Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

03.00.04 - біохімія

Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби

Бугай Андрій Олександрович

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Цвіліховський Микола Іванович,

Національний аграрний університет, директор Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва

Офіційні опоненти : доктор ветеринарних наук, професор

Любецький Віталій Йосипович,

Національний аграрний університет, завідувач кафедри акушерства, гінекології та біотехнології відтворення тварин

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

Захист відбудеться 15 травня 2008 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, кімн. 28

Автореферат розісланий 14.04.2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Є.А. Деркач

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останній час велика увага в галузі фундаментальних і прикладних наук приділяється дослідженням структури та функцій плазматичних мембран ентероцитів (Мельничук Д.О., 1992; Цвіліховский М.І., 1988 1998; Simons K., 2000; Pike L., 2003). Це зумовлено центральним положенням плазмолеми цих клітин кишечника в транспортних і регуляторних процесах та в реалізації генетичних програм, що має важливе значення у вивченні молекулярних закономірностей життєвих функцій та розвитку багатьох патологічних процесів в організмі тварин і людини. (Foltzer-Jourdainne C., 1989; De Vries K., 1995; Hoekstra D., 2004; Haegebarth A., 2006).

Функції всмоктування та переносу поживних речовин з кишечника до кровоносного русла обумовлені, насамперед, поляризованістю ентероцитів з утворенням макродоменів плазматичної мембрани - апікальної та базолатеральної мембран (Кушак Р.І., 1983; Мельничук Д.О., 1992; Цвіліховский М.І., 1988 - 1998).

Відомо, що апікальна мембрана виконує функції гідролізу та транспорту поживних речовин до ентероциту (Уголев А.М., 1970 1990), а також володіє рецепторними властивостями, що є первинною ланкою трансцитозу імуноглобулінів молозива й зумовлює формування колострального імунітету в організмі новонароджених тварин (Мельничук Д.О., 1992; Карпуть І.М., 1993; Цвіліховський М.І., 1998). Базолатеральна мембрана виконує функції транспорту поживних речовин у кровоносне русло, контакту ентероцитів з екстрацелюлярним матриксом, а також здійснює регуляцію процесів росту та розвитку клітин слизової оболонки кишечника (Fujita M., 1981).

Головним структурним елементом плазмолеми ентероцитів є ліпіди. Утворюваний ними бішар необхідний не тільки для компартмелізації та чіткої регуляції фізіолого-біохімічних процесів, які відбуваються в клітині, а й для підтримки оптимальних умов функціонування мембранних ферментів, білків-транспортерів, рецепторів тощо (Марри Р., 1991).

Дослідження, які були проведені на кафедрі біохімії та біотехнології Національного аграрного університету (Цвіліховський М.І., 1988 1998; Мельничук Д.О., 1992), показали значні відмінності ліпідного складу та функціональних властивостей фракцій плазматичної мембрани ентероцитів здорових і хворих на гострі розлади травлення новонароджених телят. В той же час, дані щодо ліпідного складу апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби відсутні. Це вказує на необхідність досліджень мембраногенезу ентероцитів порожньої кишки в пренатальний період онтогенезу великої рогатої худоби. Результати досліджень дозволять більш глибоко вивчити етіопатогенез гострих розладів травлення у новонароджених телят та розробити комплекс заходів щодо їх профілактики та лікування, вивчити причини різної конверсії кормів і формування рівня продуктивності тварин (Щербаков Г.Г., 1984; Левченко В.І., 1995; Грищенко В.А., 2006).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є розділом комплексної наукової теми “Визначення молекулярних механізмів становлення мембранного травлення у сільськогосподарських тварин та розробка методів оптимізації мембранного травлення” (номер державної реєстрації 0106U010063) (2005 2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити ліпідний склад плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в різні періоди пренатального розвитку.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

-розробити метод виділення абсорбційних ентероцитів та отримати їх високоочищену фракцію з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби;

-дослідити кількісний та якісний склад ліпідної компоненти плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки великої рогатої худоби у пренатальному періоді онтогенезу;

-визначити особливості ліпідного складу апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби;

-визначити показники ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки, які можуть бути маркерними щодо ступеню розвитку цих клітин.

Об'єкт дослідження - ліпідний склад плазмолеми абсорбційних клітин порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби.

Предмет дослідження - порожня кишка, ізольовані абсорбційні ентероцити, ліпідні фракції плазматичної мембрани, апікальна та базолатеральна мембрани.

Методи дослідження клінічні, морфометричні, цитологічні (ізольовані ентероцити порожньої кишки), препаративні (ультрацентрифугування), біохімічні (активність лужної фосфатази, лактатдегідрогенази, Na⁺, K⁺-ATPази, вміст загального білка, загальних ліпідів, загальних фосфоліпідів та їх фракцій, жирних кислот), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено метод виділення абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби з низьким ступенем їх руйнації та забрудненості іншими клітинами. У мембранному бішарі абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби встановлено наявність капронової та елаїдинової кислот, які не властиві для плазмолеми цих клітин великої рогатої худоби в постнатальному періоді онтогенезу. В плазмолемі абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби встановлено підвищення вмісту гептадеценової, гептадеканової, лауринової та міристинової кислот, рівень яких значно перевищує такий у новонароджених телят та дорослих тварин. Виявлено високу в'язкість апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби, яка з віком значно зменшується. Встановлено маркери ліпідної структури, які вказують на розвиток абсорбційних ентероцитів (динаміка вмісту амінофосфоліпідів, дієнових жирних кислот, кислих фосфоліпідів тощо).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод виділення високоочищеної фракції абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби з низьким ступенем руйнації дозволяє використовувати ці клітини в різних напрямах досліджень (біохімічні, фізіологічні, цитологічні, моделювання тощо). Отримані дані щодо динаміки змін ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби вказують на необхідність чіткого балансування ліпідної компоненти раціону тільних корів, особливо з 5-го по 7-й місяці тільності, з метою профілактики порушень органогенезу травного каналу плодів та дозволяють вивчати формування і розвиток травної функції у жуйних тварин у пренатальному періоді онтогенезу.

