цАМФ–залежний механізм деполяризації судинного ендотелію

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 577.352

03.00.02 - Біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

цАМФ - залежний механізм деполяризації судинного ендотелію

Яроцький Віктор Валентинович

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України, доктор медичних наук, професор ендотелій вазоактивний норадреналін вазоконстриктор

Сагач Вадим Федорович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Завідувач відділом фізіології кровообігу

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор медичних наук, професор Шуба Михайло Федорович Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Завідувач відділом нервово-м'язової фізіології

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Коцюруба Анатолій Вікторович Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Провідна установа - Київський Національний університет ім. Тараса Шевченка кафедра біофізики

Захист відбудеться “10” вересня 2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4

Автореферат розісланий “21”червня 2002 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Актуальність проблеми

Судинний ендотелій являє собою суцільний моношар клітин судинної стінки, що контактують з кровю. Бурхливий розвиток досліджень ендотелію розпочався у 80-х роках минулого століття із встановлення ендотелійзалежної природи розслаблення судин Furchgot and Zawadski 1980, Furchgott et al 1982. Виявилось, що ендотелій виконує цілий ряд функцій, в тому числі, регуляцію судинного тонусу шляхом вивільнення вазоактивних речовин як дилятаторної, так і констрикторної дії [Сагач В.Ф., Ткаченко М.Н., 1993 Inagami T. et al., 1995, Ткаченко М.Н. 1997, Мойбенко О.О. та ін.,1997,]. Зокрема, було показано, що низка фізіологічно активних речовин, таких як ацетилхолін, брадікінін, АТФ, субстанція Р тощо викликають ендотелійзалежне розслаблення судин, що реалізується шляхом синтезу і вивільненням ендотелієм ендотеліального фактору розслаблення, ідентифікованого як оксид азоту [Ignarro L.J. et al, 1988].

Оксид азоту синтезується із амінокислоти L-аргініну за участю кальмодулінзалежного ферменту NO-синтази Palmer R.M.J. et al, 1987, Sakuma I. Et al, 1988, Schmidt H.H.H.W. et al, 1988 Busse R et al,1993. Тобто, продукція оксиду азоту залежить від концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Судинний ендотелій відносять до незбудливих клітин. Тому рівень кальцію в цитозолі ендотеліоцитів регулюється головним чином значенням мембранного потенціалу ендотеліальної мембрани, що визначає електрорушійну силу для входу іонів кальцію. З огляду на важливу роль NO в регуляції судинного тонусу є актуальним питання про поведінку мембранного потенціалу ендотелію при дії ряду агоністів, які є вазодилататорами. Можна вважати встановленим, що початкова фаза реакції мембранного потенціалу ендотелію на агоністи є швидка гіперполяризація. Механізми швидкої гіперполяризації, а також, її фізіологічна роль зясована Marchenko S.M. and Sage S.O., 1993, Inazu M, 1994. Однак, в наступних фазах відповіді ендотелію на агоністи можливий розвиток деполяризації мембрани [Sharma N.R., 1995, Marchenko S.M. and Sage S.O., 1993. Деполяризація мембрани повинна впливати на синтетичну активність ендотелію шляхом обмеження потоку зовнішньоклітинного кальцію. Однак, фізіологічне значення і механізми деполяризації судинного ендотелію залишаються до кінця не зясованими.

Переважна більшість досліджень мембранного потенціалу як у спокої, так і при стимуляції фізіологічно активними речовинами проведена на культурах ендотелію або ізольованих ендотеліальних клітинах. Результати, отримані в таких експериментах, є неоднозначними і суперечливими. Значно кращою моделлю є інтактний ендотелій ізольованої судини Marchenko S.M. and Sage S.O., 1993. Поки що такі роботи є малочисельними і дослідження електричних властивостей інтактного ендотелію іншого видового походження представляє собою значний інтерес.

З огляду на регуляторну функцію ендотелію особливий інтерес представляє питання про вплив вазоконстрикторів на мембранний потенціал судинного ендотелію. Лише одна робота Marchenko S.M. and Sage S.O., 1994 демонструє, що цілий ряд вазоконстрикторів може глибоко деполяризувати інтактний ендотелій. Було висловлено припущення, що деполяризація є виключно результатом дії вазоконстрикторів на судинні гладенькі мязи. Не виключено, що деполяризація судинного ендотелію у відповідь на дію вазодилятаторів і вазоконстрикторів може мати деякі спільні механізми, повязані саме з деполяризацією ендотелію. В звязку з цим є доцільним дослідження механізмів деполяризації ендотеліальної мембрани вазоконстрикторами і зясування можливої ролі ендотелію і судинних гладеньких мязів у її розвитку.

В звязку з цим було поставлено завдання дослідити механізми деполяризації судинного ендотелію.

