Роль кумулюсних клітин і іонів кальцію в дозріванні ооцитів мишей в нормі та при дії антиоваріальних антитіл

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКPАЇНИ

IНСТИТУТ ФIЗIОЛОГIЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

АВТОPЕФЕPАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

РОЛЬ КУМУЛЮСНИХ КЛІТИН ТА ІОНІВ КАЛЬЦІЮ В МЕЙОТИЧНОМУ ДОЗРІВАННІ ООЦИТІВ МИШЕЙ В НОРМІ ТА ПРИ ДІЇ АНТИОВАРІАЛЬНИХ АНТИТІЛ

03.00.13.- Фізіологія людини і тварин

вознесенська тетяна юріЇвна

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі імунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктоp біологічних наук, Алексєєва Ipина Миколаївна Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН Укpаїни завідувач відділом імунології і цитотоксичних сиpоваток

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, Носенко Надія Дмитрівна Інститут ендокринології та обміну речовин АМН України завідувач лабораторії нейрогормональної регуляції репродукції і адаптації

доктор медичних наук, професор, Чернишов Віктор Павлович НДІ педіатрії акушерства і гінекології АМН України завідувач лабораторії імунології

Провідна установа: Київський національний університет ім.Тараса Шевченка, кафедра фізіології людини і тварин

Захист відбудеться " 5 " лютого 2002 p. о " 14 " годині на засіданні спеціалізованої вченої pади Д 26. 198. 01 пpи Iнституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4.

З дисеpтацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (01024, м. Київ-24, вул. Богомольця, 4).

Автоpефеpат pозісланий " 2 " січня 2002 p.

Вчений секpетаp спеціалізованої вченої pади, доктоp біологічних наук Соpокіна-Маpіна З.О.

АНОТАЦІЇ

Вознесенська Т.Ю. Роль кумулюсних клітин і іонів кальцію в дозріванні ооцитів мишей в нормі та при дії антиоваріальних антитіл.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13- Фізіологія людини і тварин - Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2002 р.

Робота належить до фундаментальних досліджень, присвячених вивченню паракринних і кальцій-залежних механізмів ооцитогенеза в нормі та при дії антиоваріальних антитіл. Встановлено, що здатність до дозрівання ооцита - формування першого полярного тільця є кальцій-залежною і змінюється в залежності від фази естрального циклу миші. За допомогою блокаторів каліцієвих каналів L- і Т- типу (верапаміла та амілорида, відповідно) показано, що при формуванні першого полярного тільця на оолемі ооцита миші функціонують переважно канали Т-типу, і їх роль є більше вираженою на стадії еструс. Встановлена роль кумулюсних клітин в дозріванні ооцита. Показано, що контакт ооцита з кумулюсними клітинами призводить до секреції останніми термостабільних, мейоз-активуючих факторів, які паракринно ініціюють відновлення мейотичного дозрівання ооцитів мишей. Показано пригнічуючий вплив великих доз і стимулюючий малих доз антиоваріальних антитіл при застосовані in vivo i in vitro на фолікуло- і ооцитогенез. Встановлена роль кумулюсних клітин у стимуляції відновлення мейозу ооцитами під впливом антитіл. Встановлений пригнічуючий ефект верапаміла на ооцитогенез дає підставу стверджувати, що цей препарат, який широко застосовується при лікуванні серцево-судинних захворювань може посилювати ризок розвитку безпліддя.

Ключові слова: ооцит, кумулюсні клітини, кальцієві канали, блокатори кальцієвих каналів, відновлення мейозу, формування першого полярного тільця, антиоваріальні антитіла.

Вознесенская Т.Ю. Роль кумулюсных клеток и ионов кальция в созревании ооцитов мышей в норме и при действии антиовариальных антител.

Ключевые слова: ооцит, кумулюсные клетки, кальциевые каналы, блокаторы кальциевых каналов, возобновление мейоза, формирование первого полярного тельца, антиовариальные антитела.

Voznesenska T.Yu. Role of cumulus cells and calcium ions in oocyte maturation of intact mice and those under antiovarial antibodies influence.

Thesis for a candidate's degree on speciality 03.00.13 - human and animal physiology - Bogomoletz Institute of Physiology of the NAS of Ukraine, Kyiv, 2002.

The scientific work is a fundamental one dealing with an exploration of calcium-dependent and paracrine mechanisms of oogenesis in intact mice and those under the influence of antiovarial antibodies. Maturation of an oocyte or forming the first polar body has been established to depend on calcium ions and the stage of oestrous cycle. With the aid of the inhibitors for calcium channels of L- and T- types (verapamil and amilorid, respectively) calcium T - type channels were determined to function preferentially on an oocyte oolema at the period of forming the polar body, and the y were more significant at stage of oestrus. The role of cumulus cells in the maturing of oocytes has been ascertained. The data obtained evidence that after coming into contact with an oocyte cumulus cells release thermostable meiosis-activating factors which resume its maturation in a paracrine fashion. Antiovarial antibodies have been shown to influence fillicle- and oogenesis in a dose-dependent fashion: large amounts inhibited it, but little ones had an opposite effect. Cumulus cells heve been determined to activate the meiosis resuming by the oocytes in the presence of antibodies. As verapamil is shown to inhibit the oogenesis, it gives grounds to think that this preparation, which is widely used in treating cardiovascular diseases, might increase the risk of female infertility.

Key words: oocyte, cumulus cells, calcium channels, inhibitors for calcium channels, meiotic resuming, polar body forming, antiovarial antibodies.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останніх десять років дослідники дотримуються уявлень, що розвиток фолікула і ооцита в яєчнику модулюється за допомогою протеїнів, які названо ростовими факторами. Такі ростові фактори можуть відігравати ключову роль у доборі домінантного фолікула та атрезії інших фолікулів яєчника, а також вирішально впливати на мейотичне дозрівання оваріальних ооцитів. Роль гормонів і ростових факторів, які керують цими процесами, складна особливо беручи до уваги вплив фолікулярного оточення ооцита. Відомо, що в незрілих ооцитах ссавців під впливом фолікулярного оточення підтримується призупинка першого поділу мейозу. Вважають, що для підтримування мейотичного арешту, цAMФ гранулярних або кумулюсних клітин проходить через gap junction в ооцит (Wert, Larsen, 1988). Так, при зміні рівня цAMФ в ооциті може відбуватися запуск відновлення першого поділу мейозу, або може існувати фактор гранулярного чи кумулюсного походження, який в паракринний спосіб зніматиме гальмівний вплив цАМФ і буде відновлювати перший поділ мейозу (Homa, 1995). Даних про роль паракринних факторів у регулюванні оваріальної функції не достатньо.

