Структурно-функціональна організація ядерця рослинних клітин в умовах зміненої сили тяжіння

Размещено на http://allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

030011 - цитологія, клітинна біологія та гістологія

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ ЯДЕРЦЯ РОСЛИННИХ КЛІТИН В УМОВАХ ЗМІНЕНОЇ СИЛИ ТЯЖІННЯ

ВИКОНАЛА СОБОЛЬ МАРГАРИТА АНАТОЛІЇВНА

Київ - 2003

АНОТАЦІЯ

Соболь М.А. Структурно-функціональна організація ядерця рослинних клітин в умовах зміненої сили тяжіння. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, гістологія. - Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 2003.

Створена комплексна модель ультраструктурної організації та функціонування ядерець клітин кореневих апексів проростків крес-салату, в якій відображені головні етапи біогенезу рибосом, а саме активація рибосомальних генів, транскрипція рибосомальної ДНК та процесинг рибосомальної РНК. Показані зони проходження процесингу молекул пре-рРНК, асоційованих з РНП-комплексами - процесомами, одним з елементів яких є фібриларин. Встановлено, що фібриларин крес-салату має молекулярну масу 41 кДа.

Мажорними специфічними аргентофільними білками в крес-салаті є гомологи нуклеоліну, названі нами NhL90 та NhL68. В крес-салаті аналог NopA100 Allium cepa - NhL90 виконує функції, переважно пов'язані з регуляцією конденсації р-хроматину та транскрипції рДНК, а аналог NopA64 Allium cepa - NhL68 - з процесингом рРНК. В умовах кліностатування виявлені суттєві особливості ультраструктурної організації ядерцевих субкомпонентів, пов'язані зі змінами локалізації рДНК та кількості найважливіших функціональних ядерцевих білків - фібриларину, NhL90 та NhL68. Ці особливості свідчать про зниження рівня транскрипції рибосомальної ДНК та процесингу рибосомальної РНК і накопичення попередників рибосомних субодиниць в ядерці, що дозволяє встановити зниження рівня функціональної активності ядерець під впливом зміненої гравітації.

Отримані дані відносно ультраструктурних характеристик ядерця та динаміки змін в ядерцевих субкомпонентах основних функціональних білків NhL90, NhL68 та фібриларину можуть бути використані для біотестування впливу на рослини реальної мікрогравітації в космічних експериментах та інших несприятливих факторів.

ядерцевий гравітація фібриларин рибосомальний

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЇ

Актуальність теми. Фундаментальне відкриття гравічутливості клітин поставило три основних, тісно взаємопов'язаних питання: як різного типу клітини сприймають гравітацію, якими є механізми впливу мікрогравітації на клітини і якими є можливості та механізми адаптації клітин до цього фактору [Кордюм и др., 1994].

Було показано, що за умов мікрогравітації відбуваються суттєві перебудови структурної організації та найважливіших процесів життєдіяльності рослинних клітин. Характер змін досліджених параметрів чітко вказує на значні зміни рівня та напряму метаболізму при впливі мікрогравітації, які відображаються у перебудовах структури клітинних органел та швидкості інтегральних процесів росту та розвитку рослинних організмів [Claassen, Spooner, 1994; Kordyum, 1997]. Наявні відомості щодо структурно-функціональної організації мітохондрій, хлоропластів, апарату Гольджі, ендоплазматичного ретикулуму в цих умовах [Делоне и др., 1991; Gruener, Hoeger, 1990; Kordyum, Sytnik, 1983], але існує дуже мало даних щодо впливу кліностатування і реальної мікрогравітації на ядерце [Shen-Miller, Gordon, 1967; Shen-Miller, Hinchman, 1968].

Ядерце є специфічним регіоном ядра, де відбувається транскрипція рибосомальної ДНК (рДНК), в результаті чого синтезується молекула попередника рибосомальної РНК - 45S пре-рРНК; процесинг рибосомальної РНК (рРНК), під час якого молекула 45S-рРНК специфічно розщеплюється, в результаті чого утворюється по одній копії 28S-рРНК, 18S-рРНК та 5,8S-рРНК, які, власно, і є компонентами рибосом; дозрівання рибосомних субодиниць, в ході якого новосинтезовані транскрипти зв'язуються з рибосомними білками з утворенням рибосом [Medina et al., 2000]. Тому різнобічне дослідження функціонування ядерця в умовах зміненої гравітації має дати відповідь на те, якими є механізми впливу мікрогравітації на клітини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася за науковими темами відділу клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України №242 (1996-1997 pр.) «Космобіологія: біологія клітини в умовах мікрогравітації, методологія діагностування фізіолого-біохімічного та імунологічного стану біологічних систем», номер державної реєстрації 01934032386; № 305 (1998-1999 pр.) «Обґрунтування пропозицій щодо досліджень впливу мікрогравітації на ріст та розвиток організмів», номер державної реєстрації 0198U004498; № 312 (2000-2002 рр.) «Розробка та створення польотного обладнання для космічних біологічних і біотехнологічних експериментів та проведення наземних досліджень», номер державної реєстрації 0100V004187. Дана робота також підтримана грантом INTAS №YSF 2001/2-144.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у з'ясуванні особливостей структури та функціонування ядерця рослинних клітин в умовах зміненої гравітації. Для досягнення цієї мети були поставлені задачі відпрацювати методи вирощування проростків крес-салату на кліностаті та дослідити в стаціонарних умовах вирощування та в умовах зміненої гравітації:

- ультраструктурну організацію меристематичних клітин коренів проростків крес-салату;

- ядерцеву локалізацію ДНК в меристематичних клітинах;

- молекулярну масу, фракційну приналежність та ядерцеву локалізацію фібриларину в меристематичних клітинах;

- субядерцеву локалізацію та особливості функціонування гомологів нуклеоліну в меристематичних клітинах;

- молекулярний діапазон специфічних аргентофільних білків крес-салату та їх вміст в ядерцях різних ростових зон кореня;

- вивчити динаміку синтезу рибосомальної РНК в ядерцях меристематичних клітин.

Об'єкт дослідження - вплив зміненої гравітації на рослинні клітини.

Предмет дослідження - ультраструктурна організація та функціонування ядерця рослинних клітин за умов зміненої гравітації.