Зв'язок теми дослідження з планом основних наукових робіт Інституту: Дисертаційна робота виконана згідно плану навчання в аспірантурі та в рамках наукових програм відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої Ради Інституту (протокол №4 від 19.02.1999).

Мета роботи: Метою даної роботи було виявити можливі цАМФ-залежні механізми деполяризації судинного ендотелію.

Задачі дослідження:

Дослідження мембранного потенціалу спокою інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля та механізмів його формування.

Вивчення електричних реакцій інтактного ендотелію на вазодилятатори ацетилхолін і аденозинтрифосфат і вазоконстриктори норадреналін і серотонін.

Дослідження впливу підвищення внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля та ролі цАМФ і цГМФ у розвитку деполяризації інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля.

Встановлення природи генерації цАМФ-залежної деполяризації інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля шляхом дослідження ізольованого шару ендотеліальних клітин від гладеньких мязів.

Вивчення природи деполяризації інтактного ендотелію неселективним агоністом адренорецепторів норадреналіном шляхом дослідження дії селективних агоністів адренорецепторів як на інтактний ендотелій ізольованої аорти кроля, так і на ізольований шар ендотеліальних клітин.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що підвищення концентрації цАМФ в цитозолі ендотеліальних клітин викликає деполяризацію мембрани. Вперше показано, що цАМФ-залежна деполяризація ендотеліальної мембрани є одним із механізмів розвитку деполяризації ендотелію, викликаної дією АТФ. Встановлено, що ні підвищення внутрішньоклітинної концентрації цГМФ, ні дія оксиду азоту не викликають деполяризації ендотеліальної мембрани. Продемонстровано, що в реакції мембранного потенціалу інтактного ендотелію на вазоконстриктори норадреналін і серотонін розвивається глибока деполяризація мембрани. Вперше показано, що деполяризація мембрани інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля, викликана дією норадреналіну, є складним результатом деполяризації гладенькомязевих клітин шляхом активації гладенькомязевих 1-адренорецепторів і деполяризації ендотеліальних клітин через активацію ендотеліальних -адренорецепторів. Виявлено, що деполяризація ендотелію, викликана дією агоністів -адренорецепторів, може бути цАМФ-залежною.

Теоретична та практична цінність роботи. Робота проводилась в рамках фундаментальних досліджень. Отримані результати дозволяють переглянути і розширити загальноприйняті уявлення про взаємозвязок між електричними реакціями судинного ендотелію у відповідь на дію вазоактивних речовин та синтетичною активністю ендотелію. Виявлено новий механізм розвитку деполяризації судинного ендотелію. Результати роботи підтвердили і виявили нові докази на користь твердження про складний механізм взаємовпливу ендотеліальних і гладенькомязевих клітин. Отримані результати розширють уявлення про механізми клітинної сигналізації судинного ендотелію. Окрім фундаментального значення, робота може мати значення для пошуків клінічних шляхів розвязання проблем патології серцево-судинної системи.

Особистий внесок пошукувача. Вся експериментальна частина досліджень була проведена автором. Також вся обробка і аналіз експериментальних результатів проведена автором. Автору належить основна редакція і написання статей за матеріалами досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені та обговорені на: конференції з міжнародною участю “Функциональная роль монооксида азота и пуринов” (Мінськ,2001), науковій конференції фізіологів України, присвяченій 160-річчю Національного медичного університету (Київ, 2001), Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001), засіданні Сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця (грудень 2001р), XVI зїзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002)

Публікації. Результати роботи опубліковано в 4 наукових статтях і тезах 3-х доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел з 199 найменувань. Роботу викладено на 145 сторінках та ілюстровано 32 рисунками.

Основний зміст дисертації

Методика

В експериментах були використані самці кролів породи шиншила вагою 2-2,5кг і віком 5 - 8 місяців яким вводили гепарин у вушну артерію із розрахунку 0,5мл/кг безпосередньо перед проведенням повітряної емболіії. Експерименти показали, що в такій концентрації гепарин не впливає на значення мембранного потенціалу спокою і запобігає звертанню крові на поверхні ендотелію.

Грудну частину аорти нарізали на сегменти довжиною 3-4мм і зберігали у модифікованому розчині Кребса наступного складу (ммоль/л): NaCl - 118,3; NaHCO3 - 25; KCl - 4,7; Na2HPO4 - 1,2; CaCl2 - 2,5; MgSO4*7H2O - 1,2; глюкоза - 11,1; (всі виробництва Sigma-Aldrich) гентаміцин - 50мкг/мл. Модифікований розчин Кребса аерувався сумішшю повітря (95%) та СО2 (5%). Отримані судинні кільця аорти можна було використовувати для електрофізіологічних досліджень протягом двох діб.