В літературі є дані про роль кальцію в дозріванні ооцита (Busa, Nucitelli, 1985; Swann,Whitaker, 1986; Klne, 1988; Steinhardt, 1990; Whitaker, Patel, 1990). Встановлено, що відбувається вхід Са²⁺ в яйцеклітину при заплідненні, а також Са²⁺ є необхідним для звільнення від другого арешту метафази яєць ссавців ( мишей (Cuthbertson et al., 1981; Kline, 1992), хом'яків (Miyazaki, 1990), корів (Collas et al., 1993)). Тоді як роль позаклітинного кальцію та участь кальцієвих каналів у забезпеченні просування мейозу до метафази ІІ, тобто у формуванні першого полярного тільця ооцитами ссавців точно не визначено.

Відомо, що при цілому ряді порушень в жіночій репродуктивній системі присутній аутоімунний компонент, пов'язаний з появою в сироватцi кровi антиоваріальних антитіл. Це показано при неспецифічних запальних ураженнях органів репродуктивної системи (Niauru, 1995), розвитку передчасної недостатності яєчників (Wheatcroft et al., 1994), при пошкодженні тканин яєчника жінок після повторних пункцій фолікулів з метою екстракорпорального запліднення (Hovav et al., 1994). в безплiдних жiнок присутні антитіла до антигенів власних яйцеклітин (Crha et al., 1995). Механізм дії цих антитіл вивчений недостатньо.

Для моделювання дії аутоантитіл в експеpименті викоpистовують ксеногенні антитіла, які за своєю пpиpодою не відpізняються від аутоантитіл. Показано, що антиоваpіальні антитіла (антиоваpіальна цитотоксична сиpоватка) дозозалежно впливають на моpфостpуктуpу яєчників самок щуpів та їх естpальний цикл (Зеленська Т.М., 1965, 1967; Спасокукоцький Ю А., 1977). Досліджено вплив антиоваріальних антитіл на моpфологічні (Вербицький М.Ш., Гоцуляк Я.Н., 1997; Гоцуляк Я.М., Янчій Р.І., 1999) та електрофізіологічні (Гоцуляк Я.М. і співавт., 1991) особливості ооцитів мишей. Встановлено участь кальцієвих каналів у пригнічуючій дії антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу (Блашків Т.В., 2000). Проте участь кальцієвих каналів у дії антиоваріальних антитіл на подальший розвиток ооцита - формування першого полярного тільця не вивчена. Не з'ясована і роль кумулюсних клітин у змінах розвитку ооцита під впливом антиоваріальних антитіл.

Тому дослідження ролі кумулюсних клітин і іонів кальцію в дозріванні ооцитів в нормі та при дії антиоваріальних антитіл є актуальним для встановлення паракринних та кальцій-залежних механізмів регуляції дозрівання ооцитів ссавців, а також для розкриття механізмів дії антиоваріальних антитіл на яєчники.

Мета i задачі дослiдження. Мета дослідження полягала у встановленні ролі кумулюсних клітин та іонів кальція в дозріванні ооцитів мишей на різних стадіях естрального циклу в нормі та при дії різних доз антиоваріальних антитіл. Для досягнення цієї мети були поставлені слідуючі завдання:

Дослідити здатність ооцитів до формування першого полярного тільця in vitro в залежності від розмірів фолікулів та ооцитів, а також від стадії естрального циклу миші.

Вивчити вплив кальцію в різних його концентраціях в культуральному середовищі та блокаторів кальцієвих каналів (амілорида як блокатора Т-типу, та верапаміла як блокатора L-типу) на мейотичне дозрівання ооцитів мишей на різних стадіях естрального циклу.

Дослідити участь кумулюсних клітин як в формі безпосередніх контактів з ооцитом, так і в гуморальному впливі на ооцит у відновленні мейозу in vitro.

Дослідити вплив антиоваріальних антитіл при застосуванні in vivo на мейотичне дозрівання ооцитів мишей.

Дослідити вплив антиоваріальних антитіл при застосуванні їх in vitro на мейотичне дозрівання ооцитів мишей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для виділення ооцитів з фолікулів застосовано не ферментативні методи.

Вперше встановлено, що завершення мейотичного дозрівання ооцитів - формування першого полярного тільця in vitro - залежить від стадії естрального циклу мишей і концентрації позаклітинного кальцію.

Показано, що при формуванні полярного тільця на оолемі ооцитів функціонують кальцієві канали L- і Т- типу. Вперше показано, що роль кальцієвих каналів Т- типу є більш виражена при формуванні першого полярного тільця ооцитами мишей на стадії еструс.

Вперше встановлена роль кумулюсних клітин у мейотичному дозріванні ооцита. Показано, що контакти ооцита з кумулюсними клітинами призводять до секреції останніми термостабільних чинників, які сприяють відновленню мейоза.

Новими є дані про вплив антиоваріальних антитіл у великих і малих дозах на ооцитогенез і про роль кумулюсних клітин в стимулюючому ефекті малих доз антитіл на відновлення мейозу.