Методи дослідження - світлова та електронна мікроскопія, цитохімія, флюоресцентна та електронна імуноцитохімія, конфокальна лазерна скануюча мікроскопія, імуноблотинг та радіоавтографія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в умовах кліностатування виявлені суттєві особливості ультраструктурної організації ядерцевих субкомпонентів, пов'язані зі змінами локалізації рДНК та кількості найважливіших функціональних ядерцевих білків - фібриларину, NopA100 та NopA64. Встановлені особливості свідчать про зниження рівня транскрипції рибосомальної ДНК та процесингу рибосомальної РНК і накопичення попередників рибосомних субодиниць в ядерці, що дозволяє вперше встановити зниження рівня функціональної активності ядерець під впливом зміненої гравітації.

Вперше показано, що фібриларин крес-салату має молекулярну масу 41 кДа. Встановлено, що мажорними специфічними аргентофільними білками в крес-салаті є гомологи нуклеоліну, названі нами NhL90 та NhL68. Показано, що в крес-салаті аналог NopA100 Allium cepa - NhL90 виконує функції, переважно пов'язані з регуляцією конденсації р-хроматину та транскрипції рДНК, а аналог NopA64 Allium cepa - NhL68 - з процесингом рРНК.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані щодо ультраструктурних характеристик ядерця та динаміки змін в ядерцевих субкомпонентах основних функціональних білків NhL90, NhL68 та фібриларину можуть бути використані в біотестуванні впливу на рослини реальної мікрогравітації в космічних експериментах, а також інших несприятливих факторів.

Особистий внесок здобувача полягає в аналізі наукової літератури, освоєнні методик дослідження, самостійній розробці та виконанні науково-дослідної програми, обробці отриманих експериментальних даних, підготовці наукових статей та оформленні дисертаційної роботи.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Основним об'єктом дослідження були клітини зон меристеми, розтягу та диференціювання головного кореня 2-добових проростків крес-салату (Lepidium sativum L.).

Методи культивування. Насіння крес-салату в асептичних умовах вміщували в середовище, яке містило 1%-ий розчин агару у дистильованій воді. Посів насінин провадили у ламінарному боксі. Під час висіву насінини орієнтували зародковим коренем донизу. Проростки росли в пробірках діаметром 30 мм та висотою 100 мм у темряві протягом двох діб. Для вирощування рослинних об'єктів в умовах кліностатування нами були використані горизонтальні кліностати з швидкістю обертання 2 об/хв.

Давлені препарати для цитохімічних досліджень виготовляли за [Соболь, 1999; Соболь, 2001; Соболь, Мартин, 2002].

Давлені препарати для імуноцитохімічних досліджень готували за [Carcer, Medina, 1999].

Препарати напівтонких зрізів меристем, заключених в смолу LRWhite виготовляли за [Cerdido, Medina, 1995].

Препарати напівтонких зрізів меристем, заключених в смолу Immuno-Bed готували за [Carcer, Medina, 1999].

Фарбування толуідіном блакитним та фарбування гематоксиліном Караччі - еозином проводили за [Martin et al., 1992].

Цитохімію на ДНК з флюоресцентним барвником 4',6-діамідін-2-феніліндолом (DAPI) проводили за [Testillano et al., 1992].

Цитохімію на специфічні ядерцеві аргентофільні білки проводили згідно [Соболь, 1999; Соболь, 2001; Соболь, Мартин, 2002].

Імуноцитохімію з антитілами до фібриларину на давлених препаратах проводили за [Carcer, Medina, 1999] в нашій модифікації.

Ультратонкі зрізи меристем, заключених в смолу Epon, для ультраструктурних досліджень готували згідно [Соболь, 2001].

Ультратонкі зрізи меристем, заключених в смолу LRWhite, для імуноцитохімічних досліджень виготовляли за [Cerdido, Medina, 1995].

Ультраструктурну імуноцитохімію з антитілами до ДНК, фібриларину, NopA100, NopA64 проводили згідно [Cerdido, Medina, 1995; Martin et al., 1992; Yano, Sato, 1995] з нашими модифікаціями.

Ультраструктурну детекцію ДНК з термінальною деоксінуклеотиділтрансферазою (Tdt) проводили за [Jennane et al., 2000] в нашій модифікації.

Виділення ядер, фракціонування білків, електрофорез білків в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE), імуноблотинг, видалення антитіл з Western blot - мембран, неспецифічне фарбування сріблом, специфічне фарбування AgNO3 проводили згідно [Лазарева и др., 1997; Carcer et al., 1997; Cerdido, Medina, 1995] з нашими модифікаціями.

Радіоавтографію проводили за [Medina et al., 1995] в нашій модифікації.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням комп'ютерної програми Bio8.

Результати досліджень:

1. Ультраструктурна організація меристематичних клітин коренів проростків крес-салату в контрольних умовах та за умов зміненої гравітації

Дводобові проростки крес-салату у нормі мали зародковий корінь, гіпокотиль, сім'ядолі та зачатки першої пари справжніх листків. Корені орієнтувалися строго вертикально, їх довжина варіювала від 7 до 12 мм. Кліностатовані рослини відрізнялися від контрольних вигнутими або покрученими зародковими коренями, що росли паралельно поверхні агару або вертикально, у протилежному напрямку по відношенню до поверхні субстрату. Їхня довжина істотно не змінювалася у порівнянні з контролем. В контролі ультраструктура меристематичних клітин коренів крес-салату була характерною для клітин цього типу. Клітини 2-4 шарів периблеми містили ядро, яке займало центральне положення, круглої або овальної форми, наповнене переважно дифузним хроматином. Поодиноке велике ядерце круглої або злегка овальної форми було розташовано в центрі ядра. Згідно прийнятої морфо-функціональної класифікації [Челидзе, Зацепина, 1988], ядерця в клітинах, що аналізувалися, можуть бути віднесені до нуклеолонемного типу або нуклеолонемно-вакуолізованого типу, для яких характерний високий або помірно-високий рівень функціональної активності. Фібрилярні центри (ФЦ) розміщувалися по всьому ядерцевому об'єму. Щільний фібрилярний компонент (ЩФК) розміщувався навколо фібрилярних центрів або між ними. Гранулярний компонент (ГК) був розташований на периферії ядерця та навколо вакуолей. Широкий пухкий шар ГК на ядерцевій периферії може бути непрямим показником інтенсивного транспорту рибосомних субодиниць з ядерця в каріоплазму і потім в цитоплазму. Ядерцеві вакуолі (ЯВ) різних розмірів розміщувалися по всьому ядерцевому об'єму, мали нечіткі контури та нуклеоплазмо-подібний вміст. Іноді ЯВ межували з ФЦ.

