Біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх вплив на формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

БУЛАВЕНКО ЛЮДМИЛА ВАЛЕРІЇВНА

УДК 579.22+582.736+577.482

БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ФОСФАТМОБІЛІЗУЮЧИХ БАКТЕРІЙ І ЇХ ВПЛИВ НА ФОРМУВАННЯ БОБОВО-РИЗОБІАЛЬНОГО СИМБІОЗУ У РОСЛИН СОЇ

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Курдиш Іван Кирилович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях

Офіційні опоненти:

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154)

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

Размещено на http://www.allbest.ru

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що запаси фосфору в ґрунтах досить великі, проте основна їх частина знаходиться в недоступних для рослин формах. Забезпечення рослин рухомими формами фосфору може вирішуватись двома шляхами. Одним з них є внесення мінеральних добрив, а другим - використання мікроорганізмів, які покращують доступність фосфору для рослин [Патика, 1993; Тараріко с соавт, 1997; Чайковська, 1997]. В ряді країн розробляються прийоми активізації аборигенної мікрофлори ґрунту і ведуться пошуки високоактивних фосфатмобілізуючих мікробних культур та оптимізуються шляхи їх інтродукції в кореневу зону рослин [Liste, 1993; Milic, 1996; Курдиш, 2001; Суховицкая с соавт, 2002]. Однак, в Україні вони поки що не знайшли широкого застосування в сільськогосподарському виробництві. Тому, виділення мікроорганізмів, що характеризуються високою активністю мінералізації як органічних, так і важкорозчинних неорганічних сполук і які можуть стати основою ефективних препаратів для рослинництва є досить актуальним. штам бактерія фосфат соя фосфор

Особливо перспективним напрямком є створення мікробних препаратів комплексної дії на рослини на основі двох чи декількох штамів [Li, 1990; Liste, 1993; Omar et al., 1994; Курдиш, 2001]. До складу таких препаратів доцільно вводити мікроорганізми, що характеризуються азотфіксуючою і фосфатмобілізуючою дією, а також здатні продукувати біологічно активні речовини, які стимулюють ріст рослин. Застосування таких препаратів дозволить зменшити використання в рослинництві хімічних добрив і пестицидів, обмежити забруднення ними довкілля і отримувати екологічно чисту сільськогосподарську продукцію. В останні роки цьому питанню присвячено чимало досліджень і вже одержані певні успіхи [Канівець, 1990; Андреюк с соавт, 1999; Колмаз, 2000; Курдиш з співавт., 2003; Малиновська, 2003].

Проведення подальших досліджень в цьому напрямку дозволить розробити наукові передумови створення високоефективних бактеріальних препаратів комплексної дії для рослинництва.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в межах науково-дослідної роботи відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за темами "Закономірності впливу високодисперсних матеріалів на функціонування змішаних культур мікроорганізмів, що мобілізують ряд біогенних елементів" (держбюджетна тема 2.28.9.3.), "Підтримання і розвиток Української колекції мікроорганізмів" (№ державної реєстрації 0102 W007446).

Мета і задачі досліджень. Мета дисертаційної роботи полягала у розробці наукових передумов створення бактеріальних препаратів комплексної дії для рослин сої на основі фосфатмобілізуючих та азотфіксуючих бактерій.

Відповідно до поставленої мети завданнями наших досліджень були:

* виділення і ідентифікація нових штамів бактерій, здатних мобілізувати фосфати з органічних та важкорозчинних неорганічних сполук фосфору;

* дослідження активності мінералізації деякими видами бактерій органічних сполук фосфору і мобілізації фосфату з його важкорозчинних неорганічних сполук;

* визначення залежності фосфатазної активності виділених культур бактерій від ряду фізико-хімічних факторів;

* оцінка впливу природних глинистих матеріалів на фосфатазну активність бактерій;

* дослідження впливу бактеріальних композицій на основі Bradyrhizobium japonicum та інших бактерій, на різні етапи формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої.

Об'єктами дослідження були представники фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та азотфіксуючі мікроорганізми родів Azotobacter і Bradyrhizobium.

Предметом дослідження були біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх вплив на формування бобово - ризобіального симбіозу у рослин сої.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, фізіологічні, біохімічні, вегетаційні а також статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше виділено та ідентифіковано нові штами роду Bacillus, які характеризуються високою активністю мобілізації фосфору як з його органічних, так і важкорозчинних неорганічних сполук.