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес і використовуються при викладанні дисциплін “Біохімія тварин”, ”Фізіологія тварин”, ”Цитологія, гістологія та ембріологія” на факультетах ветеринарної медицини Білоцерківського національного аграрного університету, Дніпропетровського державного аграрного університету, Луганського національного аграрного університету, Сумського національного аграрного університету, Львівської національної академії ветеринарної медицини (нині Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій) ім. С.З. Гжицького.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно опрацював літературні першоджерела, освоїв методики досліджень, провів експериментальні дослідження та статистичну обробку одержаних результатів. Ним здійснено інтерпретацію результатів за методичної та консультативної допомоги наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Національного аграрного університету (2005 - 2007 рр.); Дніпропетровського державного аграрного університету (2005 р.); VIII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта 2005” (м. Дніпропетровськ, 2005); Міжнародній науковій конференції “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, м. Львів, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми біохімії, фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин” (м. Дніпропетровськ, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Теоретичні і практичні досягнення молодих вчених-аграріїв” (м. Дніпропетровськ, 2006 р.); IX з'їзді Українського біохімічного товариства (м. Харків, 2006 р.); ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (м. Львів, 2007 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових праць, з яких 3 статті у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України (з них 2 одноосібні), 6 тез - у матеріалах конференції і з'їзду.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і пропозицій виробництву, списку використаних джерел, що включає 226 найменувань, з яких 180 латиницею. Робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 7 таблицями і 21 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана в 2005 - 2007 рр. на базі проблемної наукової лабораторії внутрішніх незаразних хвороб тварин кафедри терапії і клінічної діагностики Національного аграрного університету.

Для досліджень відбирали матеріал від 27 (3-х, 5-ти та 7-ми місячних) плодів великої рогатої худоби, період розвитку яких визначали морфометрично (Студенцов А.П., 2000). Плоди отримували від клінічно здорових корів голштинської породи під час вимушеного забою на м'ясокомбінаті “Ювілейний” (м. Дніпропетровськ), з дотриманням положення ветеринарного законодавства “Про попередження наслідків стихійного лиха” (посуха).

Після евтаназіі плодів розтинали черевну порожнину, видаляли порожню кишку, промивали її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для видалення вмісту. Для виділення ентероцитів порожню кишку відділяли від брижі, визначали її загальну довжину, знаходили середину, від якої відміряли рівновіддалені точки у краніальному та каудальному напрямах та відрізали ділянку кишки. При цьому довжина кишки складала третину від загальної (у ранній плідний період середня довжина цієї ділянки складала 0,8 м; у пізній плідний період - 1,7 м).

Базовою методикою виділення клітин був хімічний (цитрат/ЕДТО) метод (Цвіліховський М.І., 1998), на основі якого розроблявся метод отримання очищеної фракції абсорбційних ентероцитів із порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.

Вихід ентероцитів визначали шляхом вимірювання концентрації білка в інкубаційному середовищі (Lowry O., 1951). Визначали активність лужної фосфатази (ЛФ, КФ 3.1.3.1), як маркера зрілих стовпчастих ентероцитів та активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), як маркера деструкції клітин, питому активність яких наводили у двох варіантах - інтервальна активність (детекція виключно за певний часовий відрізок, не враховуючи показники попереднього) та кумулятивна активність (детекція наприкінці часового відрізку, враховуючи показники попереднього) (Cartwright I., 1999). Отримані клітини розфасовували в поліпропіленові флакони, позначали і зберігали в рідкому азоті впродовж 2-6 місяців для подальшого використання.

Отримання апікальної (АМ) і базолатеральної (БМ) мембран ентероцитів виконували за схемою (Масюк Д.М., 2004), яка включала в себе такі етапи:

1.Гомогенізація суспензії клітин у ножовому гомогенізаторі MPW-302 (Польща) при швидкості обертання ножа 9,5 тис. об/хв упродовж 90 с у середовищі складом (мМ): 250 сахарози, 5 ЕДТО, 5 тріс-НСl буфер при 4 6°С, рН 7,4 (Цвіліховський М.І., 1998). Концентрація білка ентероцитів у середовищі гомогенізації складала 1,65 мг/мл. Ступінь гомогенізації контролювали за допомогою мікроскопа Olimpus СH-20 (Японія) у мазках забарвлених за Романовським-Гімза, при збільшенні у 1000 разів. Критерієм якості гомогенізації були: наявність незруйнованих клітин (недостатня гомогенізація) чи відсутність вираженого осаду при центрифугуванні (10 тис.g) гомогенату (надмірна гомогенізація).

2.Диференційне центрифугування за допомогою рефрижераторної ультрацентрифуги MSE High Speed 25 (Великобританія). З метою очищення гомогенату від супутніх частин клітини та її органел (ядер, мітохондрій) і грубих мембранних фракцій його центрифугували при 10 тис.g упродовж 15 хв. Далі проводили центрифугування супернатанту при 15 тис.g - для виділення АМ, і при 70 тис.g - для виділення БМ, упродовж 60 хв, кожну. Осади очищених фракцій АМ і БМ ресуспендували у фізіологічному розчині (t 4-6°С, рН 7,4), які одразу використовували для дослідження ліпідного складу або поміщали в поліпропіленові флакони й зберігали в рідкому азоті.

Ефективність отримання фракцій плазмолеми здійснювали за вмістом білка в мембранному матеріалі. Оцінку ступеня очистки та забруднення мембранних препаратів здійснювали за активністю їх маркерних ферментів: АМ - лужної фосфатази (Cartwright I., 1999) і БМ - Na⁺, K⁺-АТРази (КФ 3.6.3.9) (Хижняк С.В., 1997).

Вміст загальних ліпідів (ЗЛП) у мембранних препаратах визначали фосфорнованіліновим методом (Knight J., 1972). Екстракцію ліпідів АМ та БМ проводили за методом (Blight E., Dyer W., 1959). Вміст загального холестеролу (ХС) в аліквоті екстракту визначали за методом (Courchaine A., 1959), а вміст загальних фосфоліпідів (ФЛ), після попередньої мінералізації, - за мікрометодом (Bartlett G., 1959).

Розділення фосфоліпідів (ФЛ) на класи проводили методом тонкошарової хроматографії на силікагелі (пластини ПТСХ-АФ-В 10Ч15, товщина шару сорбенту - 9 мкм, зв'язуюча ланка - силіказоль). В якості рухомих систем використовували суміш хлороформ-метанол-вода в об'ємному співвідношенні 65:25:4. Детекцію проводили шляхом обприскування пластин 5 % спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти із наступним прогріванням при 120⁰ С. Ідентифікацію їх класів проводили шляхом порівняння отриманої Rf з літературними даними, а також за допомогою кольорових реакцій (Кейтс M., 1975). Кількісне визначення окремих фосфоліпідів проводили шляхом вирахування площі та інтенсивності кольору плям за допомогою оптичної програми “Densitometr”.