В умовах кліностатування ядра та ядерця не відрізнялися від контролю за формою та положенням. Ядерця були віднесені до тих самих морфо-функціональних типів, що і контрольні. На відміну від контролю, більші за розміром та кількістю кластери конденсованого хроматину були виявлені в каріоплазмі. Щільний шар ГК займав ядерцеву периферію. Відносний об'єм фібрилярних центрів та кількість ФЦ на ядерце були втричі вищими, ніж в контролі, при цьому середній об'єм одного ФЦ дорівнював контрольному показникові (табл. 1).

Таблиця 1. Результати морфометричного аналізу ядерець та ядерцевих компонентів меристематичних клітин коренів крес-салату в стаціонарних умовах вирощування та при кліностатуванні

Подібне збільшення тотального відносного об'єму фібрилярних центрів в ядерці спостерігали під дією актиноміцину Д [Sato, 1988] та гіпоксії [Yano, Sato, 1999] в Allium cepa та Vicia faba, що, на думку авторів, було пов'язано зі зниженням транскрипції рДНК. Відносний об'єм ЯВ був більшим у півтора рази, ніж в контролі. Ядерцеві вакуолі були чітко окреслені і мали електронно-прозорий внутрішній матеріал. Продемонстровано, що послаблення ядерцевої біосинтетичної активності, індуковане обробкою антибіотиками в клітинах проростків гороху, спричинювало вакуолізацію ядерець [Moreno Diaz De La Espina et al., 1980]. Ядерцеві вакуолі були присутні в ядерцях з низькою транскрипційною активністю в G_0-1-заблокованих клітинах апікальної меристеми сім'ядолей гороху [Jennane et al., 2000]. Відносний об'єм щільного фібрилярного компоненту зменшувався вдвічі порівняно з контролем (табл. 1).

2. Локалізація ДНК в ядерцях меристематичних клітин кореня в контролі та при дії зміненої гравітації

В контролі з використанням інкубації в DAPI та конфокальної лазерної мікроскопії детекція ДНК на кожній сканованій оптичній поверхні виявила ядерце як темну зону, оточену шаром дифузного хроматину ядра. Кластери конденсованого хроматину візуалізовані як яскраві плями. Всередині ядерця виявляються яскраві маленькі ділянки правильної круглястої форми. Цікаво, що кожна з них «виникає» на тому чи іншому оптичному зрізі, деякі з них займають декілька сканованих поверхонь. На нашу думку, вони являють собою фібрилярні центри, які містять всередині конденсовану рДНК, так звані гетерогенні ФЦ. Кластери конденсованого хроматину у ФЦ утворені нуклеосомними фібрилами рДНК, тимчасово виведеної зі стану активації, та міжгенними нетранскрибованими спейсерними районами рДНК [Carcer, Medina, 1999; Yano, Sato, 2002]. Між фібрилярними центрами виявляється тонка сітка ДНК-філаментів, яка з'єднує ФЦ між собою та з хроматином ядра. Ми припускаємо, що вона являє собою тяжі деконденсованої рДНК, задіяної в транскрипції.

В умовах зміненої гравітації детекція ДНК на кожній сканованій оптичній поверхні не виявила особливих відмінностей у зовнішньому вигляді ядерця, стані дифузного хроматину та розташуванні кластерів конденсованого хроматину ядра порівняно з контролем. Гетерогенні фібрилярні центри, так само як і в контролі, локалізовані в ядерці у вигляді яскравих маленьких зон, які займають декілька сканованих оптичних зрізів. Як і в контрольних умовах, філаменти транскрибованої рДНК з'єднують фібрилярні центри між собою та з хроматином ядра. Кількість ядерець з гетерогенними ФЦ була на 12% меншою, ніж в контролі, але загальна кількість гетерогенних фібрилярних центрів перевищувала контрольний показник у півтора рази. Середня кількість гетерогенних ФЦ на ядерце була у півтора рази вищою порівняно з контролем (табл. 2).

Таблиця 2. Кількісний аналіз наявності гетерогенних фібрилярних центрів в ядерцях в контролі та за умов зміненої гравітації

При підвищенні ядерцевої активності гетерохроматин фібрилярних центрів поступово деконденсується з утворенням тонких фібрил рДНК. Навпаки, при зниженні рівня функціонування ядерця рДНК всередині фібрилярних центрів поступово конденсується до утворення кластерів гетерохроматину [Highett et al., 1993]. Це призводить до висновку, що конформаційні зміни фібрилярних центрів тісно пов'язані з транскрипційною активністю рДНК [Yano, Sato, 2000]. Поява великих фібрилярних центрів, які містили всередині блоки конденсованого хроматину, була продемонстрована при впливі зниженої температури на Zea mays та Pisum sativum [Mineur et al., 1998]. Мінеур з співавторами висловили припущення, що в ході інактивації транскрипції р-генів, спричиненої дією холодового стресу, транскрибована рДНК переходить з щільного фібрилярного компоненту у фібрилярні центри з наступною конденсацією і утворенням блоків гетеро-р-хроматину.

