Характеристика нових генiв 21-ої хромосоми людини та виявлення їxнix гомологiв у мишi

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Характеристика нових генiв 21-ої хромосоми людини та виявлення їxhix гомологiв у мишi

Автореферат

дисертацiї на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальнiсть теми. Хромосома 21 є найменшою аутосомою людини i становить приблизно 1-1,5% геному людини (Hattori et al., 2000). Починаючи з 1959 року, коли було вiдкрито хромосомну етiологiю синдрому Дауна (Lejeune et al., 1959), проводиться iнтенсивне вивчення структурного та генного складу 21-ої хромосоми. В результатi, хромосома 21 людини стала першою аутосомою, для якої були розробленi фiзичнi карти на основi дрiжджових штучних хромосом (YAC) (Gardiner et al., 1995) та рестриктна карта по рестриктазi NotI (Ichikawa et al., 1993). Характерною ознакою цiєї хромосоми можна вважати велику кiлькiсть генетичних аномалiй, синдромiв та захворювань, розвиток яких повязаний з картованими на нiй генами. Повна чи часткова трисомiя 21-ої хромосоми призводить до виникнення синдрому Дауна, популяцiйна частота якого є приблизно однаковою в ycix kpaїнах i, в середньому, становить 1:700 новонароджених дiтей (Hassold et al., 1996). Kpiм того, на 21-iй xpoмocoмi також виявлено ряд генiв, повязаних iз проявом багатьох захворювань, таких, як синдром Кноблаха, несиндромна спадкова глухота та хвороба Альцгеймера (Hattori et al., 2000).

Bідкриття нових генів, якi є потенційно важливими для прояву деяких хвороб, є не тільки нагальною фундаментальною науковою метою, але й має прiоритетне прикладне значення для фармакології та медицини. На сьогодні ідентифіковано лише третину з 30-40 тисяч генів, які були вирахувані, на основi інформації з визначення повної нуклеотидної послiдовностi геному людини (International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and alalysis of the human genome, 2001).

Ha сьогоднi, в результатi визначення повної нуклеотидної послiдовностi довгого плеча 21-ої хромосоми було iдентифiковано близько 225 генiв, але функцiя бiльшостi з них, а також їхня роль при синдромi Дауна та iнших захворювань, повязаних з 21-ою хромосомою, залишаються не зясованими. Аналiз отриманих даних продовжується в кiлькох напрямках i рiзними засобами.

Iстотними етапами у вирiшеннi проблеми пошуку генiв, якi вiдповiдають за виникнення захворювань, повязаних iз 21-ою хромосомою людини, є визначення її нуклеотидної послiдовностi i створення тваринних моделей синдрому Дауна, серед яких найперспективнiшою є мишача модель (Reeves et al., 1995).

Порiвняльне картування хромосом людини та мишi показало, що 21-а хромосома людини має велику дiлянку генетичної гомологiї з 16-ою хромосомою мишi, а також меншi за розмiром дiлянки, гомологiчнi дiлянкам 17-ої та 10-ої хромосом мишi (Reeves et al., 1995; Onodera et al., 1997). Ha основi цих даних були створенi мишачi моделi синдрому Дауна Ts65Dn i Ts1Cje з частковою трисомiєю дiлянки 16-ої хромосоми мишi, в яких присутнi додатковi копiї 110 i 89 генiв вiдповiдно. Створення такої тваринної моделi дозволяє простежити розвиток захворювання та асоцiйованi функцiональнi змiни в рiзних органах на всiх стадiях.

Таким чином, завдяки сучасним методам, молекулярна бiологiя наближається до вирiшення проблеми пошуку генiв, вiдповiдальних за розвиток синдрому Дауна. Визначення будови i функцiй цих генiв забезпечить у майбутньому пошук i розробку фармакологiчних агентiв спрямованої дiї для корекцiї системних модуляторних порушень, якi лежать в основi синдрому Дауна. Проблема такої складностi потребує використання рiзноманiтних пiдходiв, кожен з яких може внести частину необхiдної iнформацiї.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацiйна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу молекулярної онкогенетики Інституту молекулярної біології i генетики НАН України. Її виконано в рамках бюджетної теми «Регуляцiя експресiї генiв при патологiї: альтернативна транскрипцiя при лейкозi та синдромi Дауна» (№ держ. реєстрацiї 0101U009210) i проекту «Характеристика ряду генiв з критичного району синдрому Дауна» (програма «Фонд фундаментальних дослiджень» ДКНТ України, № договору Ф7/270). Роботу виконували також в рамках мiжнародного проекту гранта Фогартi (NIH) №1R03TW00757-01 «Синдром Дауна: геномна будова вiдповiдних нових генiв» спiльно з лабораторiєю К. Гардiнер (Iнститут дослiджень раку Елеанор Рузвельт, м. Денвер, США).

Мета та завдання дослiдження. Метою наших дослiджень був аналiз будови та експресiї трьох генiв людини, якi були попередньо картованi на довгому плечi 21-ої хромосоми людини, а також пошук та порiвняльна характеристика їхнiх гомологiв у мишi.

Для досягнення цiєї мети були поставленi такi завдання:

1) встановити i охарактеризувати будову генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 (HRMT1L1), нового ядерного бiлка (NNP-1) та iнтерсектину 1 (ITSN1) людини, якi картовано на довгому плечi 21-ої хромосоми та їхнiх мишачих гомологiв;

2) отримати кДНК генiв HRMT1L1, NNP-1 та ITSN1 мишi, якi гомологiчнi генам людини;

3) дослiдити експресію генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2, нового ядерного бiлка та iнтерсектину 1 в тканинах людини i мишi;

4) провести аналiз експресiї дослiджуваних генiв у тканинах нормальних i трисомних мишей (Ts65Dn) з метою виявлення їх можливого функцiонального значення для розвитку синдрому Дауна.