Визначено фізико-хімічні параметри для прояву максимальної фосфатазної активності у найбільш перспективного штаму B.subtilis 5 та досліджено вплив природних глинистих мінералів на фосфатазну активність цього штаму.

На основі бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та азотфіксуючих бактерій роду Azotobacter, створені нові мікробні композиції, які значно стимулюють формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої.

Найбільшим стимулюючим ефектом на формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої характеризувалися композиції B.japonicum 634б+B.subtilis 5, а також B.japonicum 634б+A.chroococcum 20 і B.japonicum 10К+A.vinelandii 56.

Практичне значення одержаних результатів.

Виділено нові високоактивні штами фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus, які поповнили Українську колекцію мікроорганізмів. Запропоновано удосконалений метод визначення фосфатазної активності, що дозволяє значно підвищити надійність одержаних результатів.

Запропоновані нові бактеріальні композиції на основі Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та Azotobacter є перспективними для створення бактеріальних препаратів комплексної дії на рослини сої.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором особисто. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми дисертації, проведено статистичну обробку всіх отриманих експериментальних даних, їх аналіз та співставлення з існуючими даними літератури, а також підготовку матеріалів результатів досліджень для їх публікації. Автором самостійно досліджена активність мінералізації деякими видами бактерій органічних сполук фосфору і мобілізації фосфату з його важкорозчинних неорганічних сполук. Визначена залежність фосфатазної активності у виділених бактерій від ряду фізико-хімічних факторів і вмісту глинистих мінералів.

Виділення та ідентифікацію фосфатмобілізуючих бактерій виконано сумісно з к.б.н. Рой А.О, яка є співавтором відповідних публікацій. Вплив мікробних композицій на основі Bradyrhizobium japonicum на розвиток рослин сої у вегетаційних дослідах виконано сумісно з к.б.н. Н.М.Мельниковою і к.б.н. Л.В.Титовою, які також є співавторами публікацій. У плануванні основних напрямків роботи та обговоренні результатів брав участь науковий керівник д.б.н. проф. Курдиш І.К.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на звітних конференціях-конкурсах наукових робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (2000, 2002 рр.); Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология на рубеже 21 столетия" (Мінськ, 2000); II установчому з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000); Міжнародній конференції "Екологія і біогеохімічна діяльність мікроорганізмів" (Одеса, 2001); Міжнародній науково-практичній конференції "Аграрна освіта і наука на початку третього тисячоліття" (Львів, 2001). 8 Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002); Всеукраїнській конференції молодих вчених "Засади сталого розвитку аграрної галузі" (Київ, 2002); Міжнародна конференція "Біологічні науки і проблеми рослинництва" (Умань, 2003).

Огляд літератури представлений двома розділами, в одному з яких наведено аналіз даних сучасної літератури щодо вмісту сполук фосфору в ґрунтах та особливостей його мобілізації різними видами мікроорганізмів.

В другому розділі описані властивості бульбочкових бактерій роду Bradyrhizobium (їх таксономія, морфологія, культурально-фізіологічні особливості та закономірності взаємодії з рослиною-хазяїном), а також висвітлено питання впливу чистих та асоціацій бактерій на основі Bradyrhizobium japonicum на врожайність рослин сої.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктами досліджень були 16 штамів фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus, які були виділені нами із зразків чорноземного ґрунту трьох областей України - Київської, Черкаської і Кіровоградської, а також B.polymyxa ВК, який був одержаний з музею культур Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН від доктора сільськогосподарських наук В.І.Канівця. В роботі використовували два виробничі штами бульбочкових бактерій: B.japonicum 634б (селекції Всеросійського інституту сільськогосподарської мікробіології, Санкт-Петербург - Пушкін) та B.japonicum 10К (селекції відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, Київ, який увійшов в Українську колекцію мікроорганізмів під номером 6023). Досліджували також азотфіксуючі мікроорганізми роду Azotobacter, а саме A.vinelandii 56 і A.chroococcum 20 , які були надані з музею культур відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ професором Антипчук А.Ф., і A.chroococcum 21 і Agrobacterium radiobacter 204 люб'язно надані академіком УААН В.П.Патикою, за що їм щиро вдячні.

Методи досліджень. Бактерії культивували в залежності від мети дослідження на рідких поживних середовищах - Менкіної, Муромцева, Ешбі або манітно-дріжджовому середовищі (МДС), в які додавали гліцерофосфат кальцію в кількості 0.2 г/л.