3. Ультраструктурна субядерцева локалізація ДНК в меристематичних клітинах в контролі та за умов зміненої гравітації

В стаціонарних умовах вирощування мічення антитілами до ДНК та мічення за Tdt методом, який базується на застосуванні термінальної деоксінуклеотиділтрансферази, на ультраструктурному рівні локалізувало ДНК ядра, пластид та мітохондрій. Інші клітинні компартменти взагалі не містили мітки. В ядрі найбільш міченими виявилися блоки гетерохроматину. Значно менша кількість часток золота була виявлена над дифузним хроматином. В ядерці мітка була локалізована над фібрилярними центрами та щільним фібрилярним компонентом. В фібрилярних центрах частки золота виявлені над кластерами конденсованого хроматину, над внутрішніми фібрилами деконденсованої рДНК та на границі ФЦ-ЩФК. Іноді частки золота виявлялися розташованими в лінію, яка простягалася від ФЦ у ЩФК. Гранулярний компонент та ядерцеві вакуолі були зовсім позбавлені мітки. За кількісним розподілом мітки антитіл до ДНК в ядерці, гомогенні та гетерогенні фібрилярні центри виявилися в 1,24 рази більш міченими, ніж щільний фібрилярний компонент. За кількісним розподілом мітки Tdt в ядерці, гомогенні та гетерогенні фібрилярні центри містили в 1,7 разів більшу кількість часток золота, ніж щільний фібрилярний компонент. Отримані нами результати співпадають з літературними даними щодо наявності в фібрилярних центрах більшої кількості рДНК, ніж у щільному фібрилярному компоненті [Motte et al., 1991].

В умовах зміненої гравітації мітка антитіл до ДНК та мітка Tdt на ультраструктурному рівні виявили ядерну, пластидну та мітохондріальну ДНК. Як і в контрольних умовах, всі інші клітинні органели зовсім не містили мітки. В ядрі блоки гетерохроматину були мічені більше, ніж в контролі. Над дифузним хроматином була виявлена помірна кількість часток золота. В ядерці мітка антитіл до ДНК була перерозподілена між ФЦ та ЩФК порівняно з контролем. У вдвічі більшій кількості мітка була локалізована над фібрилярними центрами; **p<0,01. Щільний фібрилярний компонент був мічений у півтора рази менше, ніж в контролі; *p<0,05. В ядерці виявлені великі вакуолі, що безпосередньо межували з ФЦ. В цьому випадку ФЦ вирізнялися наявністю в них мітки антитіл до ДНК, а вакуолярні ділянки - наявністю в них передрибосомних частинок. Наявність у вакуолях передрибосомних частинок, на думку Дженнан з співавторами, свідчить про те, що ядерцеві вакуолі задіяні в транспорті та/або зберіганні передрибосом [Jennane et al., 2000]. Також в ядерці виявлений перерозподіл мітки Tdt між ФЦ та ЩФК порівняно з контролем. Фібрилярні центри, включаючи кластери конденсованого р-хроматину, внутрішню рДНК та перехідну зону ФЦ-ЩФК, містили в 1,2 рази більшу кількість часток золота; *p0,05. Кількість мітки над щільним фібрилярним компонентом виявилася у півтора рази меншою, ніж в контролі; **p0,01. В фібрилярних центрах, на відміну від контролю, більш міченими виявилися блоки конденсованого р-хроматину та внутрішня рДНК, а перехідна зона ФЦ-ЩФК містила меншу кількість мітки. Поступова концентрація внутрішньоядерцевої рДНК в фібрилярних центрах з утворенням одного чи декількох кластерів гетерохроматину описана також при дії гіпоксії на Allium cepa та Vicia faba [Yamada, Sato, 1996; Yano, Sato, 1999]. Відомо, що вплив гіпоксії зменшує пул UTP та, можливо, вичерпує доступний для клітин пул ATP, тим самим знижуючи транскрипційну активність рДНК [Fernandez-Gomez et al., 1984]. Ямада з співавторами висловили припущення, що в умовах гіпоксії саме зниження рівня транскрипції р-генів призводить до переходу рДНК, задіяної в транскрипції, з щільного фібрилярного компоненту у фібрилярні центри.

5. Кількісна характеристика білка фібриларину - одного з найважливіших білків процесингу пре-рРНК - та локалізація фібриларину в ядерцях меристематичних клітин кореня крес-салату

Фібриларин локалізували на мембранах після SDS-PAGE та імуноблотингу з антитілами до фібриларину. У фракції білків ядерного матриксу антитіла виявили виразну смугу, яка відповідає фібриларину. Білок, локалізований в цій фракції, має молекулярну масу 40,36 кДа. Фракція білків, розчинних при високих концентраціях солей, не показала ніякої реакції з антитілами до фібриларину. У фракції білків, асоційованих з хроматином, антитіла локалізували білок з молекулярною масою 41,38 кДа. У фракції S2, яка містить білки, розчинні у буфері ЕДТА низької іонної сили [Carcer et al., 1997], антитіла до фібриларину виявили білок, який має молекулярну масу 41,04 кДа. Отже, нами встановлено, що фібриларин з ядерець крес-салату має молекулярну масу 41 кДа. Як відомо, один і той самий білок може бути наявним в декількох фракціях, в залежності від того, в якій конформації він знаходиться і з якими іншими молекулами зв'язаний [Cerdido, Medina, 1995]. Ми вважаємо, що, ймовірно, фібриларин фракції білків ядерного матриксу in vivo знаходився в ядерці у складі процесоми, не зв'язаної з молекулою рДНК. Фібриларин фракції білків, асоційованих з хроматином, був зв'язаний з молекулою пре-рРНК під час її синтезу на рДНК. Фібриларин, виявлений у фракції S2 належав до пулу вільного фібриларину. Фібриларин та його гомологи з молекулярною масою 34 - 38 кДа ідентифіковані в дріжджах, рослинах, Xenopus та людині [Aris, Blobel, 1991; Cerdido, Medina, 1995; Lapeyre et al., 1990; Schimmang et al., 1989; Testillano et al., 1992]. Отже, фібриларин крес-салату з молекулярною масою 41 кДа відрізняється від знайдених в інших видах організмів гомологів. Фібриларин та ДНК були сумісно виявлені на оптичних зрізах з використанням конфокального лазерного скануючого мікроскопу. Імунофлюоресцентна детекція фібриларину з використанням антитіл до фібриларину виявила яскраве забарвлення майже всього ядерця, за виключенням його периферійного шару. В забарвленій зоні, обмеженій фібрилярним компонентом ядерця, візуалізовані ділянки різної яскравості, що, за нашою думкою, свідчить про неоднорідний розподіл фібриларину крізь ядерце. Детекція ДНК після реакції з DAPI візуалізувала помірно забарвлену зону дифузного хроматину ядра та яскраві кластери конденсованого хроматину ядра і гетерогенних ФЦ. Цікаво відмітити, що гетерогенні ФЦ розташовані у зонах, позбавлених мічення антитілами, але оточені яскраво забарвленою зоною фібриларину. В ядерці наявні ФЦ, з'єднані тонкими філаментами ДНК з кластерами гетерохроматину ядра або між собою. Ця деконденсована ДНК занурена у шар фібриларину. Нерівномірний розподіл фібриларину в ядерці був показаний для Allium cepa [Carcer, Medina, 1999; Cerdido, Medina, 1995]. Дані, отримані авторами, лягли в основу моделі функціональної архітектури ядерця. Згідно неї, фібрилярні центри є фокусами акумуляції рДНК, яка переважно транскрибується в дискретних локусах на периферії фібрилярних центрів. Рибосомальна ДНК, простягнута крізь щільний фібрилярний компонент, з'єднує фібрилярні центри між собою і містить транскрипційно-активні ділянки. Ця модель добре узгоджується з результатами, отриманими нами для крес-салату. Ми вважаємо, що зони, мічені анти-фібриларин антитілами, відповідають зонам проходження процесингу молекул пре-рРНК, асоційованих з РНП-комплексами або процесомами [Medina et al., 1995], одним з елементів яких є фібриларин.

