Метаболізм азоту у прісноводних водоростей та його роль у формуванні їх угруповань і якості води

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГІДРОБІОЛОГІЇ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

МЕТАБОЛІЗМ АЗОТУ У ПРІСНОВОДНИХ ВОДОРОСТЕЙ ТА ЙОГО РОЛЬ У ФОРМУВАННІ ЇХ УГРУПОВАНЬ І ЯКОСТІ ВОДИ

Спеціальність: Гідробіологія

Клоченко Петро Дмитрович

Київ, 2002 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. У зв'язку з ростом антропогенного навантаження на водойми особливо загострилася проблема якості води, що зумовлює необхідність з'ясування механізмів функціонування водних екосистем з метою управління їх станом. Значний інтерес при цьому становить кругообіг азоту. Від кількісного та якісного складу азотовмісних речовин залежать ступінь продуктивності водойм, а також якість води в них. Сполуки азоту характеризуються високою біологічною активністю, беруть участь у метаболічних процесах гідробіонтів та істотно погіршують органолептичні властивості води.

В екологічному метаболізмі азоту важливу роль відіграють водорості, клітини яких здатні засвоювати як неорганічні (аміак, нітрити, нітрати), так і органічні сполуки азоту, а також молекулярний азот (Сиренко, 1972, Кузьменко, 1981). Разом з тим водорості прижиттєве, а також після відмирання виділяють у воду різноманітні азотовмісні речовини, які суттєво впливають на формування біоценозів та якість води (Хайлов, 1971, Сакевич, 1985, Сиренко, Козицкая, 1988).

Однак попри чисельні літературні дані щодо різнобічного впливу азотовмісних сполук на розвиток водоростей та їх участі в кругообігу азоту у природних водах все ще не розкритими залишаються фізіолого-біохімічні механізми формування угруповань фітопланктону, а також не до кінця розшифровані процеси, які супроводжуються накопиченням біологічно активних азотовмісних речовин у клітинах водоростей та у воді. Відсутність належних знань про хімічну природу метаболітів водоростей та шляхи їх трансформації у водному середовищі не дозволяє зробити остаточні висновки про складні хімічні взаємовідносини в угрупованнях гідробіонтів, а отже розкрити сутність функціонування прісноводних екосистем.

З'ясування особливостей метаболізму азоту у водоростей пов'язане також з необхідністю обґрунтування шляхів підвищення продуктивності водойм та зменшення негативного впливу біологічно активних речовин водоростевого походження на гідробіоценози та якість питної води.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота тісно пов'язана з виконанням планових наукових досліджень Інституту гідробіології НАН України, державних проектів та міжнародних грантів, зокрема держбюджетних тем "Оцінити роль водяних рослин у процесах трансформації азотовмісних сполук у водоймах різного типу" (номер держ. реєстрації 0194U019358), "Дослідити зв'язок функціональних та морфологічних характеристик фотосинтезуючих гідробіонтів з факторами формування якості води" (№0197U003309), "Дослідити фізіолого-біохімічні механізми впливу гідрофітів на зміну ряду показників якості води" (№0198U003582), "Дослідити вплив біологічно активних сполук водяних рослин на формування якості води та перспективи їх практичного використання" (№0100U003771), проекти Комітету України по науці та технологіях "Визначення механізмів і кількісна оцінка процесів самоочищення, детоксикації, дезактивації забруднень у водних екосистемах різного типу з метою розробки заходів по відновленню стану природних водойм України" (шифр 6/97), "Створити уніфіковану базу даних для Дніпра, його водосховищ та головних притоків у межах України і на цій основі розробити комплексну оцінку та прогноз їх стану" (№01.06/08076) і міжнародні гранти "To study adaptive and morphological changes in aquatic plants under the influence of radioactive and chemical contamination with the purpose of bioindication and prediction of ecological consequences" (ISF, №UAV 000), "Toxic species of blue-green algae in the water bodies of Ukraine: biology, morphology, potential activity, influence on the water quality, perspectives of using" (CRDF, №UB1-331) та "Cyanobacterial agents for agricultural fungal pest control" (INTAS, №95-238).

Мета і завдання дослідження.