Об'єкт дослiдження - вивчення генiв 21-ої хромосоми людини.

Предмет дослідження - будова та експресiя нових генiв, якi картованi на 21-iй xpoмocoмi людини, та їхнiх мишачих гомологiв.

Методи дослiдження - для iдентифiкацiї кДНК дослiджуваних генiв у мишi проводили скринінг кДНК-бібліотек мишi. Пошук послiдовностей генiв мишi проводили шляхом скринiнгу геномної бiблiотеки мишi, рестрикцiйного аналiзу, гiбридизацiєю за Саузерном та клонуванням фрагментiв. Аналiз експресiї дослiджуваних генiв проводили методами Нозерн-гiбридизацiї i ЗТ-ПЛР. Визначення нуклеотидної послiдовностi ДНК проводили за методом Сенгера, аналiз нуклеотидної послiдовностi ДНК проводили за допомогою компютерних програм.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено i охарактеризовано будову трьох генiв 21-ої хромосоми людини: аргiнiн-N-метилтрансферази 2 (HRMT1L1), нового ядерного бiлка (NNP-1) та iнтерсектину 1 (ITSN1) та їхнiх гомологiв у мишi. Вперше одержано повну нуклеотидну послiдовнiсть гена нового ядерного бiлка (NNP-1) мишi. Iдентифiковано та iзольованоно нуклеотиднi послiдовностi кДНК генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2, нового ядерного бiлка та iнтерсектину 1 мишi, якi є гомологiчними генам, картованим на довгому плечi 21-ої хромосоми людини. Вперше показано змiну рiвня експресiї гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини (HRMT1L1) в рiзних тканинах у процесi ембрiогенезу. Вперше встановлено, що рiвень експресiї генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 та NNP-1 є iдентичним y тканинах нормальних i трисомних мишей (Ts65Dn), що може вказувати на вiдсутнiсть їхнього функцiонального значення для розвитку синдрому Дауна. Отримано новi iзоформи транскриптiв генiв iнтерсектину 1 людини i мишi. Показано їхню тканинну специфiчнiсть.

Практичне значення одержаних результатів. Аналiз генiв 21-ої хромосоми людини, проведений в рамках мiжнародного наукового проекту «Геном людини», не закiнчено з визначенням повної нуклеотидної послiдовностi хромосом людини. Цi данi є основою для iдентифiкацiї та аналiзу генiв, а також дослiдження їхньої ролi у проявi багатьох захворювань людини. Отримана в роботi характеристика генiв, локалiзованих на довгому плечi 21-ої хромосоми людини, є вкладом у вирiшення проблеми iдентифiкацiї та дослiдження генiв, якi можуть обумовлювати фенотипiчнi i фiзiологiчнi риси синдрому Дауна та iнших генетичних хвороб, повязаних з цiєю хромосомою.

Аналiз експресiї iзоформ генiв як на рiвнi мРНК, так i бiлка при рiзних патологiях дає необхiдну iнформацiю для пошуку кореляцiї мiж бiлковим рiзноманiттям i фенотипiчними ознаками, розвитку науково обгрунтованих пiдходiвдо лiкування захворювань, конструювання, аналiзу та iнтерпретацiї вiдповiдних тваринних моделей. Розвиток дослiджень у визначеннi напрямку лише починається. Можливiсть iснування показаних нами шляхiв альтернативного сплайсингу пре-мРНК гена iнтерсектину 1, а також ранiше описаного шляху утворення його довгої та короткої форм, дає нам пiдставу говорити про iснування великого рiзноманiття бiлкових iзоформ цього гена.

Iдентифiкацiя i аналiз мишачих гомологiв генiв 21-ої хромосоми людини та порiвняльна характеристика їхньої будови i експресiї, буде сприяти дослiдженню ролi цих генiв у проявi синдрому Дауна та супутнiх хвороб на твариннiй моделi. Taкi данi можуть бути корисними в iдентифiкацiї мiшеней для розробки терапевтичних засобiв, здатних безпосередньо впливати на експресiю конкретних генiв i, тим самим, усувати їхню негативну роль у проявi вiдхилень вiд норми.

Особистий внесок здобувача. Дисертацiйну роботу було виконано пiд керiвництвом д.б.н., професора, члена-кореспондента НАН України, зав. вiддiлу молекулярної онкогенетики IМБiГ НАН України А.В. Риндич. Основний обсяг експериментальної роботи виконаний за беспосередньої участi здобувача. Обробку i аналiз отриманих результатiв виконано безпосередньо пошукачем. Експерименти з отримання нуклеотидної послiдовностi гена нового ядерного бiлка мишi i дослiдження експресiї гена iнтерсектину 1 було виконано у спiвробiтництвi з к.б.н. Л.О. Цибою. Здобувач висловлює подяку за допомогу в дослiдженнi генiв HRMT1L1 i NNP-1 O.B. Анопрiєнко i к.б.н. С.М. Квашi, а також доктору Д. Славовову (Денвер, США) - за допомогу у секвенуваннi нуклеотидних послiдовностей ДНК. Автор висловлює щиру подяку д.б.н., професору, член.-кор. НАН України А.В. Риндич за керiвництво, кориснi поради, обговорення результатiв та проведення Нозерн-блот аналiзу РНК з тканин трисомних мишей. Отриманi результати обговорено та опублiковано в спiльних публiкацiях.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Основнi положення дисертацiї були представленi на конференцiї для студентiв, аспiрантiв i молодих спецiалiстiв (Київ, 2001), 7-му мiжнародному зїздi «Геном людини» (Шанхай, Китай, 2002), 6-iй Пущинськiй школi-конференцiї молодих вчених «Биология - наука XXI века» (Пущино, Росiя, 2002), 4-iй Парнасiвськiй Конференцiї (Вроцлав, Польща, 2002), VIII-мy Українському бiохiмiчному зїздi (Чернiвцi, 2002), VIII-мy зїздi Українського товариства генетикiв та селекцiонерiв (Бахчисарай, 2002) та на наукових семiнарах вiддiлiв молекулярної онкогенетики та бiосинтезу нуклеїнових кислот IМБiГ НАН України. Публiкацiї. За матерiалами дисертацiї опублiковано 3 статтi та тези шести доповiдей на наукових конференцiях. Отриманi пошукачем нуклеотиднi послiдовностi кДНК, дослiджуваних в цiй роботi генiв i послiдовностi гена нового ядерного бiлка (NNP-1) мишi мають такi реєстрацiйнi номери в GenBank: AF169620, AF312394, AF169622, AF169623, AF169124, AF257218, AF271993, AF227000, AF294729, AF180522, AF169621, AF498310, AF498311, AF468654, AF525079, AY138139, AY127576, AY129562.

