Методи дослідження крові риб

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет

Кафедра загальної біології та водних біоресурсiв

Напрям підготовки 6.040102 - Біологія

КУРСОВА РОБОТА

на тему:

Методи дослідження крові риб

2013 р.



Зміст

Вступ

1. Взяття крові

2. Готування і фарбування мазків крові

3. Визначення вмісту гемоглобіну

4. Визначення гематокритноi величини

5. Визначення білка в сироватці крові

6. Визначення числа еритроцитів пробірковим методом в камері Горяєва

7. Визначення середнього вмісту гемоглобіну в еритроциті (СГЕ)

8. Визначення середнього обсягу еритроцитів

9. Визначення швидкості осідання еритроцитів (СОЕ)

10. Оцінка еритроцитарної картини крові риб

11. Визначення загального числа лейкоцитів

12. Виведення лейкоцитарної формули

13. Визначення метгемоглобіну

14. Визначення холестерину за методом Маркоса і Товарека

15. Визначення ліпідів в сироватці крові. Фарбування по Свану

Перелiк посилань



Вступ

Необхідною умовою успішного ведення інтенсивного рибництва і відтворення цінних видів риб є ретельний контроль за фізіологічним станом об'єктів вирощування. Кров, як найбільш лабільна тканина, швидко реагує на дію різних факторів і призводить до відновлення рівноваги між організмом і середовищем. Тому для ранньої діагностики захворювання, у тому числі і незаразних, поряд з паразитологiчними, мікробіологічними та вірусологічними дослідженнями важливе значення має аналіз крові.

У рибництві при гематологічному дослідженні прийнято визначати такі показники крові:

- кількість гемоглобіну,

- величину гематокритного числа,

- зміст загального білка в сироватці крові,

- кількість еритроцитів,

- вміст гемоглобіну в еритроциті,

- середній об'єм еритроцитів,

- швидкість осідання еритроцитів,

- кількість лейкоцитів,

- лейкоцитарну формулу,

- кількість метгемоглобіну.



1. Взяття крові

Устаткування і реактиви:

- шприц з ін'єкційними голками - стерильні,

- пастерiвскi піпетки - стерильні,

- годинне скло,

-5% розчин натрію цитрату або 0,2% розчин гепарину (1.000 ОД/мл),

- анестстики,

- спирт,

- марля, вата.

Матеріал для дослідження, хід роботи

Кров беруть у голодної риби, витриманоi в добре аерованій воді протягом 5-10 хвилин після вилову. Якщо це неможливо, то спійману рибу слід відразу поміщати у відро з водою з водоймища в співвідношенні 1:10, що містить релаксуючу концентрацію одного з анестетиків: пропаксат (0,6-0,8 мг/л), хиналдин (25-30 мг/л), сірчаний ефір (1-1,5%) і ін. Вода, в якій знаходиться анестезована риба, повинна постійно аэруватися.

Залежно від розміру об'єкта і необхідної кількості крові, кров беруть кількома способами: з серця, зябрової вени, хвостовий артерії, відсіканням хвоста.

Місце пункції після зняття луски обробляють 70° спиртом і висушують ватним тампоном для видалення слизу. Для взяття крові частіше використовують шприц з ін'єкційної голкою або пастерівську піпетку. Інструменти попередньо обробляють водним розчином антикоагулянтів: цитрату натрію або гепарину. Місце взяття крові не можна стискати щоб уникнути попадання тканинної рідини, що спотворює результати. Повторно брати кров з одного і того ж місця не рекомендується. Аналізована кров повинна бути свіжою, рідкою. Щоб уникнути руйнування еритроцитів (гемолізу) кров беруть в підготовлені пробірки (або годинне скло), зливаючи обережно по стінці.

2. Готування і фарбування мазків крові

З пофарбованим штрихів крові ведуть оцінку активності еритропоезу та облік лейкоцитів.

Устаткування і реактиви

- знежирені предметні скла,

- шліфоване скло для виготовлення мазка,

- фарба Май-Грюнвальда,

- робочий розчин фарби азур-эозина (по Романовському),

- дистильована вода з рН 6,8-7,1, нейтралізована фосфатними буферами.

Підготовка до дослідження

1. Підготовка предметних стекол

- один кінець скла розміром в 1-1,5 см шліфують на наждаку для напису простим олівцем,

- скла кип'ятять в 1%-ном розчині двовуглекислої соди - 10 хв,

- охолоджують і промивають водопровідною, а потім дистильованою водою - 5 хв.,

- скла поміщають в злегка підкисленою соляною кислотою розчин дистильованої води на 2-3 хв; потім двічі промивають дистильованою водою, висушують на повітрі або в сушильній шафі і зберігають в суміші спирту з ефіром 1:1. Перед вживанням їх виймають, витирають насухо чистою серветкою або фільтрувальним папером. Вони готові до використання.