Визначення чисельності бактерій проводили методом серійних розведень.

Для виділення спороутворюючих бактерій використовували метод прямого висіву із зразків чорноземного ґрунту на агаризоване середовище Менкіної з додаванням лецитину [Андреюк Е.И., 1988]. Фенотипову характеристику досліджуваних штамів проводили загальноприйнятими методами [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1997]. Були досліджені морфологія клітин, культуральні властивості, рухливість, забарвлення за Грамом, потреба в сполуках натрію для росту, утворення аміаку, індолу, сірководню, та ацетилметилкарбінолу, тип метаболізму. Визначали здатність бактерій редукувати нітрати, гідролізувати сечовину, казеїн, крохмаль, продукувати лецитиназу та каталазу.

Здатність мікроорганізмів мінералізувати органічні та мобілізувати фосфати з неорганічних сполук фосфору оцінювали за інтенсивністю їх росту у відповідних поживних середовищах і накопиченню в культуральній рідині фосфату. Концентрацію останнього в середовищі визначали методом Фіске-Субароу з молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою [Лурье, 1971].

Фосфатазну активність визначали колориметричним методом з використанням фенолфталеїнфосфату натрія [Калашникова,1971]. Нами запропонована нова модифікація даного методу, яка полягає в зміщенні точки виміру інтенсивності забарвлення фенолфталеїну в область рН 11,5 - 12,5, що дозволяє отримувати більш стабільні значення забарвлення фенолфталеїну і позбавитись нелінійності результатів цього методу (рис.1.).

Кількість білку в реакційній суміші визначали спектрофотометрично при 280 нм, а також за методом Бредфорда [Bradford,1976].

При дослідженні впливу високодисперсних матеріалів на фосфатазну активність бактерій, застосовували природні глинисті мінерали монтморилоніт і палигорськіт Черкаського родовища бентонітових глин, які вносили в реакційну суміш у відповідних концентраціях. В ряді експериментів використовували мінерали, подрібнені до колоїдного стану. Монтморилоніт є мінералом шаруватого типу, представлений пластівцеподібними частками розмірами 0.05 мкм, що утворюють ізометричні форми. Палигорськіт - це алюмосилікат шарувато-стрічкового типу з голкоподібними частками. Їх розмір досягає 0.2-0.5 мкм [Тарасевич, Овчаренко, 1975].

Досліди з впливу чистих культур Bradyrhizobium japonicum та змішаних з іншими видами бактерій на різні етапи формування бобово-ризобіального симбіозу, проводили на рослинах сої Glycine max L. (Merr.) районованих сортів Чорнобура та Мар'яна (селекції Інституту фізіології рослин та генетики НАНУ і Інституту землеробства УААН), що вступають в симбіотичні взаємовідносини з бульбочковими бактеріями. Насіння сої протягом 1 години оброблювали культуральною рідиною мікроорганізмів. При цьому кількість азотобактера в суспензіях монокультур складала 0,9 - 1,110⁸ клітин в мл, бацил 2,5 - 3,510⁸ клітин в мл. Титр B.japonicum 634б і B.japonicum 10К у всіх варіантах був однаковим і складав відповідно 1,510⁸ і 1,710⁸ клітин в мл. Співвідношення кількості клітин в змішаних культурах B.japonicum і інших бактерій було 1:1 і 1:0,1.

Модельні вегетаційні досліди проводили в піщаній культурі, в яку вносили суміш Гельрігеля [Гродзинский, Гродзинский, 1973], збіднену на азот (0,2 норми). Визначали кількість бульбочок, утворених на коренях, їх нітрогеназну активність [Hardy, 1968], та приріст наземної маси.

Для статистичного аналізу результатів досліджень використовували методи варіаційної статистики [Лакин, 1990].

РОЗДІЛ 3. ФОСФАТМОБІЛІЗУЮЧА АКТИВНІСТЬ ДЕЯКИХ ВИДІВ БАКТЕРІЙ

Із зразків чорноземного ґрунту виділено 216 ізолятів спороутворюючих бактерій, з яких відібрано 16 найбільш активних штамів. Була проведена їх ідентифікація. Показано, що всі штами належать до родини Bacillaceae і є представниками роду Bacillus. На підставі морфолого-культуральних і біохімічних особливостей, виділені нами спороутворюючі бактерії віднесені до наступних видів роду Bacillus - B.megaterium - 5 штамів, B.subtilis - 4 штами, B.pumilus - 4 штами, B.cereus - 3 штами.