Структура та обсяг роботи. Дисертацiю викладено на 146 сторiнках. Вона мiстить вступ, огляд лiтератури, експериментальнi дослiдження, результати дослiджень та їх обговорення, висновки. Дисертацiю проiлюстровано 53 рисунками i 7 таблицями. Список цитованої лiтератури охоплює 148 найменувань.

Основний змiст

трисомний миша гомолог хромосома

Матерiали та методи дослiдження. Отримання препаратiв нуклеїнових кислот. Ембрiональнi (вiк ембрiонiв 6-12 тижнiв) тканини людини (головний мозок, легенi, нирки, мязи) були отриманi в Українському Центрi ембрiональних тканин (м. Київ). Тканини печiнки, легенiв, нирок, яєчок, мязiв, головного i спинного мозку, мозочка мишей отриманi вiд самцiв лiнiї BALB/c x C57BL F1, вiком вiд 2 до 6 мiсяцiв (вiддiл бiохiмiчної генетики, Iнститут молекулярної бiологiї i генетики НАН України, м. Київ). Зразки тканин зберiгали i транспортували при низьких температурах (рiдкий азот чи низькотемпературний холодильник на -70о С).

Тотальну РНК видiляли iз заморожених тканин людини та мишi (в нормi i з трисомiєю (Ts65Dn)) гуанiдинiзотiоционатним методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Плазмiднy ДНК видiляли методом лужного лiзису (Маниатис и др., 1984) або кипятiнням (Holmes, Quigley, 1981).

Реакцiї рестрикцiї та лiгування. Реакцiї рестрикцiї проводили згiдно рекомендацiям фiрми-виробника та у буферному розчинi, запропонованому фiрмою «Fermentas» (Литва). Реакцiю лiгування здiйснювали при 21о С протягом 1 год за допомогою ДНК-лiгази фага Т4 в концентрацiї 1 од. Вейса на 10 мкл реакцiйної сумiшi («Fermentas», Литва).

Трансформацiя бактерiйних клiтин плазмiдною ДНК. Трансформацiю клiтин Е. coli штаму XL1-Blue («Clontech», США) плазмiдною ДНК та приготування компетентних клiтин здiйснювали як описано Манiатiсом та спiвавт. (Маниатис и др., 1984).

Електрофорез нуклеїнових кислот. Електрофорез ДНК проводили в 0,8-1% агарозному гелi при напрузi 5-10 В/см у 20 мМ трис-ацетатному електрофорезному буферi, рН 7,5 (Маниатис и др., 1984). Електрофоретичне роздiлення фрагментiв ДНК, близьких за розмiром, проводили в 5 та 8% полiакриламiдному гелi (ПААГ) при напрузi 5 В/см у трис-боратному буферi для електрофорезу. РНК роздiляли в 1% агарозному гелi в присутностi 2,2 М формальдегiду («Fluka», Швейцарiя) (Маниатис и др., 1984).

Саузерн - та Нозерн-блот аналiз нуклеїнових кислот. Перенос нуклеїнових кислот iз агарозного гелю на мембрану (Hybond N+, «Amersham», Велика Британiя/Швецiя) здiйснювали як описано (Маниатис и соавт., 1984; Southern, 1985). ДНК i PHK фiксували на мембранi за допомогою УФ в апаратi «Stratalinker» («Stratagene», США). Гiбридизацiю проводили в жорстких умовах згiдно стандартних методик, рекомендованих фiрмою «Amersham» для мембран Hybond N+, в гiбридизацiйнiй печi «BellcoGlass» (США). Радiоактивно мiченi зонди ДНК отримували в реакцiї «олiгомiчення», використовуючи набiр реагентiв «RediprimeII» та [?-³²Р] dCTP, згiдно рекомендацiй фiрми-виробника («Amesham Pharmacia Biotech», Велика Британiя/Швецiя). Для радiоавтографiї фiльтрiв використовували рентгенiвську плiвку Kodak.

Аналiз геномних - та кДНК-бiблiотек. Гiбридизацiю клонiв геномної бiблiотеки мишi на «гридах,» проводили з вiдповiдними зондами в приладi Autoblot (BellcoGlass, США) як описано для Саузерн-блот гiбридизацiї (Маниатис и др., 1984).

Cкринiнг фагових кДНК-бiблiотек проводили як описано Манiатiсом та спiвавт. (Маниатис и др., 1984). Прегiбридизацiю та гiбридизацiю з вiдповiдними зондами виконували, як описано для Саузерн-блот гiбридизацiї (Маниатис и др., 1984).

