Розробка трансгенних ліній Arabidopsis thaliana чутливих до хімічних мутагенів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут гігієни та медичної екології АМН України ім. О.М. Марзеєва

УДК: 575.224.4+277.21+577.216

Розробка трансгенних ліній Arabidopsis thaliana чутливих до хімічних мутагенів

03.00.15-генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Орел Надія Олександрівна

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Івано-Франківській державній медичній академії МОЗ України та Інституті рослинної генетики (Гатерслебен, Німеччина)

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор КОВАЛЬЧУК Лариса Євгенівна,Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України, кафедра медичної біології з курсом медичної генетики, завідувач кафедри

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор ГОРОВА Алла Іванівна, Національний гірничий університет МОН України, завідувач кафедри екології

доктор біологічних наук МІШУНІНА Тамара Мар'янівна, Інститут ендокринології та обміну речовин АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії нейрохімії

Провідна установа:

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, м. Київ, відділ біофізики і радіобіології

Захист відбудеться "26".12.2003 p. о 12.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.604.02 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ, вул. Попудренка, 50.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ, вул. Попудренка, 50.

Автореферат розісланий "25".11.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук Омельченко Е.М.

мутаген хімічний трансгенний селекція

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зростання забруднення навколишнього середовища в Україні набуває нині катастрофічного характеру (Сердюк А.М.,Тимченко О.І., 1997; Тимченко О.І., Сердюк A.M., Турос 0.І., 2000;). Першою чергою воно небезпечне тим, що спричинює негативні генетичні наслідки для наступних поколінь (Гойда Н.Г., 1997). Відомо, що синергетична дія екологічних факторів на спадковий апарат зумовлює близько 60% обсягу його пошкоджень, впливає на стан популяції та здоров'я людей, сприяє росту загальної захворюваності і особливо спадково зумовленої патології (Бариляк І.Р., Дуган О.М., 2002; Пілінська М.А. та ін., 2002). Надзвичайну небезпеку для людини і її нащадків становлять малотоксичні, але пошкоджуючі геном мутагени і канцерогени, більшість з яких виявляє генотокстичну дію і зумовлює патологічні зрушення в організмі (Ковальчук Л.Є, Нейко Є.М., 1996). Тому контроль над процесами забруднення, оцінка впливу мутагенних факторів на живі організми є актуальною проблемою (Горова A.І, 2002; Дуган О.М., Бариляк І.Р. 1995).

Описано понад 100 тест-методів для дослідження генотоксичності, які охоплюють різні рівні організації живого від бактеріофагів до ссавців. Регулярно застосовуються менше 20 з них, а деякі методи доступні лише спеціальним лабораторіям (Ковальчук О.В., 2000). Однак, універсального способу виявлення мутагенності хімічних сполук, радіонуклідів не існує; Тим більше, що для визначення внеску радіаційного або хімічного компоненту в пошкодження генетичного апарату необхідно проводити динамічне спостереження за станом довкілля забруднених регіонів, враховувати всі рівні організації спадкового апарату, а також різні види мутацій (Пілінська М.А., Дибський С.С., 2000).

Найдоцільнішими для розробки нових методів біоіндикації генотоксичності Є рослинні тест-системи, які доступні й відповідають описаним вимогам (Ковальчук Л.Є. та ін., 2002-2003; Ковальчук О.В., 1999-2000). Для виявлення інтенсивності мутагенного фону довкілля, спричиненого радіаційним забрудненням, використовується рослинна тест-система, запропонована вченими Івано-Франківської медичної академії та Інституту Ф. Мішера (Швейцарія), на основі трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana і Nicotiana tabacum. Однак при цьому передбачається застосування виключно двох ліній, які не дозволяють об'єктивно тестувати хімічні мутагени.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексних науково-дослідних робіт кафедри медичної біології з курсом медичної генетики та ЦНДЛ Івано-Франківської державної медичної академії "Механізми репарації точкових мутацій та виявлення нових генів, які беруть участь у цих механізмах. Вплив оксидантного стресу на рівень точкових мутацій у вищих еукаріот" (№ держреєстрації ВН № 03.23.067.99) - проект ЕМВО, фінансований Європейською молекулярно-біологічною Асоціацією (м. Хайдельберг, Німеччина) та "Впровадження та випробування нових тест-систем для біомоніторингу хімічного і радіонуклідного забруднення довкілля" (№ держреєстрації 01024007289).

Мета роботи: підвищення ефективності тестування мутагенів за допомогою розробки і селекції нових ліній трансгенних рослин Arabidopsis thaliana, чутливих до хімічних чинників.

Задачі дослідження:

1. Встановити гени, які регулюють структуру хроматину ДНК та беруть участь у рекомбінаційних процесах у рослин, зробити конструкції знайдених генів у сенс- і антисенс орієнтаціях.

2. Створити лінії трансгенних рослин з досліджуваними генами методом агробактеріальної трансформації через вакуумну інфільтрацію.

3. Провести тестування отриманих ліній на чутливість до хімічних мутагенів.

4. Дослідити вплив трихостатину А на ефективність тимчасової та стабільної трансформації.

5. Провести апробацію отриманих трансгенних ліній рослин як тест-систем для індикації хімічного забруднення довкілля.

Об'єкт дослідження: трансгенні рослини, агробактерії, гени-регулятори хрома-тинової структури.

Предмет дослідження: фенотипові реакції і явища гомологічної рекомбінації, зумовлені хімічними мутагенами.

Методи дослідження: молекулярно-генетичний аналіз ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, агробактеріальна трансформація, створення конструкцій генів і векторів, біохімічні методи, статистичний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше використано гени, що регулюють хроматинову структуру ДНК для отримання трансгенних ліній Arabidopsis thaliana, визначено їхній вплив на частоту гомологічної рекомбінації.

Проведено дослідження впливу трихостатину А на ефективність трансформації у Arabidopsis thaliana. Здійснено комплексне дослідження трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana (Col-0 Bin AR/SiR-8; Col-0 BinAR/SiR-7; BAR BinAR/RPD3-1; BAR BinAR/RPD3-9; Col-0 pTA/SiR-2; Col-0 pTA/SiR-4; N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 і N1DC4 no.561 pMEX/SIR2№4) на чутливість їх до хімічних мутагенів в лабораторних і натурних умовах.

Доведено збільшення частоти явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації (ІГР) залежно від інтенсивності хімічного забруднення, візуальним маркером якого було відновлення перерваної версії GUS-гена (сині плями в різних органах рослин).

Практичне значення отриманих результатів. Одержані чутливі лінії трансгенних рослин (ТР) Arabidopsis thaliana до хімічного забруднення - Col-0 BinAR/SiR-8, Col-0 BinAR/SiR-7, Соl-0 pTA/SiR-2 та Col-0 pTA/SiR-4. При пророщуванні їхнього насіння у зразках грунтів із різних екологічних зон, спостерігалися найбільш виражені зміни фенотипу та відновлення GUS-гена. Встановлено доцільність використання даних ліній, як чутливих тест-систем, для оцінки рівня хімічного забруднення оточуючого середовища.