Проведені нами дослідження процесу мінералізації органічних сполук фосфору бактеріями роду Bacillus показали, що всі виділені штами інтенсивно росли і мінералізували гліцерофосфат кальцію і фітин з накопиченням в культуральній рідині значних кількостей фосфату. При культивуванні досліджуваних штамів у рідкому поживному середовищі Менкіної з гліцерофосфатом кальцію протягом 3-х діб, чисельність бактерій зростала на три порядки, а в середовищі накопичувалось від 40 до 284 мг/л іонів фосфату. Найбільш активне накопичення фосфату в культуральній рідині спостерігалось у штамів B.megaterium 9 і 12 (204 - 284 мг/л), B.subtilis 5 і 15 (234 - 219 мг/л) та B.cereus 6 і 10 (120 - 251 мг/л) (табл.1).

Таблиця 1

Ростова активність і накопичення фосфату при культивуванні бацил в середовищі з гліцерофосфатом кальцію

Примітка. Тривалість культивування - 3 доби.

В середовищі з фітином, чисельність життєздатних клітин у більшості досліджених штамів була на порядок нижче, ніж в середовищі з гліцерофосфатом кальцію і, як правило, становила (0,5 - 13,0)10⁷ клітин в 1 мл. (табл.2). Однак, така ростова активність характерна не для всіх досліджуваних штамів. Наприклад, кількість клітин у суспензії B.pumilus 3 і B.pumilus 4 в порівнянні з усіма іншими досліджуваними штамами, була досить високою і становила (1,2 - 1,8)10⁹ клітин в 1 мл. Ці два штами, на нашу думку є перспективними для подальших досліджень, оскільки відомо, що бактерії не є найбільш активними продуцентами фітаз [Билай, 1989; Зинин с соавт., 2003]. Накопичення фосфату в культуральній рідині здійснювалось також менш активно, за виключенням B.cereus 14 (105,0 мг/л) і В.megaterium 16 (138,0 мг/л). Необхідно відмітити, що B.cereus 14 і В.megaterium 16 характеризувались високими показниками фосфатмінералізації і в середовищі з гліцерофосфатом кальцію. Ряд штамів, які слабо росли в середовищі з фітином, не накопичували фосфат в культуральній рідині, що, ймовірно, обумовлено низькою фітазною активністю цих бактерій і повним споживанням РО₄^3- бактеріями в процесі їх росту.

Зважаючи на те, що до складу комплексних бактеріальних препаратів для рослин сої вводять, насамперед, азотфіксуючі мікроорганізми родів Bradhyrhizobium і Azotobacter, була досліджена їх фосфатмінералізуюча активність. Базуючись на результатах попередніх досліджень з вивчення взаємовідносин між різними видами бактерій родів Bacillus, Azotobacter та Bradhyrhizobium, в даній роботі були застосовані штами A.vinelandii 56 і B.japonicum 634б.

Показано, що A.vinelandii 56 і B.japonicum 634б при рості в середовищі Ешбі або манітно-дріжджовому, в яких єдиним джерелом фосфору був гліцерофосфат кальцію, характеризувались значною ростовою активністю і накопичували за сім діб культивування понад 10⁸ кл/мл. При культивуванні у подібних умовах A.vinelandii 56 накопичував незначні кількості фосфату (до 17 мг/л), тоді як у B.japonicum 634б цей іон у середовищі не виявлявся.

Необхідно відмітити, що виділені бактерії роду Bacillus інтенсивно ростуть в середовищах не тільки з органічними сполуками фосфору, але і важкорозчинним фосфатом кальцію, накопичуючи в середовищі (1,3 - 4,17)10⁸ клітин в мілілітрі та 78 - 148 мг/л фосфату.

Останнім часом в Україні запропоновано ряд перспективних фосфатмобілізуючих бактерій для використання у сільськогосподарському виробництві. Одним з них є B.polymyxa ВК, на основі якого в Україні розроблена технологія виробництва і застосування біопрепарату фосформобілізуючих бактерій - поліміксобактерину [Токмакова с соавт., 1997].

Нами проведена порівняльна характеристика інтенсивності мобілізації фосфату з органічних сполук фосфору штамом B.polymyxa ВК і виділеним нами штамом B.subtilis 5 (pис.2).