З метою отримання метилових ефірів жирних кислот (ЖК), ліпідний екстракт мембранних фракцій обробляли метилатом натрію та 3 М розчином хлороводню в метанолі (Цвіліховский М.І., 1989), які очищували на пластинках ПТСХ-АФ-В у бензолі. Розділення метилових ефірів ЖК здійснювали на газовому хроматографі “Shimadzu” (Японія) (програмне забезпечення “Мультихром”, Росія), з використанням кварцової капілярної колонки HP-PONA (J&W, США) та полум'яно-іонізаційного детектора. Ідентифікацію піків проводили за показниками відносного часу утримування компонентів (функція програмного забезпечення). Кількісний розрахунок проводився в відсотках від загального вмісту метилових ефірів ЖК (функція програмного забезпечення).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistica-6.

Результати досліджень та їх обговорення

Виділення абсорбційних ентероцитів із порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. Отримання абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби здійснювали шляхом інкубації відрізків порожньої кишки в розчині, який містив в якості хелатуючого агента ЕДТО.

При отриманні ізольованих ентероцитів з порожньої кишки 3-х місячних плодів встановлено, що основна кількість цих клітин (86 %) виділяється в середовище впродовж перших 5 хв інкубації. Через 10 та 15 хв інкубації порожньої кишки виділилось 12 % та 2 % клітин відповідно. Слід зазначити, що відмінності між трьома клітинними фракціями стосовно активності ЛФ, як маркерного фермента ентероцитів, не було виявлено (табл. 1). Однак було встановлено, що із збільшення часу інкубації порожньої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби відбувається посилення цитолізу ентероцитів, оскільки зростає інтервальна активність ЛДГ в 1,3 та в 7,8 раза, на 10-й і 15-й хв інкубації, відповідно.

Таблиця 1 - Кумулятивна та інтервальна активність лужної фосфатази в середовищі виділення ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в залежності від часу інкубації, мкмоль/мгЧгод (М ± m, n = 6)

Вік плодів, місяці	Час інкубації порожньої кишки в середовищі виділення ентероцитів, хв
	5	10	15
	кумулятивна активність	інтервальна активність	кумулятивна активність	інтервальна активність,	кумулятивна активність	інтервальна активність
3	120,4 ±3,9	120,4 ±3,9	118,8 ±2,5	116,3 ±4,0	115,3 ±3,3	109,3 ±5,6
5	165,1 ±4,4	165,1 ±4,4	152,4 ±2,5*	32,3 ±1,6*	148,2 ±3,8	111,1 ±4,6*
7	1620,7 ± 32,0	1620,7 ± 2,0	1381, ±30,9*	328,3 ± 12,3*	1122,1±49,7*	95,7 ±4,8*

Примітка. ^* - Р < 0,05 - дані вірогідні у порівнянні з попереднім часовим відрізком для плодів одного віку.

При отриманні ізольованих ентероцитів з порожньої кишки 5-ти місячних плодів, за перші 5 хв в середовище інкубації виділилося 82 % клітин. За наступні два п'ятихвилинних інтервали часу виділилось 10 % та 8 % клітин відповідно.

При цьому фракція клітин, яка виділилась через 10 хв інкубації порожньої кишки 5-ти місячних плодів, є менш диференційованою і, ймовірно, не виконує в повній мірі абсорбтивної функції, оскільки інтервальна активність ЛФ (маркерного ферменту зрілих ентероцитів), зменшилась, у порівнянні з першим відрізком часу, в 5 разів (табл. 1). Через 15 хв інкубації порожньої кишки, інтервальна активність ЛФ зросла ще в 4 рази. Це свідчить про ймовірність лізису клітин та збільшення активності ЛФ за рахунок певних її лізоформ, які можуть міститись в клітинних органелах.

Підтвердженням цьому є й значне підвищення інтервальної активності ЛДГ в середовищі виділення клітин через 10 хв (на 30 %) та через 15 хв (у 7,8 раза) (табл. 2).

Аналогічна тенденція встановлена при отриманні абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки 7-ми місячних плодів. Так, за перші 5 хв інкубації порожньої кишки виділилось 66 % ентероцитів. Через 10 та 15 хв інкубації порожньої кишки 7-ми місячних плодів виділилось 14 % і 20 % клітин, відповідно. Це в 1,3 та у 2 рази більше, ніж за цей час було отримано ентероцитів з порожньої кишки 5-ти місячних плодів. Тобто, процес відшарування ентероцитів із слизової оболонки у 7-ми місячних плодів є більш повільним, що можна пояснити вищими адгезивними властивостями БМ ентероцитів у цих плодів.

Одержані дані свідчать, що абсорбтивна функція ентероцитів порожньої кишки у 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби більш розвинута, ніж у 5-ти місячних. Так, активність ЛФ ентероцитів 7-ми місячних плодів, яка була отримана за перші 5 хв виділення в порівнянні з цим показником 5-ти місячних плодів. Після 10-ї хв виділення клітин отримували тільки недиференційовані епітеліальні клітини.

Таблиця 2 - Кумулятивна та інтервальна активність лактатдегідрогенази у середовищі виділення ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в залежності від часу інкубації, мкмоль/мгЧгод (М ± m, n = 6)

Вік плодів, місяці	Час інкубації порожньої кишки в середовищі виділення ентероцитів , хвилин
	5	10	15
	кумулятивна активність	інтервальна активність	кумулятивна активність	інтервальна активність	кумулятивна активність	інтервальна активність
3	0,16 ±0,01	0,16 ±0,01	0,20 ±0,01	0,21 ±0,04	0,30 ±0,02	1,64 ±0,03
5	0,16 ±0,01	0,16 ±0,01	0,19 ±0,01	0,21 ± 0,01*	0,29 ± 0,01*	1,60 ± 0,05*
7	0,040 ± 0,001	0,040 ± 0,001	0,08 ±0,01*	0,29 ± 0,01*	0,14 ± 0,01*	0,38 ± 0,01*

Примітка. ^* - Р < 0,05 - дані вірогідні у порівнянні з попереднім часовим відрізком для плодів одного віку.

