Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК: 615.361.014.41: 611.018.46+611.013.68

ВИВЧЕННЯ ПРОЦЕСІВ, ЩО ВІДБУВАЮТЬСЯ НА РІЗНИХ ЕТАПАХ НИЗЬКОТЕМПЕРАТУРНОГО КОНСЕРВУВАННЯ В СУСПЕНЗІЯХ ЯДЕРНИХ КЛІТИН КІСТКОВОГО МОЗКУ І КОРДОВОЇ КРОВІ

03.00.19 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Холодний Віталій Сергійович

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Розанов Леонід Федорович,Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківська зооветеринарна академія, завідувач кафедри хімії та біохімії, м. Харків

кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович, Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, доцент кафедри біологічної і медичної фізики, м. Харків

Провідна установа Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, відділ медичної біофізики, м. Київ

Захист відбудеться 20.05.2003 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Автореферат розісланий 19.04.2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професорГольцев А.М.

масоперенос кістковий кордовий кріопошкодження

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Трансплантація гемопоетичних клітин застосовується в терапії захворювань різного походження, що призводять до порушень кровотворної системи, імунологічного статусу та ін. [Guillaume T., 2000; Gratwohl A., 2001; Vormoor J, 2002; Грищенко В.И., 2002]. Джерелами таких клітин разом з кістковим мозком і периферичною кров'ю є також ембріональна печінка і кордова кров [Broxmeyer H., 1995; Грищенко В.И., 1988]. Для забезпечення клінічних установ цим трансплантаційним матеріалом необхідне створення його запасу на основі низькотемпературного зберігання [Грищенко В.И., 1988; Sputtek A., 1991; Woods E.J., 2000].

Перспективи клінічного застосування ядерних клітин кордової крові пов'язані з розробкою ефективних і надійних методів їх кріоконсервування. На певних етапах розробки таких методів не виключене використання більш доступного і менш коштовного матеріалу - кісткового мозку лабораторних тварин. Однак адекватність такої експериментальної моделі повинна бути обґрунтована хоча б подібною динамікою процесів масообміну клітин кордової крові людини і кісткового мозку миші на основних етапах кріоконсервування.

Більшість відомих на сьогодні методів кріоконсервування ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові [Sputtek A., 1991; Aird W., 1992; Rowley D., 1992; Rubinstein P., 1995; Donaldson C., 1996] базується на емпіричному підході, використанні інтуїтивних уявлень про шляхи оптимізації умов кріоконсервування. Такий підхід деякою мірою вирішує проблему, але залишає багато невирішених питань, пов'язаних із визначенням припустимих меж варіювання умов кріоконсервування і подальшою оптимізацією методів з урахуванням впливу змін, що відбуваються на попередніх етапах кріоконсервування, на характеристики наступних етапів.

Основою пошуку оптимальних методичних рішень при розробці методів кріоконсервування ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові може стати експериментально-теоретичний підхід, спрямований на оптимізацію процесів масообміну в системі “клітина-навколишнє середовище” у циклі кріоконсервування. Однак застосування такого підходу, який грунтується на модифікованій фізико-математичній моделі Кедем-Качальського [Гордиенко Е.А., 1994], вимагає конкретизації даних про склад поза- і внутрішньоклітинного середовища, проникності й морфометричних параметрів клітин. Ефективність цього підходу багато в чому залежить також від припустимих меж варіювання кінетичних параметрів. Ці межі обумовлені стійкістю клітин до дії основних факторів кріопошкодження.

Актуальність обраного напрямку роботи визначається тим, що вивчення процесів масообміну в суспензіях клітин кісткового мозку й кордової крові на основних етапах кріоконсервування і визначення параметрів, які використовуються у теоретичному моделюванні, є найважливішою підставою прогнозування збереженості цих клітин у циклі кріоконсервування. Важливість досліджень процесів масообміну також визначається тим, що саме ці процеси є причиною пошкодження клітинних структур на різних етапах низькотемпературного консервування, включаючи підготовку до заморожування, власне заморожування, відтавання й підготовку клітинних суспензій до подальшого використання [Mazur P., 1971; Гордиенко Е.А., 1994; Розанов Л.Ф., 1996; Gao D., 2000].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України у відділі низькотемпературного консервування в рамках тем “Побудова і експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біооб'єктів” № державної реєстрації 0201U005144, та “Експериментальне вивчення і кількісне моделювання процесів, що відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних об'єктів”, № державної реєстрації 0101U003479.