Визначення нуклеотидної послiдовностi ДНК та її компютерний аналiз. Визначення нуклеотидної послiдовностi ДНК проводили за методом, запропонованим Сенгером та спiвавт. (Sanger et al., 1977) з використанням протоколу i набору реактивiв «USB» (США), а також [?-³⁵S] dATP («AmershamPharmaciaBiotech», Велика Британия/Швецiя). Нуклеотиднi послiдовностi аналiзували з використанням програм BlastN i BlastX сервера Нацiонального Центру Бiотехнологiчної Iнформацiї, США (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Центру Геномних Послiдовностей Людини, Коледж Медицини в м. Байлор, США (ВСМ Search Launcher, http://www.dot.imgen. bcm.tcm.edu) та European Molecular Biological Laboratory (http://woody.embl-Heidelberg.de/repeatmask/). Пошук функцiональних елементiв 3- i 5-нетрансльованих послiдовностей мРНК проводили за допомогою програми, любязно наданою доктором Г. Пезоле (м. Мiлан, Iталiя), розташованої на сайтi http://bigarea. area.ba.cnr.it:8000/EmbIT/UTRHome.

Полiмеразна ланцюгова та зворотно-транскрипцiйна полiмеразна ланцюгова реакцiї. Олiгонуклеотиднi затравки для амплiфiкацiї дiлянок кДНК людини i мишi були пiдiбранi з урахуванням гомологiї нуклеотидних послiдовностей кДНК короткої форми iнтерсектину 1 людини i кДНК Ese1 мишi за допомогою компютерної програми Oligo 4.0.

ЗТ-ПЛР проводили в приладi «DNA Thermal Cycler» («Perkin Elmer», США) з використанням набору реагентiв фiрми «Fermentas» (Литва), «Perkin Elmer» (Нiмеччина) та набору реагентiв Expand 20 kb^Plus PCR System («Roche», Нiмеччина). Реакцiю проводили в 50 мкл сумiшi згiдно протоколу до використаного набору реагентiв. Амплiфiкацiю здiйснювали за таких умов: денатурацiя - 94^о С, 40 с (в першому циклi - 2 хв); температура реасоцiацiї праймерiв - див. табл. 1; синтез - 72^о С, час - див. табл. 1; 35 циклiв.

Таблиця 1. Пари праймерiв для ЗТ-ПЛР та умови їхньої роботи

5'-RACE. 5'-RACE проводили згiдно iнструкцiї фiрми «Roche» «5/3 RACE» з такими праймерами:

до кДНК М74b: L74/20 (5-GCTGTAACTGTGCCCCATCCTG-3), L74/169 (5-CATCTCACAGCCATAGTCCACG-3), L74/128 (5-GGATGACCTGTGACTCGCTGC-3), L74/45 (5-GAGGCATGGGAGAGAAACTGAA-3);

до кДНК м33А3N6: L606 (5-GGCCCTTTCCTCCACAGTTATG-3), L174 (5-TGGGTTACCTCAGCCTGTCTTA-3), L69 (5-CATAACTGTGGAGGAAAGGGCC-3).

Результати дослiджень та їх обговорення. Визначення i аналiз будови генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 (HRMT1L1), нового ядерного бiлка (NNP-1) i iнтерсектину 1 (ITSN1) людини. Використовуючи iнформацiю про нуклеотиднi послiдовностi 21-ої хромосоми людини, нами було з'ясовано та охарактеризовано будову генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2, нового ядерного бiлка i iнтерсектину 1.

Ген аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини, картований на дiлянцi q22.3 21-oї хромосоми, кодує бiлок подiбний за будовою до аргiнiн-метилтрансферази дрiжджiв (НМТ1). Oкpiм мотивiв, притаманних аргiнiн-метилтрансферазам, його N-кiнцева дiлянка включає SH3-домен (Src homology 3). He зважаючи на велику подiбнiсть цього бiлка до аргiнiн-метилтрансфераз, вiн не виконує притаманної їм ролi в клiтинi i його функцiя залишається не зясованою (Scott et al., 1998). Аналiз будови гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини показав, що вiн включає 29294 п.н. i складається з 11 екзонiв. Проведений за допомогою компютерних програм пошук промоторної дiлянки цього гена не дав позитивного результату. Але було визначено, що вiн межує з LTR-багатою послiдовнiстю, яка може впливати на регуляцiю його транскрипцiї завдяки великому вмiсту сайтiв звязування транскрипцiйних факторiв. Kpim того, на регуляцiю експресiї гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини може впливати i CpG-острiвець, розташований в першому iнтронi.

Ген нового ядерного бiлка людини було картовано на дiлянцi q22.3 21-oї хромосоми (Cheng et al., 1994). Аналiз виведеної первинної структури бiлка NNP-1 показав, що вiн може мiстити сигнали ядерної локалiзацiї в С-кiнцевiй дiлянцi. Kpiм того, аналiз вторинної структури цього бiлка передбачає утворення суперспiралiзованих дiлянок, якi опосередковують бiлок-бiлковi взаємодiї. Вiдомо, що бiлок NNP-1 локалiзується в ядерцi клiтини, але його функцiю на сьогоднi ще не зясовано. На основi гомологiї з бiлком RRP1 дрiжджiв висунуто припущення, що вiн бере участь у процесингу пре-рРНК (Savino, 1999).

Проведене нами визначення будови гена нового ядерного бiлка людини показало, що вiн включає 29294 п.н. Ген складається з 13 екзонiв, а не 14, як вважалося (Jansen et al., 1997), тому що ранiше визначенi два екзони (8-ий та 9-тий) є одиним неперервним екзоном. За допомогою пошукових програм було визначено передбачувану промоторну дiлянку гена та сайти звязування факторiв транскрипцiї.

Послiдовнiсть гена iнтерсектину 1 людини локалiзована на дiлянцi q22.1-22.2 21-oї хромосоми, яка є гомологiчною дiлянцi 16-ої хромосоми мишi. Це робить можливим вивчення ролi цього гена на мишачiй моделi синдрому Дауна (Ts65Dn).