Значна відмінність між 5-ти та 7-ми місячними плодами великої рогатої худоби встановлена й щодо стійкості ентероцитів у процесі їх виділення. Так, активність ЛДГ у середовищі з ентероцитами 7-місячних плодів була нижчою впродовж усього часу їх виділення: за перші 5 хв виділення вона була нижчою у 7-ми місячних плодів, у порівнянні з 5-ти місячними плодами, у 4,4 раза. Це свідчить про значно вищі механічні властивості плазмолеми ентероцитів порожньої кишки у 7-ми місячних плодів.

Таким чином, скорочення часу інкубації порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в середовищі виділення з 15 до 5 хв дозволяє суттєво знизити ступінь забруднення абсорбційних ентероцитів іншими клітинами та зменшити їх деструкцію.

Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. Проведені нами дослідження свідчать, що вже на 3-му місяці пренатального періоду розвитку ентероцити порожньої кишки плодів великої рогатої худоби є досить поляризованими клітинами. Співвідношення між ліпідами та білками в АМ ентероцитів цих плодів є меншим у 4,3 раза у порівнянні з БМ. Основним ліпідом АМ і БМ ентероцитів 3-х місячних плодів є ХС. Вміст ХС в АМ (858,60 ± 8,95 нмоль/мг білка) вищий за його вміст у БМ на 39 %, що вказує на формування холестерол-збагачених мікродоменів (“рафтів”). Вміст загальних ФЛ в АМ ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів складає 640,00 ± 10,21 нмоль/мг білка, що вище за цей показник у БМ у 2,5 раза. Коефіцієнт співвідношення ХС/ФЛ (1,34 в АМ та 2,43 в БМ) є вищим в 2,0 і 3,4 рази за цей показник у новонароджених телят та дорослої великої рогатої худоби. Це свідчить про значу в'язкість, а отже, і низьку функціональну активність АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів.

Одержані дані свідчать, що зміни ліпідного складу плазмолеми абсорбційних клітин на 5-му місяці розвитку плодів полягають в зменшенні в'язкості мембранного бішару. Даний факт ми пов'язуємо з початком амніотрофного живлення плоду, яке розпочинається з другої половини внутрішньоутробного розвитку. Про зростання функціональної активності плазмолеми ентероцитів 5-ти місячних плодів може свідчити зниження величини ліпід/білкового коефіцієнта в АМ на 15 %, а в БМ - у 2,3 раза. Вміст ХС в обох фракціях плазмолеми ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів знижується в АМ на 24 %, а в БМ - на 32 %, у порівнянні з цим показником у 3-х місячних плодів.

Це сприяє зниженню в'язкості мембранного бішару, а отже, активізації транспортних процесів у кишечнику. На нашу думку, зниження в'язкості плазмолеми абсорбційних ентероцитів призводить до зростання кількості флуктуацій її бішару та посилення інтенсивності парацелюлярного шляху транспорту речовин з порожнини кишки. Поряд із зниженням вмісту ХС в плазмолемі абсорбційних ентероцитів 5-ти місячних плодів, встановлено значне підвищення вмісту ФЛ, що може вважатися одним із адаптивних механізмів у процесах онтогенезу епітелію порожньої кишки. Більш вираженою є динаміка цього показника в БМ, де він вищий у 3,9 раза у 5-ти місячних плодів у порівнянні з 3-х місячними плодами. Значне зниження в'язкості плазмолеми ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби підтверджується зміною коефіцієнту ХС/ФЛ, який в АМ ентероцитів знижується на 32 %, а в БМ - у 5,6 раза.

Ліпід/білковий коефіцієнт АМ ентероцитів порожньої кишки 7-ми місячних плодів майже не змінюється у порівнянні з цим показником в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів. Проте, в БМ ентероцитів 7-ми місячних плодів встановлено зменшення величини цього показника. Отже, результати досліджень ентероцитів плодів великої рогатої худоби свідчать про поступове зниження співвідношення між ліпідами та білками в АМ та БМ у період пренатального онтогенезу. Вказана тенденція більш характерна для онтогенезу моногастричних тварин (Pang К., 1983), але не відмічена для жуйних тварин в постнатальний період онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989).

Вміст загальних ФЛ у плазмолемі абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби з 5-го по 7-й місяці розвитку підвищувався в АМ на 38 %, а в БМ - на 90 %. В той же час, вміст ХС в цей же період зменшився в АМ у 2,2 раза, в БМ - у 2,0 раза. При цьому, коефіцієнт ХС/ФЛ знизився в АМ у 3,0 рази, а в БМ - у 3,8 раза, і досяг досить низьких значень (0,29 - в АМ та 0,13 - в БМ), які не описані в літературі для жодного виду тварин.

Одержані дані свідчать, що в процесі пренатального онтогенезу великої рогатої худоби зменшується в'язкість плазмолеми абсорбційних ентероцитів, що є передумовою розвитку їх функціональної активності.

Фосфоліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. В АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби виявлено по 6 ФЛ, з домінуванням в їх структурі ФХ та ФЕ. Спектр ФЛ представлений фосфатидилхоліном (ФХ, 52,50 ± 2,67 %), фосфатидилетаноламіном (ФЕ, 23,03 ± 1,82 %), фосфатидилсерином (ФС, 11,36 ± 0,53 %), сфінгомієліном (СМ, 9,43 ± 0,43 %), лізофосфоліпідами (ЛФЛ, 2,30 ± 0,18 %) та фосфатидилінозитолом (ФІ, 1,23 ± 0,09 %).

В БМ, у порівнянні з АМ, встановлено вірогідно вищий вміст ФС та ФІ (на 16 % та 56 %, відповідно). Значні відмінності між плодами 3-х місячного віку та великою рогатою худобою в постнатальний період онтогенезу виявлені щодо вмісту в плазмолемі ентероцитів ФІ, похідні якого виконують роль вторинних месенджерів у передачі сигналу через клітинну мембрану (Цвіліховський М.І., 1989). Так, вміст ФІ в АМ ентероцитів 3-х місячних плодів у 6,4 раза і в 2,2 раза нижчий за цей показник у новонароджених телят і дорослої великої рогатої худоби. В БМ ентероцитів 3-х місячних плодів вміст ФІ у 2,5 раза нижчий, ніж в БМ ентероцитів новонароджених телят, і в 1,8 раза, ніж дорослої великої рогатої худоби.