Мета і задачі дослідження Метою дослідження є аналіз процесів масопереносу в суспензіях клітин кісткового мозку й кордової крові на основних етапах кріоконсервування в присутності гліцерину, ДМСО і 1,2-пропандіолу, й оцінка стійкості клітин до фізико-хімічних факторів кріопошкодження.

Для досягнення мети були вирішені наступні задачі:

Експериментально вивчити осмотичну поведінку ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові в розчинах гліцерину, ДМСО, 1,2_пропандіолу, NaCl і визначити на основі даних про кінетику зміни клітинного об'єму (з використанням модифікованої фізико-математичної моделі Кедем-Качальського) коефіцієнти проникності цих клітин для молекул води і кріопротекторів, а також швидкість їх насичення кріопротекторами.

У роботі використовувалися ядерні клітини кісткового мозку миші й кордової крові людини. Клітини кісткового мозку одержували зі стегнових кісток вимиванням розчином “199”; ядерні клітини кордової крові виділяли з цільної крові з глюкозо-цитратним розчином шляхом прискореного осадження еритроцитів у розчині на основі желатину [Perutelli P., 2000; Калініченко Т.О., 1999; з модифікаціями].

Осмотичну реакцію клітин досліджували за допомогою світлової мікроскопії й подальшого аналізу фотографічних зображень клітин. Для вивчення осмотичної реакції клітин на етапі ізотермічної експозиції використовували розчини NaCl, ДМСО, 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) і гліцерину. При вивченні осмотичної поведінки клітин на етапі видалення з них кріопротекторів клітини після експозиції в розчинах згаданих кріопротекторів переносили у фізіологічний розчин, у 0,5 М розчин відповідного кріопротектора з 0,15 М NaCl, а також у 0,5 М розчин NaCl.

Параметри проникності визначали за допомогою модифікованої моделі Кедем-Качальського [Гордиенко Е.А., 1994]. Для розрахунків використовували клітини діаметром 8-10 мкм, популяція яких включає лимфоцитоподібні клітини та нормобласти.

Дослідження процесів заморожування-відтавання клітинних суспензій проводили методом кріомікроскопії [Розанов Л.Ф., 1996].

Оцінку морфофункціонального стану клітин після їх перебування в середовищах різної осмолярності здійснювали за суправітальним фарбуванням трипановим синім, а також даними про кількисний та клітинний склад суспензії ядерних клітин (на мазках пофарбованих азур-II-еозином) та оцінкою функціональної активності клітин: адгезивною здатністю, фагоцитарною активністю.

Отримані результати оброблені статистично за методом Стьюдента-Фішера.

Результати досліджень та їх обговорення

Осмотичні реакції і процеси масопереносу в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові в розчинах проникаючих кріопротекторів і хлористого натрію. Осмотичні явища, пов'язані з переносом різних речовин крізь вибірково проникну мембрану, роблять значний внесок в ушкодження клітин та їх кріозахист протягом циклу низькотемпературного консервування [Гордиенко Е.А., 1994, MacGrath J., 1997, Gao D., 2000]. Так, на етапі підготовки до заморожування клітини зазвичай переносяться з ізотонічного середовища в гіпертонічне при ізотермічних умовах.

Осмотична поведінка клітин у розчинах проникаючих кріопротекторів несе інформацію про проникність клітинних мембран для молекул води і кріопротектор, а також про можливі порушення їх бар'єрно-транспортних властивостей до іонів. Типова залежність об'єму клітини, вміщеної в розчин проникаючого кріопротектора, що містить ізотонічну концентрацію непроникаючої позаклітинної речовини, показана на рис.1. Після різкого зменшення об'єм клітини поступово повертається до початкового рівня. Така динаміка пояснюється значно меншою швидкістю проникнення кріопротектора крізь клітинну мембрану в порівнянні з водою. У результаті перерозподілу речовин між клітиною та оточуючим її розчином порушена кріопротектором осмотична рівновага відновлюється, насамперед, за рахунок швидкого виходу води з клітини. Надходження кріопротектора в клітину, рушійною силою якого є градієнт концентрації речовини на плазматичній мембрані, викликає спряжений транспорт води, що поступово відновлює об'єм клітини до початкового значення.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Експериментальні (показані колами) й теоретичні (суцільна лінія) залежності відносного об'єму клітин кісткового мозку миші від часу за оптимальним підбором параметрів проникності плазматичної мембрани при експозиції клітин у 1М розчині ДМСО (18єС).

