий", або 1,6-1,9-2,5 мм. Аналогічні схеми, але на значно вищому рівні (3-5-4, 7-5-6 і 8-9-11 мм.) отримано у плазмі.

Зміни концентрації іонів калію у плазмі та сперматозоїдах схематично подібні до змін, які встановлено для кальцію. Але якщо у плазмі еякулятів усіх дослідних груп вірогідних змін їх вмісту не встановлено, то у сперматозоїдах групи ВВК вони є реальними (Р < 0,001). При цьому процес накопичення вмісту іонів калію в клітинах відбувається за схемою "низька-висока" концентрація або 3-6-7 мм. Зміни концентрації іонів натрію у плазмі та сперматозоїдах виражені дещо менше, ніж кальцію і калію. Однак встановлено, що у плазмі еякулятів з високою кількістю патологічних форм клітин вміст іонів натрію знижується, а у сперматозоїдах - зростає. Рівновага вмісту іонів у спермі. Неоднакові концентрації кальцію, калію і натрію обумовлюють у плазмі не лише різні співвідношення іонів різноіменних пар - Na+, Ca2+ (19-13-10:1) і Na+, K+ (7-5-3:1), але і їх поступове зниження від високих значень у групі НВК до низьких - у ВВК (табл. 2).

До наведених вище даних слід додати, що співвідношення вмісту іонів у сперматозоїдах на 1-4 частин вищі, ніж у плазмі. Для співвідношень іонів різноіменних пар вони становлять: Na+, Ca2+ - 20-17-13:1, Na+, К+ - 6-5-4:1, К+, Ca2+ - 3-4-3:1. При цьому доцільно зауважити, що вектор змін для співвідношень іонів натрій-калієвої пари між плазмою та сперматозоїдами спрямований аналогічно, але їх значення (20-20-15:1) в 3-5 разів вищі, ніж у плазмі і сперматозоїдах.

Значення співвідношень Na+, Са2+ також диференційовані щодо плазми і сперматозоїдів. Проте, якщо даний показник у плазмі в 4-7 разів менший, ніж між плазмою та сперматозоїдами, то у клітинах він менший лише в 3-4 рази.

Охарактеризована ситуація властива і для співвідношень К+, Сa2+. Однак слід наголосити, що найбільші (15:1) значення даного показника встановлені в еякулятах групи СВК. Співвідношення К+, К+ та Na+, Na+ між плазмою і сперматозоїдами в еякулятах усіх дослідних груп - майже однакові (3-4-4:1), але Са2+, Сa2+ в 1,3-1,8 рази вищі (3-6-5:1).

Зміна оптимальних параметрів об'єму плазми, а також концентрації, рухливості і кількості патологічних форм сперматозоїдів в еякулятах, яка обумовлена розвитком олігозооспермії І-ІІІ ступенів, супроводжується збільшенням або зменшенням співвідношень одно- та різноіменних пар іонів у плазмі, сперматозоїдах та між ними. Проведені нами дослідження свідчать, що у плазмі еякулятів груп НВК та ВВК неоднакові абсолютні зміни співвідношень Na+, Са2+ (8 і 4 частини) обумовлюють значні і майже однакові (47 і 40%) їх відносні зміни. За цих же умов зміни співвідношень Na+, К+ в 1,5-3 рази менші, ніж Na+, Са2+, і в усіх групах еякулятів становлять 14-33%. Зміни співвідношень К+, Са2+ (33%) встановили лише у групі ВВК. Це означає, що незалежно від ступеня розвитку олігозооспермії баланс іонів калію і кальцію у плазмі еякулятів НВК та СВК залишається стабільно однаковим і не виходить за межу норми. У сперматозоїдах при неоднакових абсолютних значеннях співвідношень Na+, Са2+, Na+, К+ і К+, Са2+ їх найбільші відносні зміни вмісту іонів в еякулятах групи СВК становлять 20-25%. У групі НВК вони зростають до 29-48%, а у групі ВВК - найвищі і коливаються у межах 33-100%.

Подібну закономірність встановили при аналізі розподілу вмісту іонів між плазмою та сперматозоїдами. Баланс іонів електролітів у системі "клітина-середовище" змінюється найменше в еякулятах групи СВК (14-25%), а його зміни в еякулятах груп НВК та ВВК майже однакові (25-73, 20-67%). Таким чином, ми довели, що патологічні процеси, які є причиною розвитку олігозооспермії І-ІІІ ступенів, негативно впливають на розподіл іонів у спермі чоловіків. Крім того найбільші зміни вмісту Са2+, К+, Na+ під впливом ендогенних чинників встановлено в еякулятах груп НВК та ВВК.