Метою даної роботи було встановлення закономірностей асиміляції, трансформації та виділення сполук азоту прісноводними водоростями і з'ясування ролі цих процесів у формуванні альгоугруповань та якості води. Для цього необхідно було виконати такі завдання:

- вивчити специфіку асиміляції і трансформації неорганічних сполук азоту та сечовини залежно від біологічних особливостей водоростей, що вегетують як в умовах культур, так і в різних біотопах водних екосистем;

- встановити закономірності взаємозв'язку між ступенем розвитку фітопланктону, особливостями його якісного складу та динамікою вмісту неорганічних сполук азоту як у водосховищах Дніпра, так і в його притоках;

- виявити особливості механізмів, що регулюють зміни угруповань планктонних водоростей під впливом азотовмісних сполук;

- оцінити вплив рослинного планктону на динаміку вмісту білковоподібних речовин, вільних амінокислот і летких амінів у прісноводних екосистемах;

- дослідити кількісний та якісний склад органічних азотовмісних екзо- та ендогенних продуктів життєдіяльності прісноводних водоростей і розкладу їх біомаси;

- вивчити особливості трансформації азотовмісних органічних речовин водоростевого походження, ідентифікувати сполуки, що утворюються при цьому, та оцінити їх значення для екологічного і санітарно-гігієнічного стану водного середовища.

Об'єкт дослідження: механізми функціонування прісноводних екосистем.

Предмет дослідження: метаболізм азоту у водоростей та його значення в прісноводних екосистемах.

Методи дослідження: загальноприйняті методи відбору і опрацювання проб водоростей та їх культивування, фотоколориметрія та спектрофотометрія при визначенні вмісту неорганічних і органічних сполук азоту, пігментів та активності ферментів, мас-спектроскопічний аналіз для встановлення вмісту 15N і хімічної структури метаболітів водоростей, газова, рідинна та іонообмінна хроматографія при визначенні складу азотовмісних сполук водоростевого походження, ELISA для оцінки вмісту альготоксинів. Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у синьо-зелених і зелених водоростей виявлено суттєві відмінності в активності ферментних систем, які здійснюють зв'язування аміаку, що має істотне значення для процесів формування угруповань рослинного планктону. Показано, що внесення в природну воду вуглеамонійних солей та сечовини супроводжується змінами видового складу альгоугруповань та інтенсивності їх розвитку: знижується вегетація представників Cyanophyta і посилюється розвиток зелених водоростей, в першу чергу із порядків Volvocales і Chlorococcales, які активно споживаються зоопланктоном.

Вперше на прикладі водосховищ Дніпра і водотоків його басейну встановлено позитивний зв'язок між біомасою планктонних водоростей та концентрацією в природній воді нітритів. Співвідношення процесів поглинання і виділення нітритного азоту значною мірою залежить від складу домінуючого комплексу рослинного планктону.

Вперше на прикладі видів роду Scenedesmus встановлена залежність вмісту нітритного азоту в культуральному середовищі від таксономічного положення водоростей.

Показано, шо максимальний питомий вміст нітритів у альгологічно чистих та аксенічних культурах синьо-зелених і зелених водоростей спостерігається в період їх активної життєдіяльності.

З'ясовані особливості взаємозв'язку між добовими коливаннями вмісту неорганічних сполук азоту в середовищі та кількістю клітин водоростей в процесі їх росту на різних джерелах цього біогенного елементу.

Доведено, що прісноводні водорості беруть активну участь у трансформації сечовини внаслідок ферментативної діяльності, інтенсивність якої найвища в період активного росту культур і зумовлена у хлорококових водоростей біологічними особливостями видів.

Вперше продемонстрована участь природних угруповань фітоепіфітону в асиміляції і трансформації неорганічних та органічних сполук азоту.

Вперше встановлено позитивний зв'язок між інтенсивністю вегетації фітопланктону в притоках Дніпра та вмістом у воді білковоподібних речовин і вільних амінокислот, вивчено склад і визначено концентрацію окремих вільних амінокислот у Київському та Канівському водосховищах, а також виявлено особливості амінокислотного складу білків низки видів прісноводних водоростей.

Вперше серед летких амінів, що накопичуються у середовищі в процесі інтенсивного росту та при розкладі біомаси зелених і синьо-зелених водоростей, ідентифіковано 13 сполук, 9 з яких є вторинними амінами. Доведено, що леткі аміни можуть активно асимілюватись клітинами планктонних мікроводоростей.

Синьо-зелені водорості, які вегетують у різнотипних водоймах України, синтезують і виділяють у воду мікроцистини - азотовмісні сполуки, токсичні для гідробіонтів і теплокровних тварин. Доведено, що низькомолекулярні азотовмісні метаболіти синьо-зелених водоростей здатні пригнічувати ріст мікроскопічних грибів з роду Fusarium.