2. Приготування робочого розчину фарби азур-еозина:

- 5,5 мл концентрованої фарби азур-эозина поміщають в 250 мл нейтральної дистильованої води і ретельно перемішують.

Хід роботи

Кров після взяття (див. п. 2.) наносять у вигляді невеликої краплі на заздалегідь приготовану знежирене предметне скло, на відстані 1,5-2 см від його шліфованого краю. Великим і вказівним пальцями правої руки беруть шліфоване скло за бічні ребра, ставлять на предметне скло під кутом 45° і посувають тильною стороною до краплі, яка від дотику розтікається. Ковзаючим рухом просувають шліфоване скло вперед. Кров має рівномірно розподілятися по предметного скла у вигляді мазка. Від кожної риби готують не менше двох мазків. Після приготування мазка його висушують на повітрі протягом 10-15 хвилин.

Підсохлi мазки без фіксації фарбують за Романовським - Гімзою. Перший етап - фарбування та фіксація одночасно розчином Май-Грюнвальда протягом 5 хвилин, потім промивають нейтральною дистильованою водою. Другий етап - дофарбовування в робочому розчині Романовського 30-40 хвилин. Якість фарбування клітин контролюють під малим збільшенням мікроскопа. Пофарбовані мазки промивають водопровідною водою і висушують на повітрі.

3. Визначення вмісту гемоглобіну

Гемоглобін - це дихальний пігмент, що міститься в еритроцитах. Його кількість в організмі виражається у г/л і має важливе діагностичне значення. Визначати вміст гемоглобіну можна двома способами: за Салі та цианметгемоглобiновим методом. Найбільш поширеним і простим є метод визначення гемоглобіну за Салі. Однак він дає ряд об'єктивних (поступове посилення фарбування) і суб'єктивних (візуальне порівняння кольору) помилок. Цианметгемоглобіновий метод є найбільш точним.

1. Метод визначення гемоглобіну за Салі

Підготовка до дослідження

Приготування 0,1 п. розчину соляної кислоти:

- на 1 л дистильованої води додають хімічно чистого 8,2 см3 соляної кислоти з питомою вагою 1,19, або 0,1 п. фиксанал соляної кислоти.

Устаткування і реактиви

- гемометр Салі,

- капілярна піпетка від гемометра Салі,

- очна піпетка,

- скляна паличка,

- годинне скло,

- 0,1 п. розчин соляної кислоти,

- дистильована вода.

Хід визначення та облік результатів

В градуйовану піпетку гемометра Салі до позначки "2" очної піпеткою наливають децинормальний розчин соляної кислоти. У капілярну піпетку від гемометра Салі набирають кров до позначки 20 мкл і видувають її в розчин соляної кислоти. Отриману суміш перемішують скляною паличкою і залишають на 10 хвилин. Після закінчення цього часу в пробірку по краплях доливають дистильовану воду і, перемішуючи скляною паличкою, підбирають колір робочого розчину до збігу з кольором рідини в стандартних пробірках. Кількість гемоглобіну відраховують по нижньому меніску робочого розчину на градуйованому пробірці (показники в г % виражають у г/л), 1 г % дорівнює 10 г/л.

2. Цианметгемоглобіновий фотометричний метод

Підготовка до дослідження

Приготування розчину Драбкіна, на 1 л реактиву беруть:

- бікарбонат натрію - 1 г,

- червона кров'яна сіль,

- 0,2 г, ціаністий калій і натрій - 0,05 г,

- вода дистильована - решта.

Устаткування і реактиви:

- фотоелектроколоріметр (ФЕК) або спектротометр з зеленим світлофільтром і кюветами товщиною 1 см;

- хімічні пробірки з пробками;

- капілярна піпетка від гемометра Салі об'ємом 20 мкл;

- градуйована піпетка на 5 мл;

- розчин Драбкіна.

Хід визначення та облік результатів

Мірної піпеткою в пробірку наливають 5 мл розчину Драбкіна, що трансформує. Піпеткою від гемометра Салі додають 20 мкл крові. Вміст пробірки добре перемішують і залишають в холодильнику на 20 хвилин. По закінченню цього часу робочий і трансформуючий розчини наливають у кювети і, використовуючи зелений світлофільтр, проводять вимірювання на ФЭКе. Розрахунок концентрації гемоглобіну (г/л) на основі даного визначення проводять за формулою:

x=d540 x 367,1 г/л,

де: d 540 - свідчення ФЕК;

367,1 - коефіцієнт перерахунку, що враховує розведення крові, мілімолярниа вага гемоглобіну та інші показники.