Ізольований шар ендотеліальних клітин отримували при допомозі власноруч виготовлених із голок для інсулінових інєкцій мікроінструментів Ендотеліальний шар механічно відділяли від гладеньких мязів разом із сполучною тканиною, що безпосередньо прилягає до нього. Процедуру виділення проводили під стереомікроскопом МБС-9. Отриманий ізольований шар ендотеліальних клітин (близько 4мм2) закріплювали в камері обємом близько 100 мкл. Камеру перфузували розчином Кребса із швидкістю 0,6 мл/хв.

Мембранний потенціал ендотелію вимірювали з використанням методу перфорованого patch-clamp у режимі фіксації струму. Для перфорації ендотеліальної мембрани використовували антибіотик ністатин, кінцева концентрація якого у піпетці становила 100 мкг/мл). Піпетки заповнювали розчином, що містив (ммоль/мл): KCl - 149; NaCl -10; HEPES-KOH - 10 (рН7,3 доводили за допомогою КОН).

Для аплікацій використовували N-метил-D-глюкамін, ацетилхолін, АТФ, норадреналін, серотонін, ізобутилметилксантин, теофілін, букладезин, 8-Br-цГМФ, нітопрусид натрію, MDL-12330A, фенілефрин, ізопротеренол (виробництва Sigma-Aldrich). Як розчинник використовували бідистильовану воду та диметилсульфоксид (виробництва Sigma-Aldrich).

Дослідження проводили при температурі 20 - 24 С.

Експериментальні результати обробляли за допомогою статистичної програми “ORIGIN 6.0”.

Результати досліджень

Електричні властивості інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. Оскільки електричні властивості інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля взагалі не були досліджені і описані, на першому етапі роботи було поставлено за мету визначити значення мембранного потенціалу спокою ендотелію, характер його розподілу, та вклад різних іонних провідностей у його формування. Також було досліджено реакції ендотелію на вазодилататори і вазоконстриктори.

Дослідження показали, що значення мембранного потенціалу спокою інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля демонстрували високу стабільність протягом реєстрацій. Рєстрації від ендотелію однієї судинної смужки, різнилися до 2 мВ, а реєстрації, отримані від ендотелію різних судинних смужок, але із однієї аорти відрізнялись не більше, ніж на 4 мВ. Діапазон значень потенціалу спокою становив - 58 - 35 мВ, а середнє значення -46,85,1 мВ, розподіл значень носив одномодовий характер (Рис. 1 А).

Вважають що мембранний потенціал спокою ендотелію формується переважно калієвою, натрієвою та хлорною провідностями. Для перевірки вкладу калієвої провідності використовували перфузію препарату розчином із підвищеною концентрацією іонів калію (20, 40 і 60 ммоль/л). В результаті цього спостерігалась деполяризація мембрани інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. Отримані експериментально значення мембранного потенціалу порівняли із теоретично розрахованими за формулою Нернста значеннями калієвого рівноважного потенціалу (Рис.1 Б)

Для дослідження вкладу натрієвої провідності у формування потенціалу спокою ендотелію у перфузуючому розчині 59ммоль/л NaCl еквімолярно заміщували на N-метил-D-глюкамін, при цьому спостерігалась гіперполяризація на 4,31,6 мВ (n=3). Аналогічно, для встановлення ролі хлорної провідності 59ммоль/л NaCl еквімолярно заміщували на натрій оксибутират (n=5), при цьому мембранний потенціал залишався без змін. Із отриманих результатів було розраховано відношення проникностей для натрію і хлору по відношенню до проникності для калію PNa/PK і PCl/PK із рівняння Ходжкіна - Каца. Виявилось, що PNa/PK=0,115 і PCl/PK=0.

В наступних експериментах було досліджено вплив вазодилататорів ацетилхоліну (АЦХ) і аденозинтрифосфату (АТФ) на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. Аплікація 1 мкмоль/л АЦХ викликала швидку гіперполяризацію на 13,15,1 мВ, яка змінювалась на незначну деполяризацію, або тривалу гіперполяризацію (Рис. 3). Аплікація 100 мкмоль/л АТФ викликала незначну швидку деполяризацію, що змінювалась швидкою гіперполяризацією на 9,75,7 мВ, після якої спостерігалась деполяризація вище потенціалу спокою і яка змінювалась реполяризацією ендотеліальної мембрани (Рис. 4). Повторна аплікація АЦХ не змінювала відповідь мембранного потенціалу, тоді як для АТФ спостерігалась десенситизація.

Далі була досліджена реакція мембранного потенціалу інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля на вазоконстриктори норадреналін і серотонін. Виявилось, що і норадреналін, і серотонін дозозалежно деполяризували мембрану ендотелію (Рис. 5).