Вперше серед канцерогенних сполук, які утворюються в результаті нітрозування амінів водоростевого походження, ідентифіковані N-нітрозодибутиламін і N-нітрозоморфолін.

Встановлено, що вміст канцерогенних N-нітрозамінів у воді, які утворюються в процесі трансформації азотовмісних метаболітів водоростей, знаходиться в прямій залежності від концентрації попередників (аміни, нітрити) та знижується з підвищенням рН середовища. N-нітрозосполуки виявлені у воді дніпровських водосховищ і здатні впливати на вегетацію планктонних водоростей.

Практичне значення одержаних результатів. Досліджені ланки кругообігу азоту, пов'язані з метаболізмом прісноводних водоростей, мають важливе значення для розшифровки складних і тонких механізмів формування якості води, а також для розробки комплексу заходів щодо поліпшення технології водопідготовки на водозаборах.

Встановлені залежності між інтенсивністю вегетації фітопланктону та динамікою вмісту неорганічних і органічних сполук азоту у водосховищах Дніпра та його притоках можуть бути використані для розробки моделей прісноводних водойм з метою регулювання їх станом.

Відкриті особливості ферментативного зв'язування аміаку у представників різних таксонів водоростей можуть бути використані для аналізу конкретних екологічних ситуацій, пов'язаних з інтенсивним розвитком окремих видів рослинного планктону.

Запропонований підхід до оцінки рівнів біологічної активності азотовмісних метаболітів водоростей, що базується на особливостях їх хімічної структури, дозволить здійснювати ідентифікацію потенційно активних сполук, попередньо оцінювати рівень їх токсичності й прогнозувати ступінь небезпеки для гідробіонтів та користувачів питної води. Виявлені серед метаболітів водоростей біологічно активні сполуки з фунгіцидними властивостями можуть бути використані при створенні високоефективних препаратів для потреб сільського господарства України.

Практичні аспекти роботи стосовно змін у схемі підготовки питної води для міст Запоріжжя, Дніпропетровська, Вінниці та інших відображені у низці рекомендацій, які передані "Укркомунндіпроекту" (м. Харків).

Матеріали дисертації використані при виконанні Республіканської програми "Здоров'я людини та екологія" (розділ "Питна вода"), а також програми Кабінету Міністрів України "Використання вуглеамонійних солей в сільському господарстві" (Постанова №732 від 20.10.1994 р.).

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно обґрунтував тему, мету та основні завдання вивчення метаболізму азоту у прісноводних водоростей, оволодів сучасними методами досліджень (газова та рідинна хроматографія, ізотопний аналіз тощо), особисто виконав основний комплекс експериментальних робіт, дослідив фітопланктон водосховищ Дніпра, його притоків та ряду малих водойм і визначив у їх воді вміст неорганічних і органічних сполук азоту, самостійно проаналізував і узагальнив одержані в лабораторних та польових умовах результати досліджень і сформулював висновки щодо ролі азотного обміну прісноводних водоростей у формуванні їх угруповань і якості води та підвищенні продуктивності водойм.

При проведенні досліджень, пов'язаних із встановленням особливостей розвитку організмів зоопланктону, підрахунок їх чисельності та біомаси здійснив к. б. н. Г.В. Парчук, тестування біологічної активності на мікроміцетах виконали к. б. н. І.О. Еланська та к. б. н. О.В. Соколова.

У процесі підготовки і виконання роботи консультативну допомогу з окремих розділів і методів досліджень авторові надали колеги з Інституту гідробіології НАН України: к. б. н. В.О. Медвідь (визначення вмісту хлорофілу "а"), к. б. н. Т.Ф. Шевченко (оцінка якісного складу фітоперифітону і фітобентосу), к. х. н. Т.О. Васильчук (визначення речовин білкової природи та вільних амінокислот), к. х. н. В.Г. Кленус (оцінка рівнів вмісту радіонуклідів), наукові співробітники з інших установ Національної академії наук України та Міністерства освіти і науки України - д. б. н. В.В. Грубінко (методичні особливості при визначенні активності ферментів), д. б. н. П.М. Царенко (питання систематики хлорококових водоростей), к. б. н. О.В. Борисова (методи одержання аксенічних культур зелених водоростей), к. б. н. В.М. Михайленко та к. б. н. О.А. Главін (визначення N-нітрозамінів), дослідники із США - проф. W.W. Carmichael, Wright State University (визначення альготоксинів) і Швейцарії - проф. F. Jьttner, Institut fьr Pflanzenbiologie, Limnologische Station (спектроскопічний аналіз).