Водночас ідентифіковано дві лінії ТР Arabidopsis thaliana (N1DC4 no.561 pMEX/ SIR2 №2 і N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №4), стійкі до хімічних чинників в експериментальних умовах (при дослідженні генетичних ефектів сполук важких металів: кадмію, міді, свинцю, нікелю та хрому) та при висадженні у ґрунти різних регіонів Прикарпаття. Цей факт може бути використаний в подальших молекулярно-генетичних дослідженнях для отримання рослин, стійких до хімічних чинників.

Впроваджений результатів дослідження. Результати дослідження впроваджено в практику екологічного моніторування інтенсивності хімічного забруднення води та ґрунтів окремих міст Івано-Франківської області. Матеріали дисертації і методичні підходи використовуються при викладанні біології та біохімії на відповідних кафедрах Івано-Франківської державної медичної академії та Прикарпатського університету ім. В. Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною працею автора. Проаналізовано відповідну літературу, проведено підбір векторів, трансформацію і створення конструкцій генів, перенесення їх в Arabidopsis thaliana, здійснено натурний експеримент.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації апробовано на засіданнях наукового товариства в Інституті генетики рослин (Гатерслебен, 2001-2002), міжнародному конгресі молодих вчених з біотехнології (Київ, 2002), науково-практичній конференції "Актуальні питання гігієни та екологічної, безпеки України" (Київ, 2003), науково-практичній конференції "Імунотоксиканти, канцерогени, мутагени навколишнього середовища" (Київ, 2002), III з'їзді з радіаційних досліджень (Київ, 2003), конференції "Антропогенно змінене середовище України: Ризики для здоров'я та екологічних систем" (Київ, 2003).

Публікації. Відповідно до теми дисертації опубліковано 11 наукових праць, у тому числі - 3 статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 8-у збірниках, матеріалах, тезах конференцій і симпозіумів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 126 сторінках і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, двох розділів результатів досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, який включає 166 робіт (з них 37 кирилицею). Дисертація містить 17 таблиць та 27 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом дослідження слугували ТР родини гірчичних Arabidopsis thaliana, агробактерії Agrobacterium thumefaciens і Escherichia coli, гени - регулятори структури хроматину. Для трансформації використано два основні штами бактерій: 1) Escherichia coli - канаміцин-резистентний штам DH56 (фірма Gibco BRL, Eggenstein); 2) Agrobacterium thumefaciens - штам С58 Cl Rf, що містить ген резистентності до ріфампіцину. 55 трансформаційних експериментів проведено на рослинах Arabidopsis thaliana дикого типу екотипу Colambia (Col-0) та трансгенні рослини Arabidopsis thaliana екотипу С24: а) лінія N1DC1 no11, що містить З копії перерваного GUS гена в прямій орієнтації; б) лінія N1DC4 по.651, що містить 1 копію перерваного GUS гена в оберненій орієнтації. Лінії було надано професором X. Пухтою в Інституті генетики рослин (Гатерслебен, Німеччина).

Малекулярно-генеімчні методи. ДНК електрофорез проведено в 1% агарозному гелі з етидіем бромідом (кінцева концентрація 2,5 мг/мл) в ІХНАС буфері в горизонтальних пластинах.

Конструкції генів RPD3, SIR2 like і SU(VAR)3-7 отримано у відповідних векторах: pMEX, pTA7002, BinAR. Гени RPD3 і SIR2 були розташовані в антисенс - орієнтаціях, ген SU(VAR)3-7 - у сенс - орієнтації.

Трансформацію Е.соїі здійснено через тепловий шок.

ДНК з листків Arabidopsis thaliana виділено за методом Fulton (1995).

Саузерн-блот аналіз проведено через нерадіоактивну DIG систему, із застосуванням дигоксигенін - стероїдного гаптену. ДНК-проби було помічено DIG-dUTP через дві послідовні полімеразно-ланцюгові реакції (ПЛР).

Субстратом для ПЛР слугували плазмідна ДНК, ПЛР продукти та рослинна ДНК. Секвенування ДНК виконано за загальноприйнятими методами (Sanger T., 1977) у секвенаційній лабораторії Інституту генетики рослин під керівництвом професора X. Пухти (Гатерслебен, Німеччина).

Методи дослідження рослин. Стерилізацію насіння Arabidopsis thaliana проведено в Eppendorf пробірках у 70% етанолі з додаванням 4% NaOCI.

Пророщування рослин здійснено у теплиці за умов 16 год світло/ 8 год темрява при температурі від +20 °С до +22 °С. При натурному експерименті насіння пророщувалося на зразках ґрунтів з різних районів Прикарпаття: хімічно забруднених міст (Івано-Франківськ, Калуш, Бурштин, Коломия) та умовно екологічно чистого Верховинського району.

Трансформацію Arabidopsis thaliana проведено через вакуумну інфільтрацію. Після селекції рослин здійснено інокуляцію проростків Arabidopsis thaliana з Agrobacterium tumefadens.

Вивчення частоти явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації (ІГР) базувалося на вивченні частоти і розподілу синіх плям на різних органах рослин Arabidopsis thaliana, що виявлялися за допомогою гістохімічного X-Gluc аналізу ТР.

Для тестування проростків ТР Arabidopsis thaliana на чутливість до хімічних реагентів було використано мутагени: 1) MMS (Methnesulfonus add methyl ester) у концентраціях 25,50,75,100 і 150 пМ; 2) Мітоміцин С у концентраціях 0,5,10,15,20, 25 і ЗО мг/л; 3) MN (l,2-Dihydropyridazin-3,6-dion 99%) (T) (3,6-Dihydroxypyridazine, 99%) у концентраціях O.I; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 млМ; 4) MNU (N-Nitroso-N-Methylurea) у концентраціях 0,25; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0 млМ. У дослідах використовувалися солі тяжких металів: кадмію (Cd(NО₃)₂ * 4Н₂O), міді (CuSO₄ * 5Н₂0), кобальту (CoSO₄ * 7Н₂O), хрому (К₂Сr₂O₇) та нікелю (NiSO₄ * 7H₂0) у концентраціях 10^-5, 5 * 10^-4, 10^-4 М та 10^-3 М, у розчинах яких пророщувалося насіння Arabidopsis thaliana.

Статистичну обробку результатів та визначення кореляцій між показниками здійснено за допомогою комп'ютерної програми Ехеl, що входить до пакету Microsoft Office 2000.



РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Отримання конструкцій досліджуваних генів та трансгенних ліній Arabidopsis thaliana. Для вирішення проблеми розробки ліній ТР, чутливих до хімічних мутагенів, проведено серію молекулярно-генетичних досліджень по пошуку методології конструкції та клонування нових ліній генетично модифікованих рослин Arabidopsis thaliana, що відрізнялися від таких, отриманих у лабораторії професора Б.Хон в Інституті Ф. Мішера (Швейцарія). У процсі виконання цієї роботи було модифіковано відомі загальноприйняті методи клонування конструкцій генів і отримання ТР.

У результаті лабораторних досліджень вибрано три гени, які регулюють структуру хроматину і контролюють експресію GUS гена: 1) SIR2-ген кодує білок, що деацетилює гістони; 2) RPD3-ген гістондеацетилази; 3) SU(VAR)3-7-ген супресор варіації. Послідовності цих генів заклоновано у вектори pTA7002, BinAR та pMEX.