Вплив екзогенних чинників. Дію оптимального (37єС) і зниженого (2єС) рівнів температури та тривалості (0-24 год) зберігання сперми на особливості транспорту іонів у системі "клітина-середовище" вивчали на сперматозоїдах, виділених з еякулятів високої та низької якості (табл. 3). Вірогідність різниці між показниками концентрації, рухливості і кількості патологічних форм клітин в еякулятах була високою (Р < 0,01 і 0,001), але змін об'єму плазми в еякулятах груп НВК та СВК не зареєстрували (Р > 0,5), лише у групі ВВК встановили тенденцію до них (Р < 0,05).

Аналіз особливостей транспорту іонів при тривалому зберіганні сперми високої якості в умовах оптимального рівня температури зовнішнього середовища показав, що вектор руху кальцію в еякулятах усіх дослідних груп спрямований із плазми у сперматозоїди. В клітини додатково входить 0,3-0,6 мм. Са2+, або 9-58% його початкового вмісту. Але якщо потік іонів кальцію в еякулятах всіх груп спрямований у клітини, то калію - у плазму.

В еякулятах дослідних груп потоки іонів натрію на відміну від кальцію, які спрямовані у сперматозоїди та калію - з них, рухаються у різні сторони. Для еякулятів груп НВК і ВВК характерний їх вихід у плазму, а для СВК - вхід у сперматозоїди. При цьому абсолютні зміни вмісту К+ і Na+ в клітинах відповідно становлять 0,7-1,0 і 3,4-3,8 мм., відносні - 3-24 і 7-22%, що в 2-3 рази менше, ніж Са2+. Результати досліджень свідчать, що при тривалому витримуванні нерозбавленої сперми високої якості в еякулятах зберігається антипортний рух іонів, а саме: Са2+ входить, К+ виходить, але Na+ залежно від груп або входить (СВК), або виходить (НВК і ВВК).

Аналіз змін концентрації Са2+, К+, Na+ при тривалому витримуванні сперми низької якості за умов 37єС показав, що в еякулятах груп НВК та СВК із плазми у сперматозоїди входить 0,3-0,7 мм., або 7-35% початкового вмісту Са2+ та 0,5-0,7 мм., або 3-24% К+ і 1,9-4,4 мм., або 5-27% Na+.

В еякулятах групи ВВК встановили антипортний рух іонів. У сперматозоїди даної групи еякулятів, витісняючи іони натрію, входить кальцій. Але іони калію залежно від часу витримування сперми можуть змінювати вектор руху із входу на вихід (1,3 мм., або 11-23%). При цьому в еякулятах низької якості інтенсивність руху іонів кальцію лише в 1,3-1,5 разів вища, ніж натрію і калію.

При тривалому витримуванні еякулятів групи СВК високої якості в умовах зниженої температури (2єС) антипортний рух іонів натрію щодо кальцію і калію зберігається.

У сперматозоїди входить 20-62% вмісту Са2+, 3-19% К+ і виходить 4-15% Na+. Інтенсивність переміщення К+ і Na+ в 3-4 рази менша, ніж Са2+.

Однак якщо для еякулятів групи НВК характерне поступове накопичення Са2+, К+, Na+ у сперматозоїдах, то для групи ВВК - симпортний вихід іонів з клітин.

За цих умов у сперматозоїди групи НВК входить 27-79%, а із сперматозоїдів групи ВВК виходить 10-39% вмісту Са2+. Крім того, зниження температури зменшує інтенсивність переміщення іонів кальцію в 1,7, натрію - в 1,4 раза, а калію - залишається на рівні, який обумовлений оптимальною температурою зовнішнього середовища.

В еякулятах низької якості кардинальних змін руху іонів не встановили, але у групі ВВК антипортний рух Са2+ щодо Na+ відновлюється. Це дозволяє припустити, що біохімічні і біофізичні процеси, які відбуваються в еякулятах груп СВК і ВВК, забезпечують активний транспорт Са2+, К+ і Na+.