Незначна різниця щодо вмісту СМ між АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів може свідчити про незавершеність формування полярності плазмолеми цих клітин на даному етапі онтогенезу. Одержані дані свідчать про те, що у 3-х місячних плодів коефіцієнт співвідношення кислі/основні ФЛ є вищим в БМ, у порівнянні з АМ ентероцитів. абсорбційний ентероцит ліпідний плазмолема

Кількісні зміни у вмісті ФЛ плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби свідчать про подальший розвиток абсорбтивної та транспортної функцій цих клітин.

Основними ФЛ АМ ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби також є ФЕ та ФХ. Проте, вміст ФЕ в АМ ентероцитів цих плодів має тенденцію до підвищення у порівнянні з 3-х місячними плодами, що може бути пов'язано зі зростанням інтенсивності синтезу амінофосфоліпідів. Вміст СМ в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів нижчий у порівнянні з 3-х місячними плодами в 2,7 раза. Це можна пояснити інтенсивним амніотрофним живленням 5-ти місячних плодів і наростанням необхідності передачі сигналу до клітини. В той же час, вміст ФІ в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів у 3,3 раза вищий, у порівнянні з цим показником у 3-х місячних плодів. Внаслідок змін щодо вмісту ФЛ в плазмолемі ентероцитів 5-ти місячних плодів зменшується співвідношення між кислими та основними ФЛ. Цей показник характеризує зменшення заряду на поверхні мембрани та зниження її адсорбційних властивостей з розвитком ентероцитів порожньої кишки (Stern M., 1984; Paulsson M., 1992; Repa J., 2002).

Зміни вмісту ФЛ БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів є більш вираженими в порівнянні з АМ. Так, в БМ встановлено зменшення вмісту ФХ та підвищення вмісту ФЕ. Внаслідок цього змінюється асиметричність розподілу головних структурних ФЛ між АМ та БМ, з переважанням вмісту ФЕ в БМ, а ФХ в АМ. На користь нашого припущення щодо механізмів, які покращують парацелюлярну проникність, вказує підвищення вмісту ЛФЛ в БМ ентероцитів 5-ти місячних плодів майже на 50 % у порівнянні з цим показником в БМ ентероцитів 3-х місячних плодів.

Вміст СМ у плазмолемі ентероцитів 5-ти місячних плодів менший, у порівнянні з 3-х місячними плодами. В той же час, вміст СМ в БМ ентероцитів цих плодів вищий, у порівнянні з АМ, що не характерно для великої рогатої худоби у постнатальному періоді онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989).

Значну інтенсивність впливу певних сигнальних речовин (пептиди, тощо) на плазмолему ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів можна передбачити за зростанням вмісту ФІ в БМ, який у 3,3 раза вищий у порівнянні з цим показником в БМ 3-х місячних плодів (табл. 3). Розподіл ФІ між АМ та БМ майже не змінюється в період з 3-го по 5-й місяці внутрішньоутробного розвитку великої рогатої худоби. Не виключається ймовірність інтенсивного транспорту речовин у напрямі міжклітинний матрикс - БМ - цитоплазма ентероциту, що може бути основним джерелом надходження поживних речовин до швидкоростучих клітин (Chen M., 2001; Thomas C., 2006).

Також встановлено зміни вмісту ФЛ у плазмолемі абсорбційних ентероцитів від 5-го до 7-го місяців розвитку плодів великої рогатої худоби. Так, вміст ФС в АМ та БМ ентероцитів 7-ми місячних плодів зменшився в 2,2 і в 2,3 раза, відповідно, що встановлено і для дорослої великої рогатої худоби (Цвіліховський М.І.,1989), а вміст ЛФЛ у БМ зменшився на 38 %. Зменшення вмісту ФС в АМ та БМ абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби в період з 3-го по 7-й місяці розвитку, можна вважати маркерним показником для розвитку цього типу клітин.

В БМ і АМ ентероцитів 7-ми місячних плодів встановлено зменшення в 2,0 рази співвідношення між кислими та основними ФЛ, що свідчить про зниження поверхневого заряду мембранного бішару. При цьому індекс кислі/основні ФЛ був вищим у БМ, у порівнянні з АМ, упродовж всього досліджуваного періоду пренатального розвитку великої рогатої худоби.

Одержані дані свідчать, що на 7-му місяці розвитку плодів великої рогатої худоби абсорбційні ентероцити є більш полярними клітинами, ніж на 3-му та 5-му місяцях, оскільки саме в цей період встановлена найбільша різниця у ФЛ складі АМ та БМ. Так, якщо у 3-х місячних плодів є вірогідна різниця між АМ та БМ тільки за двома фракціями ФЛ (ФС та ФІ), то у 5-ти місячних плодів їх вже три (СМ, ФІ та ФХ), а у 7-ми місячних плодів - п'ять (ЛФЛ, СМ, ФС, ФІ та ФХ).

Таблиця 3 - Фосфоліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби, %, (М ± m, n = 6)

Фосфоліпіди	Вік плодів, міс.
	3	5	7
	АМ	БМ	АМ	БМ	АМ	БМ
ФХ	52,53 ±2,67	48,85 ±1,90	50,13 ±2,11	39,30 ± 2,37*	51,01 ±1,95	44,57 ±2,14
ФЕ	23,03 ±1,82	24,40 ±1,68	29,76 ±2,92	34,25 ± 2,71*	34,77 ±2,34	37,60 ±2,08
ФС	11,36 ±0,53	13,22 ±0,44	9,94 ±0,61	12,10 ±1,04	4,61 ±0,17**	5,26 ±0,04**
СМ	9,43 ±0,44	9,77 ±0,90	3,45 ±0,10*	5,67 ±0,34*	3,86 ±0,20	5,15 ±0,11**
ФІ	1,23 ±0,09	1,92 ±0,12	4,11 ±0,22*	6,26 ±0,31*	3,44 ±0,20	5,52 ±0,24**
ЛФЛ	2,30 ±0,18	1,97 ±0,12	2,51 ±0,22	2,93 ±0,22*	2,33 ±0,07	1,81 ±0,07**

Примітки: ^* - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 5-ти та 3-х місячних плодів;

^** - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 7-ми та 5-ти місячних плодів.