Спостереження показали, що в розчинах гліцерину з концентрацією вище 0,75 М (з 0,15 M NaCl) і в розчинах ДМСО і 1,2-ПД із концентраціями вище 1 М (з 0,15 M NaCl) фаза регідратації клітин кісткового мозку досить часто завершувалася їх масовим набряканням. У розчинах 1 М ДМСО, 1,2-ПД і 0,75 М гліцерину кількість набряклих клітин, як правило, не перевищувала 5%. Підвищення концентрації кріопротекторів вище за ці значення призводило до зростання кількості клітин з надмірно збільшеним об'ємом: при концентрації 1,5 М ДМСО, 1,2-ПД і 1 М гліцерину - до 30%, у випадку 2 М ДМСО, 1,2-ПД і 1,5 М гліцерину - до 50%. Суправітальне забарвлення трипановим синім, навпаки, не виявило статистично вірогідних розходжень між цими випадками, що свідчить про те, що пошкодження плазматичної мембрани після набрякання репаруються і барвник не проникає в клітини.

Після вміщення клітин як кордової крові, так і кісткового мозку в 1 М розчини ДМСО, 1,2-ПД і 0,75 М гліцерину їх об'єм зменшується за рахунок зневоднення в перші 15-20 секунд експозиції. Після цього в розчинах ДМСО і 1,2_ПД реєструється збільшення об'єму клітин до початкових значень. У розчинах гліцерину обраного часу експозиції (600 с) для повного відновлення об'єму клітин не завжди було достатньо. Час регідратації був різним для різних кріопротекторів і клітин з різних джерел. Найшвидше об'єм відновлювався в клітинах кордової крові в розчині 1,2-ПД (близько 110 с). В клітинах кісткового мозку миші в розчині 1,2-ПД цей час становив близько 140 с, для клітин кордової крові в розчині ДМСО - 180 с, кісткового мозку в розчині ДМСО - 230 с, кордової крові в розчині гліцерину - 500 с і кісткового мозку в розчині гліцерину - 630 с. Динаміка об'ємних змін клітин кісткового мозку миші і клітин кордової крові людини відрізнялася незначно. Клітини кісткового мозку миші відновлювали свій об'єм трохи повільніше, ніж клітини кордової крові людини.

Коефіцієнт фільтрації й коефіцієнт проникності плазматичної мембрани разом з осмотично неактивним об'ємом, коефіцієнтом відбивання і поверхнево - об'ємним відношенням клітин містяться як феноменологічні коефіцієнти у модифікованій моделі Кедем-Качальського, яка пов'язує зміни об'єму клітини з потоками речовин крізь мембрану [Гордиенко Е.А., 1994]. З використанням цієї моделі були визначені параметри проникності плазматичних мембран ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини. На рис.1 представлений результат підбору коефіцієнтів проникності для клітин кісткового мозку миші в розчині 1 М ДМСО, при зіставленні теоретичної залежності відносного об'єму клітин від часу експозиції в середовищі (показана суцільною лінією) з експериментальними значеннями (показані колами). Видно, що теоретична крива добре відбиває характер експериментальної залежності.

Теоретичні залежності відносного об'єму від часу експозиції в розчинах проникаючого кріопротектора були отримані при підборі таких значень транспортних параметрів мембрани, при яких теоретичні криві найкращим чином описують експериментальні дані. У результаті було одержано коефіцієнти проникності для кожного з трьох зазначених кріопротекторів і коефіцієнти фільтрації плазматичної мембрани в присутності кріопротектора, а також за його відсутності (табл. 1).

Таблиця 1. Коефіцієнти проникності плазматичних мембран для води L_p і кріопротекторів K_s ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини

Примітки: ¹ - p>0,05 при порівнянні з проникністю для води плазматичних мембран відповідних клітин за відсутності кріопротектора; ² - p<0,05 при порівнянні між собою коефіцієнтів проникності плазматичних мембран відповідних клітин для кріопротекторів.

Видно, що водна провідність вірогідно не залежить від типу кріопротектора як для клітин кісткового мозку миші, так і для клітин кордової крові людини. Крім того, не спостерігається вірогідних розходжень і при порівнянні коефіцієнта фільтрації в присутності кріопротекторів і за його відсутності. Вивчені кріопротектори утворюють наступний ряд за зменшенням проникності: 1,2_пропадіол > ДМСО > гліцерин. Таке співвідношення спостерігається також і для клітин інших типів, зокрема, еритроцитів людини [Панина Ю.Е., 1998; Woods E.J., 2000], сперматозоїдів бика [Chaveiro A.E.N., 2001].