Велику допомогу при виконанні роботи авторові надали д. б. н., проф. Л.Я. Сіренко (цінні поради при узагальненні одержаних матеріалів) та д. б. н. О.Й. Сакевич (важливі рекомендації при проведенні експериментальних досліджень).

Участь співавторів у виконанні окремих досліджень відображено у відповідних спільних публікаціях.

Апробація результатів роботи. Результати дисертації були представлені на Республіканській науковій конференції "Теоретические и прикладные аспекты изучения флоры Молдавии" (Кишинів, 1989), 8-му Всесоюзному симпозіумі "Канцерогенные N-нитрозосоединения и их предшественники - образование и определение в окружающей среде" (Таллінн, 1990), 1-й Всесоюзній нараді по хемотаксономії (Київ, 1990), Республіканській нараді "Методы и приборы для экологических исследований" (Іркутськ, 1990), 2-му Всесоюзному симпозіумі з екологічної онкології (Київ, 1990), 1, 2 і 3-му з'їздах Гідроекологічного товариства України (Київ, 1993, 1997, Тернопіль, 2001), науково-практичній конференції (Гримайлів, 1995), симпозіумі з екологічної хімії (Кишинів, 1995), конференції молодих вчених та спеціалістів "Актуальные вопросы ботаники и экологии" (Харків, 1996), 6-му Міжнародному фікологічному конгресі (The Netherlands, Leiden, 1997), 4-й і 5-й Міжнародних науково-практичних конференціях "Вода: проблемы и решения" (Дніпропетровськ, 1998, 1999), 2-му Міжнародному симпозіумі з біотехнології рослин (Київ, 1998), 2-й Міжнародній конференції "Актуальные проблемы современной альгологии" (Киев, 1999), 16-му Міжнародному ботанічному конгресі (USA, St. Louis, 1999), 8-й Міжнародній конференції з прикладної альгології (Italy, Montecatini Terme, 1999), 11-му Угорському альгологічному симпозіумі (Hungary, Salgуbбnya, 2000), 5-й Всеросійській конференції з водяних рослин (Борок, 2000), 7-му Міжнародному фікологічному конгресі (Greece, Thessaloniki, 2001), 1-му Конгресі Міжнародного товариства з прикладної альгології (Spain, Almeria, 2002), Міжнародному зібранні з культивування водоростей (Germany, Gцttingen, 2002).

Публікації. Результати дисертації викладено у 55 роботах, із них 34 - у фахових виданнях, а 21 - в інших наукових журналах та матеріалах конференцій, з'їздів і симпозіумів.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, 8 розділів, висновків та списку літератури, який нараховує 414 назв. Робота ілюстрована 26 таблицями та 72 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Наведено критичний аналіз наявної у фаховій вітчизняній та зарубіжній літературі інформації про шляхи азотного обміну у прісноводних водоростей, зв'язок їх життєдіяльності з динамікою концентрації неорганічних та органічних сполук азоту у водному середовищі, хімічну природу азотовмісних метаболітів водоростей, особливості їх синтезу та вплив на якість води. Акцентується увага на нез'ясованих питаннях щодо механізмів формування угруповань рослинного планктону під впливом азотовмісних сполук.

Основні експериментальні роботи з культурами водоростей проводили в Інституті гідробіології НАН України. Комплекс натурних досліджень виконано на водосховищах Дніпра та його притоках (річки Прип'ять, Здвиж, Ірпінь, Либідь, Рось, Вільшанка, Тясьмин, Цибульник і Сула), а також на озерах та ставках, розташованих в околицях Києва та в Київській області.

У процесі відбору проб фітопланктону, фітоепіфітону, фітоперифітону і фітобентосу, їх камерального опрацювання, визначення видового складу та біомаси водоростей використовували загальноприйняті гідробіологічні методи (Топачевський, Масюк, 1984).