Теоретичне i практичне значення роботи. Отримані результати, що свідчать про важливість ролі кумулюсних клітин, позаклітинного кальцію та кальцієвих каналів Т-і L-типу в мейотичному дозріванні ооцитів мишей, мають фундаментальне значення в розкритті паракринних і кальцій-залежних механізмів нормального розвитку і дозрівання яйцеклiтин. Експериментальні моделі мейотичного дозрівання ооцитів миші можуть бути використані при дослідженні факторів, які є важливими для росту і розвитку ooцита, а також в прикладних дослідженнях і розробках допоміжних репродуктивних технологій для медицини і тваринництва. Встановлення впливу антиоваріальних антитіл на здатність ооцитів до мейотичного дозрівання має як теоретичне значення для розуміння змін репродуктивної функції імунного генезу, так і прикладне значення для розробки нових методик по регулюванню репродуктивної функції самок ссавців. Дані про пригнічуючий вплив верапаміла на оогенез дають можливість стверджувати, що хіміотерапія при лікуванні різноманітних захворювань, в першу чергу, серцево-судинних, в наш час досягла рівня, що дозволяє сформулювати проблему стерильності або безпліддя як наслідок впливу препаратів блокаторів кальцієвих каналів на репродуктивні органи.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень. Запропоновано моделі для вивчення мейотичного дозрівання ооцитів, а також розроблено технологічні параметри систем культивування для адекватного дослідження росту та розвитку ооцитів ссавців in vitro. Самостійно проведені всі експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних результатів, аналіз результатів, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації доповідалися: на мiжнаpодному симпозiумі “Імунологiя pепpодукцiї” (Київ, Укpаїна, 22-25 жовтня 1996 року), на симпозіумі з міжнародною участю “Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии 2000” (Київ, Україна; 27-28 травня 1999 року), на міжнародній конференції “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, Росія; 23-25 вересня 1999 року), на ІІІ Національному Конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одеса, 24-27 травня 2000р), на Міжнародній школі-семінарі “Membranes and Signalling”(Київ, 4-8 вересня 2000р), Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Актуальні проблеми профілактичної медицини” (Київ, 16-17 жовтня 2000р), конференції молодих вчених “Актуальні проблеми фармакології і токсикології” (Київ, 7 грудня 2000р), на міжнародній конференції “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, Росія; 14-16 березня 2001р), на 1 з'їзді Федерації товариств з клінічної імунології (FOCIS) (Бостон, США; 5-7 травня 2001р).

Публікації. Результати дисертації викладені в 15 публікаціях: статті - 6, тези конференцій, симпозиумів, з'їздів - 9.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 8 рисунками і 11 таблицями. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу описання матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, розділу аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Список літератури охоплює 239 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослiджень. Дослідження проведено на самках статевозрілих білих безпородних мишей віком 8 тижнів масою 20 г. Для дослідів використовували самок на стадіях діеструс, проеструс, еструс. Стадії проеструс та еструс, індукували присутністю самця в клітці, розділеній перегородкою (Манк М., 1990); частину самок стимулювали ін'єкцією гонадотропінів сироватки жеребої кобили (гСЖК) в дозі 12 МО. Стадії естрального циклу самок мишей контролювали за допомогою вагінальних мазків. Тварин присипляли ефіром і забивали методом зміщування шийних хребців. Під мікроскопом МБС-9 фолікули механічно звільняли від сполучно-тканинної основи кортикальної речовини. Скляними трубочками фолікули попередньо розділяли на групи за розмірами і переносили в (37 ⁰С) середовище DМЕ (D5405, Sigma), в якому визначали їх розміри за допомогою окулярного мікрометра. Після проколу фолікула голкою, під мікроскопом МБС-9, в середовищі DМЕ, не застосовуючи ферменти виділяли ооцити, оточені кумулюсними клітинами (кумулюсно-ооцитарні клітинні комплекси - КОКК). Загальне число КОКК, які виділяли з обох яєчників однієї миші, становило 30. Ооцити (О) і кумулюсні клітини (КК) отримували з КОКК, пропускаючи їх через тонку скляну піпетку. Ооцити знаходилися на стадії “зародкового пухирця” (ЗП+), яку встановлювали під інвертированим мікроскопом за наявністю чітко сформованої ядерної оболонки. Розміри ооцитів (з прозорою оболонкою) встановлювали за допомогою окулярного мікрометра.

КОКК, КК та О окремо та сумісно культивували в камерах, що містили 0,45 мл культурального середовища DМЕ з 15 ммоль HEPES, з фізіологічною концентрацією Са²⁺ (1,71 ммоль/л), в термостаті при 37⁰С, в стерильному боксі. Використовували також супернатанти від культивованих клітин та їх термостабільні фракції. Підраховування ооцитів здійснювали в кінці терміну культивування. Кількість ооцитів із зародковим пухирцем (ЗП+), розчиненим зародковим пухирцем (ЗП-) - після 2 год культивування і таких, що сформували перше полярне тільце (ПТ) - після 20 год культивування визначали, використовуючи інвертований мікроскоп. Вираховували відношення кількості ооцитів з розчиненим зародковим пухирцем (ЗП-) до початкової (загальної) кількості (ЗП+) ооцитів у процентах (% ЗП-) і відношення кількості ооцитів з ПТ до загальної кількості ооцитів у процентах (% ПТ).

Антиоваріальну цитотоксичну сироватку (АОЦС) одержували шляхом імунізації кролів. Видiлення iмуноглобулiнiв (г-АОЦС) iз сироватки кровi кролів здiйснювали при допомозi сульфату амонiю. Нормальну кролячу сироватку (НКС) одержували від інтактних кролів. Фракцію г-НКС отримували за тією ж методикою, що і аналогічну фракцію АОЦС. Для дослідження впливу на фолікуло- та оогенез in vivo АОЦС та г-АОЦС вводились внутрівенно мишам на стадії діеструсу. Для дослідження впливу на мейотичне дозрівання ооцитів in vitro АОЦС та г-АОЦС додавалися в середовище культивування. Вивчено дозозалежний вплив АОЦС і г-АОЦС на ооцитогенез.

В дослідах використовували: культуральні середовища DМЕ (DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM)(D5405, FOB Sigma), MEM (JOKLIK MODIFIED) (0518, FOB Sigma). Для зміни концентрації кальцію в культуральному середовищі використовували 1М розчин СаCl₂2Н₂О, з якого при додаванні в розрахованих кількостях до без кальцієвого середовища М0518 отримували 0,34; 0,80; 1,71 ммоль/л розчин СаСl₂ в середовищі. Подібно отримували середовище з 3,00; 5,00; 10,00 та 20,00 ммоль/л розчинами СаСl₂ для дослідів з їх підвищеною концентрацією. Для приготування базового середовища використовували деіонізовану вод. Амілорид (Sigma) - блокатор Са²⁺ каналів Т-типу, додавали до середовища DМЕ (D5405, Sigma), отримуючи розчин з кінцевими концентраціями: 0,03 ммоль/л, 0,05 ммоль/л; верапаміла гідрохлорид (Sigma) - блокатор Са²⁺ каналів L-типу, додавали до середовища DМЕ (D5405, Sigma), отримуючи розчин з кінцевими концентраціями: 0,02 ммоль/л, 0,12 ммоль/л, 0,24 ммоль/л.