4. Визначення гематокритної величини

Гематокритное число - це відношення обсягу еритроцитів до загального об'єму крові, виражене в г/л (1 г/л дорівнює 100%).

Підготовка до дослідження.

Готування розчинів антикоагулянту:

- розчин Геллера і Пауля:

- на 100 мл води: амоній щавлевокислий - 1,2 г, щавлевокислий калій - 0,8 г;

- 5% розчин тризамiсного лимоннокислого натрію.

Устаткування і реактиви:

- микрокапiляри,

- центрифуга, при масовому відборі проб зручніше використовувати спецiальну центрифугу МГЦ-8,

- розчини антикоагулянтів: розчин гепарину 1000 ОД/мл або 7,7 мг/мл, або розчин Геллера і Пауля, або 5% розчин лимоннокислого натрію.

Хід визначення та облік результатів

Микрокапiляри попередньо обробляють одним з розчинів антикоагулянтiв. Можна кілька разів сполоснути їх розчином гепарину і висушити при кімнатній температурі або ж в капіляри набирають на 1/10 частину розчину Геллера і Пауля і висушують у сушильній шафі при 60°С. В підготовлені таким чином капіляри набирають кров. Кінець капіляра закупорюють за допомогою замазки й ставлять центрифугувати до отримання постійного обсягу еритроцитів. Час центрифугування залежить від швидкості обертання центрифуги. Досягають ефекту повного осідання еритроцитів. Відлік обсягу еритроцитів і плазми проводять за допомогою міліметрової лінійки. Процентне відношення стовпа еритроцитів до висоти всього стовпа крові є гематокритной величиною, що переводять в розмірність г/л.

5. Визначення білка в сироватці крові

Вміст білка в сироватці крові риб служить експрес - тестом для визначення рівня фізіологічного стану риб при вирощуванні в сучасних рибоводних господарствах. Концентрації білка виражають у г % або у г/л; 1 г/л дорівнює 10 г %.

Устаткування і реактиви:

- уленгутки або невеликі пробірки,

- штатив,

- центрифуга,

- рефрактометр,

- пастерiвськi піпетки,

- спирт.



Хід визначення та облік результатів

2-3 мл крові, отриманої одним з методів (див. п.2), поміщають в підготовлені уленгутки або невеликі пробірки. Після цього кров центрифугують 5 хвилин при 3000 об./хвил. У разі відсутності центрифуги проводять відстоювання крові в холодильнику 30-45 хвилин. Отримана після центрифугування або відстоювання сироватка відсмоктується чистою пастерівською піпеткою і кілька iї крапель поміщають на пластинку рефрактометра. Реєструють показник заломлення за його шкалою. З таблиці 1, наведеною нижче, визначають зміст білка в сироватці крові. Після кожного дослідження обидві поверхні призм протирають марлевим тампоном, змоченим в спирті.

Таблиця 1

Концентрація білка (в г %) при різному показнику заломлення*

Показник заломлення	Концентрація білка (в г %)
1,337	0,60	0,66	0,72	0,77	0,83	0,89	0,95	1,01	1,07	1,12
1,338	1,18	1,24	1,30	1,36	1,41	1,47	1,53	1,59	1,65	1,70
1,339	1,76	1,82	1,88	1,94	2,0	2,05	2,11	2,17	2,23	2,29
1,340	2,34	2,40	2,46	2,52	2,58	2,63	2,69	2,75	2,81	2,87
1,341	2,93	2,98	3,04	3,10	3,16	3,22	3,27	3,33	3,39	3,46
1,342	3,51	3,57	3,62	3,68	3,74	3,80	3,86	3,91	3,97	4,03
1,343	4,09	4,15	4,20	4,26	4,32	4,38	4,44	4,50	4,55	4,61
1,344	4,67	4,73	4,79	4,84	4,90	4,96	5,02	5,08	5,13	5,19
1,345	5,25	5,31	5,37	5,43	5,48	5,54	5,60	5,66	5,72	5,77
1,346	5,83	5,89	5,95	6,01	6,07	6,12	6,18	6,24	6,30	6,36
1,347	6,41	6,47	6,53	6,59	6,65	6,70	6,76	6,82	6,88	6,94
1,348	7,0	7,05	7,11	7,17	7,23	7,29	7,34	7,40	7,46	7,52
1,349	7,58	7,63	7,69	7,75	7,81	7,87	7,93	7,98	8,04	8,10
1,350	8,16	8,22	8,27	8,33	8,39	8,46	8,51	8,57	8,62	8,68
1,351	8,74	8,80	8,86	8,91	8,97	9,03	9,09	9,15	9,20	9,26
1,352	9,32	9,38	9,44	9,50	9,55	9,61	9,67	9,73	9,79	9,84

*при наявності гемолізу необхідно вiд результатів визначення загального змісту білка відняти экспериментально встановлену поправку на ступінь гемолізу: при "l" - 0,6-0,7; при "++" 1,2-1,4; сильногемолiзована сироватка для визначення загального змісту білка використана бути не може.