Вплив циклічних нуклеотидів на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. Було висловлено припущення, що в розвитку деполяризації інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля може бути обумовлене зростанням концентрації циклічних нуклеотидів в цитозолі ендотеліоцитів. На даному етапі роботи ми намагалися перевірити цю гіпотезу. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів досягали шляхом аплікації блокаторів фосфодиестераз ізобутилметилксантину (ІВМХ) (1 ммоль/л) та теофіліну (10 ммоль/л). В обох випадках спостерігалась деполяризація мембрани ендотеліальних клітин на 8,83,0 мВ (n=7) і 193,9 мВ (n=8) відповідно (Рис.6). На відміну від теофіліну, в реакції мембранного потенціалу інтактного ендотелію на ІВМХ після деполяризації спостерігалась реполяризація.

Для того, щоб зясувати які саме циклічні нуклеотиди беруть участь в розвитку деполяризації мембрани інтактного ендотелію, використовували мембранопроникаючий аналог цАМФ N-дибутирил-цАМФ (букладезин) у концентрації 10ммоль/л і мембранопроникаючий аналог цГМФ 8-Br-цГМФ у концентрації 5 ммоль/л. Виявилось, що лише букладезин викликав деполяризацію мембрани інтактного ендотелію ізольованої аорти на 8,71,0 мВ (n=7 Рис.7.А), а 8-Br-цГМФ не впливав на мембранний потенціал ендотелію (n=7 Рис.7.Б). Аналогічно, донор оксиду азоту нітропрусид натрію (10мкмоль/ (n=5) та 100мкмоль/л (n=5)), що використовувався для зясування питання можливої активації розчинної гуанілатциклази і, таким чином, збільшення внутрішньоклітинної концентрації цГМФ, також не впливав на мембранний потенціал (Рис.7.В)

Для зясування роль цАМФ-залежної деполяризації у електричних відповідях ендотеліальної мембрани, стимульованої АТФ, використовували аплікацію неселективного блокатора аденілатциклаз MDL-12330A у концентрації 100мкмоль/л під час розвитку фази деполяризації інтактного ендотелію, викликаної аплікацією 100 мкмоль/л АТФ. При цьому спостерігалось зворотнє інгібування деполяризації (Рис.8). Як додатковий аргумент на користь участі цАМФ-залежної деполяризації в електричній реакції ендотелію на АТФ досліджували кореляцію амплітуд деполяризації, викликаної аплікацією АТФ і ІВМХ. Для цього здійснювали послідовні аплікації 100 мкмоль/л АТФ 1 ммоль/л ІВМХ. Отримані дані демонстрували кореляцію у амплітуді деполяризації мембрани інтактного ендотелію відносно потенціалу спокою із коефіцієнтом кореляції k=0,8.

Вплив агоністів адренорецепторів і цАМФ на мембранний потенціал ізольованого від ГМК шару ендотеліальних клітин аорти кроля. Як було показано вище, цАМФ-залежна деполяризація є одним із компонентів електричної реакції інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля, викликаної дією АТФ. Однак, окрім вазодилататорів деполяризацію інтактного ендотелію ізольованої аорти також можуть викликати і вазоконстриктори. Хоча вважають, що деполяризація ендотелію при аплікації вазоконстрикторів є результатом деполяризації гладеньких мязів, ми не виключили можливої участі цАМФ-залежної деполяризації. Тому на цьому етапі досліджень ми намагалися встановити можливу роль цАМФ-залежної деполяризації, описаної вище, у електричних реакціях інтактного ендотелію на вазоконстриктори, зокрема, на норадреналін. Для цього було досліджено вплив селективних агоністів адренорецепторів на інтактний ендотелій ізольованої аорти кроля і на ізольований від гладеньких мязів шар ендотеліальних клітин.

Виявилось, що агоніст 1- адренорецепторів фенілефрин (0,1ммоль/л) викликав глибоку деполяризацію інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля на 17,12,6мВ (n=9) і водночас не змінював значення мембранного потенціалу ізольованого від ГМК шару ендотеліальних клітин (Рис.9). Таким чином, реакція ізольованого шару ендотеліальних клітин на фенілефрин може бути критерієм якості ізоляції ендотеліального шару від підлеглого шару гладеньких мязів - ендотеліальний шар ізольовано якісно, якщо практично відсутня реакція на фенілефрин.

Аплікація агоніста -адренорецепторів ізопротеренолу (0,1 ммоль/л) викликала деполяризацію на 17,41,9 мВ (n=4), яка супроводжувалась осциляціями в інтактному ендотелії аорти кроля (Рис.10.А). В ізольованому шарі ендотеліальних клітин ізопротеренол в тій же концентрації викликав деполяризацію на 14,5,6 мВ (n=5), яка змінювалась реполяризацією. При цьому осциляції зникали (Рис.10.Б).