Тварини в дослідах використовувалися з розрахунку: 36 самок на один досліджуваний параметр при культивуванні in vitro; 0,3 мг білка/яєчник при імунізації кролів; 12 самок на одну дозу при введенні in vivo. Для статистичної обробки результатів використовували t-критерій Ст'юдента (Х. Шенк, 1972).

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Здатність ооцитів до формування першого полярного тільця in vitro в залежності від розмірів фолікулів та самих ооцитів, а також від стадії естрального циклу миші. Отримані нами результати вимірювань зовнішнього діаметра фолікулів дозволили розподілити їх на групи: “малі”, “середні” та “великі”. Ці групи представлені в яєчниках мишей на всіх досліджуваних стадіях естрального циклу. Розміри ооцитів мишей на стадії діеструсу, котрі виділялися з “малих” фолікулів, становили 70.0 0.2 мкм (N=84), з “середніх”- 71,70,3 мкм (N=76) і з “великих” - 72,00,3 мкм (N=66). У мишей на стадії еструс І відповідні величини становили: 73,40,3 мкм (N=77), 74,20,2 мкм (N=73), 75,60,3 мкм (N=55). Міжгрупові відмінності ооцитів з “малих” і “великих” фолікулів та відповідних груп на різних стадіях естрального циклу були вірогідними. Нами встановлено, що кількість ооцитів з “малих” фолікулів мишей на стадії діеструс, які формували перше полярне тільце після 20 год культивування, була 21,4%0,2 (n=18), на стадії еструс - 26,1%0,2 (n=18), р<0.01; з “великих” фолікулів мишей на стадії діеструс - 30,3%0,3 (n=18) та на стадії еструс - 43,6%0,2 (n=18), р<0.01. Отримані нами величини розмірів фолікулів, виділених механічно, дещо відрізняються від розмірів фолікулів миші за даними літератури, де використовували ферментативні методи (Roy, Greenwald, 1996). Нами встановлено, що здатність до формування першого полярного тільця ооцитами, залежить як від розмірів фолікула та самого ооцита, так і від стадії естрального циклу миші. Найбільший процент ооцитів, які формували полярне тільце in vitro, характерний для “великих” фолікулів мишей на стадії еструс (І). Цікавим є і той факт, що ооцити з “малих” фолікулів мишей на стадії діеструс теж формували перше полярне тільце in vitro. Порівнюючи величини діаметра ооцита з чітко сформованим “зародковим пухирцем” на різних стадіях естрального циклу миші, ми підтвердили скоординованість процесів ядерного і цитоплазматичного дозрівання. Реєстрована нами зміна (збільшення ооцита в процесі розвитку овуляції) може свідчити про те, що за період розвитку від “малого” до “великого” фолікулів в яєчнику миші від стадії діеструс до стадії еструс (І) ооцити проходять подальше диференціювання, збільшуючись при цьому в об'ємі і, можливо, набуваючи здатності до повного завершення цитоплазматичного дозрівання. Фізіологічне значення отриманих відмінностей між ооцитами від мишей на стадії діеструс та еструс І полягає в тому, що стадії еструс І передує передовуляторне зростання концентрації лютеїнізуючого гормону, який відповідає за дозрівання ооцитів in vivo (Lindner et al., 1974 ; Downs et al., 1988).

Вплив кальцію в різних його концентраціях в культуральному середовищі на формування першого полярного тільця ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу. Ми підраховували кількість ооцитів мишей на стадіяї проеструс та еструс (І), які формували перше полярне тільце іn vitro в середовищі з різними концентраціями кальцію. Встановлено, що формування першого полярного тільця ооцитами мишей, які знаходилися на стадіях проеструс та еструс (І), в без кальцієвому середовищі не відбувалося. Мінімальна концентрація кальцію, при якій ооцити після 18 годин культивування формували перше полярне тільце, становила 0,34 ммоль/л. Зростання концентрації кальцію від нульової до фізіологічної (1,71 ммоль/л) супроводжувалося зростанням здатності ооцитів до формування першого полярного тільця на обох стадіях естрального циклу, при цьому найбільший процент характерний для ооцитів мишей на стадії еструс (І) після 22 годин культивування. Зростання концентрації кальцію від 1,71 ммоль/л до 5,00 ммоль/л в середовищі після 18 годин культивування збільшувало, а після 22 годин - зменшувало кількість ооцитів, які формували перше полярне тільце. А концентрації 10,00 ммоль/л та 20,00 ммоль/л кальцію в середовищі пригнічували здатність всіх ооцитів формувати перше полярне тільце. Таким чином, нами отримано дані про те, що здатність до формування полярного тільця ооцитами миші є кальцій-залежною і вона змінюється в залежності від фази естрального циклу. В літературі є суперечливі дані про участь Са²⁺ в розвитку статевих клітин, а саме в період їх мейотичного дозрівання. Наводяться дані про те, що ооцити миші в середовищі без іонів Са²⁺ швидко гинуть (Paleos, Powers, 1981). В Са-дефіцитному середовищі, яке, як вказують дослідники, не впливає на відновлення мейозу ооцитами, але пригнічує формування полярного тільця (ПТ) ооцитами корови та свині (Maruska et al., 1984; Kaufman, Homa, 1993). Проте, в середовищах з високими концентраціями кальцію спостерігалося збільшення кількості ооцитів миші, які формували полярне тільце (Paleos, Powers, 1981; Maruska et al., 1984). Отримані нами дані можуть зняти в якійсь мірі протиріччя у визначенні ролі кальцію в процесі формування першого полярного тільця серед даних літератури, в яких кальцій-залежні механізми оогенезу не розглядалися з урахуванням стадій естрального циклу дослідних тварин. В наших дослідах при відсутності кальцію в експериментальному середовищі звільнення його із внутрішніх депо є, очевидно, недостатнім для формування першого полярного тільця ооцитами мишей на досліджуваних стадіях проеструс і еструс (І). На нашу думку, для формування ооцитами першого полярного тільця необхідне додаткове надходження іонів кальцію в клітину, можливо через потенціал-керовані кальцієві канали оолеми.