6. Визначення числа еритроцитів пробірковим методом в камері Горяєва

Кількість еритроцитів (млн. в 1 мкл) - важливий показник фізіологічного стану риб, який характеризує наявність анемії.

Підготовка до дослідження

Приготування розчину Хендрікса:

- сульфат натрію - 20 г,

- хлористий натрій - 5 г,

- цитрат натрію тризаміщений - 3 г,

- крижана оцтова кислота - 100 мл,

- вода дистильована до 1000 мл.

Обладнання і реактиви;

- хімічні пробірки з пробками,

- градуйована піпетка на 5 мл,

- капілярна піпетка від гемометра Салі,

- пастерівська піпетка,

- камера Горяєва,

- мікроскоп,

- розчин Хендрікса.

Хід визначення та облік результатів

Градуйованою піпеткою в хімічну пробірку наливають 4 мл розчину Хендрікса. У капілярну піпетку від гемометра Салі набирають кров до позначки 20 мкл і видувають в пробірку, обережно промиваючи капіляр кілька разів. Покривне скло притирають до камери Горяєва до появи ньютонівських кілець. Вміст пробірки ретельно перемішують і пастерівської піпеткою заповнюють камеру Горяєва. Через 1-2 хвилини починають підрахунок числа еритроцитів під мікроскопом в 5 великих або 80 малих квадратах, розташованих по діагоналі. Для визначення кількості еритроцитів в 1 мкл досить помножити отримане при підрахунку числа еритроцитів на 10000.

7. Визначення середнього вмісту гемоглобіну в еритроциті (СГЕ)

Показник середнього вмісту гемоглобіну в еритроциті дуже важливий для виявлення гіпо- і гиперхроматii. СГЕ в одному еритроциті прийнято виражати в пiкограмах (синонім - мiкромiкрограм); 1 пг - КГ12 г.

Хід визначення та облік результатів

СГЕ в одному еритроциті визначають діленням концентрації гемоглобіну в 1 мкл крові, вираженої в грам-відсотках, на кількість еритроцитів у цьому ж обсязі. Для спрощення розрахунків можна розділити вміст гемоглобіну, виражене у г/л, на кількість еритроцитів у мільйонах.

8. Визначення середнього обсягу еритроцитів

Для з'ясування наявності мікро- і макроцитозiв поряд із безпосереднім вимірюванням розмірів еритроцитів на мазках зручніше обчислювати середній об'єм еритроцитів побічно, що виражають у кубічних мiкрометрах (мкм3).

Хід визначення та облік результатів

Для визначення середнього обсягу еритроцитів свідчення гематокритного числа ділять на кількість еритроцитів в 1 мкл крові.

Практично середній об'єм еритроцитів визначають за формулою:

А х 1000/Б,

де: А - гематокритное число, u/л;

Б - кількість еритроцитів, млн /мкл

9. Визначення швидкості осідання еритроцитів (СОЕ)

Залежно від фізичних і хімічних властивостей крові еритроцити осідають в мiкрокапiлярах з різною швидкістю. Швидкість осідання еритроцитів визначається в апаратах Панченкова і виражається в міліметрах за 1 год (мм/ч).

Устаткування і реактиви:

- годинне скло,

- апарат Панченкова, що складається з штатива і спеціальних капілярних піпеток, на яких нанесена міліметрова шкала; верхнє розподіл шкали зазначено літерами О і К (кров), проти поділки 50 є буква Р (реактив),

- профільтровану 5% розчин тризамiщеного лимоннокислого натрію.

Хід визначення та облік результатів

Промивають капілярну піпетку розчином лимоннокислого натрію, потім набирають цей розчин до мітки Р і виливають у годинне скло. Тим же капіляром набирають кров 2 рази до мітки і спускають у годинне скло. Добре перемішують і, набравши суміш у капіляр до мітки, ставлять в штатив на 1 год. Після закінчення цього часу визначають швидкість осідання еритроцитів. Величину стовпчика плазми, що звільнилася від еритроцитів, враховують з поділом на капілярної піпетці.

При роботі з молоддю риб допускається набирати менший об'єм крові (1/2 або 1/3 К), при цьому співвідношення лимоннокислого натрію і крові необхідно строго зберігати на рівні 1:2.

10. Оцінка еритроцитарної картини крові риб

По співвідношенню молодих і зрілих форм еритроцитів оцінюють активність еритропоезу. Співвідношення еритроцитів виражають у відсотках (%).