Як видно з одержаних результатів, в середовищі Менкіної з гліцерофосфатом кальцію або фітином досліджувані культури суттєво відрізнялись за ростовою активністю і здатністю накопичувати фосфат. За 9 діб культивування бактерій в середовищі, що містило гліцерофосфат кальцію, B.subtilis 5 накопичував понад 350 мг/л фосфату, в той час як B.polymyxa ВК лише 5мг/л. В аналогічних умовах в середовищі з фітином, B.subtilis 5 накопичував до 106 мг/л, а B.polymyxa ВК - 68 мг/л РО₄^3-. Однак, в середовищі з трикальційфосфатом B.polymyxa ВК активніше накопичував фосфат порівняно з B.subtilis 5. Більш активна мобілізація фосфату B.polymyxa ВК, ймовірно, пов'язана з більшим підкисленням середовища.

В останні роки виділенню фосфатмобілізуючих бактерій та дослідженню процесу фосфатмобілізації присвячено чимало робіт [Токмакова с соавт., 1997; Чайковська, 1997; Андреюк с соавт, 1999; Малиновська, 2003]. Порівняння активності мінералізації органічних сполук фосфору у виділених нами фосфатмобілізуючих бактерій з деякими описаними в літературі, дозволяє зробити висновок про більш високу активність мінералізації органічних сполук фосфору B. subtilis 5.

Розділ 3. ФОСФАТАЗНА АКТИВНІСТЬ ДЕЯКИХ ВИДІВ МІКРООРГАНІЗМІВ

Встановлено, що виділені фосфатмобілізуючі мікроорганізми характеризуються високою фосфатазною активністю. Порівняльне дослідження фосфатазної активності клітин B.subtilis 5 і B.megaterium 12 показало, що вона проявляється в досить широкому температурному діапазоні (від 10С до 65С) і досягає максимальних значень при 55С (рис.3). В цих умовах фосфатазна активність у B.subtilis 5 склала 260 мкмоль/ггод., а у B.megaterium 12 - 100 мкмоль/ггод. Зважаючи на те, що рівень фосфатазної активності клітин B.subtilis 5 перевищував в 2-3 рази аналогічний показник у B.megaterium 12, для подальших експериментів ми відібрали B.subtilis 5.

Дослідження залежності фосфатазної активності B.subtilis 5 від рН середовища показало, що висока ферментативна активність у даного штаму спостерігається в досить широкому діапазоні рН 7,2 - 11,1 і досягає максимальних значень в області рН 9,5 - 10,0 (рис.4) та в кінці логарифмічної фази росту культури (рис.5).

Було розраховано, що для фосфатази B.subtilis 5 К_м дорівнює 4,2 мМ, а ФА_max - 475 мкмоль/ггод.(рис.6).

Відомо, що лужні фосфатази мікроорганізмів є металоферментами [Эйхгорн, 1978]. Як показано на рис.7, в присутності Mg²⁺, Ca²⁺ ферментативна активність B.subtilis 5 збільшується. Максимальний стимулюючий ефект (на 160% і 70% в порівнянні з контролем) спостерігали при концентрації іонів металів 10 мкг/мл і 30 мкг/мл, відповідно (рис.7).

За літературними даними, одні і ті ж іони в залежності від їх концентрації можуть збільшувати або зменшувати каталітичну активність ферментів. Так і в наших дослідах, подальше підвищення концентрації цих елементів призводило до зниження ферментативної активності. Іони металів можуть не тільки збільшувати, але і знижувати каталітичну активність ферментів. В наших дослідах Cu²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ навіть в концентрації 0,5 мкг/мл інгібували фосфатазну активність B.subtilis 5 (рис.7).

Відомо, що в молекулі лужної фосфатази E.coli в утворенні внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків приймають участь чотири цистеїнових залишки. Найчастіше інгібуючу дію іонів металів на лужні фосфатази пояснюють їх здатністю утворювати сульфіди як з цистеїном, що входить до складу ферментів, так і з продуктами розпаду [Диксон, 1982]. Можна було б припустити, що саме цей механізм є визначальним у інгібуванні ферменту у наших дослідах. Проте, на відміну від всіх інших лужних фосфатаз, бацилярні лужні фосфатази не мають в своєму складі цистеїнових залишків [Вершинина с соавт., 1997]. Тому, механізм інгібуючої дії досліджених катіонів металів, ймовірно, має іншу природу.