Клонування у векторі pTA7002 проводилося по сайтах Spel і Xhol. кДНК гена SIR2 було ампліфіковано з праймерами, що містили сайти рестрикції для Spel і Xhol ензимів CATGACTAGTCATGTCATCGTCAAATTGG і CGAACTCGACTTA-TGAGCCACTGACAG. Після екстракції з гелю потрібного фрагменту ДНК довжиною приблизно 900 bp (відповідним набором QIAquik Gel Extraction Kit) було проведено рестрикцію. Рестрикційна суміш містила Spel і Xhol ферменти (Amerscham) і 10Х буфер Н. Рестрикція проводилася протягом ночі при температурі +37°С. Паралельно проведено рестрикцію вектору pTA7002 рестрикційними ферментами Spel і Xhol в Н буфері. Після очищення рестрикційних продуктів (High Pure PCR Product Purification Kit Boeringer Mannheim) ліговано порізані вектор pTA7002 (50 нг) і SIR2 фрагмент в об'ємі 10 мкл з лігазою Т4 при температурі +16°С протягом ночі.

Трансформацію в Е. соli здійснено методом теплового шоку. З отриманих 100 колоній вибрано по 20 клонів, які перевірено ПЛР з ген-специфічними праймерами на наявність досліджуваного гена. Доведено наявність 5 позитивних продуктів ПЛР, що відповідали довжині SIR2 гена. За допомогою ферментів рестрикції Spel і Xhol перевірено наявність вставки у плазмідній ДНК. Виділено мідіпреп плазмідної ДНК клонів 2 і 3 для наступної трансформації в Agrobacterium. Методика, за якою гени RPD3 і SU(VAR) 3-7 було заклоновано у вектор pTA7002, аналогічна до описаної вище.

Наступним етапом роботи було з'єднання досліджуваних генів з вектором рМЕХ001-VS. Це вектор з конститутивним 35S промотором, який містить селективний для рослин ген метотрексату, модифікований нащадок родини векторів pMEX. У мультиполілінкері (MCS) для клонування містяться наступні сайти рестрикції- Smal, BamHl, Xbal, Sall. Унікальні рестрикційні сайти в MCS можливі для клонування по EcoRI, Sad, Kpnl, Smal, BamHI, Xbal, Sall, PstI і HindIII. pVSl rep і sta регіони з VS1 для неселективного клонування в Agrobacterium (Deblaere Н., 1987). Клонування генів здійснено за сайтом ХbаІ.

Третім вектором було вибрано BinAR. Це наступне покоління вектора BinlQ (Bevan M., 1984). Він містить експресійну касету для конститутивної експресії генів у рослинах, яка заклонована в EcoR1/HmdIII сайг BinlQ Beicropa(Hofger D. and WiUmitzer Т., 1990). Касета має довжину 770 bp EcoRI/HindIII, містить CaMV 35S промотор, частково pUC19 полілінкер і термінатор октопінсинтазного гена (OCS3). До складу касети входить ген стійкості до канаміцину - NTPII - неоміцин фосфатаза-Ген RPD3 клонувався по сайтах ХbаІ і Sall. кДНК гістондеацетилази амплі-фіковано з праймерами CCTCTGGCrTCTGTTACGTC і CATATCCGTGCTCA-АТССТС для тримання більшого числа копій гена. Після очищення продукту проведено наступну ПЛР з праймерами GCCTAGAGCCATATCCGTGCTCAATCCTC і ACGCGTCGACCCTCCGGCTCTGTTACGTC, які містили на кінцях рестрикційні сайти ХЬаІ і Sall.

Після екстракції з гелю потрібного фрагмента (набором QIAquik Gel Extraction Kit) проведено рестрикцію впродовж 3 год при температурі +37°С за методикою аналогічною для вектора рТА7002.

Позитивні колонії клонів вирощено в рідкому LB-середовищі з канаміцином у концентрації 50 мг/л і виділено мідіпрепи. Останні ще раз перевірено рестрикціями на вставку і правильну орієнтацію (сенс-антисенс) гена за допомогою рестрикції з рестрикційним сайтом ВаmНІ. Останній міститься у положенні 468 від кінця гена. Таким способом після рестрикції з ХbаІ і ВаmНІ було отримало фрагмент довжиною 468 нуклеотидів, а при рестрикції ВаmНІ і Sall - 783 нуклеотиди. Це засвідчило, що отримані клони мають ген RPD3 в антисенс орієтації. За такою ж методикою було заклоновано SIR2 і SU(VAR) гени у вектор BinAR.

Наступним етапом роботи була трансформація отриманих клонів плазмідної ДНК в Agrobacterium tumefaciens штаму С58 шляхом електропарації. Перед трансформацією було проведено діалізацію плазмідної ДНК.

Таким чином, у результаті проведених клонувань отримано конструкції генів SIR2, SU(VAR) та RPD3 у вектори рМЕХ, BinAR та рТА7002. Проведено перевірку на вставку генів у вектори за допомогою ПЛР та рестрикції по відповідних сайтах. Отримані плаз міди було затрансформовано в Agrobacterium tumefadens і підготовлено до наступної трансформації у рослини.

З метою отримання ТР було проведено 55 трансформацій рослин методом вакуумної інфільтрації з Agrobacterium tumefariens. Рідка культура Agrobacterium t. з потрібною конструкцією вирощувалася протягом першої ночі в 50 мл YEB-середовища З додаванням антибіотика; протягом другої ночі додавалося 150 мл YEB-середовища при перемішуванні 160 обертів за хв при температурі +28 °С. Культуру відцснтрифу-говували при 6,5 тис. обертів за хв протягом 15 хв. Далі бактерії розчинялися у 800 мл інфільтраційного середовища. Останнє використано для 3 послідовних трансформацій по 7 рослин у кожній. Для трансформації вибрано рослини на початку цвітіння з обрізаними силіками.

Після дозрівання зібране насіння було простерилізовано і висіяно на поживне середовище з відповідним антибіотиком. Для рослин, трансформованих вектором рМЕХ - метотрексат, для вектора рТА7002 - гігроміцин, для вектора BinAR - кана-міцин. Проростки, які вижили на відповідних ангибіотиках, склали покоління F1. Вони були кандидатами на трансгенні лінії, які було висаджено у землю для отримання насіння (табл. 1).

Таблиця 1

Отримані кандидати на трансгенні лінії рослин

Рослини для трансформації	Конструкція гена у векторі	Кількість трансформацій	Трансгенні лінії або кандидати
Соl-0	PMEX/SIR2 PTA/S1R2 BinAR/SIR2	6 4 3	9 4 1
	pMEX/RPD3 PTA/RPD3 BinAR/RPD3	7 3 2	15 5 2
	pMEX/SU(VAR)3-7	4	14
N1DC4 no.561	PMEX/SIR2 pMEX/RPD3 pMEX/SU(VAR)3-7	3 7 5	1 9 5
N1DC4 no11	PMEX/SIR2 pMEX/RPD3 pMEX/SU(VAR)3-7	3 4 4	1 1 4
BAR	pMEX/SIR2 pMEX/RPD3	3 5	5 7

Кількість трансформацій не завжди корелювала з кількістю трансгенних ліній. Рослини дикого типу Соl-0 з вектором рМЕХ та досліджуваними генами давали найбільшу кількість кандидатів трансгенних ліній (9,15,14, 11).