Аналогічна реакція до дії ізопротеренолу на ізольований шар ендотелію спостерігалась при дії норадреналіну (10 мкмоль/л,) та ІВМХ (1 ммоль/л,) - деполяризація на 11,85,1 мВ (n=6) і на 19,73,5 мВ (n=6), що змінювалась реполяризацією (Рис.11). Оскільки активація -адренорецепторів норадреналіном і ізопротеренолом підвищують в ендотелії рівень цАМФ (як і ІВМХ), то ця деполяризація з великою імовірністю є цАМФ-залежною.

Досліди з ізольованим від гладеньких мязів шаром ендотеліальних клітин також показали, що цАМФ-залежна деполяризація, яка спостерігається при стимуляції інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля АТФ, розвиваються власне в ендотелії, а не в гладеньких мязах.

Заключення

Наші дослідження показали, що значення мембранного потенціалу спокою інтактного ендотелію аорти кроля відзначаються високою стабільністю, характеризуються одномодовим розподілом значень. Це відповідає результатам, описаним в літературі, отриманих від інтактного ендотелію іншого видового походження [Marchenko S.M. and Sage S.O., 1993.]. Окрім того, особливості мембранного потенціалу спокою, що були досліджені, а саме, висока стабільність протягом реєстрації, порівняно вузький діапазон значень, одномодовий характер розподілу значень, дозволяють говорити, що обрана модель досліджень - інтактний ендотелій ізольованої аорти кроля - є більш вдалою у порівнянні із культурою ендотеліальних клітин.

Вважають, що мембранний потенціал спокою ендотелію формується натрієвою, калієвою та хлорною провідністю [Nilius B. et al., 1997]. Наші дослідження говорять про те, що мембраний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля формується переважно калієвою і натрієвою провідністю, хлорна провідність не приймає участі у формуванні мембранного потенціалу спокою.

В ході роботи було показано, що агоністи-вазодилататори ацетилхолін та АТФ викликають складну електричну реакцію, початковою фазою якої є швидка гіперполяризація, яка змінювалась незначною деполяризацією або плато гіперполяризації у випадку дії АЦХ і глибокою деполяризацією, що змінювалась реполяризацією у випадку дії АТФ. Початкова фаза відповіді на АЦХ чи АТФ - швидка гіперполяризація - є детально дослідженою. Вона є результатом активації кальційзалежних калієвих каналів [Adams D.J. et al, 1993 Nilius B. et al., 1997]. Однак, можлива деполяризація після швидкої гіперполяризації є маловивченою. Ми досліджували фазу деполяризації, викликану дією АТФ. Було висловлено гіпотезу, що АТФ-викликана фаза деполяризації може бути обумовлена зростанням внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів. Тому наступними експериментами було показано, що дійсно, зростання внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів, яке досягалося аплікаціями блокаторів фосфодиестераз ІВМХ і теофіліном, викликає деполяризацію ендотеліальної мембрани. Досліди із мембранопроникаючими аналогами цАМФ букладезином та цГМФ 8-Br-цГМФ, а також, із донором оксиду азоту нітропрусидом натрію показали, що саме цАМФ, а не цГМФ викликає деполяризацію судинного ендотелію. Це суперечить гіпотезі про існування негативного зворотнього звязку між продукцією оксиду азоту і розвитком деполяризації ендотеліальної мембрани через катіонні канали, ворітні механізми яких регулюються циклічними нуклеотидами [Nilius,2001]. Такий механізм описано на культурі ендотелію [Wu S. et.al., 2000]. Ми вважаємо, що ця невідповідність нашим результатам може бути породженням обраної моделі експерименту, а саме, культури ендотелію.

Досліди з ізольованим від гладеньких мязів шаром ендотеліальних клітин, в яких для підвищення внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів використовували ІВМХ, дозволили встановити, що цАМФ-залежна деполяризація, яка спостерігалась в інтактному ендотелії ізольованої аорти кроля, розвивається саме в ендотеліальних клітинах, а не є результатом деполяризації підлеглих гладеньких мязів, що передається через ефективні електричні міоендотеліальні контакти.

Аплікація блокатора аденілатциклаз MDL-12330A на фоні фази деполяризації, викликаної дією АТФ та кореляція із деполяризацією, викликаною аплікацією ІВМХ підтвердили, що цАМФ-залежна деполяризація присутня у електричній відповіді ендотелію на АТФ, проте, неповне інгібування деполяризації вказує на участь в деполяризації інших механізмів.

Стає цілком зрозумілим, чому при аплікації ацетилхоліну фаза деполяризації була слабо виражена - активація деяких типів мускаринових рецепторів приводить до пригнічення активності аденілатциклаз. Тому слабо виражена фаза деполяризації при дії ацетилхоліну є також відображенням присутності в ендотелії аорти кроля цАМФ-залежної деполяризації.