Одним із основних компонентів ґрунтів є глинисті мінерали [Тарасевич, Овчаренко, 1975]. Мікроорганізми різних таксономічних груп здатні вступати у взаємодію з високодисперсними матеріалами, що в значній більшості випадків призводить до змін їх фізіологічних властивостей [Курдиш, 2001]. Оскільки даних щодо впливу глинистих мінералів на фосфатазну активність бактерій роду Bacillus не достатньо, нами було досліджено це питання. Показано, що палигорськіт в концентраціях 0,6-10,0 г/л суттєво не впливав на фосфатазну активність B.subtilis 5 (рис.8). Підвищення концентрації мінералу до 20,0 г/л призводило до збільшення фосфатазної активності на 22%. Монтморилоніт більш суттєво стимулював фосфатазну активність цих бактерій. При внесенні в реакційну суміш 20,0 г/л цього мінералу фосфатазна активність зростала на 40%. Збільшення фосфатазної активності в деяких варіантах досліду, можливо пов'язано з екстракцією мінеральних домішок, які входять до складу даного мінералу і стимулюють фосфатазну активність. До таких домішок можуть належати катіони магнію і кальцію, які збільшують ферментативну активність B.subtilis 5.

Вплив природних глинистих мінералів на фосфатазну активність Bacillus subtilis 5.

Таким чином, нами показано, що природні глинисті мінерали палигорськіт і монтморилоніт не тільки не знижують фосфатазну активність B.subtilis 5, але і в деяких випадках її підвищують. Цей факт є важливим, оскільки в нашому відділі показана можливість і перспективність застосування цих мінералів в якості наповнювачів при виготовленні гранульованих бактеріальних препаратів [Курдиш з співавт., 2003].

РОЗДІЛ 4. ВПЛИВ BRADYRHIZOBIUM JAPONICUM 634Б В ЧИСТИХ І ЗМІШАНИХ КУЛЬТУРАХ НА ПРОРОСТАННЯ НАСІННЯ СОЇ

Виділено 216 ізолятів спороутворюючих бактерій, що здатні мінералізувати органічні сполуки фосфору з яких відібрано 16 найбільш активних штамів. Проведена їх видова ідентифікація і показано, що всі виділені мікроорганізми належать до родини Bacillaceae і є представниками роду Bacillus, а зокрема - B.megaterium, B.subtilis, B.pumilus, B.cereus.

Встановлено, що виділені штами бактерій роду Bacillus характеризуються високою активністю мобілізації фосфору з його органічних та важкорозчинних неорганічних сполук. В середовищах з такими сполуками, ці бактерії інтенсивно ростуть та накопичують понад 200 мг/л фосфату.

Удосконалено метод визначення фосфатазної активності з використанням фенолфталеїнфосфату натрію. Показано, що найбільш активним фосфатмобілізуючим бактеріям B.subtilis 5 та B.megaterium 12 властива лужна фосфатаза. В оптимальних за температурою (55С) і рН (9,5-10,0) умовах фосфатазна активність B.subtilis 5 становить 260 мкмоль/ггод., а B.megaterium 12 - 100 мкмоль/ггод. Показано, що фосфатазна активність цих бактерій активується катіонами Mg²⁺, Ca²⁺ і інгібується катіонами Cu²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, а також аніонами ортофосфату (РО₄^3-).

Додавання природних глинистих мінералів палигорськіту і монтморилоніту в реакційну суміш в концентраціях до 20,0 г/л, супроводжувалось збільшенням фосфатазної активності B.subtilis 5 на 22 - 40% відповідно.

На основі бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum, Bacillus subtilis 5 та Azotobacter vinelandii 56 створено нові бактеріальні композиції для інокуляції насіння сої. Застосування цих композицій сприяє збільшенню кількості нормально сформованих проростків на 10-27%.

Показано, що бактеріальні композиції на основі бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючих бактерій роду Bacillus та азотфіксуючих бактерій роду Azotobacter, значно стимулюють формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої. Найбільшим стимулюючим ефектом характеризувалися композиції B.japonicum 634б+B.subtilis 5, а також B.japonicum 634б+A.chroococcum 20 і B.japonicum 10К+A.vinelandii 56.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Булавенко Л.В., Бега З.Т., Курдиш І.К. Мобилизация фосфора некоторыми микроорганизмами из труднорастворимых неорганофосфатов // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. - 2000. - № 4. - С. 55 - 56. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження по вивченню фосфатмобілізуючої здатності деяких видів бактерій, здійснено аналіз та інтерпритацію одержаних результатів).