Вплив різних концентрацій блокаторів кальцієвих каналів на формування першого полярного тільця ооцитами іn vitro мишей на різних стадіях естрального циклу. Відомо, що клітинна мембрана містить декілька типів каналів, по яких Са²⁺ рухається із внутріклітинного простору та із Са-депонуючих органел в гіалоплазму ( Hosey, Lazdunski, 1988). Ми підраховували кількість ооцитів мишей на різних стадіях естрального циклу, які формували перше полярне тільце в середовищі з різними концентраціями верапаміла блокатора L-типу кальцієвих каналів та блокатора Т-типу - амілорида. Верапаміл в дозі 0,02 ммоль/л частково пригнічував формування полярного тільця ооцитами мишей на всіх стадіях естрального циклу. А при дозі 0,12 ммоль/л та 0,24 ммоль/л спостерігалося повне блокування формування полярного тільця ооцитами мишей на всіх стадіях. Амілорид в дозі 0,03 ммоль/л та 0,05 ммоль/л мав більш пригничуючий ефект на процес формування першого полярного тільця ооцитами мишей на всіх стадіях естрального циклу. Отримані дані можуть свідчити про те, що для формування полярного тільця ооцитом, який відновив перший поділ мейозу, є необхідним надходження Са²⁺ з позаклітинного простору, і що це може здійснюватися при участі кальцієвих каналів а також, що при формуванні першого полярного тільця функціонують переважно канали Т-типу, і їх роль є більш вираженою на стадії еструс І. Вплив кумулюсних клітин, та речовин, які вони секретують на відновлення мейозу ооцитами мишей in vitro. Нами досліджено роль клітинних контактів між кумулюсними клітинами та ооцитом на відновлення мейозу ооцитами. КОКК від стимульованих гонадотропіном мишей культивували 3 год, потім кумулюсні клітини відокремлювали від ооцитів і ці ізольовані КК ко-культивували з ооцитом в том же середовищі ще 2 год. Відновлення мейозу ооцитами становило 67,01,4 %. Якщо ж міжклітинні контакти не райнували, тобто культивували самі КОКК відновлення мейозу у ооцитів було вірогідно меншим 46,01,4 % (р<0.01). Якщо відділені ооцити продовжували культивувати окремо від КК і в новому середовищі, тобто, без подальшого впливу паракринних факторів, відновлення мейозу також було вірогідно меншим 47,02,1 % і вірогідно не відрізнялось від такого у О від не стимульованих мишей (42,01,4 %). При 2 год ко-культивування КК стимульованих мишей і О не стимульованих мишей відновлення мейозу ооцитами становило 49,02,4 %, при 42,01,4 % , (р<0.01) в контролі (ко-культивування КК і О не стимульованих мишей) (рис. 1.).

Рис. 1. Вплив кумулюсних клітин на відновлення мейозу ооцитами мишей in vitro.

Примітка: По осі абсцис представлено групи дослідів, а по осі ординат - величина (% ЗП-). 1 - ко-культивування КК і О стимульованих мишей. К1 - контроль (ко-культивування КОКК стимульованих мишей); 2 - культивування О стимульованих мишей, відділених від КК в новому середовищі; К2 - контроль (культивування О не стимульованих мишей, відділених від КК в новому середовищі); 3 - ко-культивування КК стимульованих мишей з О не стимульованих мишей; К3 - контроль (ко-культивування КК не стимульованих мишей з О не стимульованих мишей), - р<0.01 - вірогідно по відношенню з контролем.

Таким чином, одержані дані показали, що КК потрібні для відновлення мейозу ооцитами, але їх стимулюючий вплив виявляється не в формі безпосереднього контакту з ооцитом, а можливо завдяки чинникам, які виробляються КК при контакті з ооцитом. Для перевірки цього припущення ми додавали в середовище культивування ооцитів від не стимульованих мишей супернатанти від культивованих КОКК або ізольованих КК від стимульованих мишей.

При цьому досліджено, чи необхідна присутність ооцита для реалізації стимуляції мейозу кумулюсними клітинами (рис. 2.) Супернатанти (СН) одержували після 4 год культивування 150 КОКК / мл культурального середовища від стимульованих мишей (СН Іа) і після 16 год їх культивування (СН Іб). Використовували також супернатанти від КК стимульованих мишей без ооцитів: після 4 год культивування - (СН ІІа) і після 16 год їх культивування (СН ІІб). Супернатанти центрифугували при 3500 об/хв 10 хв для видалення клітинних останків і використовували для подальшого культивування з ними О не стимульованих мишей. Показано, що при 2 год культивування О не стимульованих мишей в СН Iа відновлення мейозу ооцитами становило 30,01,8 %. Натомість культивування О в СН IIа поновлювало мейоз тільки в 7,00,6 %, (р<0.01). При культивуванні О не стимульованих мишей в СН Iб показники зростали до 90,02,4 %, при 4,00,8 % в СН IIб, (р<0.01). Таким чином показано, що інтактні ооцити при ко-культивуванні в середовищі з кумулюсними клітинами стимульованих гонадотропінами тварин, а також при культивуванні у середовищі, в якому попередньо культивувалися КОКК, ооцити з кумулюсними клітинами, стимульованих гонадотропінами мишей, відновлюють мейоз значно краще, ніж ізольовані ооцити. В той же час, кумулюсні клітини, які культивували без ооцитів від стимульованих гонадотропінами мишей, не ініціювали відновлення мейозу ооцитами, що свідчить про те, що ооцит грає вирішальну роль в процесі запуску кумулюсними клітинами продукції мейоз-активуючих факторів.