Аналіз абсолютних і відносних змін вказує на те, що розбалансованість гомеостазу іонів в еякулятах групи НВК призводить до змін антипортного способу переміщення іонів на симпортний, що супроводжується зниженням життєздатності і біологічної повноцінності сперматозоїдів.

Дослідження свідчать, що зміни концентрації іонів кальцію в еякулятах низької якості щодо високої відповідно становлять 0,3-0,5 мм., або 5-42% проти 0,2-0,7 мм., або 10-79%. Отже, у спермі низької якості вони в 1,9 рази вищі. Це, очевидно, означає, що зміни вмісту кальцію обумовлені лише пасивним переміщенням іонів у сперматозоїди.

Відносні зміни вмісту іонів калію і натрію в еякулятах низької якості також є достатньо значними. Якщо їх показники співставити з рівнем відносних змін в еякулятах високої якості, то вони в 1,3 і 1,6 рази більші. Різниця між показниками змін вмісту іонів полягає у тому, що в еякулятах групи СВК антипортний спосіб руху іонів зберігається, у ВВК - відновлюється. Але вектор їх руху - різний: в еякулятах групи СВК кальцій і калій витісняють натрій, а у ВВК кальцій витісняє натрій і калій з клітини.

Таким чином, зниження температури зовнішнього середовища до 2°С зменшує інтенсивність транспорту іонів кальцію на 25-40, калію - на 15-29 і натрію - на 6-19%. Крім того, в еякулятах групи НВК іони входять у сперматозоїди (симпорт), але у СВК та ВВК активний антипортний спосіб їх руху зберігається.

Активність АТФаз у спермі високої і низької якості. Аналіз впливу умов, які забезпечують максимальну активність АТФаз у сперматозоїдах виділених з еякулятів високої якості, свідчить, що рівень активності Nа+, К+-АТФази значно вищий, ніж Са2+, Mg2+, АТФази, а саме: 3,44 проти 2,32 мкмоль Фн/мг білка за 1 хвилину. При цьому максимальне розкриття їх латентних активностей забезпечує 0,2% концентрація сапоніну у середовищі. Крім того, якщо для переважної більшості ізольованих та неізольованих клітин організму або везикульованих препаратів клітинних мембран дослідники рекомендують створювати в інкубаційних середовищах рН 7,4, то максимальну активність транспортних ферментів у високоякісній спермі забезпечує рН 7,0. Суттєвий інгібуючий вплив змін рН у середовищі встановлено вже при відхиленнях до 6,8 і 7,4.

Зниження активності Nа+, К+, АТФази за цих умов коливається у межах 60-69%, а Са2+, Mg2+, АТФази - у межах 31-40%. Тобто для даних ферментних систем характерна неоднакова чутливість до змін рН в оточуючому клітини середовищі. При гідролізі АТФ із збільшенням її концентрації в інкубаційному середовищі активність Ca2+, Mg2+, АТФази лінійно зростає і досягає максимальних значень, а саме 35-40 мкмоль Фн/мг білка на 20-25 хвилині інкубації. При з'ясуванні ділянок зв'язування субстратів максимальну активність ферментів забезпечує наявність у середовищі 0,5 мм. АТФ. До викладеного вище слід додати, що плато активності обох ферментів створює широка межа концентрації (0,5-5 мм.) АТФ у середовищі. Однак кожен фермент має відповідний рівень активності: Na+, K+, АТФаза - 3,2-3,5, а Ca2+, Mg2+, АТФаза - 1,5-2 мкмоль Фн/мг білка за хвилину. Отже, вивчені нами ферментні системи у спермі високої якості характеризуються не лише різною активністю, але і неоднаковою інтенсивністю гідролізу АТФ. Встановлені оптимальні умови, які забезпечують максимальну активність ферментів, дали змогу приступити до вивчення і аналізу їх активностей при нормо- та олігозооспермії.

Активність Ca2+, Mg2+, АТФази при нормозооспермії становить 1,9 мкмоль Фн/мг білка за хвилину, що в 2,4 рази нижче, ніж при олігозооспермії. Частка її активності від загальної АТФазної активності становить 20%. Однак для Na+, K+, АТФази у нормі та при патології вона залишається без змін. Це дає змогу припустити, що різниця в активності ферментів при нормо- та олігозооспермії пов'язана з змінами цитоплазматичної мембрани сперматозоїдів. Внаслідок чого просторова конфігурація іонних помп обумовлює максимальний доступ субстратів до активних центрів ферментів. Розподіл кількості оцінених у дослідній вибірці еякулятів свідчить, що відношення показника кількості еякулятів оптимального об'єму до зменшеного і збільшеного - однакове, а саме: на 54% еякулятів оптимального об'єму припадає 46% еякулятів об'єм яких зменшений (гіпофункція придаткових статевих залоз), або збільшений (гіперфункція).