Обладнання:

- мікроскоп,

- пофарбовані мазки крові (див. п. 3.),

- іммерсійне масло.

Хід визначення та облік результатів

Під мікроскопом на мазку крові переглядають не менше 1000 еритроцитів при збільшенні х 630 (під iммерсiею). Клітини ідентифікують, використовуючи "Атлас клітин крові риб" (Іванова, 1983) і виводять відсоток різних стадій дозрівання еритроцитів за формулою:

Х = (А х 100)/1000= А х-0,1%,

де: А - число незрілих еритроцитів, що зустрічаються при підрахунку 1000 еритроцитів;

Х - шуканий відсоток незрілих еритроцитів.

11. Визначення загального числа лейкоцитів

Лейкоцити, як клітини білої крові риб, виконують різноманітні фізіологічні та імунологічні функції. Вони беруть участь в регенерації пошкоджених тканин, руйнуванні чужорідних тіл, синтезі білка і антитіл, інкапсуляції паразитів і т.д. Існує непрямий і прямий спосіб обліку лейкоцитів в периферийній крові риб. Кількість лейкоцитів виражають в 1 мкл крові (тис. шт. / мкл).

Непрямий метод

1. Обладнання:

- мікроскоп,

- пофарбовані мазки крові (див. п. 3),

- іммерсійне масло.

2. Хід визначення та облік результатів

Визначають кількість лейкоцитів, що зустрічаються при підрахунку 1000 еритроцитів в мазку крові, і потім перераховують їх кількість на 1 мкл за формулою:

Х = (А х В)/1000,

де: Х - загальна кількість лейкоцитів в 1 мкл крові;

А - кількість еритроцитів в 1 мкл крові, визначене в камері Горяєва:

В - Кількість лейкоцитів, виявлене при підрахунку 1000 еритроцитів на мазку крові.

Прямий метод підрахунку кількості лейкоцитів

1. Підготовка до дослідження

Готування розчинів А і В

- 25 мг нейтральрота і 0,6 г хлористого натрію розчиняють в 100 мл дистильованої води ( розчин А можна використовувати одну добу);

- 12 мг кристалвіолета, 3,8 мг натрію цитрату і 0,4 мл формаліну розчиняють в 100 мл дистильованої води (розчин В використати близько тижня).

2. Устаткування і реактиви:

- мікроскоп,

- розрахункова камера формених елементів крові,

- змішувач для підрахунку еритроцитів ссавців,

- пастерiвськi піпетки - стерильні,

- годинне скло,

- 2% розчин натрію цитрату,

- розчини А і В.

3. Хід визначення та облік результатів.

Взяття крові проводять відповідно до п.2. Кров з годинникового скла набирають у змішувач для підрахунку еритроцитів ссавців до мітки 0,5 або 1. Кінчик змішувача витирають ватою, набирають у змішувач розчин А до половини розширення змішувача, потім до мітки 101 заповнюють розчином Б.

Якщо кров набирають до мітки 0,5, то виходить розведення в 200 разів, якщо до позначки 1 - в 100 разів.

Після наповнення зі змішувача знімають гумову трубку, затискають його між великим і середнім пальцем і перемішують кров з розчиненою рідиною. Змішувач залишають в горизонтальному положенні на 5-10 хвилин, потім знову перемішують. Перші 2-3 краплі, що виходять з змішувача, струшують і лише наступного краплею заряджають рахункову камеру. Покривне скло повинне бути заздалегідь притерто до рахункової камери до появи кілець Ньютона. Під дією розчинів А і В відбувається вітальне фарбування формених елементів крові. Ядра лейкоцитів фарбуються в темний фіолетово-червоний колір, а протоплазма - рожевий. В еритроцитах слабо фарбуються тільки ядра. Завдяки цьому еритроцити і лейкоцити помітні в камері.

Кількість лейкоцитів підраховують в 80 великих квадратах і визначають їх кількість за формулою:

Х = Мх250хУ/n, де:

Х - кількість лейкоцитів в 1 мкл,

М - загальна кількість клітин в підрахованих квадратах,

У ступінь розбавлення крові,

n - кількість переглянутих квадратів.

12. Виведення лейкоцитарної формули

Для характеристики лейкоцитозiв і лейкопенiй, що виникають у риб при різних захворюваннях, використовують диференцiйний підрахунок лейкоцитів, тобто виводять лейкоцитарну формулу. Кількість різних груп лейкоцитів виражають у відсотках (%).

Лейкоцитарний складу представлений у риб еозинофілами, нейтрофiлами, базофілами, що відносяться до гранулоцитів; лімфоцитами і моноцитами, що відносяться до агранулоцитiв, а також бластами.