Жирнокислотний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. В АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів виявлено по 10 ЖК (табл. 4).

Таблиця 4 - Жирнокислотний склад плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби, % (М ± m, n = 6)

Жирна кислота	Вік плодів, міс.
	3	5	7
	АМ	БМ	АМ	БМ	АМ	БМ
С10:0	-	-	0,56 ±0,04	1,21 ±0,02	0,56 ±0,02	0,15 ±0,02
С12:0	2,76 ±0,03	3,31 ±0,03	2,07 ±0,07	4,41 ±0,14	1,98 ±0,09	1,31 ±0,06
С14:0	2,45 ±0,04	3,98 ±0,06	3,59 ±0,07	5,11 ±0,14	2,58 ±0,09	3,60 ±0,17
С14:1	-	-	-	2,03 ±0,11	1,08 ±0,07	0,39 ±0,06
С15:0	-	4,21 ±0,10	1,23 ±0,08*	2,22 ±0,06*	1,11 ±0,13	1,87 ±0,08
С16:0	6,55 ±0,09	7,30 ±0,08	28,80 ± 2,71*	23,50 ± 0,20*	16,90 ± 0,25**	18,02 ± 0,46**
С16:1	2,82 ±0,04	3,47 ±0,08	8,42 ±0,19*	10,63 ± 0,47*	5,28 ± 0,06**	4,16 ± 0,26**
С17:0	2,03 ±0,04	-	4,96 ±0,15*	9,10 ±0,04*	12,86 ± 0,30**	4,11 ±0,22
С17:1	30,00 ± 1,98	17,00 ± 0,99	6,96 ±0,38*	5,62 ±0,53*	21,70 ± 1,13**	46,90 ± 2,75**
С18:0	11,90 ± 0,15	27,40 ± 2,60	13,98 ± 0,14*	11,30 ± 0,26*	11,60 ± 0,23**	7,74 ± 0,06**
С18:1	5,84 ±0,03	8,36 ±0,14	21,30 ±1,9*	18,00 ± 0,17*	15,70 ± 0,32**	9,60 ± 1,42**
С18:2	31,78 ± 2,30	23,97 ± 1,50	4,04 ±0,08*	3,52 ±0,10*	2,47 ± 0,04**	1,31 ± 0,07**
С18:3	-	0,72 ±0,02	-	-	2,85 ± 0,19**	-
С20:1	3,22 ±0,19	-	-	-	-	-
С20:4	-	-	-	-	2,67 ± 0,04**	-

Примітки: ^* - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 5-ти та 3-х місячних плодів;

^** - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 7-ми та 5-ти місячних плодів.

Основними ЖК АМ є лінолева (С_18:2), гептадеценова (С_17:1), стеаринова (С_18:0) та пальмітинова (С_16:0). Також виявлені середньоланцюгові ЖК - лауринова (С_12:0) та міристинова (С_14:0), які не властиві для плазмолеми ентероцитів порожньої кишки дорослої великої рогатої худоби (Цвіліховський М.І., 1989).

Загальна сума насичених ЖК складає 25,70 ± 0,19 %, ненасичених - 74,30 ± 0,34 %, а співвідношення між ними становить 0,350 ± 0,004. Переважання ненасичених ЖК може бути компенсаторним механізмом щодо зменшення в'язкості ліпідного бішару АМ внаслідок високого вмісту в ньому ХС. Сума моноєнових ЖК складає 41,92 ± 2,12 %, дієнових - 31,78 ± 2,25 %, а співвідношення між ними становить 1,34 ± 0,16.

Слід зазначити, що в постнатальному періоді онтогенезу в плазмолемі ентероцитів порожньої кишки великої рогатої худоби не встановлено високого вмісту гептадеканової (С_17:0) та гептадеценової (С_17:1) кислот (Цвіліховський М.І., 1989). Тому, виявлена нами у плідному періоді розвитку великої рогатої худоби особливість щодо значного вмісту цих кислот у плазмолемі ентероцитів можна пояснити значною активністю елонгазо-десатуразної системи в тканинах плода та використанням в якості субстратів для синтезу вищих ЖК пропіонату, який може надходити з материнського організму.

Основною ЖК БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів є стеаринова (С_18:0) кислота, вміст якої в 2,2 рази вище, ніж в АМ. В БМ, у порівнянні з АМ, встановлено нижчий вміст ненасичених ЖК - лінолевої (на 36,6 %) та гептадеценової (в 1,8 раза), проте частка олеїнової кислоти є вищою на 43 %. Загальний вміст насичених ЖК в БМ вищий, ніж в АМ в 1,8 раза, а ненасичених - нижчий на 27 %. Співвідношення насичені/ненасичені ЖК в БМ склало 0,87 ± 0,09, що нижче за цей показник в АМ у 2,5 раза.

Зміни ЖК складу плазмолеми абсорбційних клітин 5-ти місячних плодів можна роглядати як компенсаторний механізм по відношенню до змін динаміки вмісту ХС, що є необхідним для підтримання оптимальної в'язкості внутрішньої частини мембранного бішару (Dias V., 1995; Hansen G., 2005). Так, при зниженні вмісту ХС в плазмолемі, в ній встановлено підвищення вмісту насичених ЖК, що не властиво для великої рогатої худоби у постнатальному періоді онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989). При цьому співвідношення між насиченими та ненасиченими ЖК зростає: в АМ у 3,5 раза, а в БМ у 1,6 раза. На 5-му місяці пренатального періоду онтогенезу в плазмолемі ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби встановлено наявність транс-ізомеру лінолевої, а також капринової кислот, що не описано в літературі для інших об'єктів досліджень. При цьому, вміст інших середньоланцюгових ЖК (крім лауринової в АМ) підвищується на 20 40 %, що може свідчити про посилення парацелюлярної проникності епітелію порожньої кишки.

Подальша поляризація ентероцитів порожньої кишки підтверджується змінами вмісту ЖК в їх плазмолемі на 7-му місяці розвитку плодів великої рогатої худоби. Так, вміст середньоланцюгових ЖК (С₁₀ С₁₄) у плазмолемі ентероцитів у цей період розвитку плода, знижується в 2 рази. В АМ з'являється арахідонова кислота, яка була відсутня в АМ ентероцитів плодів 3-х та 5-ти місячного віку, знижується вміст олеїнової (в 1,4 - 1,8 раза) та елаїдинової (в 4,0 9,0 рази) кислот.