цАМФ-залежна деполяризація відіграє важливу роль у ендотелійзалежному розслаблені, викликаному дією АТФ. Дійсно, для продукції оксиду азоту необхідно активувати кальційзалежний фермент ендотеліальну NO-синтазу. Однак, тривале збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію може привести до запуску механізмів смерті ендотеліальних клітин. Як механізм обмеження вхідного потоку іонів кальцію є деполяризація ендотеліальної мембрани, викликана зростанням цАМФ. І, хоча при наявності такого механізму концентрація внутрішньоклітинного кальцію буде зменшуватись за рахунок зменшення значення електрорушійної сили для вхідного потоку іонів кальцію, підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ збільшує активність NO-синтази [Zhang X. and Hintze T.H., 2001], що дозволяє підтримувати рівень продукції оксиду азоту на високому рівні при зменшенні концентрації кальцію. Таким чином, ми спостерігаємо складну взаємодію між електричною та кальцієвою сигналізацією і цАМФ. На основі наших досліджень ми запропонували схему регуляції синтезу оксиду азоту при дії АТФ (Рис.12).

Однак, деполяризацію інтактного ендотелію можуть викликати також і вазоконстриктори [Marchenko S.M. and Sage S.O., 1994]. Зокрема, нами було показано, що норадреналін і серотонін викликають деполяризацію інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля.

Цілком можливо, що там також є цАМФ-залежний компонент. Тому в наступних експериментах було зроблено спробу встановити можливу участь цАМФ-залежної деполяризації у реакції на норадреналін, який є неселективним агоністом адренорецепторів. Було показано, що фенілефрин, агоніст 1-адренорецепторів, викликав глибоку деполяризацію інтактного ендотелію аорти кроля, хоча в ізольованому шарі ендотеліальних клітин реакція деполяризації не спостерігалась взагалі. Агоніст -адренорецепторів ізопротеренол викликав деполяризацію, що супроводжувалась осциляціями, інтактного ендотелію і деполяризацію, яка змінювалась реполяризацією ізольованого шару ендотеліальних клітин. Осциляції, що спостерігались при дії агоністів адренорецепторів на інтактний ендотелій ізольованої аорти кроля, можуть бути результатом осциляцій мембранного потенціалу гладеньких мязів внаслідок активації 1-адренорецепторів [Marchenko S.M. and Sage S.O., 1994].

Аналогічну до ізопротеренолу за кінетикою реакцію викликав і норадреналін у ізольованому шарі ендотеліальних клітин. Відомо, що ізопротеренол підвищує рівень цАМФ в ендотеліоцитах [Wang H.Z. et al, 2000]. Реакція ізольованого шару ендотеліальних клітин на ізопротеренол за своїм характером цілком відповідала реакції цього ж препарату на ІВМХ. Дійсно, ІВМХ також викликав деполяризацію, що змінювалась реполяризацією ізольованого шару ендотеліальних клітин. Тому з високою імовірністю можна сказати, що деполяризація ендотелію, повязана із активацією -адренорецепторів, є результатом цАМФ-залежної деполяризації. Відомо, що активація -адренорецепторів викликає реакцію розслаблення судинних препаратів. Очевидно, що одним із пояснень цього може бути зростання концентрації цАМФ в ендотелії, що веде до підвищення активності ендотеліальної NO-синтази.

Таким чином, отримані результати вказують на те, що реакція на норадреналін, яка спостерігається в інтактному ендотелії, є результатом деполяризації гладеньких мязів внаслідок активації гладенькомязевих 1-адренорецепторів і передачі її до ендотелію через міоендотеліальні контакти і деполяризації власне ендотелію внаслідок активації ендотеліальних -адренорецепторів. Деполяризація ендотелію, повязана із активацією -адренорецепторів обумовлена зростанням внутрішньоклітинної концентрації цАМФ, тобто також є цАМФ-залежною.

Висновки

В результаті отриманих експериментальних результатів вдалось зробити наступні висновки:

Встановлено, що мембранний потенціал спокою інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля формується калієвою і натрієвою провідністю. Хлорна провідність не вносить вклад у мембранний потенціал спокою інтактного ендотелію.

Зясовано, що перша фаза відповіді мембранного потенціалу інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля на агоністи ацетилхолін і аденозинтрифосфат є швидка гіперполяризація ендотеліальної мембрани. В наступних фазах відповіді ацетилхолін деполяризував мембрану нижче потенціалу спокою, а аденозинтрифосфат викликав глибоку деполяризацію, яка змінювалась реполяризацією мембрани ендотелію.