Отже, негативний вплив патологічних процесів на рівень концентрації Са2+, К+, Na+ та їх співвідношень у плазмі, сперматозоїдах і між ними обумовлений змінами генеративної функції сім'яників і секреторної функції придаткових залоз, які виражені зменшенням або збільшенням об'єму спермальної плазми і концентрації сперматозоїдів, збільшенням кількості їх патологічних форм та зменшенням рухливості.

Додатковий, з використанням електронномікроскопічних досліджень, аналіз змін форми сперматозоїдів показав, що кількість несформованих або юних форм клітин в еякулятах дослідних груп становить 4-6%, але в умовах нормозооспермії межа змін їх кількості зменшена до 3-4% (табл. 3).

Кількість еякулятів низької якості ознаками яких є відхилення від оптимальних рівнів концентрації та співвідношень клітин неоднакової форми в 6-7 разів більша, ніж еякулятів високої якості. Але при зміні оптимального рівня рухливих сперматозоїдів кількість еякулятів низької якості лише в 4-5 разів більша. При цьому найбільші зміни характерні для групи НВК (концентрація і форма клітин) та для групи ВВК (рухливість і форма клітин), а у групі СВК найменше змінюються показники їх рухливості і концентрації.

В еякулятах високої та низької якості, сперматозоїди яких мають змінену структуру акросоми і цитоплазматичної мембрани, міститься відповідно 13-15 і 15-16% клітин різного рівня розпаду.

В еякулятах високої якості зміни форми сперматозоїдів, які пов'язані із станом генеративної функції сім'яників, диференційовані щодо дослідних груп. Так, у групах НВК, СВК і ВВК вони становлять 5-7%. При цьому залежно від патологічних змін їх кількість поступово зростає із 36 на першій до 64% на третій стадії розвитку олігозооспермії. Тобто збільшення в еякулятах кількості сперматозоїдів із патологічно зміненою формою суттєво знижує (73-78 проти 14-44%) кількість типових, або нормальних, форм клітин в еякулятах.

Таким чином, ми встановили, що при олігозооспермії, ознаками якої є зміни концентрації, рухливості і кількості патологічних форм сперматозоїдів, якість сперми в 2 рази нижча, ніж при нормозооспермії. Вказані зміни суттєво впливають на баланс іонів у сперматозоїдах і плазмі, а також в 1,5-2,0 рази підвищують активність транспортних АТФаз.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено нове вирішення наукової задачі, що полягає у вивченні ролі транспортних АТФаз, а також іонів кальцію, калію і натрію при дії на сперматозоїди ендо- та ензогенних чинників з метою збереження життєздатності і біологічної повноцінності клітин. В результаті вирішення поставленої задачі зроблено наступні висновки:

1. У спермі чоловіків встановлено низьку (13,64-0,28), середню (21,81-0,26) і високу (31,01-0,58 мм.) концентрацію К+, яка визначає наявність неоднакових співвідношень різно- (Na+, Са2+, Na+, К+ і Са2+, К+) і одноіменних (Са2+, Са2+, К+, К+ і Nа+, Na+) пар іонів у плазмі;

2. Асиметричний розподіл (висока концентрація у плазмі і низька - у сперматозоїдах), обумовлює зворотний зв'язок між одноіменними парами іонів. Але вміст Са2+ у плазмі залежно від концентрації К+ у сперматозоїдах збільшується або зменшується;

3. Суттєві зміни оптимального рівня Са2+, К+, Na+ і збільшення активності транспортних АТФаз при олігозооспермії обумовлюють зменшення, і збільшення концентрації, зменшення рухливості і збільшення кількості патологічних форм сперматозоїдів в еякулятах;

4. Збільшення або зменшення вмісту Са2+, К+, Na+ впливає на гомеостазу іонів у плазмі, сперматозоїдах та між плазмою і сперматозоїдами. Найбільші зміни співвідношень іонів встановлено в еякулятах з низьким та високим вмістом іонів калію;