Співвідношення між насиченими та ненасиченими ЖК в АМ ентероцитів 7-ми місячних плодів зменшилося на 35 %, а в БМ - у 2 рази в порівнянні з цим показником у 5-ти місячних плодів. Внаслідок цього показник співвідношення насичені/ненасичені ЖК стає вищим в АМ у порівнянні з БМ, що є характерним для дорослої великої рогатої худоби та моногастричних тварин. Також, на 7-му місяці розвитку плодів великої рогатої худоби в АМ та БМ ентероцитів встановлено зниження в 2 рази вмісту дієнових ЖК. Слід зазначити, що зниження вмісту дієнових ЖК у плазмолемі ентероцитів порожньої кишки спостерігається впродовж усього досліджуваного періоду пренатального розвитку великої рогатої худоби, що також можна вважати важливим маркерним показником мембраногенезу цих клітин.

Висновки

В результаті проведеної роботи досліджено ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. Одержані результати розкривають закономірності пренатального розвитку травного каналу у великої рогатої худоби.

1. Розроблено метод отримання високоочищеної фракції абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби, який дозволяє зменшити деструкцію цих клітин, у порівнянні з базовою методикою, в 7-10 разів.

2. Динаміка кількісних характеристик ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби характеризується зменшенням величини ліпід/білкового коефіцієнту (в АМ - у 1,2 раза, у БМ - у 2,8 раза), зниженням рівня холестеролу (в АМ та БМ у 2,9 раза), зниженням відношення холестерол/фосфоліпіди (в АМ - у 4,7 раза, у БМ - у 21 рази) та зростанням загального вмісту фосфоліпідів (в АМ - у 1,6 раза, у БМ - у 7,3 раза). Одержані дані свідчать про зниження в'язкості фракцій плазматичної мембрани ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в процесі їх пренатального розвитку.

3. Динаміка вмісту фосфоліпідів у плазмолемі ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби характеризується зменшенням рівня фосфатидилсерину (в АМ та БМ - у 2,5 раза), сфінгомієліну (в АМ - у 2,7 раза, у БМ - у 1,4 раза), суми холіновмісних фосфоліпідів (в АМ - у 1,1 раза, у БМ - у 1,2 раза), кислих фосфоліпідів (в АМ - у 1,6 раза, у БМ - у 1,4 раза), співвідношення між основними та кислими фосфоліпідами (в АМ - у 2,3 раза, у БМ - у 2,2 раза).

4. Найбільш виражені зміни фосфоліпідної композиції встановлені в АМ та БМ абсорбційних клітин у період з 5-го по 7-й місяці розвитку плодів, що вказує на завершення формування структури та основних функціональних властивостей плазмолеми ентероцитів наприкінці 2-го - початку 3-го триместру внутрішньоутробного розвитку.

5. Особливості жирнокислотного складу плазмолеми ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби полягають у наявності капринової, лауринової, гондіонової та елаїдинової кислот, які не виявляються у великої рогатої худоби в постнатальному періоді онтогенезу.

6. Встановлено зниження вмісту дієнових вищих жирних кислот в обох фракціях плазматичної мембрани (в АМ та БМ - у 11 разів), і підвищення у 10 20 разів рівня гептадеканової та гептадеценової кислот у пренатальний період розвитку великої рогатої худоби в порівнянні з новонародженими телятами та дорослою великою рогатою худобою.

7. Маркерними показниками розвитку ліпідного бішару плазмолеми абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби є підвищення в ній вмісту загальних фосфоліпідів (в АМ - в 1,6 раза, у БМ - у 7,3 раза), рівня фосфатидилінозитолу (в АМ та БМ - у 3,3 раза), фосфатидилетаноламіну (в АМ і в БМ у 1,5 раза), поява арахідонової кислоти в АМ, зниження вмісту холестеролу (в АМ та БМ у 2,9 раза), фосфатидилсерину (в АМ та БМ - в 2,5 раза), сфінгомієліну (в АМ - у 2,7 рази, у БМ - у 1,4 раза), зменшення величини співвідношення між кислими і основними фосфоліпідами (в АМ - у 2,3 раза, у БМ - у 2,2 раза) та коефіцієнту фосфатидилсерин/фосфотидилінозитол (в АМ - у 5,5 раза, а в БМ - у 7,3 раза), зниження вмісту дієнових жирних кислот (в АМ та БМ - у 11 разів) та середньоланцюгових жирних кислот (в АМ - у 1,2 раза, у БМ - у 1,3 раза).

8. Для забезпечення стабільного розвитку мембранних структур травного каналу в пренатальний період розвитку великої рогатої худоби рекомендується дотримуватись балансування ліпідного складу кормів раціону тільних корів, починаючи з другої половини тільності.

Список праць опублікованих за темою дисертації

1. Бугай А.О. Особливості динаміки фосфоліпідної композиції плазматичної мембрани ентероцитів порожньої кишки великої рогатої худоби у плідний період онтогенезу // Науково-техніч. Бюлетень Інституту біології тварин і ДНДКІ вет. препаратів та кормових добавок - Львів, 2005. - Вип. 6, № 3. - С. 54 - 58.

2. Бугай А.О., Цвіліховський М.І. Інтегральні показники ліпідного складу плазматичної мембрани ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби // Вісник Дніпропетровського державного аграрного університету: Зб. наук. пр. - Д.: ДДАУ. - 2006. - № 1. - С. 79 - 83. (Дисертантом проведено експериментальну роботу, статистично опрацьовано результати, підготовлено до друку статтю).

3. Бугай А.О. Динаміка жирнокислотного складу плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів тонкої кишки плодів великої рогатої худоби // Науковий вісник НАУ. 2007. - Вип. 108. - С. 227 - 232.

4. Бугай А.О., Цвіліховський М.І. Одержання ізольованих ентероцитів тонкої кишки плодів великої рогатої худоби під контролем біохімічних показників клітинних фракцій // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, №2. - С. 130 - 135 (Дисертант провів експеримент, визначив показники клітинних фракцій, статистично опрацював результати, підготував до друку статтю).