Обладнання:

- мікроскоп,

- пофарбовані мазки крові (див. п. 3.),

- іммерсійне масло.

Хід визначення та облік результатів

Для визначення лейкоцитарної формули проводять підрахунок 200 клітин білої крові в мазку під збільшенням мікроскопа об.90 х ок.7 (з iммерсiею). Підрахунок лейкоцитів краще проводити в центральних і декілька віддалених від бічного краю ділянках початкової третини частини мазка. Всі входження клітини білої крові записують у спеціальну таблицю згідно з класифікацією клітинних форм (Іванова, 1983) і розраховують процентне співвідношення клітин білої крові, тобто груп лейкоцитів у відсотках. Для цього використовують формулу:

Х = (А х 100) / 200, де:

Х - відсоток визначеної групи клітин в лейкоцитарної формули; А - кількість цих клітин, знайдене при підрахунку 200 лейкоцитів (за показаннями лічильника).

Лейкоцитарна формула вказує тільки на відносне співвідношення лейкоцитів. Для визначення їх абсолютного значення використовують формулу перерахунку, тобто з'ясовують кількість кожного виду клітин в 1 мкл крові (шт./мкл).

кров риба гемоглобін білок еритроцит



Формула перерахунку:

Х = (А х В) /100, де:

А - відсоток визначеної групи лейкоцитів в лейкоцитарної формули, %;

- Загальна кількість лейкоцитів в 1 мкл, тис. шт./мкл;

100 - загальний відсоток всіх лейкоцитів в лейкоцитарної формули. %.

13. Визначення метгемоглобіну

При накопиченні метгемоглобіну в крові вище певного рівня виникає патологічний стан, зване метгемоглобiнемiею. Внаслідок метгемоглобінемії знижується киснева ємність крові і розвивається гіпоксія, що супроводжується гальмуванням обмінних процесів і накопиченням недоокислених продуктів в тканинах.

Метод заснований на порівняльному вимірювання оптичної щільності розчинів досліджуваної крові з вихідної концентрацією оксигемоглобiнe і паралельної проби крові, в якій весь оксигемоглобін окислено до метгемоглобіну феррицианiдом калію, з використанням фотоелектроколориметра у червоному свiтлофiльтрi.

Підготовка до дослідження

0,25%-й розчин аміаку готують, додаючи до 1 мл аміаку 99 мл дистильованої води.

Насичений розчин фериціаниду калію готують, розчиняючи 70 г цієї солі в 100 мл дистильованої води, розчин зберігають не більше тижня. Розчин гепарину готують шляхом додавання до 5 мл гепарину 20 мл дистильованої води.

Устаткування і реактиви

- аміак водний (nh4ОН),ГОСТ 3760-64.

- калій залізосинеродистий (ферицианід калію, кров'яна сіль червона) ГОСТ 4206-65. Гепарин (25000 од.).

- хімічні пробірки.

- піпетки на 1, 10 мл.

- фотоелектроколориметр (ФЕК) з червоним світлофільтром.

Хід визначення та облік результатів

Для аналізу у досліджуваних риб відбирають в пробірку 1 мл крові з серця або хвостовій артерії. Кров стабілізують, додаючи в пробірку 2-3 краплі розчину гепарину. У молодих риб можливо групове взяття крові (від 2 риб і більше).

При необхідності перевезення або зберігання проб крові, закриті заглушками пробірки з кров'ю поміщають в термос з льодом або в морозильну камеру холодильника з температурою - 12°С, кров можна зберігати протягом декількох діб.

Перед дослідженням кров розморожують і ретельно перемішують.

У дві хімічні пробірки наливають по 7,3 мл 0,25%-го розчину аміаку і додають по 0,2 мл досліджуваної проби (з однієї проби крові). В одну з пробірок (пробірка №2) додають 1-2 краплі насиченого розчину фериціаниду калію, перемішують вміст пробірок і залишають обидві пробірки на 1 годину. Через 1 годину визначають величину оптичної щільності (екстинцiю) обох розчинів крові, в кюветах 10 мм у червоному свiтлофiльтрi, використовуючи для порівняння 0,25% розчин аміаку.

У першій пробірці (пробірка №1) визначають величину світлопоглинання розчину крові, з вихідною концентрацією оксигемоглобіну, у другій пробірці (пробірка №2) - величину світлопоглинання розчину крові, в якій весь оксигемоглобін (Нв02) перетворений в метгемоглобін (mthb).

Зміст оксигемоглобіну у вихідній пробі крові відповідає вмісту гемоглобіну в ній.

Оскільки у паралельній пробі крові (пробірка №2) весь гемоглобін повністю переводиться в метгемоглобін додаванням насиченого розчину фериціаниду калію, величина свiтлопоглинання розчину метгемоглобіну практично постійна і залежить від вихідного рівня гемоглобіну, тобто оксигемоглобіну.