6. Ультраструктурна субядерцева локалізація фібриларину в меристематичних клітинах в контролі та за умов зміненої гравітації

В контролі мічення антитілами до фібриларину на ультраструктурному рівні було локалізовано в ядерці. Мітка виявлена на периферії фібрилярних центрів, тобто у перехідній зоні ФЦ-ЩФК, і у щільному фібрилярному компоненті. Гранулярний компонент та ядерцеві вакуолі не містили часток золота. За кількісним розподілом мітки антитіл до фібриларину в ядерці, перехідна зона ФЦ-ЩФК виявилася в п'ять разів більш міченою, ніж щільний фібрилярний компонент. Виявлена нами висока концентрація фібриларину в перехідній зоні ФЦ-ЩФК добре узгоджується з результатами досліджень Шира з співавторами, який показав, що фібриларин є компонентом термінальних кульок молекул рРНК, які синтезуються [Scheer, Benavente, 1990]. Це дозволило зробити висновок, що фібриларин бере участь в ранніх стадіях процесингу рРНК [Kass et al., 1990]. Однак, багато інших пост-транскрипційних подій в рибосомному біогенезі також залежать від фібриларину [Tollervey et al., 1993]. Локалізація фібриларину навколо фібрилярних центрів, в перехідній зоні ФЦ-ЩФК свідчить про проходження процесів визрівання рРНК на їх периферії. Фібриларин, локалізований в щільному фібрилярному компоненті, задіяний в подальшому процесингу молекул пре-рРНК.

В умовах зміненої гравітації мітка антитіл до фібриларину на ультраструктурному рівні мала виключно ядерцеву локалізацію. Частки золота були виявлені на границі ФЦ-ЩФК і над щільним фібрилярним компонентом. За кількісним розподілом мітки антитіл до фібриларину в ядерці, перехідна зона ФЦ-ЩФК була міченою втричі менше, ніж в контролі; *p0,05. Кількість мітки, локалізованої у щільному фібрилярному компоненті, була втричі меншою порівняно з контролем; ***p0,001. Було продемонстровано, що зменшення кількості фібриларину відповідає зниженню рівня функціонування ядерця і, навпаки, підвищення функціональної активності ядерця корелює зі збільшенням кількості фібриларину [Haaf et al., 1990; Ochs, Smetana, 1991]. Ці результати спростовують положення про фібриларин як простий структурний білок ядерець рослинних клітин та його незалежність від транскрипційної активності р-генів [Testillano et al., 1992].

7. Ультраструктурна субядерцева локалізація гомологів нуклеоліну NopA100 та NopA64 в меристематичних клітинах в контролі та за умов зміненої гравітації

В стаціонарних умовах вирощування мічення антитілами до NopA100 та антитілами до NopA64 на ультраструктурному рівні було локалізовано над ядерцем. Частки золота виявлені над фібрилярними центрами та щільним фібрилярним компонентом. В ЩФК мітка була розташована на різній відстані від ФЦ. Іноді частки золота були розташовані в лінію, яка простягалася вздовж границі ФЦ або перпендикулярно до неї. В фібрилярних центрах більша частина мітки виявлена над перехідною зоною ФЦ-ЩФК. Гранулярний компонент та ядерцеві вакуолі були позбавлені мітки. За кількісним розподілом мітки антитіл до NopA100 в ядерці, фібрилярні центри та перехідна зона ФЦ-ЩФК виявилися в 1,7 разів більш міченими, ніж щільний фібрилярний компонент.

За кількісним розподілом мітки антитіл до NopA64 в ядерці, фібрилярні центри та перехідна зона ФЦ-ЩФК містили у півтора рази більшу кількість мітки, ніж щільний фібрилярний компонент. Відомо, що нуклеолін, гомологами якого є NopA100 та NopA64, задіяний в регуляції процесів конденсації-деконденсації р-хроматину та підтримці рДНК у потенційно-активному стані [Erard et al., 1990]. Було показано, що нуклеолін активує транскрипцію р-генів [Caizergues-Ferrer et al., 1987]. Визначено, що нуклеолін одним з перших зв'язується з молекулою пре-рРНК, яка синтезується, та бере участь у формуванні процесуючого комплексу [Lazdins et al., 1997]. Нуклеолін є задіяним і в наступних стадіях процесингу рРНК [Tong et al., 1997]. Отже, нуклеолін, як і всі його гомологи, є поліфункціональним білком, і баланс між виконанням ним окремих функцій залежить від превалювання в його структурі тих чи інших доменів [Ginisty et al., 1999]. За нашою думкою, NopA100 та NopA64, виявлені нами в фібрилярних центрах, забезпечують деконденсований, потенційно-активний стан рДНК. NopA100 та NopA64, розташовані у перехідній зоні ФЦ-ЩФК, вельми ймовірно, є задіяними в активації транскрипції рДНК та у ранньому процесингу пре-рРНК, яка синтезується. Останнє наше припущення підтверджується детекцією нуклеоліну на молекулах пре-рРНК під час їх синтезу на матриці рДНК [Ghisolfi-Nieto et al., 1996]. NopA100 та NopA64, локалізовані нами в щільному фібрилярному компоненті, за нашою думкою, беруть участь в наступних стадіях процесингу рРНК.