Таким чином, у результаті експериментального й фізико-математичного моделювання процесів масообміну клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини з оточуючим їх середовищем на етапі введення в клітинні суспензії кріопротекторів визначено основні параметри, що характеризують проникність плазматичних мембран цих клітин для молекул води й речовин, які найчастіше застосовуються як проникаючі у клітини кріопротектори (гліцерин, ДМСО і 1,2_ПД). Показано, що проникність мембран клітин кордової крові трохи вища, ніж проникність мембран клітин кісткового мозку. Знайдені розходження невеликі, що свідчить на користь можливості використання клітин кісткового мозку експериментальних тварин як моделі на етапах попереднього відпрацьовування регламентів кріоконсервування кордової крові. Знайдені значення коефіцієнтів проникності, значення осмотично неактивних об'ємів і поверхнево-об'ємних відношень можуть бути використані для прогнозування різних кріобіологічних ситуацій на різних етапах кріоконсервування. Отримані дані про стійкість клітин кісткового мозку й кордової крові до гіпертонічного стресу, а також терміни насичення клітин кріопротекторами можуть бути використані при розробці спрощених процедур еквілібрації, що підвищить надійність методів кріоконсервування.

Осмотичні реакції та процеси масопереносу в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові на етапі видалення з них кріопротекторів. Одним з найважливіших етапів, які визначають збереженість клітин при низькотемпературному консервуванні і якість трансплантату, є видалення кріопротектора з клітин після їх розморожування. Залежності, отримані в результаті волюмометричного аналізу клітин після їх переносу в середовище з меншою тоничністю, ніж середовище кріоконсервування, подані на рис. 2 (для випадку переносу клітин з розчину ДМСО). При переносі клітин з 1 М розчину кріопротектора у фізіологічний розчин (дані показані незаштрихованими колами на рис. 2) об'єм клітин зростає до 190% від початкового значення і потім поступово повертається до первісного об'єму. За таких умов набрякання великої кількості клітин було необоротним, що свідчить про порушення проникності клітинних мембран для в нормі не проникаючих позаклітинних речовин, що виникає на етапі видалення кріопротекторів із клітин. Швидкість відновлення об'єму була різною у випадку різних кріопротекторів. Найвидше об'єм відновлюють клітини, експоновані в розчині 1,2-ПД. Повільніше відновлювався об'єм клітин, що відмиваються від ДМСО і ще повільніше - від гліцерину. Спостерігається також розходження між швидкістю відновлення об'єму для клітин кісткового мозку й кордової крові: клітини кордової крові відновлюють свій об'єм трохи швидше. При переносі клітин з 1М розчину кріопротектора в 0,5 М розчин того ж кріопротектора (дані показані заштрихованими колами на рис. 2) збільшення об'єму було значно меншим, ніж у першому випадку і не перевищувало рівня 120% від початкового. Таке розходження в зміні об'єму пояснює, чому при двоетапному відмиванні клітин від кріопротектора (1>0,5>0 М кріопротектора) їх збереженість є значно вищою, ніж при одноетапному [Rubinstein P., 1995]. Плазматична мембрана може пошкоджуватися при переносі клітин із середовища з великим осмотичним тиском у середовище зі значно меншим осмотичним тиском у результаті її надмірного натягу. При багатоступінчастій зміні тонічності збільшення об'єму не настільки вагоме і клітинна мембрана зазнає меншого ізотропного натягу. При використанні 0,5 М NaCl як середовища відмивання (дані показані квадратами на рис.2) ніякого збільшення об'єму клітин не відзначено.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Порівняння показників проникності, визначених на етапі відмивання клітин від кріопротекторів з коефіцієнтами, визначеними нами для ядерних клітин кордової крові й кісткового мозку на етапі еквілібрації клітин у гіпертонічних розчинах кріопротекторів, показує, що статистично вірогідної різниці між ними немає.