У випадку використання вектора рМЕХ у рослинах N1DC4 no.561 pMEX/SJR2, N1DC4 по651 рМЕХ/ RPD3 і N1DC no11 pMEX/RPD3 значне число проведених трансформацій і невелика кількість отриманих трансгенних ліній пояснюється складністю селекції рослин з рМЕХ вектором на метротрексаті. Це зумовлено сильною токсичністю даного антибіотика і необхідністю індивідуального підбору селективної концентрації в кожному конкретному експерименті.

З метою ідентифікації ТР на наявність SIR2, RPD3 тa SU(VAR)3-7 генів покоління F₂ було тестовано сегрегацією та Саузерн аналізом на наявність трансгена та можливу кількість копій. Для сегрегації насіння було висіяно на поживне середовище з відповідним антибіотиком. Через два тижні після проростання проведено підрахунок і розраховано сегрегацію. Оскільки гени знаходяться в антисенс орієнтації, то число копій не було визначальним у подальших екстіериментах.

За результатами Саузерн-блот гібридизації доведено створення деяких транс-генних ліній рослин та можливе число копій трансгена в кожній з них (табл.2).

Таблиця 2

Отримані трансгенні лінії рослин Arabidopsis thaliana та можливе число копій трансгену в кожній, перевірені Саузерн-блот аналізом

Трансгенні лінії	Кількість трансгенних копій
Соl-0 pMEX/SIR2 2	2
Соl-0 pMEX/SIR2 3	1
Col-0 pTA/SIR2 2	1
Col-OpTA/SIR24	2
Соl-0 BinAR/SIR2 7	3
NHDC4 no.561 pMEX/SIR2 2	2
NHDC4 no.561 pMEX/SIR2 4	3
NHDC4 no.561 pMEX/SIR2 5	>3
Col-0 BinAR/RPD3 1	1
Col-O pTA/RPD3 2	>3
Col-0 pTA/RPD3 2	1



Таким чином, нами було отримано цілий ряд трансгенних ліній Arabidopsis thaliana. Ці рослини було використано для наступного аналізу впливу на них хімічних мутагенів та природних факторів забруднення навколишнього середовища.

Селекція трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana, чутливих до мутагенів та зміна рівня гомологічної рекомбінації, дослідження ефективності трансформації. Для тестування ТР було застосовано сильні мутагени, що спричинюють дволанцюгові розриви ДНК. Тижневі проростки ТР переносилися у спеціальні чашки зі зростаючою концентрацією хімічного мутагена у рідкому поживному середовищі. Доведено різну чутливість трансгенних ліній до хімічних сполук. При обробці проростків ТР Соl-0 pMEX/SIR2 різними концентраціями MMS збільшення чутливості не спостерігалося.

У всіх рослин майже одночасно з'являлися листочки, формувалася розетка. Гістохімічна обробка для виявлення продукту GUS гена та підрахунок кількості рекомбінаційних явищ не показали достовірних відмінностей у рослин, пророщених у присутності різних концентрацій MMS. Це можна пояснити особливостями дії MMS на геном ТР. Водночас різні концентрації мітоміцину С зумовили підвищення чутливості трансгеної лінії Соl-0 pMEX/SIR2 до даної хімічної речовини (табл. 3).

Найменшу чутливість до мітоміцину С виявили лінії pMEX/SIR2 №2, №7 №9 і №10. Водночас TPpMEX/SIR2 №3, pMEX/SIR2 №6, і pMEX/SIR2 №8 розподілились майже наполовину за фенотипом.

При обробці ТР Cot-0 pTA/SIR2 хімічними реагентами враховувалося, що рТА вектор - індуцибельний. Тому в цих дослідах порівнювалася поведінка індукованих дексаметазомом та неіндукованих (контроль) проростків. Було протестовано три лінії ТР - Соl-0 pTA/SIR2 №1, pTA/SIR2 №2 та pTA/SIR2 №4.

Як і у попередньому досліді, при обробці проростків різними концентраціями MMS, збільшення чутливості порівняно з контролем не спостерігалося.

Таблиця З

Результати аналізу чутливості трансгенних лінії Соl-0 pMEX/SIR2 до мітоміцину С

Номер лінії Соl-0 pMEX/SIR2	Кількість дослідів	Показник чутливості порівняно з контролем
		Збільшена чутливість	Відсутні зміни
2	22	4	18
3	13	7	6
6	16	8	8
7	5	1	4
8	5	2	3
9	8	1	7
10	3	0	3

Вплив різних концентрацій мітоміцину С проявлявся уповільненням розвитку та відмиранням ТР лінії Соl-0 pTA/SIR2, як індукованих дексаметазоном, порівняно з контрольними неіндукованими рослинами. Виявлено достовірні зміни ІГР цієї лінії ТР, зумовлені мітоміцином С.

Наступним етапом було вивчення чутливості ще двох трансгенних ліній - Соl-0 pTA/SIR2 №1 і Соl-0 pTA/SIR2 №4.

Лінія Соl-0 pTA/SIR2 №4 виявилася найчутливішою до мітоміцину С. Друге місце за змінами фенотипу зайняла лінія Соl-0 pTA/SIR2 №2. Водночас у лінії Cot-0 pTA/SIR2 №1 показано тенденцію до незначного зниження кількості фенотипових змін ТР (терміну проростання, утворення розетки, товщини стебла). Отримані результати по обробці трансгенних проростків ліній Соl-0 pMEX/SIR2 та Соl-ОрТА/ SIR2 хімічними реагентами дозволяють припустити, що SIR2 ген кодує протеїн, відсутність якого перешкоджає рекомбінаційним процесам ДНК.

Аналогічним способом було протестовано трансгенні лінії Соl-0 BinAR/SIR2. Проростки, що оброблялися MMS, MNU i MN показували незначне відхилення росту і розвитку. Отримані результати не були достовірними. При додаванні у поживне середовище мітоміцину С встановлено фенотипові зміни проростків (табл. 4).

Таблиця 4

Результати аналізу чутливості трансгених проростків лінії Col-0 BinAR/SIR2 до мітоміцину С

Номер лінії Соl-0 BinAR/SIR2	Кількість дослідів	Показник чутливості порівняно з контролем
		Збільшена чутливість	Відсутні зміни
1	11	5	6
3	14	6	8
7	8	6	2
8	12	8	4
9	8	4	4

Проведений аналіз чутливості проростків ТР ліній Col-0 BinAR/SIR2 довів виражені фенотипові зміни у лініях Col-0 BinAR/SIR2 №7 та Col-0 BinAR/SIR2 №8. Лінії Col-0 BinAR/SIR2 №3 та Соl-0 BinAR/SIR2 №9 виявилися найбільш толерантними до дії мітоміцину С. Подібні результати отримані іншими дослідниками щодо функції SIR2 гена (Takano M. et al., 1997).