Рой А.А., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Новые штаммы почвенных бацилл, минерализующие органические соединения фосфора // Мікробіологічний журнал. - 2001. - Т. 63, № 4. - С.9 - 15. (Здобувач особисто провів літературний пошук, брав участь в лабораторних дослідженнях по виділенню та ідентифікації бактерій роду Bacillus, аналізі одержаних результатів та написанні статті).

Мельникова Н.Н., Булавенко Л.В., Курдиш И.К., Титова Л.В., Коць С.Я. Формирование и функционирование бобово-ризобиального симбиоза у растений сои при интродукции штаммов родов Azotobacter и Bacillus // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - 38, № 4. - С. 427 - 432. (Здобувач безпосередньо брав участь в постановці вегетаційних дослідів по впливу бактерій Bradyrhizobium japonicum з іншими бактеріями на формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої, провів аналіз та інтерпретацію даних).

Мельникова Н.Н., Булавенко Л.В., Титова Л.В., Курдиш І.К. Вплив азотфіксуючих та фосфатмобілізуючих бактерій на формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої // Вісник Львівського державного аграрного університету. - 2002. - № 6. - С. 145 - 151. (Здобувачем особисто проведено аналіз літературних даних, брав участь в дослідженнях впливу комбінацій бактерій на основі B.japonicum на формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої).

Булавенко Л.В., Рой А.А., Курдиш И.К. Сравнительная характеристика ростовой и фосфатмобилизирующей активностей Bacillus subtilis 5 і Bacillus polymyxa ВК // Вісник Одеського національного університету. - 2001. - Т. 6, № 4. - С.43 - 46. (Здобувачем особисто проведено експериментальні дослідження фосфатмінералізуючої активності Bacillus subtilis 5 і Bacillus polymyxa ВК, здійснено аналіз та інтерпритацію даних, підготовлено матеріали статті до друку).

Титова Л.В., Рой А.А., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Комбинированные бактериальные препараты на основе глинистых минералов и композиции почвенных микроорганизмов // Вісник Одеського національного університету. - 2001. - Т. 6, № 4. - С.305 - 308.(Здобувач особисто брав участь в постановці вегетаційних дослідів по впливу гранульованих препаратів фосфатмобілізуючих і вільноживучих азотфіксуючих бактерій на ризосферний грунт і продуктивність томатів, здійснив аналіз одержаних результатів, сформулював висновки).

Курдиш І.К., Рой А.О., Бега З.Т., Булавенко Л.В. Гранульовані бактеріальні препарати комплексної дії на рослини // Збірник наукових праць Уманського державного аграрного університету (спеціальний випуск). Біологічні науки і проблеми рослинництва. - Умань, 2003. - С. 267 - 270. (Здобувач безпосередньо брав участь в дослідженнях впливу бактеріальних препаратів на деякі види рослин, особисто дослідив фосфатазну активність ряду бактерій, що входять до складу гранульованих бактеріальних препаратів.)

Рой А.А., Бега З.Т., Булавенко Л.В., Курдиш И.К. Мобилизация фосфора из органо- и неорганофосфатов бактериями родов Вacillus и Azotobacter // Материалы Международной конф. "Микробиология и биотехнология на рубеже 21 столетия" (Минск, 1-2 июня 2000г.). - Минск: ЗАО "ПРОПИЛЕИ", 2000. - С. 96 - 97.

Булавенко Л.В., Рой А.О., Курдиш І.К. Фосфатазна активність деяких видів мікроорганізмів // Украинский биохимический журнал Т.74, № 4б (додаток 2). - 2002 / Матеріали 8 Українського біохімічного з'їзду (ЧЕРНІВЦІ 2002). - Чернівці. - 2002. - С.65.

Булавенко Л.В., Курдиш І.К. Фосфатазна активність бактерій роду Bacillus // Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених "Засади сталого розвитку аграрної галузі" (КИЇВ 2002). - Київ: Інститут агроекології та біотехнології. - 2002. - С.94 - 95.

АНОТАЦІЯ

Булавенко Л.В. Біологічні властивості фосфатмобілізуючих бактерій і їх вплив на формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої .- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія.- Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2004.