Об'єктами лабораторних досліджень були альгологічно чисті та аксенічні культури синьо-зелених (Anabaena flos-aquae (Lyngb.) Brйb. HPDP-26, Anabaena hassalii (Kьtz.) Wittr. HPDP-7, Anabaena sp. P-9 (Wolk, USA), Calothrix braunii Born. et Flah. HPDP-16, Calothrix elenkinii Kossinsk. HPDP-2, Gloeotrichia natans (Hedw.) Rabenh. HPDP-107, Hapalosiphon fontinalis (Ag.) Born. HPDP-3, Lyngbya limnetica Lemm. HPDP-9, Microcystis aeruginosa Kьtz. emend. Elenk. HPDP-6, Microcystis wesenbergii Komarek HPDP-31, Nostoc linckia (Roth.) Born. et Flah. HPDP-453, Nostoc muscorum Ag. HPDP-526, Nostoc punctiforme (Kьtz.) Hariot HPDP-48, Oscillatoria limosa Ag. HPDP-12, Oscillatoria neglecta Lemm. HPDP-25, Plectonema boryanum Gom. HPDP-24, Phormidium bijugatum Kongiss. HPDP-35, Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. HPDP-27, Tolypothrix tenuis Kьtz. HPDP-5) та зелених (Ankistrodesmus fusiformis Corda HPDP-437, Chlorella fusca Shihira et Krauss IBASU-A 348, Chlorella saccharophila (Krьger) Mig. IBASU-A 187, Chlorella vulgaris Beijer. ССАР-211/11в, Coelastrum astroideum De Not. IBASU-A 211, Scenedesmus acuminatus (Lagerh.) Chod. CALU-200, Scenedesmus acutus Meyen IBASU-A 251, Scenedesmus armatus (Chod.) Chod. IBASU-A 270, Scenedesmus brasiliensis Bohl. IBASU-A 273, Scenedesmus communis Hegew. IBASU-A 277, Scenedesmus falcatus Chod. IBASU-A 281, Scenedesmus javanensis Chod. IBASU-A 283, Scenedesmus maximus (W. et G.S. West) Chod. IBASU-A 287, Scenedesmus obtusus Meyen IBASU-A 310, Scenedesmus opoliensis P. Richt. IBASU-A 298, Scenedesmus subspicatus Chod. IBASU-A 302, Selenastrum gracile Reinsch. IBASU-A 317, Pediastrum boryanum (Turp.) Menegh. IBASU-A 240 і Tetraedron caudaum (Corda) Hansg. IBASU-A 319) водоростей із колекцій Інституту гідробіології НАН України (HPDP), Інституту ботаніки ім. М.Г Холодного НАН України (IBASU-A), Біологічного інституту Санкт-Петербурзького університету (CALU), а також із колекцій культур Великобританії (CCAP) та Лімнологічної станції в м. Цюрих (Швейцарія).

Водорості культивували на середовищі Фітцджеральда в модифікації Цендера і Горема №11 (Методы …, 1975) при температурі 22-25С та освітленні лампами денного світла (4000 лк) протягом 16 год/добу, рН середовища вимірювали за допомогою іономіра ЭВ-74.

У деяких дослідах використовували природні популяції Microcystis aeruginosa Kьtz. emend. Elenk., Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs і Oscillatoria sp. із Канівського водосховища.

У процесі дослідження фунгіцидної активності синьо-зелених водоростей використовували 13 видів мікроміцетів із родів Fusarium, Bipolaris, Rhizoctonia та Alternaria з колекції Інституту мікробіології і вірусології НАН України.

Підрахунок клітин водоростей в умовах культур здійснювали за допомогою камери Горяєва, інтенсивність їх росту визначали за сухою біомасою, а фізіологічний стан контролювали за допомого люмінесцентного мікроскопа МЛД-1 (Методы …, 1975).

Концентрацію хлорофілу "а" встановлювали за методикою ЮНЕСКО (Сиренко, Курейшевич, 1982) з використанням відомих рівнянь (Jeffrey, Humphrey, 1975).

Активність ферментів, що зв'язують аміак, визначали відповідно до методів, наведених у працях (Евстегнеева и др., 1980, Софьин и др., 1984).

Під час визначення особливостей розвитку фітопланктону в умовах мікрокосм використовували скляні посудини спеціальної конструкції об'ємом 50-70 л (Клоченко и др., 1994).

Радіоактивність зразків біомаси водоростей при вивченні асиміляції амінів визначали на сцинтиляційній установці SL-30 (Франція), ізотопний аналіз з використанням 15N здійснювали відповідно до методичних вказівок (Методические указания …, 1978) із підрахунком вмісту міченого азоту на мас-спектрометрі МИ-1208 В.

Кількість кисню у середовищі визначали йодометричним методом (за Вінклером) (Методы …, 1975), вміст неорганічних сполук азоту у воді, його органічної форми та загального азоту в культурах водоростей встановлювали загальноприйнятими методами (Лурье, 1973, Руководство …, 1977, Методы …, 1987).

Для визначення концентрації речовин білкової природи у природній воді використовували реактив Фоліна (Дебейко и др., 1973), загальний вміст вільних амінокислот та летких амінів оцінювали відповідно до методик (Семенов и др., 1961, Немцева и др., 1964).