Вперше показано, що підвищення внутрішньоклітинної концентрації циклічних нуклеотидів у цитозолі ендотеліальних клітин викликає деполяризацію мембрани. Встановлено, що деполяризація обумовлена саме циклічним аденозинмонофосфатом, а не циклічним гуанозинмонофосфатом. Показано, що оксид азоту не впливає на мембранний потенціал інтактного ендотелію.

Вперше показано, що одним із механізмів агоніст-викликаної фази деполяризації ендотеліальної мембрани аорти може бути цАМФ-залежна деполяризація. Встановлено, що вазоконстриктори норадреналін і серотонін викликають деполяризацію інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля.

Вперше показано, що деполяризація інтактного ендотелію ізольованої аорти норадреналіном ініціюється активацією гладенькомязевих 1-адренорецепторів і активацією -адренорецепторів ендотеліальних клітин. Механізм деполяризації, викликаний активацією -адренорецепторів ендотелію може бути цАМФ-залежним.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Яроцький В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Вплив агоністів адренорецепторів і циклічних нуклеотидів на мембранний потенціал ізольованого шару ендотеліальних клітин аорти кроля // Фізіол. журн. - 2002. - Т. 48, №1. - С. 25-29.

2. Яроцький В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Вплив циклічних нуклеотидів на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля // Фізіол. журн. - 2001. - Т.47. - №6. - С. 3-9.

3. Яроцький В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Електричні властивості інтактного ендотелію аорти кроля // Фізіол. журн. - 2001. - Т. 47, №1. - С. 9-16.

4. Яроцкий В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Влияние циклических нуклеотидов на мембранный потенциал интактного эндотелия изолированной аорты кролика. Функциональная роль монооксида азота и пуринов. Минск: Бизнесофсет. 2001, С. 211-213.

5. Яроцький В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Електричні властивості нестимульованого ендотелію грудної аорти кроля. В зб. “Історія та сучасні досягнення фізіології в Україні” наукової конференції, присвяченій 160 річчю Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця. Київ, 2001. - C.41.

6. Яроцький В.В., Марченко С.М. Вплив цАМФ та цГМФ на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. В зб. “Актуальні проблеми гастроентерології” Всеукраїнської наукової конференції, Київ, 2001, С.61.

7. Яроцький В.В., Сагач В.Ф., Марченко С.М. Вплив вазоактивних речовин на мембранний потенціал інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. В фізіол. журн., Т.48, №2. Матеріали ХVI зїзду Українського фізіологічного товариства, Вінниця, 2002, С. 86.

Анотація

Яроцький Віктор Валентинович. цАМФ-залежний механізм деполяризації судинного ендотелію. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02. - Біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. - Київ, 2001р.

Дисертацію присвячено дослідженню ролі цАМФ у розвитку електричних реакцій ендотелію аорти кроля, викликаних дією вазоактивних речовин. Використовуючи модель інтактного ендотелію ізольованої аорти, встановлено, що збільшення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ в цитозолі ендотеліоцитів викликало деполяризацію мембрани ендотелію. За допомогою блокатора аденілатциклаз MDL-12330A показано, що цАМФ-залежна деполяризація є одним із механізмів фази деполяризації, викликаної дією АТФ. Встановлено, що цГМФ не приймає участі у розвитку деполяризації інтактного ендотелію ізольованої аорти кроля. Це ставить під сумнів існування зворотнього звязку між продукцією оксиду азоту та деполяризацією мембрани ендотелію, що описано в культурі ендотеліальних клітин. Показано, що вазоконстриктори норадреналін і серотонін викликають деполяризацію інтактного ендотелію аорти кроля. Деполяризація, викликана дією норадреналіну обумовлена деполяризацією гладеньких мязів внаслідок активації 1-адренорецепторів і деполяризацією власне ендотелію внаслідок активації -адренорецепторів. Деполяризація ендотелію, викликана активацією -адренорецепторів, є цАМФ-залежною.

Ключові слова: ендотелій, електрична сигналізація, цАМФ, цГМФ, оксид азоту, адренорецептори.

Аннотация

Яроцкий Виктор Валентинович. цАМФ-зависимый механизм деполяризации сосудистого эндотелия. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02. - Биофизика. - Институт физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины. - Киев, 2001г.