При тестуванні проростків трансгенних ліній з рекомбініційними субстратами N1DC4 по. 651 pMEX/SIR2 сполуками MMS, мітоміцину С, MNU і MN достовірних позитивних результатів не визначено. Аналогічні результати отримано щодо впливу MNU, MN, MMS та мітоміцину С на геном ліній ТР Col-0 pMEX/RPD3.

Таким чином, при тестуванні 25 ліній ТР, що містили конструкції генів з векторами рМЕХ, рТА та BinAR, встановлено різну чутливість до MMS, мітоміцину С, MNU і MN- Для подальших експериментів з визначення частоти рекомбінації відібрано лінії з геном SIR2 (N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 1-8 та BAR), які показали найбільшу чутливість до MMS та мітоміцину С.

У гомозиготного покоління F3 отриманих ТР було виявлено зменшення реставрації -глукуронідазного (GUS) гена, тобто рекомбінаційних випадків (табл. 5). Частота ІГР знижена у 3,45; 3,92; 3,69 та 3,16 раз в лініях N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №2, N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №4, N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №7, N1DC4 nо.651 pMEX/SIR4 №8, відповідно (Р<0,001). Відновлення GUSгена, близьке до контрольних значень, показано в лінії N1DC4 nо.651 pMEX/SIR2 №6. Частота та розподіл синіх плям у різних органах трансгенних рослин підтверджували кількість явищ ІГР.

Таблиця 5

Частота рекомбінаційних явищ у трансгенних лініях рослин N1DC4 nо.651 pMEX/SIR2 №1-8

Проростки Трансгенних рослин	Число рекомбінаційних явищ в перерахунку на ЗО рослин
N1DC4 по.651 контроль	30,71 2,51
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №1	12,05 1,70*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №2	8,90 1,32*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №3	14,24 0,91*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №4	7,84 1,11*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №5	11,80 1,01*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №6	22,81 1,33
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №7	8,33 0,82*
N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №8	9,72 1,10*

Примітка *Р<0,001

Подібні результати про вплив SIR гена на соматичну інтрахромосомну гомологічну рекомбінацію у TP Arabidopsis thaliana отримано вперше. Вони потребують наступних експериментальних підтверджень, оскільки в літературі наводяться дані лише про вплив SIR білка на негомологічну рекомбінацію (Mayerhofer R et al., 1991). Оскільки зростання забруднення біосфери тяжкими металами відмічено у воді та грунтах різних регіонів світу, наступним етапом роботи було встановлення їхнього впливу на геном ТР (Holmgren G., Meyer M., 1993). Виявлено різну активність проростання насіння Arabidopsis thaliana у розчинах солей тяжких металів порівняно з контролем. Чіткої залежності фенотипових змін від концентрацій металів не встановлено. Усі експерименти довели найменшу схожість насіння в присутності солей кобальту та хрому. На третьому місці при концентраціях 10^-5, 5 * 10^-4 і 10^-4 М виявися нікель, при ІО-3 М - кадмій. Достовірні результати досліджень ідентифіковано при концентрації всіх солей металів 5 * 10^-4 М. Вивчення впливу цих же металів на патологію мітозу у рослин Allium сера ана-телофазним методом іншими дослідниками вказує на наступний розподіл металів за ступенем токсичності - Cu>Cd>Ni (Довгалюк А. І., Калиняк Т. Б., Блюм Я. Б., 2001).

Тому закономірним продовженням роботи був порівняльний аналіз впливу солей важких металів на процеси репарації ДНК, проведений для двох ліній ТР - N1DC4 pMEX/SIR2 № 2 і N1DC4 pMEX/SIR2 № 4 (табл. 6).

Таблиця 6

Число рекомбінаційних явищ у трансгенних рослинах Arabidopsis thaliana, оброблених солями тяжких металів у концентрації 5 * 10^-4 М, у перерахунку на одну рослину (М m)

Солі важких металів	Лінії трансгенних рослин
	N1DC4 nо.651 контрольна	N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №2	N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №4
Кадмію	17,9 1,1	7,1 0,7*	6,8 0,2*
Міді	16,8 1,4	4,7 0,4**	5,7 0,3**
Кобальту	18,2 1,6	5,9 0,9**	6,4 0,7**
Хрому	13,3 1,2	7,9 0,7*	5,9 0,5*
Нікелю	15,4 1,2	4,8 0,1**	4,6 0,1**

Примітка. * - Р<0,01, ** - Р<0,005.



Частоту явищ ІГР істотно знижували солі всіх досліджуваних металів, особливо міді, кобальту та нікелю для лінії TPNlDC4 nо.651 pMEX/SIR2 №2 (відповідно у 3,5; 3,0 і 3,2 разу, Р<0,005) і для лінії N1DC4 nо.651 pMEX/SIR2 №4 (відповідно у 3,0; 2,8 і 3,3 разу, Р<0,005). За токсичністю для лінії ТР №2 солі тяжких металів розподілено наступним чином - мідь > нікель > кобальт > кадмій > хром; для ТР лінії №4 - нікель > мідь > кобальт > кадмій > хром. Водночас за частотою ІГР у популяціях ТР контрольної лінії, що культивувалися на середовищах з додаванням солей тяжких металів у концентрації 5 * 10^-4 M, інтенсивність впливу цих солей була іншою: кобальт > кадмій > мідь > нікель > хром. За відсутності SIR гена найтоксичнішими виявилися кобальт і кадмій, а у дослідних лініях вони посідали відповідно третє і четверте місця. Однаково зменшувалася частота рекомбінаційних явищ у всіх ТР тільки у присутності хрому, де цей показник залишався на останньому місці.

Подібну закономірність зниження кількості рекомбінаційних явищ у ТР із трансгеном SIR відмічено для інших концентрацій солей тяжких металів. У контрольній популяції ТР найбільшу частоту ГР відзначено при концентрації 10^-3 М для кадмію (19,1 1,2), практично однакові показники - для міді та кобальту (відповідно 18,2 1,6 і 18,3 1,2), найменші значення -для нікелю та хрому (16,2 1,1 і 14,7 1,2). Істотне зменшення рівнів рекомбінації у рослинах із SIR геном ліній №2 і №4 було особливо значним (5,3 0,3 і 4,2 0,1) при пророщуванні ТР у середовищі з додаванням нікелю. За ступенем токсичності та захистом від двониткових розривів ДНК у лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 солі важких металів розподілено наступним чином: кадмій > хром > мідь > кобальт> нікель; у лінії NlDC4 no.561 pMEX/SIR2 №4 - кобальт > мідь > кадмій > хром > нікель.

При концентрації солей тяжких металів 10^-4 М частота двониткових розривів ДНК у рослин контрольної лінй за чутливістю до кобальту подібна до попередніх результатів (16,7 1,1), а найбільше відрізнялась за відношенням до кадмію (ІГР зменшена від 19,1 1,2 до 13,4 0,9). Токсичність тяжких металів для контрольної лінії Arabidopsis thaliana складала ряд: кобальт > мідь > кадмій > нікель > хром. Останні два показники були приблизно однаковими -12,4 0,8 та 12,0 1,0. У лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 ряд токсичності для цієї концентрації виглядав наступним чином: кадмій > хром > кобальт > мідь > нікель (відповідно 10,5 0,9; 6,2 0,2; 6,0 0,1; 5,5 0,4; 5,0 0,9); у лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №4 - хром > кобальт > кадмій > мідь > нікель (відповідно 6,5 0,1; 6,5 0,2; 6,0 0,1; 5,6 0,2; 3,5 0,04). Як і в попередній серії експериментів нікель не спричиняє достатньої кількості явищ ІГР у дослідних ліній ТР, що засвідчило зниження двониткових розривів ДНК. Водночас для контрольної популяції ТР найменш токсичним був хром.