В умовах зміненої гравітації мітки антитіл до NopA100 та антитіл до NopA64 були виявлені виключно над ядерцем. В фібрилярних центрах відмічені зміни в локалізації мітки порівняно з контролем. Більша кількість мітки виявлена у внутрішньому просторі ФЦ, ніж над перехідною зоною ФЦ-ЩФК. В щільному фібрилярному компоненті значно менша кількість часток золота розташована в лінії вздовж або перпендикулярно границі ФЦ порівняно з контролем. Гранулярний компонент та ядерцеві вакуолі були позбавлені мічення. Іноді фібрилярні центри межували з ядерцевими вакуолями. В цьому випадку мітка антитіл до NopA100 була локалізована над перехідною зоною ФЦ-ЩФК. За кількісним розподілом мітки антитіл до NopA100 в ядерці, фібрилярні центри та перехідна зона ФЦ-ЩФК були мічені в 2,4 рази більше порівняно з контролем; *p0,05. Щільний фібрилярний компонент містив вдвічі меншу кількість часток золота, ніж в контролі; **p0,01. За кількісним розподілом мітки антитіл до NopA64 в ядерці, фібрилярні центри та перехідна зона ФЦ-ЩФК виявилися міченими вдвічі менше, ніж в контролі; *p0,05. Щільний фібрилярний компонент містив в п'ять разів меншу кількість мітки порівняно з контролем; ^***p<0,001.

9. Специфічні ядерцеві аргентофільні білки

Специфічні аргентофільні білки локалізували на Western blot - мембранах після електрофорезу білків ядерних фракцій в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію. Денситометричний аналіз показав, що аргентофільні білки належать до фракції S2, яка містить білки, розчинні у буфері ЕДТА низької іонної сили [Carcer et al., 1997], та фракції мембран, яка містить білки ядерної мембрани та залишки асоційованого з нею цитоскелету [Carcer et al., 1997]. У фракції S2 специфічне фарбування AgNO₃ виявило 10 смуг з оптичною щільністю від 1,105 до 3,556. Мажорним білком цієї фракції є білок з молекулярною масою 90,00 кДа. Другим за оптичною щільністю є білок 67,93 кДа. Мінорний білок фракції має молекулярну масу 78,29 кДа. У фракції мембран специфічним Ag-фарбуванням виявлено 6 смуг з оптичною щільністю від 1,010 до 2,263. В цій фракції білок з молекулярною масою 90 кДа не утворює найвиразнішу смугу, замість нього мажорним білком фракції мембран є білок 48,76 кДа. Близький до нього за молекулярною масою білок 49,13 кДа є третім за оптичною щільністю у фракції S2. На відміну від фракції S2, у фракції мембран зовсім відсутні смуги між 50,71 та 90,00 кДа. Цікаво відмітити, що в обох фракціях наявні білки з молекулярними масами близько 45 кДа та близько 49 кДа.

Наші дані добре узгоджуються з результатами, отриманими для Allium cepa [Martin et al., 1992], де також аргентофільні білки займали фракцію S2. Медіна з співавторами довів, що мажорними білками, які специфічно фарбуються сріблом, є рослинні гомологи нуклеоліну з молекулярними масами 64 кДа та 100 кДа (NopA64 та NopA100 з Allium cepa) [Carcer et al., 1997]. В різних видах організмів охарактеризовані нуклеолін та нуклеолін-подібні білки, молекулярна маса яких варіює від 52 кДа до 110 кДа [Bogre et al., 1996; Echeverria, Lahmy, 1995; McGrath et al., 1997]. З урахуванням цих літературних даних, ми вважаємо, що мажорними специфічними аргентофільними білками в крес-салаті є гомологи нуклеоліну, названі нами, за аналогією з термінологією, запропонованою Карсером з співавторами [Carcer et al., 1997], NhL90 та NhL68 (Nucleolin homologue from Lepidium of 90 kDa та ... 68 kDa). Відповідно, аналогом NopA100 Allium cepa в крес-салаті є NhL90, а аналогом NopA64 Allium cepa в крес-салаті є NhL68. Як відомо, нуклеолін не є єдиним специфічним аргентофільним білком [Соболь, 2001]. Показано, що білок з молекулярною масою 40 - 45 кДа також позитивно відповідає на специфічне фарбування AgNO₃ [Shaw, Jordan, 1995] і є білком B23. Ймовірно, що в крес-салаті молекулярна маса аналогу B23 дещо відрізняється від описаної іншими авторами і складає 45 - 49 кДа.

Специфічні аргентофільні білки виявляли із застосуванням методу цитохімії на рівні світлової мікроскопії в ядерцях клітин зон меристеми, розтягу та диференціювання. Вміст аргентофільних білків оцінювали наступними параметрами: площею проекції, об'ємом та площею поверхні ядерець [Архипчук, 1995]. В контролі вміст специфічних аргентофільних білків в ядерцях клітин зон меристеми, розтягу та диференціювання за таким параметром, як об'єм ядерець, складав 219,555,12 мкм³; 177,906,39 мкм³ та 97,115,50 мкм³ відповідно. В умовах кліностатування по всіх трьох параметрах: площі проекції, об'єму та площі поверхні ядерець статистично достовірні відмінності у вмісті аргентофільних білків спостерігалися в ядерцях клітин зони розтягу - 36,370,84 мкм²; 177,906,39 мкм³ та 145,463,35 мкм² в контролі проти 31,420,84 мкм²; 145,415,95 мкм³ та 125,683,36 мкм² при зміненій гравітації відповідно; р<0,001 (табл. 3).

Таблиця 3. Вміст Ag-білків в ядерцях різних зон коренів 2-добових проростків крес-салату в контрольних умовах та під впливом кліностатування

В каріоплазмі був виявлений аргентофільний матеріал, рівномірно розташований в інтерхроматинових зонах. Зменшення вмісту аргентофільних білків в ядерці співвідноситься зі статистично достовірним зменшенням об'єму клітин зони розтягу - 45637,501896,97 мкм³ в контролі проти 32841,771507,60 мкм³ в умовах кліностатування відповідно; р<0,001.