Для виявлення характеру діючих чинників досліджено вплив термостабільної фракції СН - після прогрівання при 70° С протягом 30 хв (рис. 2.) Прогрівання не впливало на ефект СН. При 2 год культивування О не стимульованих мишей в термостабільної фракції СН Іа відновлення мейозу оцитами становило 27,02,3%, при 24,01,3 % в контролі (2 год культивування О не стимульованих мишей в термічно не обробленому СН Iа). При 2 год культивування О не стимульованих мишей в термічно обробленому СН Іб відновлення мейозу ооцитами становило 59,02,1%, при 62,02,2% в контролі (2 год культивування О не стимульованих мишей в термічно не обробленому СН Iб).

ооцитогенез кумулюсний клітина кальцій

Рис. 2. Вплив супернатантів та термостабільної фракції супернатантів на відновлення мейозу ооцитами мишей in vitro.

Примітка: По осі абсцис представлено групи дослідів, а по осі ординат - величина (% ЗП-). 1 - вплив СН Ia; К1 - вплив СН IІa; 2 - вплив СН Iб; К2 - вплив СН IIб; 3 - О не стимульованих мишей в термічно обробленому СН Ia; К3 - контроль (О не стимульованих мишей в термічно не обробленому СН Ia); 4 - О не стимульованих мишей в термічно обробленому СН Iб; К4 - контроль (О не стимульованих мишей в термічно не обробленому СН Iб); ? -р<0.01-вірогідно по відношенню з контролем.

Таким чином, нами показано: 1) безпосередні контакти між КК і ооцитом не є абсолютно необхідними для реініціації мейозу, але такі контакти потрібні для запуску синтезу мейоз-активуючих факторів в КК; 2) присутність ооцита є необхідною для запуску КК продукції мейоз-активуючих факторів; 3) КК під дією гонадотропінів секретують термостабільні фактори, які паракринно ініціюють відновлення мейозу ооцитами.

З літератури відомо, що виділено два стероли, які активують відновлення мейозу ооцитами мишей: перший - з преовуляторної фолікулярної рідини людини, названий F-MAS (F-MAS - фолікулярний мейоз-активуючий стерол), та другий - з тестикулярної тканини бика, названий Т-MAS (Byskov et al., 1995a). Показано, що обидва стероли можуть запускати відновлення мейозу гермінативними клітинами миші (Byskov et al., 1995b). Ми припускаємо, що мейоз-активуючі термостабільні фактори, продуковані КОКК стимульованих гонадотропінами мишей в наших дослідах, можуть бути з родини мейоз-активуючих стеролів.

Вплив антиоваріальних антитіл при застосуванні їх in vivo на ооцити. Вплив великих доз антитіл на здатність ооцитів формувати перше полярне тільце. В наших дослідженнях одноразове внутрішньовенне введення великих доз АОЦС та г-АОЦС викликало: повне пригнічення оогенезу in vitro (ооцити не формували перше полярне тільце (%ПТ)) (p<0.01) після 18 годин культивування під дією АОЦС в дозах 0.1 мл та 0.01 мл; після дії г-АОЦС в дозі 0.2 мг/білку жоден ооцит не формував перше полярне тільце (p<0.01). Після дії меншої дози г-АОЦС - 0.02 мг/білку процентне відношення ооцитів, які формували перше полярне тільце in vitro (%ПТ) становило 22,00,9 % (p<0.01) при 50,40,8 % в контролі.

Вплив малих доз антитіл на розподіл фолікулів і ооцитів за розмірами в яєчнику, на відновлення ооцитами мейозу та формування першого полярного тільця. В наших дослідженнях АОЦС та г-АОЦС через 72 години після трьохкратного внутрішньовенного введення малих доз викликали: збільшення кількості ооцитів, які виділяли з одного яєчника після ін'єкцій. При цьому стимулюючий ефект зростав при зменшенні дози. Так, після дії АОЦС у дозах 0.0005 мл та 0.0001 мл кількість ооцитів в одному яєчнику становила до 19,81,9 шт/яєчник (p<0.05) та 22,00,9 шт/яєчник (p<0.01) відповідно при 15,60,2 шт/яєчник в контролі. Після введення г-АОЦС в дозах 0.0004 мг/білка та 0.0002 мг/білка кількість ооцитів збільшувалася, до 16,00,7 шт/яєчник та 19,31,5 шт/яєчник (p<0.05) відповідно, при 15,60,2 шт/яєчник в контролі. Змінювалися також в залежності від дози антитіл розподіл фолікулів за розмірами в яєчнику, розміри фолікулів і ооцитів в ньому. Так, після дії АОЦС в дозах 0.0005 мл реєструвалася відсутність “малих” фолікулів (p<0.01), зменшення “середніх” 260,41,4 мкм (p<0.05) при 263,35,8 мкм в контролі і “великих” фолікулів 310,22,2 мкм (p<0.01) при 357,64,7 мкм в контролі. Після дії 0.0001 мл АОЦС - зменшення “малих” до 143,23,00 мкм (p<0.05) при 149,31,6 мкм в контролі, збільшення “середніх” фолікулів до 276,72,4 мкм (p<0.05) при 263,35,8 мкм в контролі і “великих” до 367,53,5 мкм (p<0.01) при 357,64,7 мкм в контролі. Після дії г-АОЦС в дозах 0.0004 мг/білка реєструвалося збільшення розміру “малих” фолікулів до 159,41,8 мкм (p<0.01) при 149,31,6 мкм в контролі, “середніх” фолікулів до 284,94,0 мкм (p<0.01) при 263,35,8 мкм в контролі, а також “великих” фолікулів до 383,93,1 мкм (p<0.01) при 357,64,7 мкм в контролі. Після дії г-АОЦС з 0.0002 мг/білка - збільшення розміру “малих” фолікулів до 161,73,6 мкм (p<0.01) при 149,31,6 мкм в контролі, а також збільшення “великих” фолікулів - 395,33,0 мкм (p<0.01) при 357,64,7 мкм в контролі. Після дії АОЦС в дозах 0.0005 мл та 0.0001 мл реєструвалося збільшення розміру ооцита з “малого” фолікула до 74,00,2 мкм (p<0.05) та 74,20,2 мкм (p<0.05) при 73,30,2 мкм в контролі, відповідно, а також збільшення розміру ооцита з “великого” фолікула 76,50,2 мкм (p<0.01) при 75,30,2 мкм в контролі, після дії АОЦС в дозі 0.0001 мл; після дії г-АОЦС в дозах 0.0004 мг/білка реєструвалося збільшення ооцитів з “великого” фолікула 76,30,2 мкм (p<0.01) при 75,30,2 мкм в контролі. Після дії 0.0002 мг/білка ооцит з “малого” фолікула збільшувався до 74,00,2 мкм (p<0.05) при 73,30,2 мкм в контролі, а також відбулося збільшення розміру ооцита з “великого” фолікула до 76,60,2 мкм (p<0.01) при 75,30,2 мкм в контролі.