Концентрація (10^-5 М) солей тяжких металів неістотно гальмувала реларативні процеси у всіх ТР. Відповідні ряди токсичності для дослідних ліній ТР: N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 - мідь > кадмій > хром > кобальт > нікель, N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №4 - кадмій > мідь > хром > кобальт > нікель.

Таким чином, при високих концентраціях солей тяжких металів найбільший вплив на частоту ГР у контрольній популяції ТР і лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 виявив кадмій і кобальт, для лінії N1DC4 no.561 pMEX/SER4 при концентрації 10^-4 М - хром. Цікавим виявився той факт, що контрольна популяція рослин була найменш чутливою до дії хрому. Неістотні відмінності між впливом різних металів, окрім кадмію, при концентрації 10^-5 М на ГР усіх ліній ТР свідчать, що при накопиченні у середовищі хімічних мутагенів, їхній вплив не залежить від типу солей.

При проведенні кореляційного аналізу між показниками частоти ІГР та різними концентраціями солей тяжких металів у трьох лініях ТР встановлено сильні від'ємні кореляційні зв'язки (r > -0,91-0,98) між цими показниками у лінії N1DC4 no.561. Найвищий коефіцієнт кореляції виявлено для різних концентрацій солей кадмію (r = -0,987). Зменшення активності відновлення гена-маркера безпосередньо залежить від концентрації цього металу у середовищі, на якому пророщувались рослини. Сильні від'ємні кореляції встановлено між показниками частоти ІГР у лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №2 та концентраціями солей кадмію, кобальту, хрому і нікелю (відповідно r = -0,721; -0,804; -0,914; -0,898). Кореляційний коефіцієнт для міді становив -0,674, що прирівнюється до взаємозв'язків середньої сили. Водночас встановлено сильні кореляційні зв'язки між показниками частоти ІГР та різними концентраціями солей тяжких металів у лінії N1DC4 no.561 pMEX/SIR2 №4. Отримані результати підтвердили дані інших дослідників про участь SIR2 гена у регуляції функції хроматину (Lauf P., Autran D., Traas G., 1999). Цей ген одночасно з внурішньоклітинним диханням включає механізми захисту, які забезпечують нейтралізацію радикалів, що утворюються в мітохондріях при окисленні глюкози і утворенні АТФ, і репарацію ДНК. ТР з SIR2 геном менш чутливі до дії мутагенних чинників, тяжких металів зокрема. При отриманні ТР важливу роль має ефективність трансформаційних явищ. З метою активації останніх проведено експеримент з використанням трихостатину А (ТСА). Спочатку проростки Arabidopsis thaliana інкубовано з ТСА. Після стерилізації насіння було розділено на дві частини. Одна росла в рідкому поживному середовищі без ТСА, а до другого середовища було додано ТСА у концентрації О,4 мкМ. Після інокуляції проростків Arabidopsis з A. tumefadens вивчено експресію -глукуронідазного гена, що корелювало з ефективністю перенесення Т-ДНК молекули в ядро рослинної клітини (табл. 7).



Таблиця 7

Ефективність тимчасової трансформації Т-ДНК після індукції проростків Arabidopsis thaliana з трихостатином А у перерахунку на кількість проростків

Проби	Розведення 6000K:pDG5	Загальна кількість проростків	Кількість проростків з синіми плямами
			абсолютна	%	середня
Контроль	1:0 1:10 1:100 1:1000	49 54 46 48	15 9 9 13	30,6 16,6 19,6 27,1
					23,47 %
Середовище +ТСА	1:0 1:10 1:100 1:1000	49 45 86 48	11 18 44 18	22,4 40 51,7 37,5
					37,9 %

Як видно з результатів експериментів, інкубація проростків з ТСА змінює здатність рослинного генома до проникнення Т-ДНК. Проростки, вирощені у середовищі з ТСА, мали підвищену ефективність трансформації порівняно з контролем від 23,47 до 37,90 %. Аналогічні дані отримані при перевірці ефективності трансформації Т-ДНК після індукції проростків Arabidopsis thaliana з трихостатином А у перерахунку на кількість синіх плям.

Інтеграція Т-ДНК у рослинну клітину підсилюється ТСА. Це призводить донезначної редукції компакгизації хроматину та переходу його в евхроматин, що дає змогу більшої інтеграції сайтів у геном рослини. При декомпактизації хроматину абсолютна кількість трансформованих клітин і кількість інтеграцій Т-ДНК молекул на геном зростає. Тому, на нашу думку, ТСА-ефект пояснюється підвищенням кількості клітин, що отримують компетенцію до трансформації або кращу здатність до селекції.

Не можна відкидати гіпотезу про те, що ТСА впливає на транскрипційну активність селективного маркера протягом чи після інтеграційних процесів. Це було показано у ссавців (Nan М., 1998). Обробка ТСА активує гени РНК у рослин подібно до азацитидіну (Сhen Н., Picaard T.M., 1997), що сприяє деметилюванню транскрипції репресованих трансгенів (Palmgren A., 1993). Оскільки отримані нами результати подібні до таких з азацитидіном, можна припустити спільний механізм обох феноменів. Це може бути пов'язано з тим, що у присутності ТСА ацетильовані молекули гістонів вільніше інкорпоруються у новосформовані нуклеосоми, які асоційовані з інтегрованою ДНК. Альтернативним поясненням наших результатів може бути те, що більшість клітин проростків отримують компетентність інтеграції під впливом обробки ТСА. Як і у ссавців (Magnaghi J., 1998), присутність ТСА може спричиняти індукцію ДНК реплікації через блокування транскрипційносупресивного ефекту з ретинобластом білка, який є також досить консервативним і у рослин. Оскільки інтеграція відбувається в S фазі, обробка ТСА може викликати збільшення кількості клітин і тим самим підвищувати здатність до інтеграції.

З метою оптимізації тестування інтенсивності та природи хімічного забруднення довкілля випробувано 8 ліній трансгенних рослин Arabidopsis thaliana: Col-0 Bin AR/ SiR-8; Col-0 BinAR/SiR-7; BAR BinAR/RPD3-l; BAR BinAR/RPD3-9; Col-0 pTA/SiR-2; Col-0 pTA/SiR4; N1DC4 no.651 pMEX/SIR2 №2 і N1DC4 no.651 pMEX/SIR2 №4, чутливість яких було доведено у попередніх експериментах. Для оцінки радіологічного стану, мікробіологічного та хімічного складу грунтів використано дані обласної СЕС, які засвідчили перевагу хімічного фактора у загальній сукупності забруднювачів. У населених пунктах, де забиралися зразки грунтів, рівень радіоактивності був у межах допустимого. Встановлено схожість зразків за мікробіологічним складом.