10. Спектр молекулярних мас ядерних та ядерцевих білків крес-салату

Виділені ядра з меристем коренів перевіряли на чистоту фракції та структурну цілісність з використанням фарбування метиловим зеленим - піроніном та фазово-контрастної світлової мікроскопії. Ядерця в ізольованих ядрах зберігали свою структуру та форму, подібні до ядерцевих характеристик in situ. Фракціонування та SDS-PAGE всіх ядерних білків з наступним перенесенням на полівініліден діфлюоридні (PVDF) мембрани та неспецифічним фарбуванням сріблом виявили 43 смуги в 5 фракціях. У фракції білків ядерного матриксу локалізовані 4 смуги з оптичними щільностями від 0,681 до 1,736, утворені білками з молекулярними масами від 27,37 кДа до 64,67 кДа. У фракції білків, розчинних при високих концентраціях солей, виявлена 1 смуга білку з молекулярною масою 63,26 кДа, оптична щільність якої дорівнює 0,465. У фракції білків, асоційованих з хроматином, денситометричний аналіз виявив 5 смуг, оптична щільність яких варіювала від 0,722 до 4,318.

Мажорний білок цієї фракції з молекулярною масою 25,60 кДа виходить за межі діапазону, охопленому стандартами молекулярних мас, тому вельми ймовірним претендентом на мажорність в цій фракції є білок 62,49 кДа з оптичною щільністю 1,218. У фракції S2, яка містить білки, розчинні у буфері ЕДТА низької іонної сили, локалізовано 17 смуг з оптичними щільностями від 0,336 до 2,227. Мажорним білком фракції S2 є білок з молекулярною масою 74,72 кДа. Другим за оптичною щільністю є білок 49,42 кДа. Білки з молекулярною масою 40,68 кДа, 45,30 кДа та 44,30 кДа посідають проміжне положення і мають оптичну щільність відповідно 1,127, 1,299 та 0,884. Мінорність у фракції S2 належить білку 86,12 кДа. До групи мінорних білків відноситься білок 92,85 кДа з оптичною щільністю 0,699. У фракції мембран, яка містить білки ядерної мембрани та залишки асоційованого з нею цитоскелету, виявлено 16 смуг, оптична щільність яких лежить в діапазоні від 0,289 до 2,854. Мажорним в цій фракції є білок з молекулярною масою 48,87 кДа. Білок з молекулярною масою 44,88 кДа посідає проміжне положення за оптичною щільністю 0,840. Мінорним білком фракції мембран є білок з молекулярною масою 34,60 кДа. Дещо більшу оптичну щільність - 0,587 має білок 88,69 кДа. Нами продемонстровано, що серед всіх ядерних та ядерцевих білків крес-салату, фібриларин посідає проміжне положення за оптичною щільністю і, виявлений неспецифічним фарбуванням сріблом, має молекулярну масу 40,68 кДа, що лежить в межах помилки техніки детекції [Cerdido, Medina, 1995]. Нами показано, що серед всіх ядерних та ядерцевих білків крес-салату, NhL90 та NhL68 утворюють мінорні смуги, на відміну від аналогів B23, що, ймовірно, пояснюється їх функціональною участю в пізніших стадіях процесингу рДНК, можливо, на периферії та поза ядерцем [Spector et al., 1984]. Мінорність основних ядерцевих білків серед всіх ядерних білків була показана і для Allium cepa [Martin et al., 1992].

11. Синтез рибосомальної РНК в ядерцях меристематичних клітин коренів проростків крес-салату в контрольних умовах та за умов зміненої гравітації

Рівень синтезу рРНК в ядерцях та його динаміку визначали на радіоавтографах після інкубації проростків крес-салату у середовищі з ³Н-уридином, при цьому частину проростків з кожного варіанту після мічення ³Н-уридином інкубували у середовищі без ³Н-уридину. Кількість зерен срібла над ядерцями в контролі становила 26,86±1,23 та 8,68±0,73 при інкубації з ³Н-уридином протягом 1 год. 20 хв. та 2 год. 20 хв. відповідно. При наступній інкубації проростків без міченого уридину кількість мітки над ядерцями складала 60,91±1,81 та 15,22±0,71 при першій інкубації протягом 1 год. 20 хв. та 2 год. 20 хв. відповідно.

В умовах зміненої гравітації кількість мітки над ядерцем достовірно збільшувалася при обох строках інкубації в ³Н-уридині і становила відповідно 30,86±1,33 та 18,42±0,81; *р<0,05 у першому випадку та ***р<0,001 у другому. При подальшій інкубації у нерадіоактивному середовищі кількість мітки зменшувалася після включення ³Н-уридину протягом 1 год. 20 хв. і складала 31,64±1,74 та збільшувалася після включення ³Н-уридину протягом 2 год. 20 хв. і становила 94,72±2,27; ***р<0,001. Є цікавим той факт, що зі збільшенням часу інкубації з ³Н-уридином, кількість мітки над ядерцем зменшувалася як в контролі, так і у досліді. Лише в умовах кліностатування при наступній інкубації проростків у середовищі без міченого уридину зростання часу первинної інкубації призвело до збільшення кількості мітки над ядерцем. Як в контрольних умовах, так і в умовах зміненої гравітації подальша інкубація проростків у середовищі без міченого нуклеотидного попередника порівняно з єдиною інкубацією в ³Н-уридині призводила до зростання кількості мітки над ядерцем. Чмилевський з співавторами показав, що збільшення інтенсивності включення ³Н-уридіну в ядерця та повільне виведення міченої рРНК відображає зниження функціонування ядерець. Навпаки, підвищення функціональної активності ядерець в синтезі рРНК відповідає активному виведенню міченої РНК з ядерця [Чмилевский, Каменева, 2001].

ВИСНОВКИ

Вперше проведено комплексне дослідження впливу зміненої гравітації (кліностатування) на структурно-функціональну організацію ядерця рослинних клітин із застосуванням методів світлової та електронної мікроскопії, цитохімії, флюоресцентної та електронної імуноцитохімії, конфокальної лазерної скануючої мікроскопії, імуноблотингу та радіоавтографії.