5. Бугай А.О. Особливості фосфоліпідного складу плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів тонкої кишки плодів Bos domesticus // Матер. IX Українського біохім. з'їзду. Харків, 24 27 жовтня 2006 р. - Харків, 2006. - Т. 1. - С. 103.

6. Бугай А.О. Жирнокислотний склад плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів тонкої кишки великої рогатої худоби на третьому місяці пренатального періоду онтогенезу // Конференція професорсько-викладацького складу і аспірантів ННІ ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ: Тези доп. Київ, 5 6 квітня 2006 р. - К., 2006. - С.10.

7. Бугай А.О. Динаміка змін ліпідного складу апікальних і базолатеральних мембран ентероцитів тонкого кишечнику великої рогатої худоби у пренатальному онтогенезі // “Наука і освіта 2005” VIII Міжнар. наук.-практ. конф. Т.2. Біохімія та біофізика. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 15 17 лютого 2005 р. - С. 44 - 45.

8. Бугай А.О., Масюк Д.М. Динаміка фосфоліпідного складу плазматичної мембрани епітеліоцитів тонкої кишки великої рогатої худоби у плідний період онтогенезу // “Актуальні напрямки розв. вет. мед. на сучасному етапі науково-технічного прогресу” Матер. наук. конфер. професорсько-виклад. складу і студент., - Дніпропетровськ, 19 21 березня 2005. - С. 28 - 29.

9. Бугай А.О., Бугай П.О., Вяткін О.К., Сандомирський О.В. Особливості жирнокислотного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів тонкої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби // “Теоретичні й практичні досягнення молодих вчених-аграріїв” Міжнар. наук.-практ. конф. молодих вчених, Дніпропетровськ, 1114 травня 2006. - С. 187 - 188.

10. Бугай А.О. Жирнокислотний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів тонкої кишки плодів великої рогатої худоби // Молодь та поступ біології: Збір. тез ІІІ Міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів. Львів, 23 27 квітня 2007 р. Львів, 2007. - С. 102 - 103.

Бугай А.О. Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Національний аграрний університет, Київ, 2008.

В дисертації досліджено закономірності змін ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.

Розроблено та науково обґрунтовано схему отримання ізольованих абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби.

Встановлено динаміку змін показників ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів, внаслідок чого їх можна вважати маркерними стосовно ступеня розвитку функції спеціалізованого кишкового епітелію. До маркерних особливостей відносяться: підвищення вмісту загальних фосфоліпідів, на тлі зниження вмісту холестеролу, зниження вмісту фосфатидилсерину на фоні підвищення вмісту фосфатидилетаноламіну, підвищення вмісту фосфатидилінозитолу, зниження вмісту сфінгомієлину, зменшення співвідношення між кислими та основними фосфоліпідами, появу арахідонової кислоти в апікальних мембранах, зниження вмісту дієнових жирних кислот, зменшення вмісту середньоланцюгових жирних кислот.

Ключові слова: велика рогата худоба, плоди, абсорбційний ентероцит, плазмолема, ліпідний склад, холестерол, фосфоліпіди, жирні кислоти.

Бугай А.А. Липидный состав плазмолеммы абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Национальный аграрный университет, Киев, 2008.

В диссертации изложены закономерности изменений липидного состава плазмолеммы абсорбционных энтероцитов плодов крупного рогатого скота. Полученные данные дают возможность более глубоко изучить этиопатогенез острых расстройств пищеварения новорождённых телят и разрабатывать комплекс мероприятий по профилактики и лечению гастроэнтеропатологии, изучать причины разной конверсии кормов и, как следствие, формирование уровня продуктивности.

Научная новизна работы заключается в следующем: впервые разработан метод выделения абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота с низкой степенью разрушения и загрязнённостью другими клетками. В мембранном бислое абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота установлено наличие каприновой и элаидиновой кислот, которые не свойственны для плазмолеммы этих клеток крупного рогатого скота в постнатальный период онтогенеза. В плазмолемме абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота выявлено повышение содержания гептадеценовой, гептадекановой, лауриновой и миристиновой кислот, уровень которых значительно превышает таковой у новорождённых телят и взрослых животных. Установлено высокую вязкость апикальной и базолатеральной мембраны абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота, которая с возрастом уменьшается. Установлено маркеры липидной структуры плазмолеммы энтероцитов, которые указывают на развитие абсорбционных энтероцитов (динамика содержания аминофосфолипидов, диеновых жирных кислот, кислых фосфолипидов).

Практическое значение полученных результатов следующее: разработанный метод выделения высокоочищенной фракции абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота с низкой степенью их разрушения позволяет использовать эти клетки в различных направлениях исследования (биохимические, физиологические, цитологические, моделирования). Полученные данные относительно динамики изменений липидного состава плазмолеммы абсорбционных энтероцитов плодов крупного рогатого скота указывают на необходимость чёткого балансирования рационов тельных коров, особенно с 5-го по7-й месяц тельности, с целью профилактики нарушений органогенеза пищеварительного тракта плодов и позволяют изучать формирование и развитие пищеварительной функции жвачных животных в пренатальном периоде онтогенеза.

Установлено количественную и качественную динамику липидных соединений апикальной (АМ) и базолатеральной (БМ) мембран абсорбционных энтероцитов плодов крупного рогатого скота, которая свидетельствует о развитии и поддержании полярности данного типа клеток.

Разработано и научно обоснованно метод получения изолированных абсорбционных энтероцитов плодов крупного рогатого скота, суть которого заключается в сокращении времени инкубации участков тощей кишки в среде с хелатирующими агентами.

Динамика количественных характеристик липидного состава плазмолеммы абсорбционных энтероцитов 3-х, 5-ти и 7-ми месячных плодов крупного рогатого скота характеризуется уменьшением величины липид/белкового коэффициента (в АМ - в 1,2 раза, в БМ - в 2,8 раза), снижением уровня холестерола (в АМ и БМ в 2,9 раза), снижением соотношения холестерол/фосфолипиды (в АМ - в 4,7 раза, в БМ - в 21 раз) и повышением содержания фосфолипидов (в АМ - в 1,6 раза, в БМ - в 7,3 раза). Полученные данные свидетельствуют о снижении вязкости фракций плазмолемы абсорбционных энтероцитов тощей кишки плодов крупного рогатого скота в процессе их пренатального развития.