Таким чином, у результаті проведених досліджень осмотичної поведінки ядерних клітин кордової крові й кісткового мозку на етапі видалення проникаючих кріопротекторів із клітин встановлено, що перенесення клітин, які містять гліцерин, ДМСО і 1,2-ПД у 1 М концентрації, у фізіологічний розчин супроводжується майже дворазовим збільшенням клітинного об'єму, а перенесення у 0,5 М розчин кріопротектора, що містить фізіологічну концентрацію хлориду натрію, призводить до збільшення об'єму клітин, які відмиваються, приблизно на 20%. Використання 0,5 М хлориду натрію як середовища відмивання цілком виключає набрякання клітин, призводячи до поступового зменшення об'єму клітин до рівня, зумовленого концентрацією солі в розчині відмивання. За присутності гліцерину термін перебування клітин у набряклому стані значно перевищує термін “оборотного набрякання” клітин, що відмиваються від ДМСО і 1,2-ПД. Тривалість набрякання є важливим чинником, що визначає рівень деструкції кріоконсервованих клітин. Експерименти показують, що процеси масообміну клітин з оточуючим середовищем на етапах введення й видалення кріопротекторів характеризуються тими самими коефіцієнтами проникності.

Моделювання процесів заморожування-відтавання суспензій клітин кісткового мозку миші методом кріомікроскопії. Кріомікроскопія залишається дотепер єдиним методом, що дозволяє візуалізувати процеси, які протікають у клітинних суспензіях на етапах заморожування й відтавання.

Моделювання процесів заморожування-відтавання суспензій незахищених клітин кісткового мозку показало, що 1) за відсутності істотного початкового переохолодження позаклітинного розчину клітини кісткового мозку миші встигають зневоднитися до рівня мінімального об'єму при швидкостях охолодження, що не перевищують 10 град/хв на першому етапі двоступеневої програми заморожування, 2) ушкодження клітин у процесі заморожування-відтавання виникає не тільки під дією дегідратації і внутрішньоклітинної кристалізації, 3) відсутність набрякання клітин після швидкого заморожування є наслідком більш серйозних деструктивних змін, ніж порушення бар'єрних властивостей клітинної мембрани для позаклітинного розчину.

Проведені кріомікроскопічні дослідження показали, що в діапазоні швидкостей охолодження від 1 до 10 градусів за хвилину істотним фактором, що впливає на збереженість заморожених - відігрітих клітин, є переохолодження клітинної суспензії до початку кристалізації. Збільшення позаклітинного переохолодження до початку кристалізації підвищує швидкість замерзання позаклітинного розчину і внутрішньоклітинне переохолодження, яке, у свою чергу, призводить до внутрішньоклітинного кристалоутворення. Основною перевагою ДМСО перед гліцерином і 1.2-ПД є менший рівень початкового переохолодження в суспензіях клітин кісткового мозку, що містять ДМСО. Незважаючи на присутність внутрішньоклітинного льоду в суспензії при візуальній оцінці, ступінь деструктивних змін клітин під захистом кріопротекторів виявляється досить низькою. Показано, що динаміка розвитку ушкоджень після заморожування-відтавання включає поряд з набряканням також знебарвлення клітин, що, імовірно, є наслідком більш грубих порушень мембранної проникності, ніж набрякання.

Вплив розчинів різної осмолярності на збереженість, морфологічний склад і функціональну активність клітин кісткового мозку. Шляхом моделювання зміни об'єму клітин у розчинах різної осмолярності в роботі були проведені дослідження можливих границь зміни об'єму, що не призводять до різкого падіння життєздатності клітин. На рис.3 показана залежність збереженості клітин кісткового мозку миші від осмолярності позаклітинного середовища і, відповідно, об'єму клітин. Установлено, що існує певний діапазон змін осмолярності (200-600 мОсм), де збереженість клітин змінюється у припустимих межах (на 5-10%). Клітини, витримані в розчинах, що мають осмолярність від 200 до 600 мОсм, морфологічно не відрізняються від клітин, що знаходилися в ізотонічному розчині. У розчинах поза цим діапазоном клітини зазнають різних морфологічних змін.

Рис. 3. Збереженість ядерних клітин кісткового мозку після експозиції в розчинах NaCl різної осмолярності.

Для дослідження фунціональних параметрів ядерних клітин було обрано адгезивну властивість та фагоцитарну активність.

Було встановлено, що осмолярність вірогідно не змінює рівень молекул адгезії на клітинах кісткового мозку при експозиції їх у вивченому діапазоні осмолярностей.