5. При зберіганні еякулятів високої якості впродовж 0-24 годин в умовах 37?С встановлено антипортний рух іонів із плазми у сперматозоїди, але при зниженні температури середовища до 2?С він змінюється на симпортний. При цьому в еякулятах з низьким та середнім вмістом К+ іони входять у сперматозоїди, а з високим - виходять із них;

6. Для еякулятів з низьким вмістом К+ при низькій їх якості в умовах оптимальної (37?С) встановлено одновекторний симпортний рух Са2+, К+ і Na+ у сперматозоїди, а для еякулятів з середнім та високим вмістом К+ - антипортний рух Са2+ щодо Na+ і К+. Зниження температури зберігання до 2?С в еякулятах з високим вмістом К+ антипортний рух іонів змінюється на симпортний, але в еякулятах з середнім вмістом К+ вектор руху Са2+ проти Na+ і К+ зберігається; кальцій сперматозоїд біологічний

7. При зберіганні сперми низької якості в умовах 37єС кількість переміщеного вмісту Са2+, К+ і Na+ у системі "клітина-середовище" в 2-3 рази менша, ніж у спермі високої якості, але в умовах зниження до 2оС вона в 2-5 разів більша.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Максим'юк Г.В., Воробець З.Д., Бєсєдін В.М. Співвідношення вмісту іонів Са2+, К+, Na+ і концентрація сперміїв у спермі чоловіків // Медична хімія. - 2000. - Т. 2, № 3. - С. 65-67.

2. Максим'юк Г.В., Воробець З.Д., Бєсєдін В.М. Активність Na+,К+- і Са2+, Mg2+, АТФаз та вміст К+, Na+ і Са2+ у спермі чоловіків при нормо- і олігоспермії // Вісник. Київ. нац. ун-ту ім. Т. Шевченка. - Сер. біологія. - 2001. - Вип. 34. - С. 8-10.

3. Зв'язок концентрації іонів Са2+, К+, Na+ з біологічною повноцінністю сперматозоїдів / Г.В. Максим'юк, Д.З. Воробець, Ю.Б. Борис, М.І. Бойко // Медична хімія. - 2003. - Т. 5, № 3. - С. 85-89 (дисертант розробила схему досліджень, брала участь у їх проведенні та написанні роботи).

4. Максим'юк Г.В., Воробець З.Д., Бєсєдін В.М. Рух іонів електролітів у сперміях здорових та хворих чоловіків в умовах нормо- та гіпотермії // Наук. вісн. Львів. держ. акад. вет. мед. - 2000. - Т. 2, №2. - Ч. 2. - С. 196-199.

5. Максим'юк Г.В., Бойко М.І., Воробець Д.З. Особливості транспорту іонів Са2+, К+, Na+ у чоловічій спермі високої і низької якості // Практична медицина. - 2003. - № 4. - С. 86-89 (дисертант обґрунтувала схему досліджень, провела статистичний аналіз та узагальнила результати).

6. Макроелементи у спермі чоловіків при нормо- і олігоспермії / Г.В. Максим'юк, З.Д. Воробець, В.М. Бєсєдін, Л.П. Оліферчук, В.М. Максим'юк, Г.В. Звєрєва, І.М. Тимчишин // Наук. - техн. бюл. Ін-ту землеробства і біології тварин. Сер. фізіологія і біохімія. - 1999. - Вип. 1 (3). - С. 188-191.

7. Зміни вмісту іонів та виживання сперміїв при заморожуванні / В.М Максим'юк, Г.В. Звєрєва, Г.В. Максим'юк, І.М. Тимчишин, Л.П. Оліферчук // Передгірне та гірське землеробство і тваринництво. - 2000. - Вип. 42. - С. 195-199.

8. Максим'юк В.М., Максим'юк Г.В., Тимчишин І.М. Трансмембранне переміщення іонів Са2+, К+, Na+ і втрати життєздатності сперміїв в екстремальних умовах // Передгірне та гірське землеробство і тваринництво. - 2001. - Вип. 43. - Ч. 2. - С. 114-120.

9. Maksymjuk H.V. Contents and rates of macroelements ions in human sperm // International scientific conference for students and young Physicians in Lviv state medical university. - Lviv. -1999. - P. 58.

Размещено на Allbest.ru