Визначення світлопоглинання розчинів крові в обох пробірках проводять на фотоэлектроколориметрi (ФЕК) у червоному свiтлофiльтрi.

У ФЕКiв різних марок довжина хвилі, відповідна максимуму пропускання у червоному світлофільтрі, буває різною. Так, у ФЕКа - 56 при роботі з червоним світлофільтром № 8 довжина хвилі становить 597 нм, у спектрофотометрів ФЕК-56 ПМ і ФЕК КФК-2 довжини хвиль при роботі з червоним світлофільтром лежать в інтервалі 600-670 нм,

Визначення світлопоглинання розчинів крові проводять з використанням ФЭКiв різних марок у червоному свiтлофiльтрi у вищенаведеному інтервалі довжини хвиль, використовуючи для порівняння 0,25 % розчин аміаку в кюветах з робочою довжиною 10 мм.

Відмінності, пов'язані з вимірюванням екстинцiй розчинів крові при різних довжинах хвиль при роботі на ФЕКах різних марок, коригують шляхом введення в розрахункову формулу коефіцієнта - величини наведеної екстинції розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну (ЕнвО2), як показано в розділі - розрахунок результатів аналізу. При розрахунку цієї наведеної величини використовують виміряні досвідченим шляхом величини світлопоглинання розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну.

Попередньо дослiдним шляхом на молоді коропових риб встановлена середня величина світлопоглинання розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобін (ЕнвО2) та середня величина світлопоглинання розчину крові з отриманим рівнем метгемогдобiну (ЕМthв).

Таким чином, знайдено, що середнє значення щільності розчину крові з вихідним рівнем оксигемоглобіну (ЕнвО2) становить 0,15, а метгемоглобіну (emthb) - 0,77.

Оскільки гемоглобін в пробі крові риб повністю переводиться в метгемоглобін додаванням насиченого розчину фериціаниду калію, зміна світлопоглинання, рівна 0,62 (0,77-0,15) відповідає 100% вмісту метгемоглобіну.

Всі ці дані були необхідні для виведення коефіцієнтів при розрахунку змісту метгемоглобіну в крові риб за даною методикою.

За методикою проводять визначення світлопоглинання розчинів досліджуваної крові риб з вихідним рівнем оксигемоглобіну (пробірка №1) та отриманим рівнем метгемоглобіну (пробірка № 2) і розраховують зміст метгемоглобіну в крові по нижченаведеній формулою, використовуючи встановлений коефіцієнт і розрахункове наведене значення світлопоглинання розчину оксигемоглобiнy з урахуванням корекції вимірювання цієї величини при червоному свiтлофiльтрi з різними довжинами хвиль,

Х=(e2-e1) x 1,61 x 100, де:

Х - зміст метгемоглобіну в досліджуваній пробі крові, %;

е2 - наведене значення світлопоглинання розчину оксигемоглобіну (ЕhвО2)

е1 - середнє значення величини світлопоглинання розчину оксигемоглобіну, рівну 0,15;

1,61 - розрахунковий коэффициент, знайдений з середніх величин світлопоглинання розчинів оксигемоглобіну i метгемоглобіну.

Якщо наведене значення оптичної густини розчину оксигемоглобiнy (Е2) дорівнює або менше середньої величини оптичної щільності розчину оксигемоглобiнy (е1 = 0,15) (що пояснюється індивідуальними коливаннями вмісту гемоглобіну в крові риб), то зміст метгемоглобіну буде дорівнює або менше 1,61%.

14. Визначення холестерину за методом Маркоса і Товарека

Принцип реакції: холестерин у присутності оцетового ангідриду і суміші оцетової і сірчаної кислот дає зелене забарвлення.

Обладнання:

- ФЕК-3;

- пробірки 7-10 мл;

- штатив для пробірок;

- колба 500 мл;

- піпетки 0,1 і 5 мл.

Реактиви:

Розчин 1 - суміш однієї частини крижаний оцтової кислоти, п'яти частин оцтового ангідриду і однієї частини концентрованої сірчаної кислоти, яка повинна витримувати пробу Саваля.

Складові компоненти змішуються в вищевказаної послідовності при постійному охолодженні колби, в якій готується суміш. Отримана суміш повинна бути безбарвною або злегка жовтуватою. При недотриманні послідовності додавання реактивів і без охолодження суміш виходить темно-жовтою та непридатною для вживання.

Суміш переливається в склянку темного скла з притертою пробкою і зберігається в холодильнику при температурі 4оС до двох тижнів.

Розчин 2. Стандартний розчин холестерину. 10 мг холестерину розчиняють в 10 мл хлороформу (1 мл розчину містить 1 мг або 1000 холестерину).