Аналіз кількісного та якісного складу амінокислот проводили за допомогою методу іонообмінної хроматографії з використанням аналізатора ААА Т339 М (Чехія).

Із культурального середовища водоростей та води при розкладі їх біомаси леткі аміни вилучали методами вакуумної дистиляції та відгонки з парою (Головня, 1971, Головня и др., 1971, Методы …, 1975), а їх ідентифікацію здійснювали на газовому хроматографі "Pye-Unicum" 304 (Великобританія) з урахуванням методичних вказівок (Golovnya, Zhuravleva, 1973, Головня и др., 1986).

Метанольні екстракти біомаси водоростей розділяли на окремі фракції за допомогою рідинного хроматографа фірми "KNAUER" (Німеччина) з використанням УФ-детектора. Мас-спектроскопічний аналіз активних фракцій здійснювали на мас-спектрометрі фірми "BRUKER" (Німеччина).

Кількісний та якісний склад N-нітрозамінів визначали за методикою (Канн, 1981) з використанням газового хроматографа "Газохром 09" з детектором ТЕА-502 (США), а метаболіти водоростей нітрозували відповідно до методики (Scheunig, Ziebarth, 1976).

Наявність токсичних сполук у воді та біомасі водоростей встановлювали за допомогою імунного тесту (ELISA) "Microcystin Tube Kit" (США).

Вміст Sr-90 в біомасі водоростей визначали радіохімічним методом, а Cs-137 - на спектрометрі (Марей, Зыкова, 1980).

Проби зоопланктону відбирали за допомогою планктонної сітки (80-90 мкм), а під час їх камерального опрацювання ідентифікували до виду коловерток, гіллястовусих та веслоногих ракоподібних (Иванова, 1985, Ricci, 1983). Математичне опрацювання одержаних результатів здійснювали з використанням кореляційного та регресійного аналізів, а також інших статистичних методів (Зайцев, 1984, Лакин, 1990).

Наші дослідження асиміляції сполук азоту прісноводними водоростями показали, що форма цього елементу у водному середовищі справляє значний вплив на накопичення їх біомаси. Найвища продуктивність культур зелених водоростей Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis спостерігається при їх вирощуванні на вуглеамонійних солях (ВАС) (відповідно 848,0 і 779,0 мг/л на 80-ту добу), тоді як максимальні величини сухої маси синьо-зелених водоростей Anabaena flos-aquae (555,0 мг/л) і Microcystis aeruginosa (535,0 мг/л) були зареєстровані при використанні як джерела азоту нітрату натрію. У присутності ВАС культура Anabaena flos-aquae відмирала на 12-ту добу досліду, а розвиток Microcystis aeruginosa пригнічувався впродовж усього періоду культивування, внаслідок чого біомаса цієї водорості не перевищувала 55,6 мг/л.

Дослідження динаміки вмісту неорганічних сполук азоту у культуральному середовищі показало, що процес росту зелених водоростей за наявності ВАС супроводжується активною асиміляцією іонів NH4+. Зокрема, концентрація амонійного азоту в культуральному середовищі на 80-ту добу вирощування Scenedesmus acuminatus була в понад 60 разів меншою, ніж його початкова кількість, і становила всього 1,23 мг/л.

При використанні NaNO3 як джерела азоту в культурах досліджуваних водоростей реєструвалося зменшення кількості позаклітинних іонів NO3-. Однак вже на 25-ту добу досліду відзначалась істотна різниця в інтенсивності асиміляції цієї форми азоту: при вирощуванні Microcystis aeruginosa і Anabaena flos-aquae кількість іонів NO3- у середовищі не перевищувала 40,0-45,0 мг. N/л, тоді як у культурах Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis вона знаходилась у межах 55,0-61,25 мг. N/л. Така ж тенденція щодо концентрації іонів NO3- спостерігалась і при вирощуванні водоростей на середовищі з нітратом амонію.

Дослідження вмісту загального азоту в культурах зелених і синьо-зелених водоростей також засвідчили, що найсприятливішим його джерелом для росту представників Chlorophyta є ВАС. Так, наприкінці досліду (80-й день) у біомасі Scenedesmus acuminatus містилося 64,2% азоту від його початкової кількості в культурі, а для Ankistrodesmus fusiformis ця величина становила 40,4%. При використанні ж NaNO3 ці показники були такими: 27,1% - для Anabaena flos-aquae, 23,0% - для Scenedesmus acuminatus і 19,2% - для Ankistrodesmus fusiformis.