Наше подальше дослідження носило характер апробації можливості використання отриманих ТР як модельного об'єкта для тестування хімічних мутагенів довкілля. При пророщуванні ТР у досліджуваних фунтах виявлено істотні порушення росту і розвитку: затримка появи перших листків і формування розетки, зменшення діаметра стебла, збільшення кількості відмерлих листків (Р<0,005) (табл. 8).

Враховуючи те, що зміни фенотипу не завжди достовірно відображали ступінь забруднення грунтів, наступним етапом була оцінка частоти явищ ІГР.

Встановлено залежність ІГР від інтенсивності забруднення. Незначну чутливість, як і в експерименті, виявили лінії BAR BinAR/ RPD3-1 і BAR BinAR/RPD3-9. При пророщуванні насіння ТР Col-0 BinAR/SiR-8, Col-0 BinAR/SiR-7, Col-0 pTA/SiR-2 та Col-0 pTA/SiR-4 у зразках грунтів з різних регіонів, спостерігалися найбільш вираженізміни фенотипу та відновлення GUS-гена.

Таблиця8

Морфологічна характеристика трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana, пророщених на різних пробах грунтів

Лінії трансгенних рослин	Верховинський район	м. Івано-Франківськ	м. Коломия
	Висота стебла (см)	% схожості	Бутоні-зація	Висота стебла (CM)	% схожості	Бутоні-зація	Висота стебла (CM)	% схо-жості	Бутонізація
Соl-0 BinAR/ S1R2-8	1,5±0,5	75,0	-	1,5±0,5	62,5	-	1,0±0,5	50,0	-
Соl-0 BinAR/ SiR2-7	2,0±0,4	100,0	-	2,1±0,5	100,0	-	2,7+0,8	25,0	-
BAR BinAK/ RP03-1	1,3±0,6	75,0	-	1,3+0,6	25,0	-	1,3±0,6	37,5	-
BAR BinAR/ RP03-9	1,0±0,5	62,5	-	0,7+0,3	62,5	-	0,7+0,5	37,5	-
Col-0 pTA/ SiR2-2	1,0+0,5	75,0	-	1,2+0,5	50,0	+	0,5±0,0	37,5	-
Col-0 pTA/ SiR2-3	2.0+0,5	87,5	-	5,2±0,8	75,0	+	3,9+0,5	50,0	+
Col-0 pMEX/ SiR2-3	3,0+0,8	50,0	+	5,0±0,6	62,5	+	4,1±0,6	50,0	+
Col-0 pMEX/ SiR2-9	5,4+0,8	75,0	+	4,1±1,8	62,5	+	4,8+0,2	25,0	+

Вивченн явищ ІГР за відноленням гена в-глукуронідази довело неістотне збільшення кількості синіх плям у рослин N1DC4 по.651 pMEX/SIR2 №6 та №9, пророщених на грунтах міст Калуша, Коломиї та Бурштина порівняно з такими у N1DC4 no.651 pMEX/SIR2 №3.

Відмінності в розмірах рекомбінаційних секторів можуть бути маркерами інтенсивності забруднення. Великі сектори відповідають рекомбінаційним явищам, що виникають на ранніх стадіях розвитку рослин, а малі - на пізніх стадіях онтогенезу. Водночас виявлено дві лінії (N1DC4 no.651 pMEX/SIR2 №2 і N1DC4 no.651 pMEX/ SIR2 №4), стійкі до хімічних чинників. Подібну закономірність встановлено при експериментальних дослідженнях генетичних ефектів сполук важких металів.

Таблиця 9

Число рекомбінаційних явищ у різних лініях трансгенних рослин Arabidopsis thaliana в перерахунку на одну рослину (М m)

Зразки ґрунтів	Лінії трансгенних рослин
	NlDC4 no.561 Контрольна	NlUC4no.561 pMEX/SIR2 №2	NlDC4no.561 pMEX/SIR2 №4
Івано-Франківськ №1	12.67 1,9	7,1 0,9*	5,6 0,2*
Івано-Франківськ №2	13,2 1,4	3,7 0,2*	4,7 0,3*
Бурштин №1	15,6 1,5	4,9 1,0*	6,5 0,7*
Бурштин №2	17,3 1,2	8,1 0,7*	5,7 0,5*
Коломия № 1	12.4 1,2	3,8 0,2*	4,8 0,1*
Коломия №2	18,4 1,3	5,7 0,5*	4,9 0,2*
Калуш № 1	12,5 0,9	2,9 0,2*	4,8 0,3*
Калуш №2	11,7 1,0	4,3 0,2*	3,9 0,1*

Примітка *Р<0,001

Таким чином, з 8-ми досліджуваних трансгенних ліній Arabidopsis thaliana відібрано чотири найбільш чутливі до хімічних мутагенів. Це дозволяє використовувати їх для визначення хімічних сполук у питній воді та грунтах з різних екологічних регіонів.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у розробці та селекції нових ліній трансгенних рослин Arabidopsis thaliana та отримано результати, які дозволяють зробити наступні висновки:

1. Отримані лінії ТР Arabidopsis thaliana, чутливі до хімічних чинників, можуть використовуватися як модельний об'єкт, для підвищення ефективності тестування мутагенів довкілля.

2. Встановлено гени, які регулюють структуру хроматину - RPD3, S1R2, SU(VAR) 3-7. Розроблено методичний підхід до створення конструкцій генів RPD3, S1R2, SU(VAR) 3-7 із векторами pMEX, pTA7002, BinAR.

3. Методом агробакгеріальної трансформації отримано 25 ліній ТР Arabidop sis thatiana з генами RPD3, S1R2 та SU(VAR) 3-7, що було підтверджено сегрегаційним методом і Саузерн-аналізом.

4. В експерименті з обробкою проростків трансгенних рослин різними концентраціями MMS, MN, MNU, дексаметазону і мітоміцину С проведено тестування всіх трансгенних ліній Arabidopsis thaliana на чутливість до хімічних мутагенів. Гістохімічним аналізом на реставрацію -глукуронідазного гена виявлено незначне зменшення явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації під впливом MMS, MN, MNU, дексаметазону та підвищену чутливість проростків ТР до мітоміцину С.

5. Проведення експериментів впливу тяжких металів (кадмію, міді, хрому, кобальту, нікелю) на частоту гомологічної рекомбінації підтвердило чутливість 2 транс генних ліній: N1DC4 no.561 pMEX/SiR2 №2, NlDC4 no.561 pMEX/SiR2 №4. За ступенем генетичних ефектів солі тяжких металів складають ряд мутагенної дії: кадмій > кобальт > мідь > хром > нікель.

6. Інкубація проростків ТР із трихостатином А змінює здатність рослинного генома до проникнення Т-ДНК. Проростки, вирощені у середовищі з ТСА, мали підвищену ефективнісгь трансформації, порівняно з контролем, від 23,47 до 37,90 % залежно від лінії Arabidopsis thaliana.