1. На основі ультраструктурної локалізації ДНК і основних функціональних ядерцевих білків - фібриларину, NhL90 та NhL68 створена комплексна модель ультраструктурної організації та функціонування ядерець клітин кореневих апексів проростків крес-салату, в якій відображені головні етапи біогенезу рибосом, а саме активація рибосомальних генів, транскрипція рибосомальної ДНК та процесинг рибосомальної РНК.

2. Встановлено, що мажорними специфічними аргентофільними білками крес-салату є гомологи нуклеоліну, названі нами NhL90 та NhL68. Функції NhL90 переважно пов'язані з регуляцією конденсації р-хроматину та транскрипції рДНК, а NhL68 - з процесингом рРНК.

3. Вперше встановлено, що фібриларин крес-салату має молекулярну масу 41 кДа та може знаходитися в ядерці у складі процесоми, не зв'язаної з молекулою рДНК, або бути зв'язаним з молекулою пре-рРНК під час її синтезу на рДНК, або належати до пулу вільного фібриларину.

4. В умовах зміненої гравітації продемонстрована ре-локалізація рДНК з щільного фібрилярного компоненту та перехідної зони ФЦ-ЩФК до фібрилярних центрів, яка корелює зі змінами кількості NhL90 в ядерцевих субкомпонентах, що вказує на зниження рівня транскрипції рДНК та перехід її у потенційно-активний стан при кліностатуванні.

5. Встановлене в умовах зміненої гравітації зменшення кількості NhL68 та фібриларину в перехідній зоні ФЦ-ЩФК свідчить про зниження рівня раннього процесингу рРНК під час її синтезу на рДНК.

6. В умовах зміненої гравітації встановлено зменшення кількості фібриларину, NhL68 та NhL90 в щільному фібрилярному компоненті, яке корелює зі зменшенням його відносного об'єму, що вказує на зниження рівня середнього та пізнього процесингу рРНК.

7. Дані щодо відмінностей в рівні синтезу рРНК в умовах кліностатування свідчать про накопичення рибосомальної РНК у складі незрілих попередників рибосомних субодиниць в ядерці.

8. Встановлене в умовах кліностатування зниження рівня транскрипції рДНК та процесингу рРНК вказує на зниження рівня функціональної активності ядерець під впливом зміненої гравітації.

9. Отримані дані відносно ультраструктурних характеристик ядерця та динаміки змін в ядерцевих субкомпонентах основних функціональних білків NhL90, NhL68 та фібриларину можуть бути використані для моніторингу впливу на рослини реальної мікрогравітації в космічних експериментах та інших несприятливих факторів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Соболь М.А. Вплив кліностатування та мікрогравітації на ультраструктуру та функції ядерець рослинних клітин // Космічна наука і технологія. - 2001. - 7, №1. - 183-186.

2. Соболь М.А. Роль ядрышка в реакциях растительных клеток на действие физических факторов окружающей среды // Цитология и генетика. - 2001. - 35, №3. - С. 72-84.

3. Соболь М.А. Структурно-функціональні особливості ядерець клітин кореня Lepidium sativum L. (Brassicaceae Burnett) в умовах зміненої сили тяжіння // Український ботанічний журнал. - 1999. - 56, №4. - С. 358-364.

4. Соболь М.А., Мартин Г.Г. Вплив мікрогравітації на структурно-функціональну організацію ядерця вищих рослин // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. - 2002. - №3 (18). - С. 134-138.

5. Соболь М.А. Вплив кліностатування та мікрогравітації на ультраструктуру та функції ядерець рослинних клітин // Збірник тез ІІ Всеукраїнської молодіжної науково-практичної конференції «Людина і Космос». - Дніпропетровськ. - 2000. - С. 334.

6. Соболь М.А. Морфофункциональный анализ ядрышек клеток корневой меристемы проростков Lepidium sativum в условиях клиностатирования // Тезисы VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. - Санкт-Петербург. - 2000. - С. 157-158.

7. Соболь М. А., Кордюм Е. Л. Структурно-функциональная организация ядрышка в условиях измененной гравитации // Цитология. - 2002. - 44, №9. - С. 906-907 (XIV Всероссийский симпозиум «Структура и функции клеточного ядра». - Санкт-Петербург. - 2002).

8. Соболь М.А. Структурно-функціональні особливості ядерець кореневих клітин крес-салату при дії зміненої сили тяжіння // Матеріали конференції молодих вчених «Актуальні питання ботаніки та екології». - Херсон. - 1998. - С. 78.

9. Соболь М.А. Структурно-функциональные особенности ядрышек апикальных клеток корня Lepidium sativum в условиях клиностатирования // Тезисы докладов Международной конференции «Физиология растений - наука III тысячелетия», IV съезд Общества физиологов растений России. - Том 1. - Москва. - 1999. - С. 462.

10. Соболь М.А. Ультраструктура та функціонування ядерця рослинної клітини під впливом кліностатування // Матеріали ХІ З'їзду Українського ботанічного товариства. - Харків. - 2001. - С. 373-374.

11. Соболь М.А. Функціональне значення змін ядерець рослинних клітин під дією мікрогравітації та кліностатування // Матеріали Конференції молодих вчених-ботаніків України «Актуальні питання ботаніки та екології». - Ніжин. - 1999. - С. 131-132.

12. Соболь М.А. Функціональне значення змін ядерця під дією мікрогравітації та кліностатування // Збірник тез Всеукраїнської молодіжної науково-практичної конференції «Людина і Космос». - Дніпропетровськ. - 1999. - С. 205.

13. Sobol M.A. Morphology and ultrastructure of nucleoli in cells of Lepidium sativum root apices under clinorotation // Book of Abstracts of 33^rd COSPAR Scientific Assembly. - Warsaw (Poland). - 2000. - P. 69.

14. Sobol M.A. Nucleolar structure and function under clinorotation // Abstracts of 22^nd Annual International Gravitational Physiology Meeting. - Budapest (Hungary). - 2001. - P. 103.

Размещено на Allbest.ru