Ha сьогоднi вiдомо двi основнi форми iнтерсектину 1: коротка, яка мiстить два ЕН-домени, ?-спiральний-домен i 5 SH3-доменiв та довга, що експресується, переважно, в мозку i мiстить три додатковi домени: DH, PH i C2. Хоча функцiю iнтерсектину 1 до кiнця не зясовано, показано, що вiн бере участь у ендоцитозi (в тому числi i синаптичних пухирцiв), забезпечує взаємну локалiзацiю рiзних компонентiв мембранного транспорту та може вiдiгравати певну роль при передачi сигнгалiв у клiтинi (Yamabhai et al., 1998; Okamoto et al., 1999; Tong et al., 2000).

Для гена iнтерсектину 1 людини було визначено, що вiн включає 247794 п.н. i складається, щонайменше, з 41-го екзону. Для нього було виявлено нуклеотиднi послiдовностi, подiбнi до промоторної дiлянки та консервативної послiдовностi ТАТА-боксу, а акож сайти звязування транскрипцiйних факторiв.

Аналiз будови дослiджуваних генiв людини показав, що вони мiстять повтори, якi займають 36,20% (для гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2), 17,13% (для гена нового ядерного бiлка) та 38% (для гена iнтерсектину 1) вiдносно довжини їхнiх iнтронiв.

Отримання та аналiз кДНК- i геномних послiдовностей мишi, гомологiчних генам довгого плеча 21-ої хромосоми. Для iдентифiкацiї дослiджуваних генiв мишi нами було проведено скринiнг кДНК - та геномних бiблiотек. Як зонд використовували послiдовностi кДНК генiв людини, якi були отриманi ранiше при скринiнгу кДНК-бiблiотек людини послiдовностями 21-ої хромосоми: кДНК аргiнiн-N-метилтрансферази 2, нового ядерного бiлка та iнтерсектину 1.

Отримана нами в результатi дослiджень кДНК М74b гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 мишi, яка включає 1954 п.н., вiдповiдає бiлку довжиною 449 амiнокислотних залишки iз молекулярною масою 43 кДа. Центральнi 369 амiнокислотних залишкiв мають 91% iдентичностi з послiдовностю бiлка гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини.

З метою отримання повнорозмiрної кДНК гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 мишi було поставлено 5-RACE на мРНК мозку дорослої мишi. Отримано продукт з подовженим на 62 п.н. 5-кiнецем кДНК М74b.

Ha основi геномних послiдовностей 10-ої хромосоми мишi, якi представленi в нуклеотидних базах даних, було визначено та охарактеризовано будову гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 мишi. Ген включає 29192 п.н. i складається з 11 екзонiв. Бiльшiсть iнтронiв мають у своєму складi повтори, якi становлять 26,95% вiд їхньої довжини. Аналiз 5-геномної дiлянки, вище 1-го екзону, показав можливiсть iснування промоторної дiлянки на 61 п.н. вище початку транскрипту i сайти звязування факторiв транскрипцiї для неї.

Послiдовнiсть iншої отриманої нами кДНК гена мишi - кДНК М120 (1644 п.н., реєстрацiйний номер у GenBank AF312394) - maє гомологiю з послiдовнiстю кДНК гена нового ядерного бiлка (NNP-1) людини, i з кДНК NNP-1 (peєстрацiйний номер у GenBank U79775) та NNP-1 var (peєстрацiйний номер у GenBank U79774) мишi, отриманими ранiше (Jansen et al., 1997). Послiдовнiсть кДНК М120 мишi найбiльш подiбна до кДНК NNP-1 var гена нового ядерного бiлка мишi, але вiдрiзняється вiд неї вiдсутнiстю 192 п.н. з 5-кiнця та делецiєю (108 п.н.) в транслюємiй дiлянцi, яка не порушує рамки зчитування.

Отриману нами кДНК М120 було використано для скринiнгу космiдної геномної бiблiотеки селезiнки миши, з метою визначення повної нуклеотидної послiдовностi гена нового ядерного бiлка мишi. Нуклеотидний та комп'ютерний аналiзи отриманих нами послiдовностей допомогли встановити та охарактеризувати будову гена нового ядерного бiлка мишi. Геномна послiдовнiсть довжиною 20074 п.н. мiстила 12449 п.н. послiдовностi гена, 1839 п.н. послiдовностi, що межує з нею з 5-кiнця i 5786 п.н., що межують з нею з 3-кiнця. Було встановлено, що ген нового ядерного бiлка мишi включає 13 екзонiв. За допомогою пошукових програм нами були iдентифiкованi сайти для факторiв транскрипцiї, але жодна з програм не змогла визначити промоторну дiлянку гена. Пошук послiдовностей повторiв в iнтронах гена нового ядерного бiлка мишi за допомогою програми Repeat Masker показав, що вони займають 12,99% вiд їхньої спiльної довжини.

В результатi скринiнгу двох кДНК-бiблiотек мишi кДНК-послiдовнiстю гена iнтерсектину 1 людини було iзольвано два клони, що мiстили послiдовностi кДНК гена iнтерсектину 1 мишi. Обидвi мишачi кДНК виявились неповними i мiстили 3-кiнець кДНК гена iнтерсектину 1. кДНК гена iнтерсектину 1 мишi було використано нами для пошуку геномних послiдовностей в космiднiй бiблiотецi селезiнки мишi. Використовуючи отриманi геномнi послiдовностi та геномнi- i кДНК-послiдовностi гена iнтерсектину 1 мишi i людини, якi зявились за останнiй час в базах даних, було охарактеризовано екзон-iнтронну будову гена iнтерсектину 1 мишi. Визначена довжина гена, який складається, як мiнiмум, iз 41 екзону, становить понад 183 т. п.н. Використання програми Repeat Masker дозволило виявити повтори в iнтронах гена iнтерсектину 1 мишi. Вони займають 23,08% вiд загальної довжини iнтронiв. Аналiз дiлянки, розташованої з 5-кiнця гена iнтерсектину 1 мишi, показав можливiсть iснування промоторної дiлянки в позицiї -48 i TATA-боксу в позицiї -78, дуже близьких до визначеного нами 5-кiнця транскрипту гена iнтерсектину 1 мишi.