7. При пророщуванні насіння трансгенних рослин ліній. Соl-О BinAR/SIR2-8, Col-0 BinAR/SIR2-7, BAR BinAR/RPD3-1, BAR BinAR/RPD3-9, N1DC4 no.561 pTA/ SiR2-2, NlDC4 no.561 pTA/SiR2-3, NlDC4no.561 pMEX/SiR2-2, N1DC4 no.561 pMEX/ SiR2-4 у зразках грунтів із хімічно забруднених зон (міста Івано-Франківськ, Калуш, Бурштин), встановлено виражені зміни фенотипу та зменшення частоти відновлення GUS гена порівняно з контролем (Верховинський район).

8. У лініях трансгенних рослин N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-2 і N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-4 не виявлено підвищення числа рекомбінаційних явищ під впливом хімічних мутагенів. Вони можуть використовуватися в подальших експериментах по отриманню генетичне модифікованих рослин, стійких до хімічних сполук.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Орел Н.О. Вплив генів-регуляторів хроматинової структури на стабільність рослинного геному // Наукові записки Тернопільського педагогічного інституту. Серія: Біологія. - 2000.-№ 3 (10). - С.31-35.

2. Орел Н.О. Вплив трихостатину А на рівень частоти трансформацій в Arabidopsis thaliana // Наукові записки Тернопільського держ. педінститу. Серія: Біологія. - 2002 -№2(17).-С.85-89.

3. Orel N., Puchta H.. Differences in the processing of DNA ends in Arabidopsis thaliana and tobacco: possible implication for genome evolution// Plant Molecular biology. - 2003. -Vol. 51.- P.523-531. Особистий внесок складає 60%. Він полягає у виділенні і дослідженні ДНК, статистичній обробці даних частоти ІГР, кореляційному аналізі.

4. Orel N., Kink A., Puchta H. Speciel-specifik differences in the repair of double-strand breaks in plants are due to diferences in the processing of DNA ends // 6 Gatersleben Research Conference. Plant Cenetic Resources in the Genomis Era: Genetic Diversity, Genome Evolution and New Applications. - 2002.- March 07 to 11. - S.85. Особистий внесок складає 30%. Він полягає у розробці методики отримання трансгенних ліній рослин, експериментах з класичними мутагенами для вивчення репараційних процесів ДНК.

5. Orel N., Sluchyk V., Sluchyk I. Use of transgenic plants at system of environment ecogenetic monitoring // Conference for students, PhD students and young scientists on molecular biology and genetics. Abstracts book. - Kyiv.- 2001. - September 20-22. - S.I 24. Особистий внесок складає 50%. Він полягає у розробці чутливих до хімічних мутагенів трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana, визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації за кількістю та розподілом синіх плям.

6. Kovalchuk L., Orel N.O., Tdjuk P. Application of the plant-based test-systems for the estimation of the mutagenic background intensivenes // Abstracts 30th Annual Meeting ofEEMS.- Budapest- 2000.-P.81. Особистий внесок складає 30%. Він поляж у отри манні насіння трансгенних ліній рослин, визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації.

7. КовальчукЛ.Є, Случик В.М., Орел Н.О., Телюк П.М„ Шутак B.I., Козовий Р.В. Комплексна рослинна тест-система визначення мутагенів у довкіллі та ризику для здоров'я населення // Довкілля та здоров'я. - 2003. - №2(25). - С.74. Особистий внесок складає 20%. Він полягає у визначенні частоти явищ ІГР ДНК трансгеиних рослин, пророщених на зразках грунтів різних екологічних районів Прикарпаття.

8. Ковальчук Л.Є., Орел Н.О., Ковальчук О.В., Козовий Р.В., Телюк П.М., Кочерга З.Р. Комплексна система оцінки впливу антропогенного забруднення довкілля на спадковий апарат живих організмів // Матер. конф. "Ангропогенно змінене середовище України: Ризики для здоров'я та екологічних систем".- Київ. - 2003. - С.56 Особистий внесок складає 20%. Він полягає у молекулярно-генетичному аналізі трансгенних рослин на виявлення репараційних процесів ДНК.

9. Ковальчук Л.Є., Козовий Р.В. Орел Н.О. Розробка тест-системи для оцінки впливу іонізуючого опромінення на основі трансгенних рослин // Тези III з'їзду з радіаційних досліджень. - Київ. - 2003. - С.41. Особистий внесок складає 20%. Він полягає у визначенні частоти явищ гомологічної рекомбінації ДНК трансгенних рослин, опромінених радіоактивним кобальтом.

10. Ковальчук Л.Є., Орел Н.О. Розробка та використання генетичне модифікованих рослин для оцінки реальних навантажень забруднення довкілля // Матер. наук. -практ-конф. "Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України". - Київ. -2003. - С. 28-30. Особистий внесок складає 50%. Він полягає у проведенні експерименту по впливу на репараційні процеси ДНК трансгенних рослин солей важких металів, визначенню частоти гомологічної рекомбінації у рослин пророщених на зразках грунтів хімічно забруднених територій.

11. Ковальчук Л.Є, Козовьш Р.В., Орел Н.А., Кочерга З.Р. Разработка й внедрение комплексной тест-системы для оценки экогенетических эффектов ионизирующей радиации// Матер. научн.-практ. конф. "Медицинские и экологические зффекты ионизирующего излучения". Северск-Томск. - 2003.-С. 94-%. Особистий внесок складає 20%. Він полягаєу визначенню впливу іонізуючої радіації на репараційні процеси ДНК трансгенних рослин.

Подано Деклараційний патент України на винахід №52183А. МПК А61В10/00 Спосіб тестування антропогенного забруднення довкілля//Л.Є. Ковальчук, Н.О.Орея, Р-В. Козовий. Заявлено 12.03.2003.

АНОТАЦІЇ

Орел Н.О. Розробка транс генних ліній Arabidopsis thaliana чутливих до хімічних мутагенів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15. - генетика. - Інститут гігієни та медичної екологін ім. О.М. Марзеєва АМН України, Киів, 2003.

Розроблено методологію отримання 25 трансгенних ліній рослин Arabidopsis thaliana з генами RPD3, SIR2, SU(VAR) 3-7, які регулюють структуру хроматину. Створено конструкції цих генів із векторами pMEX, pTA7002, BinAR. Досліджено чутливість трансгенних ліній до різних концентрацій хімічних мутагенів. Гістохімічним аналізом на реставрацію -глукуронідазного гена виявлено незначне зменшення явищ інтрахромосомної гомологічної рекомбінації під впливом MMS, MN, МNU, дексаме-тазону та підвищену чутливість проростків ТР до мітоміцину С. Встановлено, що солі тяжких металів впливають на репаративні процеси ДНК 2 трансгенних ліній: N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-2, N1DC4 no.561 pMEX/SiR2-4. За ступенем генетичних ефектів солі тяжких металів складають ряд за активністю мутагенної дії: кадмій > кобальт > мідь > хром > нікель. Доведено, що трихостатином А підвищену ефективність трансформації залежно від лінії Arabidopsis thaliana.

Обґрунтовано використання отриманих ліній ТР, чутливих до хімічних чинників, як модельного об'єкта, для підвищення ефективності тестування мутагенів довкілля.

Ключові слова: трансгенні рослини Arabidopsis thaliana, гени-регулятори структури хроматину, гомологічна рекомбінація, хімічні мутагени.



Орел НА. Разработка трансгенных линий Arabidopsis thaliana чувствитепьных к химическим мутагенам. - Рукопись.