Диссертация посвящена иссследованию роли цАМФ в развитии электрических реакций эндотелия аорты кролика, вызванных действием вазоактивных веществ. Исследовано свойства мембранного потенциала нестимулированного эндотелия, к которым относятся распределение и характерные значения мембранного потенциала покоя и типы проводимости, формирующие мембранный потенциал эндотелия. Оказалось, что значения потенциала покоя характеризуются одномодовым распределением, лежат в узком диапазоне значений и имеют высокую стабильность при регистрациях, а мембранный потенциал формируется калиевой и натриевой, но не хлорной проводимостью. Исследования, проведенные на интактном эндотелии изолированной аорты кролика показали, что при действии агонистов-вазодилататоров, таких как ацетилхолин и АТФ после быстрой гиперполяризации эндотелия может наблюдаться деполяризация. В экспериментах с блокаторами фосфодиэстераз изобутилметилксантином и теофиллином, а также, мембранопроникающими аналогами цАМФ букладезином и цГМФ 8-Br-цГМФ было показано, что деполяризация интактного эндотелия может быть результатом повышения внутриклеточной концентрации цАМФ. Повышение внутриклеточной концентрации цГМФ не влияло на мембранный потенциал эндотелия. Считают, что оксид азота может активировать эндотелиальную расворимую гуанилатциклазу, таким образом, повышать внутриклеточную концентрацию цГМФ. Эксперименты с донором оксида азота нитропруссидом натрия продемонстрировали отсутствие реакции мембранного потенциала. Таким образом, полученные результаты опровергают существование негативной обратной связи между продукцией оксида азота и мембранным потенциалом эндотелия, которая наблюдается в культуре эндотелиальных клеток. Эксперименты с неселективным блокатором аденилатциклаз MDL-12330A продемонстрировали, что в фазе деполяризации интактного эндотелия, вызванной действием АТФ, присутствует компонент цАМФ-зависимой деполяризации, однако он не является единственным механизмом деполяризации эндотелиальной мембраны в реакции эндотелия на АТФ. Эксперименты с изолированным от гладких мышц слоем эндотелиальных клеток показали, что цАМФ-зависимая деполяризация - эффект, который реализуется в эндотелии, а не результат деполяризации гладких мышц, которая передается через эффективные электрические миоэндотелиальные связи от гладких мышц к эндотелию. Показано, что вазоконстрикторы норадреналин и серотонин способны деполяризовать интактный эндотелий изолированной аорты кролика. Было продемонстрировано, что агонист 1-адренорецепторов фенилэфрин и -адренорецепторов изопротеренол деполяризуют интактный эндотелий изолированной аорты кролика. На изолированном от гладких мышц слое эндотелиалных клеток аорты кролика показано, что фенилэфрин не вызывал изменений мембранного потенциала эндотелия, а изопротеренол вызывал деполяризацию, которая сменялась реполяризацией эндотелиальной мембраны. Аналогичную изопротеренолу реакцию на препарате изолированного слоя эндотелиальных клеток демонстрировала аппликация норадреналина - деполяризация, сменяющаяся реполяризацией. Учитывая то, что активация -адренорецепторов, экспрессированных в эндотелии, вызывает повышение внутриклеточной концентрации цАМФ, пришли к выводу, что деполяризация изолированного от гладких мышц слоя эндотелиальных клеток есть цАМФ-зависимой. Таким образом, деполяризация интактного эндотелия при действии норадреналина - это комплексный ответ, обусловленный деполяризацией гладкомышечных клеток вследствие активации гладкомышечных 1-адренорецепторов, которая передается через миоэндотелиальные контакты, и цАМФ-зависимой деполяризацией собственно эндотелиальных клеток вследствие активации эндотелиальных -адренорецепторов.

Ключевые слова: эндотелий, электрическая сигнализация, цАМФ, цГМФ, оксид азота, адренорецепторы.

Annotation

Yarotsky Victor Valentinovich. cAMP-dependent mechanism of depolarization of vessel endothelium. - Manuscript.

Thesis for candidate's degree by speciality - 03.00.02. - Biophysics. - Bogomolets Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The dissertation deals with a role of cAMP in electrical reactions of a rabbit aorta endothelium that induced by action of vasoactive substances. Using a model of intact endothelium of isolated aorta, it has been established that increasing of the intracellular cAMP concentration induced the endothelial membrane depolarization. With assistance of the adenylyl cyclase blocker MDL-12330A, it has been shown that cAMP-dependent depolarization is one of mechanisms of the depolarizing phase that induced by ATP. It has been established that cGMP do not take part in the development of depolarization of the intact endothelium of isolated rabbit aorta. It puts under doubt the existence of the negative feedback between a nitric oxide producing and an endothelial membrane depolarization described in the endothelial cells culture. It has been shown that vasoconstrictors noradrenaline and serotonin cause depolarization of the intact endothelium of rabbit aorta. A noradrenaline-affected depolarization is caused by smooth muscle cells depolarization owing to 1-adrenoceptors activations and actually endothelium depolarization owing to -adrenoceptors activation. -adrenoceptors-activating depolarization is the cAMP-dependent.

Key words: endothelium, electrical signaling, cAMP, cGMP, nitric oxide, adrenoceptors.

Размещено на Allbest.ru