Порiвняння послiдовностей дослiджуваних нами генiв показало, що гени людини мають бiльший розмiр, нiж їхнi гомологи у мишi. Це є результатом бiльшої довжини послiдовностей iнтронiв цих генiв у людини, що повязано iз нагромадженням послiдовностей повторiв. Нашi данi збiгаються з даними, отриманими дослiдниками, якi проводили порiвняльний аналiз послiдовностей хромосом людини та мишi з метою дослiдження еволюцiйних процесiв у ссавцiв (Makalowski, Boguski, 1998; Pletcher et. al, 2000).

Дослiдження експресiї генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 i нового ядерного бiлка за допомогою Нозерн-блот-аналiзу. Аналiз експресiї гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини за допомогою Нозерн-блот гiбридизацiї тотальної РНК ембрiональних тканин людини показав змiну рiвня експресiї цього гена залежно вiд стадiї розвитку ембрiона (рис. 1).

Нозерн-аналiз РНК з тканин дорослих мишей показав, що найвищий рiвень експресiї гена спостерiгається в мозку i легенях, нижчий - в нирках i серцi. При Нозерн-блот гiбридизацї РНК з тканин мишi кpiм сигналу, що вiдповiдає основному транскрипту (2,4 т.н.) були виявленi сигнали меншої iнтенсивностi - 1,8 т.н. i 4,7 т.н. (рис. 2А). Присутнiсть додаткових транскриптiв, можливо, повязана з альтернативним процесингом пре-мРНК цього гена. Пiдтвержденням такого припущення може бути поява в нуклеотидних базах даних нової форми транскрипту гена людини, яка мiстить додатковий екзон (Е.М.А. G.E. клон ВС000727).

Проведене нами дослiдження експресiї гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 мишi в мозку трисомних мишей (Ts65Dn) показало iдентичнiсть рiвня експресiї гена в тканинах нормальних i трисомних мишей.

Виявлення експресiї гена нового ядерного бiлка в ycix протестованих тканинах дає пiдставу вважати його геном «домашнього господарства». Рiзницi мiж експресiєю гена нового ядерного бiлка в тканинах мишей та у мозку дорослих мишей рiзного вiку з нормальним набором хромосом i при трисомiї дiлянки 16-ої хромосоми (Ts65Dn) в проведеному нами Нозерн-аналiзi виявлено не було (рис. 3).

Це, як i y випадку гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2, що також знаходиться за межами трисомної дiлянки, може бути свiдченням того, що змiна експресiї генiв, якi представленi трьома копiями в геномi Ts65Dn-мишi, не впливає на рiвень експресiї гена нового ядерного бiлка. Kpiм того, одержанi нами результати можуть свiдчити i про те, що данi гени, мабуть, не є критичними для розвитку синдрому Дауна. Це не виключає їхньої ролi в розвитку iнших захворювань, пов'язаних з локусом хромосоми людини, в якому вони розташованi i для дослiдження яких порiвняльний аналiз генiв людини i мишi, як модельного обєкта, може вiдiгравати важливу роль.

Дослiдження експресiї гена iнтерсектину 1 людини i мишi за допомогою методу ЗТ-ПЛР. Проведений нами аналiз баз даних EST та даних Нозерн-аналiзу показав можливiсть iснування, кpiм двох вiдомих транскриптiв гена iнтерсектину 1, нових транскриптiв, утворення яких вiдбувається в результатi процесингу пре-мРНК цього гена. Пошук нових траскриптiв проводили в тканинах ембрiонiв людини i дорослих мишей за допомогою зворотно-полiмеразної ланцюгової реакцiї. В результатi проведеної роботи було виявлено 5 нових iзоформ гена iнтерсектину 1, якi утворюються внаслiдок альтернативного сплайсингу. Одна з них була знайдена поки що тiльки в тканинах мишi (реєстрацiйний номер у GenBank AF468654) (рис. 4). Вона утворюється шляхом сплайсингу девяти екзонiв (з 6-го по 14-й), якi кодують другий ЕН-домен та частину ?-спiрального-домену. Новий транскрипт вiдповiдає бiлку довжиною 132 амiнокислотних залишки, 117 з яких з N-кiнця вiдповiдають основному складу iнтерсектину, а 15 С-кiнцевих - «новоутворенi». Цей бiлок мiстить один ЕН-домен. У нуклеотидних базах даних подiбного транскрипту знайдено не було.

Оскiльки для iнтерсектину 1 мозку щурiв показано, що вiн, взаємодiючи з бiлками SNAP-25 та SNAP-23 через свiй а-спiральний-домен, бере участь в екзоцитозi, втрата цього домену в послiдовностi бiлка вилучає iнтерсектин 1 з процесу екзоцитозу в клiтинi.

«новоутворенi». Цей бiлок мiстить один ЕН-домен. У нуклеотидних базах даних подiбного транскрипту знайдено не було.

Оскiльки для iнтерсектину 1 мозку щурiв показано, що вiн, взаємодiючи з бiлками SNAP-25 та SNAP-23 через свiй а-спiральний-домен, бере участь в екзоцитозi, втрата цього домену в послiдовностi бiлка вилучає iнтерсектин 1 з процесу екзоцитозу в клiтинi.

Утворення iншої знайденої нами iзоформи (реєстрацiйний номер у GenBank AF525079) вiдбувається шляхом використання альтернативного 3-сайту сплайсингу, який знаходиться в 6-му екзонi (рис. 5). При цьому 111 п.н. 5-кiнця 6-го екзону стають частиною iнтрону. Це не викликає змiни рамки зчитування i не зачiпає доменної структури нового бiлка. Iснування подiбної iзоформи пiдтверджується знайденою в нуклеотидних базах даних подiбною делецiєю 5-кiнця кДНК FLJ14940 (peєстрацiйний номер у GenBank AK027846).