Під впливом АОЦС і г-АОЦС відбувалося збільшення процентного відношення ооцитів, які відновлювали мейоз in vitro (%ЗП-), яке також зростало по мірі зменшення дози препаратів. Так, після дії АОЦС в дозах 0.0005 мл 55.60,7 % (p<0.01) ооцитів відновлювали мейоз (%ЗП-) після 2-ох годин культивування при 39,31,4 % в контролі. А після дії 0.0001 мл АОЦС (%ЗП-) становив 64,36,4 % (p<0.01) при 39,31,4 % в контролі; після дії г-АОЦС в дозі 0.0004 мг/білка (%ЗП-) збільшувався до 40,80,8 % (p<0.05), а після 0.0002 мг/білка - 43,80,4 % при 39,31,4 % в контролі, після 2 годин культивування. Збільшувалось також процентне відношення ооцитів, які проходили подальше дозрівання, тобто формували перше полярне тільце (%ПТ) після 18 годин культивування. Так, після дії АОЦС в дозах 0.0005 мл - 56,3 2,8 % , а при 0.0001 мл - 60,12,6 % (p<0.05) ооцитів формували полярне тільце при 52,21,4 % в контролі ; після дії г-АОЦС в дозі 0.0004 мг/білка 53,51,0 % ооцитів формували перше полярне тільце, а в дозі 0.0002 мг/білка - 60,80,9 % (p<0.05) при 52,21,4 % в контролі.

Отримані нами дані розкривають деякі механізми пригнічуючої дії великих доз антиоваріальних антитіл і стимулюючої дії малих доз на жіночу репродуктивну функцію на рівні дозрівання ооцитів.

Вплив антиоваріальних антитіл при застосуванні їх in vitro на формування першого полярного тільця ооцитами мишей. Вплив великих доз антитіл на формування першого полярного тільця. Ооцити з зародковим пухирцем (ЗП+) від мишей на стадії діеструс культивували протягом 4 год потім ооцити без зародкового пухирця (ЗП-), тобто ті, що відновили мейоз, переносили в культуральне середовище з різними концентраціями г-АОЦС та г-НКС. При дії г-АОЦС в 0.2 мг/білка після 14 годин культивування жоден з (ЗП-) ооцитів, не формував перше полярне тільце. Після 20 годин культивування кількість ооцитів, що формували перше полярне тільце становила 12,51,7%. При дії контрольного препарату г-НКС в такій же дозі кількість ооцитів, що формували полярне тільце, через 14 і 20 годин була значно більшою і становила 14,42,2% та 20,42,2% (p<0.01), відповідно. Зменшення дози г-АОЦС до 0.02 мг/білка в меншей мірі гальмувало процес формування полярного тільця. Через 14 годин культивування 7,52,5 % ооцитів формували полярне тільце (при дії г-НКС - 16,21,6 %, p<0.01). Подальше зменшення дози г-АОЦС і г-НКС до 0.002 мг/білка пригнічуючого впливу на формування першого полярного тільця ооцита не приводило.

Таким чином, результати досліджень свідчать про гальмівну дію великих доз антиоваріальних антитіл на завершення процесу мейотичного дозрівання ооцитів - формування першого полярного тільця in vitro.

Вплив малих доз антитіл на формування ооцитами першого полярного тільця. Додавання до середовища культивування АОЦС в дозі 0.0005 мл пригнічувала формування першого полярного тільця ооцитами мишей без зародкового пухирця (ЗП-) однак тільки після 20 годин культивування in vitro; в дозі 0.0001 мл цій ефект менш виявлено. Дози г-АОЦС 0.0002 мг/білка та 0.0004 мг/білка, вірогідного впливу на формування першого полярного тільця ооцитами не мали.

Таким чином, додавання антиоваріальних антитіл в будь якій з використаних нами доз до середовища культивування ізольованого ооцита стимулюючого ефекту не викликало, у відміну від даних при введенні антитіл in vivo.

Вплив малої дози г-АОЦС на відновлення мейозу ооцитами мишей при їх ко-культивуванні в середовищі з кумулюсними клітинами. Щоб оцінити роль мікрооточення, нами показано вплив малих доз антитіл на відновлення мейозу ооцитами мишей при їх ко-культивуванні з кумулюсними клітинами. Після 3 год культивування КОКК мишей в середовищі з г-АОЦС в дозі 0,0002 мг/білка, КК відділяли від О. Далі ко-культивували відділені КК і О в тому ж середовищі і після 2 год такого ко-культивування відновлення мейозу ооцитами становило 50,01,4%, при 42,01,4% в контролі (5 год ко-культивування КК і О, в середовищі без г-АОЦС), (р<0.01). При 2 год ко-культивуванні КК (після впливу г-АОЦС) і інтактних О в новому середовищі відновлення мейозу ооцитами становило 47,02,7% при 42,01,4% в контролі (ко-культивування КК і О, в середовищі без г-АОЦС), (р<0.01). Культивування ооцитів без КК в середовищі з г-АОЦС становило 43,80,4% при 39,31,4% в контролі (культивування ооцитів без впливу г-АОЦС).

Таким чином, ми констатуємо стимулюючий вплив г-АОЦС в малих дозах при додаванні їх в культуральне середовище на відновлення мейозу ооцитами мишей при їх ко-культивуванні з КК. Нами вперше показана роль кумулюсних клітин в стимулюючому впливі антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу ооцитами мишей. Ці дані розширюють уявлення про роль мікрооточення ооцита в реакції фолікулів на дію антиоваріальних антитіл у великих дозах, яка показана в нашому відділі.