При вивченні фагоцитарної активності було встановлено, що не зважаючи на зміни, які відбуваються в структурі фагоцитуючих клітин, їх здатність до поглинання чужорідних часток зберігається на рівні ізотонічного контролю, вірогідно знижуючись тільки після експозиції клітин в розчині з осмолярністю 2400 мОсм/кг.

Переведення значень осмолярності розчинів, в яких експонувалися клітини, до відповідних значень клітинного об'єму показало, що припустимими (тобто такими, що не призводять до значного падіння збереженості клітин) є зменшення об'єму до 60% і збільшення до 120% від вихідного значення.

Оптимізація умов масообміну клітин із навколишнім середовищем на етапах введення і видалення кріозахисних речовин, а також заморожування і відтавання, є основним результатом процедур, спрямованих на розробку методів кріоконсервування біологічних суспензій. Отримані в роботі дані про транспортні характеристики клітин кісткового мозку й кордової крові, а також особливості осмотичної реакції клітин на різних етапах циклу низькотемпературного консервування можуть бути використані надалі для оптимізації умов кріоконсервування цих клітин і прогнозування його результатів.

ВИСНОВКИ

Вивчення процесів масообміну в суспензіях клітин на основних етапах кріоконсервування й оцінка стійкості клітин до фізико-хімічних факторів кріопошкодження є підставою прогнозування процесу збереженості цих клітин у циклі низькотемпературного консервування. У дисертації проведене комплексне дослідження і теоретичне узагальнення явищ, що супроводжують низькотемпературне консервування ядерних клітин кісткового мозку кордової крові в присутності гліцерину, диметилсульфоксиду та 1,2_пропандіолу. Визначено біофізичні параметри, що описують ці явища, і проведено оцінку стійкості клітин до дії фізико-хімічних факторів кріопошкодження.

Методом волюмометрії з використанням модифікованої фізико-математичної моделі Кедем-Качальського визначено коефіцієнти проникності ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини для молекул води, гліцерину, диметилсульфоксиду і 1,2-пропандіолу. Проникність плазматичних мембран для води не залежить від присутності цих кріопротекторів у розчині. Вивчені кріопротектори створюють наступний ряд за зростанням проникності крізь мембрани ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові: гліцериндиметилсульфоксид1,2-пропандіол. Коефіцієнти проникності клітин кісткового мозку і кордової крові не залежать від напрямку трансмембранного потоку води або кріопротектора.

Значення коефіцієнтів проникності і характер об'ємних змін на етапах низькотемпературного консервування для кордової крові людини і кісткового мозку миші відрізняються незначно, що може бути підставою для використання кісткового мозку миші як моделі на етапах оптимізації методів кріоконсервування кордової крові людини.

Клітини кісткового мозку й кордової крові є стійкими до осмотичних впливів, що призводять до змін їх об'єму в діапазоні 60-125% від значення в ізотонічних умовах, та добре переносять зміни об'єму, пов'язані з одноступеневим додаванням до клітинної суспензії кріопротекторів у концентраціях 1 М для диметилсульфоксіду, 1,2-пропандиолу та 0,75 М для гліцерину.

Характерними ознаками пошкодження клітин після дегідратації є вакуолізація цитоплазми, поява трансмембранних дефектів і набрякання клітин. У випадку незахищених клітин внутрішньоклітинна кристалізація призводить до розривів мембран і втрати вмісту клітин. Присутність кріопротекторів знижує ступінь виразності цих пошкоджень. Запобігання внутрішньоклітинному кристалоутворенню шляхом зниження рівня позаклітинного переохолодження в захищених кріопротектором суспензіях є необхідним для забезпечення високого рівня збереженості клітин.

Збільшення об'єму клітин вище за початкові значення на етапі одноступеневого видалення кріопротекторів не завжди призводить до негайного порушення бар'єрних властивостей мембран у відношенні позаклітинних солей, про що свідчить динаміка осмотичної поведінки клітин на цьому етапі. Перевагою двоступеневого видалення кріопротекторів із клітинної суспензії є запобігання надмірному збільшенню об'єму, що при цьому не перевищує 125% від первісного значення (на відміну від 170-200% при одноступеневому видаленні кріопротектора). Використання гіпертонічної концентрації непроникаючої до клітин речовини в середовищі при видмиванні дозволяє повністю запобігти збільшенню клітинного об'єму.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Холодный В.С. Осмотическое поведение и транспортные характеристики плазматических мембран ядросодержащих клеток кордовой крови человека в гипертонических растворах проникающих криопротекторов // Пробл. криобиологии.- 2002, N1.- C.120-122.