В результатi проведеного нами аналiзу тканин ембрiонiв людини i дорослих мишей за допомогою ЗТ-ПЛР, було виявлено, що транскрипт, який мiстить послiдовнiсть 20-го екзону (15 п.н.), присутнiй лише в мозку та мозочку (рис. 6). Одержанi результати свiдчать про те, що такий транскрипт можна справдi вважати специфiчним для мозку, на вiдмiну вiд транскрипту довгої форми iнтерсектину 1, який експресується не тiльки в головному мозку, а i в iнших тканинах, хоча i на низькому рiвнi.

Присутнiсть додаткових 15-ти нуклеотидних залишкiв у специфiчному для мозку транскриптi призводить до появи пяти амiнокислотних залишкiв у вiдповiдному бiлку в послiдовностi SH3A-домену, не змiнюючи рамки зчитування i не порушуючи його доменної структури. Для iнтерсектину 1 мишi такий транскрипт було виявлено вперше (реєстрацiйний номер у GenBank AY127576). Показано, що експресiя транскриптiв з послiдовнiстю 20-го екзону i без неї змiнюється в мозку людини в процесi ембрiогенезу. Якщо в мозку 6-ти тижневого ембрiона транскрипт, що не мiстить 20-го екзону, експресується в бiльшiй кiлькостi, то в мозку 12-ти тижневого ембрiона вiн уже детектується на дуже низькому рiвнi. А кiлькiсть транскрипту, який включає додатковi 15 п.н., навпаки, зростає з вiком ембрiона.

Аналiз дiлянки, що включає послiдовнiсть SH3-доменiв показав можливiсть утворення двох додаткових транскриптiв (рис. 7). В ycix реакцiях амплiфiкацiї kpim продукту, який вiдповiдає основному транскрипту, були виявленi додатковi продукти як у мишi, так i y людини. Один iз них (реєстрацiйний номер у GenBank для транскрипту людини - AF180522, для мишi - AF498310) вiдповiдає транскрипту, у якому в результатi альтернативного сплайсингу вiдсутнi 25-ий i 26-ий екзони. У такому транскриптi не порушується рамка зчитування i вiн не кодує третiй SH3-домен. Вiдповiдний йому бiлок повинен вмiщувати чотири SH3-домени. Подiбний транскрипт було знайдено i для iнтерсектину 1 щура (Okamoto at al., 1999).

Iнший продукт, отриманий в цiй реакцiї, вiдповiдає транскрипту (реєстрацiйний номер у GenBank для транскрипту людини AY138139, для мишi - AF498311), в якому вiдсутнiй лише 25-ий екзон. В результатi такого альтернативного сплайсингу порушується рамка зчитування i утворюється стоп-кодон. Потенцiйний бiлок цього транскрипту мiстить лише два SH3-домени.

Варто вiдзначити, що SH3-домени iнтерсектину 1 характеризуються невисокою гомологiєю i вiдрiзняються не лише за складом амiнокислотних залишкiв, а й функцiонально. Так, пiдвищена експресiя SH3C- i E - доменiв, на вiдмiну вiд SH3A-домену, призводить до iнгiбування пiзнiх стадiй ендоцитозу (Simpson et al., 1999). SH3D-домен, вiдсутнiй при альтернативному сплайсингу 25-ого екзону, вiдрiзняється вiд iнших здатнiстю iнгiбувати бiлок CdGAP, регулятор Rac1 i Cdc42 ГТФаз (Hussain et al., 2001). Таким чином, можна очiкувати, що регуляцiя альтернативного сплайсингу пре-мРНК гена iнтерсектину 1 може модулювати його функцiї.

Проведений нами аналiз наявностi транскриптiв довгої iзоформи iнтерсектину 1 в тканинах дорослої мишi i 12-и тижневого ембрiона людини за допомогою ЗТ-ПЛР дав позитивний результат в ycix зразках (рис. 8), що говорить про присутнiсть довгої iзоформи iнтерсектину 1 не тiльки в мозку, як показав Нозерн-аналiз проведений ранiше в iнших лабораторiях (Guipponi et al., 1998; Okamoto et al., 1999; Sengar et al., 1999). Вiдсутнiсть сигналу при проведеннi Нозерн-гiбридизацiї може бути повязана з тим, що ефективнiсть перенесення великих за розмiром мРНК з агарозного гелю на мембрану є значно меншою, нiж менших за розмiром мРНК, i спiввiдношення сигналiв 5,5 i 15 т.н. для транскриптiв iнтерсектину не обовязково вiдображає їхню вiдносну кiлькiсть.

У проведених нами ЗТ-ПЛР на тканинах мишей довгий транскрипт iнтерсектину 1 мишi виявлявся в ycix дослiджуваних зразках у великiй кiлькостi пiсля 35-и раундiв амплiфiкацiї. В аналогiчних реакцiях амплiфiкацiї на ембрiональних тканинах людини довгий транскрипт тестувався на високому рiвнi тiльки в мозку. На основi цих даних можна пiдтвердити висновок, що довга iзоформа iнтерсектину експресується, переважно, в мозку. Виходячи з даних амплiфiкацiї, отриманих нами та iншими дослiдниками (Guipponi et al., 1998), можна припустити, що в тканинах мишi довга iзоформа iнтерсектину експресується в бiльшiй кiлькостi, нiж у тканинах людини, стосовно його експресiї в мозку.

Можливiсть iснування показаних нами шляхiв альтернативного сплайсингу пре-мРНК гена iнтерсектину 1, а також ранiше описаного шляху утворення його довгої та короткої форм, дає нам пiдставу говорити про iснування великого рiзноманiття бiлкових iзоформ цього гена. Множиннiсть форм iнтерсектину може мати дуже складну схему регуляцiї експресiї цього гена в клiтинi. Внаслiдок цього, при трисомiї вона може порушуватись i призводити до дисбалансу зв'язування з iншими бiлковими компонентами системи ендоцитоз-екзоцитоз, що, в свою чергу, призведе до порушення дiяльностi клiтини.