Вплив блокаторів кальцієвих каналів на формування першого порлярного тільця ооцитами при дії антиоваріальних антитіл in vitro. Існують численні свідчення того, що в патогенезі ряду захворювань таких, як боковий аміотрофічний склероз, міастенічний синдром Ламберт-Етона, інші види міастеній важливу роль відіграють аутоантитіла, здатні інтенсивно впливати на кальцієві, калієві та натрієві мембранні канали (Greenberg, 1994; Appel et al., 1994; Waxman, 1995; Mallea, Yoshino, 1994; Goldstein et al., 1994; Lennonet al., 1995; Takamori, 1995; Motomura et al., 1994; Shillito et al., 1995; Takigawa et al., 1995) і викликати істотні розлади в нервовій системі. Проте даних стосовно впливу антиоваріальних антитіл на кальцієві канали оолеми ооцитів ссавців не достатньо. Ми спробували визначити, чи впливають антиоваріальні антитіла в малих дозах на формування першого полярного тільця ооцитами в разі блокування кальцієвих каналів. Дослідження проводилися за допомогою блокаторів кальцієвих каналів L- і Т- типу (верапаміла та амілорида, відповідно) (Kaufman, Homa, 1993; Tang et al., 1988). Дані про здатність ооцитів формувати полярне тільце в середовищі з блокаторами кальцієвих каналів при дії малої дози г-АОЦС представлено в таблиці. Показано, що формування полярного тільця в О, які поновили мейоз, призупиняється під впливом верапаміла (для ооцитів на стадії діеструс) та амілорида (для ооцитів на стадії діеструс і еструс). Отже, дійсно, на оолемі ооцитів миші функціонують кальцієві канали L- і Т-типу, активність яких залежить від стадії естрального циклу і пов'язана з механізмами формування першого полярного тільця. При формуванні першого полярного тільця функціонують переважно канали Т-типу, і їх роль є більше вираженою на стадії еструс І. На фоні дії блокаторів кальцієвих каналів такі агенти як г-АОЦС та г-НКС в малих дозах, не мали стимулюючого впливу на процес формування першого полярного тільця ооцитами мишей. Отже вірогідних відмінностей у впливі антитіл відносно дії самих блокаторів ми не одержали.

Таблиця Кількість (ЗП-) ооцитів, які формували перше полярне тільце, (% ПТ) при впливі антитіл (Мm).

Примітка: *-p<0.01, **-p<0.05, вірогідності відмінностей між величинами (%ПТ) ооцитів при впливі блокаторів кальцієвих каналів в порівнянні з ооцитами при нормальних умовах.

Вплив різних доз та способів введення блокатора кальцієвих каналів верапаміла на дозрівання ооцитів мишей in vitro. Оскільки блокатор кальцієвих каналів верапаміл широко застосовується в медицині при лікуванні ряду захворювань, в першу чергу серцево-судинних, а наші дослідження показали, що цей препарат пригнічує дозрівання ооцитів вирішено було дослідити роль дози, кратності та способу його введення на ооцитогенез.

При введенні мишам внутрішньовенне та внутрішньоочеревинно верапаміла реєструвалося зменшення кількості ооцитів, які виділяли з одного яєчника миші. Верапаміл при 3- і 5-кратному введенні внутрішньовенне в дозах 0,2-2,5 мг/кг і внутрішньоочеревинно в дозах 0,7-5,0 мг/кг зменшував кількість ооцитів в яєчнику мишей і пригнічував їх здатність до мейотичного дозрівання in vitro.

Таким чином, нами вперше показано, що при введенні мишам верапаміла гідрохлорида відбувалося зменшення кількості ооцитів в яєчнику і пригнічувалася їх здатність до подальшого мейотичного дозрівання. Гальмівна дія верапаміла зростала по мірі збільшення дози і кратності його застосування. Ці дані дають можливість стверджувати, що застосування блокаторів Са-каналів в клініці може негативно впливати на різні системи, в тому числі і репродуктивну систему, а в разі наявностіі аутоімунного ураження яєчників посилювати ризик розвитку безпліддя.

ВИСНОВКИ

Досліджено дозрівання ооцитів миші в залежності від стадії естрального циклу за даними розподілу фолікулів і ооцитів в яєчнику за розмірами, відновленню і завершенню мейоза in vitro,а також участь позаклітинного кальцію, кальцієвих каналів і кумулюсних клітин в дозріванні ооцитів в нормі та при дії великих та малих доз антиоваріальних антитіл.

Показано, що здатність ооцитів до завершення мейозу - формуванню першого полярного тільця притаманна всім ооцитам, але підвищується по мірі росту ооцита, та переходу від стадії діеструс до стадії еструс.

Показано, що формування першого полярного тільця ооцитами є кальцій залежним. При відсутності кальцію в культуральному середовищі формування полярного тільця не відбувається ні на стадії проеструс, ні на стадії еструс. Зростання концентрації кальцію від нульової до фізіологічної (1,71 ммоль/л) супроводжується зростанням здатності ооцитів до формування першого полярного тільця, особливо на стадії еструс, а зростання від фізіологічної концентрації до 20 ммоль/л - поступовим зменшенням цієї здатності до повного пригнічення.

Встановлено, що при формуванні полярного тільця на оолемі функціонують кальцієві канали L- і Т- типу, але переважно останні, і їх роль більш виражена на стадії еструс. Блокатори кальцієвих каналів L- і Т- типу (верапаміл і амілорид, відповідно) пригнічували формування полярного тільця.

Показано, що контакти ооцита з кумулюсними клітинами призводять до секреції останніми термостабільних мейоз-активуючих чинників.

Встановлено, що антиоваріальні антитіла у великих дозах при застосуванні in vivo i in vitro пригнічують фолікуло - і ооцитогенез.

Показано, що малі дози антиоваріальних антитіл стимулюють фолікуло- ооцитогенез. Стимулюючий вплив антитіл на відновлення мейозу ооцитом здійснюється за участю кумулюсних клітин.