2. Kholodnyy V.S., Rozanov L.F. Measurement of the permeability of plasma membrane of murine bone marrow cells to water and cryoprotectants // Вісн. Харк. ун-ту, №560. Біофізичний вісник.- 2002.- Вип. 1(10).- С. 73-77. (дисертантом проведене експериментальне вивчення осмотичної поведінки ядерних клітин кісткового мозку миші в розчинах хлориду натрію, ДМСО, 1,2-пропандиолу і гліцерину, на основі фізико-математичного моделювання осмотичних процесів визначено осмотично неактивний об'єм клітин, параметри проникності плазматичних мембран для води і кріопротекторів, статистична обробка та аналіз результатів).

3. Холодный В.С., Розанов Л.Ф. Кинетика осмотических реакций ядросодержащих клеток костного мозга мыши и кордовой крови человека на этапе удаления из них проникающего криопротектора // Пробл. криобиологии.- 2002, №3.- С. 24-29. (дисертантом проведене вивчення осмотичних процесів, що відбуваються в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку миші й кордової крові людини при видаленні з них проникаючих кріопротекторів ДМСО, 1,2-пропандіолу і гліцерину, статистична обробка та аналіз результатів)

4. Останкова Л.В., Холодный В.С. Толерантность клеток костного мозга к действию осмотического стресса // Пробл. криобиологии.- 2002, №4.- С. 3-7. (дисертантом проведене вивчення впливу змін об'єму клітин кісткового мозку, викликаних експозицією клітинних суспензій у розчинах непроникаючої речовини різної осмолярності на кількісний та якісний склад суспензій, адгезівну здатність та фагоцитарну активність, статистична обробка та аналіз результатів)

5. Розанов Л.Ф., Смольянинова Е.И., Холодный В.С. Осмотическое поведение эмбрионов и клеток костного мозга мыши в растворах криопротекторов // Пробл. криобиологии.- 2001.- N3.- C.19-20.

6. Kholodnyy V.S., Rozanov L.F. Peculiarities in the Osmotic Behaviour of Murine Bone Marrow Cells during Addition and Removal of Cryoprotectant Solutions // Cryobiology.- 2001.- Vol.43, N4.- P. 386-387.

АНОТАЦІЯ

Холодний В.С. “Вивчення процесів, що відбуваються на різних етапах низькотемпературного консервування в суспензіях ядерних клітин кісткового мозку й кордової крові”.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003.

Дисертація присвячена вивченню процесів масообміну клітин кісткового мозку й кордової крові з оточуючим середовищем на основних етапах кріоконсервування і визначенню зв'язку цих процесів із пошкодженням клітин унаслідок дії основних факторів кріопошкодження: внутрішньоклітинної кристалізації, дегідратації та регідратації.

За допомогою методів світлової мікроскопії, фізико-математичного моделювання, кріомікроскопії встановлено особливості осмотичної поведінки клітин кісткового мозку миші та кордової крові людини на всіх основних етапах кріоконсервування (експозиція клітин у кріозахисному середовищі, охолодження, заморожування та відтавання, видалення кріопротектора з клітин). Встановлено параметри, що визначають процеси масопереносу води та кріопротекторів ДМСО, 1,2 - пропадіолу, гліцерину в системі “клітина - оточуюче середовище”, що зумовлюють кріозахист та кріопошкодження. З використанням методів суправітального прокрашування, аналізу кількісного та якісного складу клітинних суспензій, адгезивної здатності та фагоцитарної активності встановлено припустимі межі зміни об'єму клітин, що не призводять до падіння їх життєздатності.

Ключові слова: клітини кісткового мозку, клітини кордової крові, кріоконсервування, ДМСО, 1,2-пропандіол, гліцерин, осмотична реакція, процеси масопереносу, мікроскопія, фізико-математичне моделювання, кріомікроскопія.

АННОТАЦИЯ

Холодный В.С. “Изучение процессов, происходящих на различных этапах низкотемпературного консервирования в суспензиях ядросодержащих клеток костного мозга и кордовой крови”.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2003.

Диссертация посвящена изучению процессов массообмена клеток костного мозга и кордовой крови с окружающей средой на основных этапах криоконсервирования и определению связи этих процессов с повреждением клеток из-за действия основных факторов криоповреждения: внутриклеточной кристаллизации, дегидратации и регидратации.