Висновки

1. Встановлено i охарактеризовано будову генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 (HRMT1L1), нового ядерного бiлка (NNP-1) та iнтерсектину 1 (ITSN1) людини, якi картовано на довгому плечi 21-ої хромосоми, та їхнiх гомологiв у мишi.

2. Отримано та визначено нуклеотиднi послiдовностi нових кДНК генiв HRMT1L1, NNP-1 та ITSN1 мишi, якi гомологiчнi генам людини, що картованi на 21q.

3. Вперше визначено нуклеотидну послiдовнiсть, яка мiстить ген нового ядерного бiлка (NNP-1) мишi.

4. Дослiджено експресію гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 у людини та мишi (HRMT1L1) i встановлено її тканиноспецифічний характер. Для гена людини вперше показано змiну рiвня експресiї в рiзних тканинах у процесi ембрiогенезу.

5. Показано присутнiсть транскрипту гена нового ядерного бiлка (NNP-1) мишi в ycix дослiджуваних тканинах i однаковий рiвень його експресiї протягом життя тварини, що свiдчить про належнiсть цього гена до генiв «домашнього господарства».

6. Вперше встановлено, що рiвень експресiї генiв HRMT1L1 та NNP-1 є iдентичним y тканинах нормальних i трисомних мишей (Ts65Dn), що передбачає вiдсутнiсть їхнього функцiонального значення для розвитку синдрому Дауна.

7. Iдентифiковано пять нових, утворених за рахунок альтернативного сплайсингу, iзоформ транскриптiв гена iнтерсектину 1 людини i мишi, що функцiонально повязаний з ендоцитозом та сигнальними шляхами в клiтинi. Показано їхню тканинну та вiкову специфiчнiсть.

Перелiк наукових праць, опублiкованих за темою дисертацiї

1. Скрипкина И.Я., Цыба Л.А., Славов Д., Кваша С.М., Гардинер К. и Рындич А.В. Получение и характеристика мышиного гена, гомологичного Nnp-1 гену человека, картированному на участке хромосомы 21 q22.3 // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, №6. - С. 530-539.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК гена нового ядерного бiлка людини; ізолювання та характеристика кДНК гена нового ядерного бiлка мишi; iдентифiкацiя геномних послiдовностей, якi мiстили ген нового ядерного бiлка мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидної послідовності генiв нового ядерного бiлка людини i мишi.

2. Скрипкина И.Я., Цыба Л.А., Аноприенко О.В., Смалько В.П., Славов Д., Гардинер К. и РындичА.В. Строение HRMT1L1 гена человека, картированного на участке хромосомы 21 q22.3, и его мышиного гомолога (Prmt2) // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. - 2001. - №8. - С. 167-172.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини; характеристика кДНК гена аргiнiн-N-метилтрансферази 2 мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидних послідовностей генiв аргiнiн-N-метилтрансферази 2 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах ембрiонiв людини за допомогою Нозерн-аналiзу.

3. Скрипкина И.Я., Цыба Л.А., Славов Д., Гардинер К. и Рындич А.В. Новые формы транскриптов гена интерсектина человека и мыши // Український бiохiмiчний журнал. - 2002. - Т.74, N4. C.33-43.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидних послідовностей генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

4. Skripkina I. Ya., Tsyba L.A. Identification of mouse homologues of some genes mapping on human chromosome 21 // Conference for students, PhD students and young scientists «Molecular biology and genetics». - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P.168.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв HRMT1L1, NNP-1 та ITSN1 людини i мишi; ізолювання та характеристика кДНК гена NNP-1 мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидних послідовностей дослiджуваних генiв людини i мишi; визначення експресії генiв HRMT1L1 та ITSN1 в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

5. Скрипкина И.Я., Цыба Л.А., Рындич А.В. Альтернативный сплайсинг пре-мРНК гена интерсектина: видовая и тканевая специфичность // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, (Россия). - 2002. - С. 324.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

6. Tsyba L., Skripkina I., Slavov D., Rynditch A., Gardiner K. Diversity in gene expression: alternative splicing in intersectin 1 pre-mRNA important in cell signaling // HUGOTs Seventh International Human Genome Meeting, HGM2002. - Shanghai (China) - 2002. - P.149.

Особистий внесок дисертанта - визначення екзон-iнтронної будови генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена iнтерсектину 1 в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

7. Tsyba L., Skripkina I., Kvasha S., Lazurkevich Z., Rynditch A. Alternative processing of gene transcripts in pathology // 4rd Parnas Conference. - Wroclav (Poland). - 2002. - P.26.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидних послідовностей генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

8. Skripkina I. Ya., Tsyba L.A., Slavov D., Gardiner K. and Rynditch A. Diversity in gene expression: Alternative splicing of pre-mRNA important in cell signaling // 4rd Parnas Conference. - Wroclav (Poland). - 2002. - P.73.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; компютерний аналіз нуклеотидних послідовностей генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

9 Циба Л.О., Скрипкiна I.Я., Ференець Г. О, Риндич А.В. Альтернативний сплайсинг пре-мРНК гена iнтерсектина: видова i тканинна специфiчнiсть / Матерiали VIII Українського бiохiмiчного зїзду // Український бiохiмiчний журнал. - 2002. - Т.74, N4б (додаток 2). - Чернiвцi (Україна). - С. 14-15.

Особистий внесок дисертанта - характеристика кДНК генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; компютерний аналіз та порiвняльна характеристика нуклеотидних послідовностей генiв iнтерсектину 1 людини i мишi; визначення експресії гена в різних тканинах ембрiонiв людини та дорослих мишей шляхом ЗТ-ПЛР; отримання i аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 мишi; аналiз нових iзоформ гена iнтерсектину 1 людини.

Размещено на Allbest.ru