Хід визначення

У хімічно чисті пробірки наливають піпеткою 2,1 мл суміші (розчин 1), повільно додають 0,1 мл негемолiзированоi сироватки крові, так, щоб вона стікала по стінці пробірки. Пробірку швидко й енергійно струшують 10-12 разів і поміщають в термостат при 37о на 20 хвилин. Потім колориметрують на ФЕКi у червоному свiтлофiльтрi в кюветі 0,5 см. Після колориметрування роблять розрахунок на попередньо побудованому калiбровочному графіку.

Побудова калібрувального графіка

З стандартного розчину холестерину готують низку розведень. У пробірки підливають 0,05, 0,1, 0,15, 0,25 мл стандартного розчину і додають, відповідно, 2,15, 2,10, 2,05, 2,0, 1,95 мл реактиву 1, енергійно струшують і поміщають в термостат при 37о на 20 хвилин, після чого колориметрують.

Калібрувальний графік будують з цифр екстинцiй, отриманих у результаті колориметрування стандартних розчинів. Для того, щоб перейти від концентрації холестерину в відповідної стандартної пробірці до кількості мг % холестерину в досвіді, слід цифри відповідної концентрації помножити на 1000.

15. Визначення ліпідів в сироватці крові. Фарбування по Свану

Обладнання та реактиви:

- ФЕК;

- пробірки скляні;

- мірні циліндри 50 -100 мл;

- хроматографічний папір;

- піпетки 0,1 і 5 мл

- спиртовий розчин судану чорного;

- спирт етиловий 50%, 60%, 100% (безводний);

- 20% розчин оцтової кислоти в безводному спирті;

- хлороформ

Хід визначення

На хроматографічні смужки шириною 2-3 см наносять 0,02 мл сироватки (по дві паралельні проби) і на кожну смужку - по 0,02 мл стандартного розчину ліпідів.

Приготування стандартного розчину

100 мг жиру з проб, узятих для аналізу на жир, зважується на торсійних вагах на фільтрувальному папері, потім цей папір поміщається в мірну колбу і заливається 10 мл хлороформу.

Фарбування

100 мг барвника судану чорного розводять в 100 мл 60% етанолу і підігрівають до кипіння при постійному помішуванні на водяній бані. Після охолодження розчин фільтрують. Для приготування 60% етанолу до 100 мл спирту додають 63 мл води. Смужки хроматографічного паперу фарбують в циліндрі у темряві в протягом 12 годин. Смужки відмивають 3 рази протягом 30 хвилин на 50% етанолі (до 100 мл спирту додають 95,89 мл води). Для елюiровання пофарбовані плями вирізують із смужки, ріжуть на дрібні шматочки і поміщають в пробірки. З бюретки в кожну пробірку підливають по 4 мл елюiрувальноi рідини. Пробірки закривають пробками, енергійно збовтують і залишають на 17 годину в темряві.

Рідина для елюiровання: 20% розчин оцтової кислоти в безводному етанолі.

Колориметрування ведеться на ФЕК - М при зеленому свiтлофiльтрi (довжина хвилі 490 нм) в кюветах товщиною 0,5 см проти контролю (20% оцтова кислота в етанолi після відмивання незабарвлених ділянок хроматографічного паперу).

Розрахунок

Екстинцiя стандартної проби - 1000

Екстинцiя проби - Х.

Х = eкстинцiя проби х 1000/ eкстинцiя стандарту (мг).



Перелiк посилань

Книга

1. Кожин А.А. Фізіолого-біохімічні і генетичні дослідження іхтіофауни Азово-Чорноморського басейну / Методичне керівництво. - Ростов-на-Дону: Еверест, 2005. - 11-14, 16-18 с.

2. Давидов О.М. Патологія крові риб / О.М. Давидов, Ю.Д. Темниханов, Л.Я. Куровська. - К., 2005. - 210 с

3. Посібник з клінічної лабораторної діагностики / П. д ред. В.Г. Денисюка. - К.: Здоров'я, 1992. - 296 с.

4. Сільськогосподарська екологія / В.К. М'якутко, Д.О. Мельничук, Ф.В. Вольвач та ін; за ред. В.К. М`якушка. - К.: Урожай, 1992. - 264 с.

5. Дехтярьов П.А. Фізіологія риб: підручник / П.А. Дехтярьов, М.Ю. Євтушенко, І.М. Шерман. - К.: Аграрна освіта, 2008. - 341 с.

Наказ

1. Методичнi вказiвки щодо проведення гематологiчного дослiдження кровi риб №13-4-2/1487 вiд 2 лютого 1999 року Департамента ветеренарii РФ.

Размещено на Allbest.ru