Дисертація присвячена дослідженню біологічних властивостей фосфатмобілізуючих бактерій і їх впливу на формування бобово - ризобіального симбіозу у рослин сої. Виділено та відібрано перспективні штами фосфатмобілізуючих бактерій, які пропонуються для виготовлення бактеріальних препаратів комплексної дії. Досліджена здатність виділених бактерій мінералізувати органічні та розчиняти важкорозчинні неорганічні сполуки фосфору.

Вивчено залежність фосфатазної активності B.subtilis 5 від температури, рН середовища, стадії розвиту культури, вмісту катіонів деяких металів та неорганічного фосфату. Показано стимулюючий вплив на фосфатазну активність B.subtilis 5 природних глинистих мінералів монтморилоніту і палигорськіту, які є компонентами багатьох типів ґрунтів.

У вегетаційних дослідах встановлено, що бактеризація насіння сої штамами Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобілізуючими бактеріями роду Bacillus, а також бактеріями роду Azotobacter, супроводжувалась збільшенням кількості нормально сформованих проростків, а також значним стимулюванням формування бобово-ризобіального симбіозу у рослин сої. На підставі одержаних результатів, відібрані нові мікробні композиції, які є перспективними для вирощування сої.

Ключові слова: фосфатмобілізуючі бактерії, фосфатазна активність, соя, бульбочкові бактерії, азотфіксуючі мікроорганізми, бобово-ризобіальний симбіоз.

АННОТАЦИЯ

Булавенко Л.В. Биологические свойства фосфатмобилизирующих бактерий и их влияние на формирование бобово - ризобиального симбиоза у растений сои .- Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология.- Институт микробиологи и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена исследованию биологических свойств фосфатмобилизирующих бактерий и их влиянию на формирование бобово - ризобиального симбиоза у растений сои. Из выделенных 216 изолятов спорообразующих микроорганизмов отобрано 16 штаммов рода Bacillus, которые отличались активным ростом и способностью минерализовать органические соединения фосфора. Установлены межштамовые различия в фосфатминерализирующей активности исследуемых бацилл. Наиболее активные штаммы в средах с органическими соединениями фосфора накапливали более 10⁸ клеток в миллилитре и свыше 200 мг/л фосфата, что свидетельствует о их высокой фосфатминерализирующей активности. В среде с труднорастворимым неорганическим соединением фосфора (фосфатом кальция) выделенные бактерии также характеризовались интенсивным ростом и накапливали порядка 140 мг/л фосфата.

Сравнительная характеристика фосфатмобилизирующей активности B.subtilis 5 и B.polymyxa ВК показала, что B.polymyxa ВК менее активно, чем B.subtilis 5 минерализирует органические соединения фосфора, но более активен на среде с фосфатом кальция.

Для определения ферментативной активности бактерий предложен оптимизированный метод, который позволяет значительно повысить точность полученных результатов. Установлено, что фосфатазная активность у наиболее перспективных штаммов B.subtilis 5 и B.megaterium 12 составляет 260 мкмоль/ггод. и 100 мкмоль/ггод. соответственно. Исследована зависимость фосфатазной активности B.subtilis 5 от стадии роста культуры, концентрации субстрата, содержания в реакционной среде катионов некоторых металлов. Показано, что максимальная фосфатазная активность у B.subtilis 5 наблюдается в диапазоне рН 9,5-10,0 и температуре 55С.

Установлено, что внесение в реакционную среду глинистых минералов монтмориллонита или палыгорскита в концентрациях до 20,0 г/л вызывало увеличение фосфатазной активности B.subtilis 5. Этот факт может быть объяснен наличием в структуре исследуемых минералов катионов магния, который, возможно, и увеличивает фосфатазную активность данного штамма.

На основе клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum, фосфатмобилизирующих бактерий рода Bacillus а также бактерий рода Azotobacter, созданы новые бактериальные композиции для инокуляции растений сои. Обработка ее семян данными композициями бактерий значительно стимулировала формирование бобово-ризобиального симбиоза у растений сои. Наибольшим стимулирующим эффектом характеризовались композиции B.japonicum 634б+B.subtilis 5, а також B.japonicum 634б+A.chroococcum 20 і B.japonicum 10К+A.vinelandii 56.

Ключевые слова: фосфатмобилизирующие бактерии, фосфатазная активность, соя, клубеньковые бактерии, азотфиксирующие микроорганизмы, бобово-ризобиальный симбиоз.

ABSTRACT

Bulavenko L.V. Biological properties of phosphate-mobilized bacteria and their influence on formation of legume-rhizobium symbiosis of soybean plants.- Manuscript.