Подібні результати були отримані і при вивченні надходження 15N в клітини досліджуваних водоростей. Зокрема, вміст 15N у біомасі Scenedesmus acuminatus і Ankistrodesmus fusiformis при вирощуванні на ВАС становив 44,0 і 26,0%, тоді як у присутності NaNO3 - відповідно 16,8 і 11,0% від початкової кількості в культурі. Anabaena flos-aquae за наявності ВАС відмирала на 10-12-ту добу експерименту мг.

У дослідах щодо впливу різної концентрації ВАС на розвиток синьо-зелених водоростей встановлено, що найбільш істотне зменшення кількості клітин у культурі Microcystis aeruginosa спостерігається уже в межах 5-10 N/л. Подібні результати були одержані і при підрахунку чисельності живих і відмираючих клітин цієї водорості, коли збільшення концентрації амонійного азоту супроводжувалось досить помітним зростанням кількості її мертвих клітин. На відміну від ВАС, чисельність клітин Microcystis aeruginosa у процесі росту на нітратах істотних змін не зазнавала.

Характерною рисою культивування водоростей на нітратах є трансформація останніх в нітрити і подальше накопичення іонів NO2- у воді. Наші дослідження показали, що максимальна концентрація нітритного азоту в культуральному середовищі хлорококових водоростей коливалась в досить широких межах - 0,225-14,460 мг. N/л. На підставі порівняння одержаних даних з результатами молекулярно-генетичних досліджень німецьких вчених (Kessler, 1984, 1992), що свідчать про наявність у роді Scenedesmus двох чітко відмінних підродів Desmodesmus і Scenedesmus, виявлені суттєві відмінності щодо продукування нітритного азоту представниками цих двох підродів. Зокрема, у видів підроду Desmodesmus (Scenedesmus armatus, S. brasiliensis, S. opoliensis, S. communis і S. maximus) найбільші показники накопичення нітритного азоту знаходилися в межах 0,225-0,786 мг. N/л, тоді як у видів підроду Scenedesmus (S. acutus, S. falcatus, S. javanensis, S. obtusus і S. subspicatus) вони становили 1,995-4,594 мг. N/л. Ця відмінність, очевидно, свідчить про наявність досконалішої ферментної системи асиміляційної нітратредукції у видів підроду Desmodesmus, який, як гадають, в еволюційному плані молодший, ніж підрід Scenedesmus.

Незважаючи на досить широкий діапазон абсолютної концентрації нітритного азоту в позаклітинному середовищі, максимальні значення його питомого вмісту в культурах зелених та синьо-зелених водоростей спостерігаються в логарифмічній фазі їх росту, тобто в період інтенсивного перебігу фізіологічних процесів. Найбільшим зазначений показник був у Chlorella vulgaris (65,6 мкг N/мг сухої маси) і Scenedesmus obtusus (44,8 мкг N/мг), а найменшим - у Nostoc muscorum, Chlorella saccharophilla і Scenedesmus armatus (відповідно 0,8, 1,7 і 2,0 мкг N/мг).

Дослідженнями показано, що не існує істотної різниці в питомому вмісті нітритного азоту в альгологічно і бактеріально чистих культурах Scenedesmus acutus. Однак, як свідчать одержані нами дані, більш високий абсолютний вміст цієї форми азоту в середовищі альгологічно чистої культури може бути наслідком інтенсифікації зростання біомаси водорості під впливом бактерій- супутників (Борисова и др., 1997).

При дослідженні динаміки вмісту неорганічних сполук азоту в середовищі під час репродукції водоростей встановлено, що процеси асиміляції і трансформації цих сполук мають добову ритміку.

Так, протягом доби спостерігається обернена залежність між концентрацією іонів NH4+ і NO3- та кількістю клітин Microcystis aeruginosa і Chlorella vulgaris, тоді як для нітритів цей взаємозв'язок може бути різний: прямий - для представників Chlorophyta і обернений - для Cyanophyta. Зафіксовано також зміщення у часі максимумів чисельності клітин водоростей при використанні різних джерел азоту.