С помощью методов световой микроскопии, физико-математического моделирования, криомикроскопии установлены особенности осмотического поведения ядросодержащих клеток костного мозга мыши и кордовой крови человека на всех основных этапах криоконсервирования (экспозиция клеток в криозащитной среде, охлаждение, замораживание и оттаивание, удаление криопротектора из клеток). Найдены параметры, определяющие процессы массопереноса воды и криопротекторов ДМСО, 1,2-пропандиола и глицерина в системе “клетка - окружающая среда”, обуславливающие криозащиту и криоповреждение. С использованием методов суправитального окрашивания, анализа количественного и качественного состава клеточных суспензий, адгезивной способности и фагоцитарной активности определены допустимые границы изменения объема клеток, не приводящие к существенному падению жизнеспособности

Ключевые слова: клетки костного мозга, клетки кордовой крови, криоконсервирование, ДМСО, 1,2-пропандиол, глицерин, осмотическая реакция, процессы массопереноса, микроскопия, физико-математическое моделирование, криомикроскопия.

ANNOTATION

Kholodnyy V.S. “Investigation of processes, occurring on various stages of low temperature preservation in the suspensions of nucleated cells of bone marrow and cord blood”.- Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of the Candidate of Biological Sciences on the specialty 03.00.19. - cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 2003.

The thesis is devoted to the studying of the processes of mass exchange of the cells of bone marrow and cord blood with an environment at the main stages of cryopreserevation and the determining of the relationship of these processes with the damage of cells due to the effect of basic cryodamage factors: intracellular crystallization, dehydration and rehydration.

Using the methods of light microscopy, physical and mathematical modeling, and cryomicroscopy there were established the peculiarities in osmotic behaviour of the nucleated cells of murine bone marrow and human cord blood at all main stages of cryopreservation (exposure of cells in cryoprotective medium, cooling, freeze-thawing, and removal of cryoprotectant out of cells). There were found the stipulating cryoprotection and cryodamage parameters, determining the processes of mass transfer for water and commonly used cryoprotectants (DMSO, 1,2- propane diol, glycerol) in the “cell-environment” system. Using the methods of supravital staining, analysis of qualitative and quantitative composition of cellular suspension, adhesive ability and phagocyte activity there were determined the admissible limits of the change in cell volume which do not result in a significant reduction in viability.

It is established that plasma membrane permeability to water does not depend on the appearance of the above stated cryoprotectants in the solution. The studied cryoprotectants formed the following row for increase in its permeability through membranes of nucleated cells of bone marrow and cord blood: glyceroldimethyl sulfoxide1,2_propane diol. These permeability coefficients do not depend on the orientation of the transmembrane flow of water and cryoprotectants.

Bone marrow and cord blood cells are resistant to osmotic effects, leading to the changes in its volume within the range of 60-120% in respect of the value under isotonic conditions. They survive well the volume changes, resulted from one-step dilution with dimethyl sulfoxide and 1,2-propane diol down to the final concentration of 1 M, and glycerol down to that of 0,75 M.

Characteristic indices of cells' damaging after dehydration are the cytoplasm vacuolisation, appearance of transmembrane defects and cell swelling. In the case of unprotected cells the intracellular crystallisation leads to membranes ruptures and the loss of cell content. The presence of cryoprotectants diminishes the manifestation rate of these damages. The preventing of intracellular crystal formation by means of decrease in the level of extracellular overcooling in the cryoprotected suspensions is essential for a high rate of cell integrity.

Cell volume increase over the initial values at the stage of one-step washing of cryoprotectant does not always lead to a immediate damage of membrane barrier functions for extracellular solutes. The advantage of the two-step cryoprotectant washing out of cell suspension is the extra-increase of the volume, which in this case dos not exceed 125% of initial value (in contrast to 170-200% at one-step removal of cryoprotectant). The usage of hypertonic concentration of non-penetrating to a cell substance in the washing-out medium allows a complete prevention of cell volume increase.

Key words: bone marrow cells, cord blood cells, cryopreservation, DMSO, 1,2_propane diol, glycerol, osmotic response, mass transfer processes, microscopy, physical and mathematical modeling, cryomicroscopy

Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук

Підписано до друку 15.04.2003 р. Формат 60х90 1/16

Наклад 100 прим. Авт. арк. 0.9. Замовлення №

Надруковано в МПП „Райдер”, м. Харків, вул. Артема, 4,

тел.: 431757

Размещено на Allbest.ru