В експериментах з експозицією дослідних склянок in situ показано, що асиміляція амонійного та нітратного азоту, а також трансформація останнього до нітритів за участю планктонних водоростей мають місце і у водоймах різного типу (річки, ставки, водосховища), а інтенсивність цих процесів залежить від кількісного та якісного складу фітопланктону. У зазначених процесах також беруть участь водорості, що вегетують на вищих водяних рослинах. Так, у варіанті з нітратним азотом найактивніше засвоювали іони NO3- епіфітні водорості рогозу вузьколистого (Typha angustifolia L.), тоді як амонійний азот вуглеамонійних солей більш активно поглинали водорості, субстратом для розвитку яких є очерет звичайний (Phragmites australis (Cav.) Trin. et Steud.). Фітоепіфітон здійснює також редукцію нітратів до нітритів, причому інтенсивніше вона відбувається під час життєдіяльності водоростей, що вегетують на Tуpha angustifolia. Процеси асиміляції, трансформації та виділення азоту за участю епіфітних водоростей значно активніші за наявності світла.

Узагальнення власних даних щодо вмісту неорганічних сполук азоту у деяких водосховищах Дніпра і водотоках його басейну та біомаси фітопланктону показало, що, поряд з асиміляцією клітинами прісноводних водоростей іонів NH4+, NO3- і NO2-, відбувається накопичення у природній воді нітритного азоту, пов'язане із збільшенням біомаси цих організмів. Аналіз кількісного та якісного складу рослинного планктону свідчить, що співвідношення процесів поглинання та виділення нітритного азоту значною мірою зумовлене складом домінуючого комплексу фітопланктону: за умов переважання у воді зелених і діатомових водоростей спостерігається інтенсифікація процесу виділення нітритів у середовище, тоді як з появою (в основному, влітку) в значній кількості синьо-зелених водоростей домінуючим стає процес поглинання іонів NO2-. Перебіг цих процесів найактивніший при помірній біомасі планктонних водоростей.

Проведений регресійний аналіз показав, що залежність між кількістю у воді неорганічних сполук азоту та біомасою фітоплантону як для водосховищ Дніпра, так і для водотоків його басейну описується степеневою функцією:

y = a0 * xв

Де:

y - вміст іонів NH4+, NO3-, NO2-, мг. N/л, х - біомаса, мг/л, а0 і коефіцієнти.

Поряд з чисельністю та біомасою водоростей, важливим показником інтенсивності розвитку фітопланктону є кількість основного фотосинтезуючого пігменту - хлорофілу "а" з розрахунку на одиницю об'єму води. Наші дослідження показали, що його концентрація в притоках Дніпра коливалась у межах 1,12-67,93 мкг/л.

Порівнюючи вміст хлорофілу "а" у воді таких річок, як Здвиж, Ірпінь, Либідь, Рось, Вільшанка, Тясьмин, Сула та Цибульник, із кількістю неорганічних сполук азоту, ми виявили, що в цих водотоках має місце обернена залежність між кількістю пігменту та вмістом іонів NH4+ і NO3-. Широкий діапазон значень коефіцієнта кореляції (r = -0,29, -0,72 - для NH4+ та r = -0,12, -0,66 - для NO3-), очевидно, пов'язаний з різним рівнем азотного навантаження на водотоки, а також з різною інтенсивністю вегетації фітопланктону. На відміну від амонійного і нітратного азоту, залежність між кількістю у воді нітритів та хлорофілу "а" може бути як оберненою, так і прямою. Таким чином, зелені (хлорококові) водорості в умовах лабораторного культивування з використанням різних джерел азоту характеризуються переважним засвоєнням його амонійної форми, тоді як синьо-зелені активніше поглинають азот у вигляді нітратів. Це знайшло своє підтвердження як при визначенні загального вмісту азоту в культурах водоростей, так і в дослідах з 15N.

На відміну від поглинання іонів NH4+, процес засвоєння NO3- клітинами водоростей супроводжується накопиченням у воді екологічно небезпечних сполук - нітритів, питомий вміст яких найбільший в період інтенсивного розвитку культур водоростей. На прикладі представників роду Scenedesmus встановлена залежність цього процесу від біологічних особливостей видів. Супутні бактерії здатні впливати на кількість нітритів у середовищі через сприяння збільшенню біомаси водоростей. Динаміка вмісту неорганічних сполук азоту у водному середовищі зазнає суттєвих змін під час репродукції водоростей. У водоймах з інтенсивним розвитком фітопланктону спостерігається обернена залежність між його біомасою та концентрацією у воді іонів NH4+ і NO3-, тоді як для нітритів вона може бути як оберненою, так і прямою, що визначається якісним складом фітопланктону. Поряд з планктонними водоростями, активну участь в екологічному метаболізмі азоту беруть водорості-епіфіти, що розвиваються на вищих водяних рослинах. Встановлені нами закономірності кругообігу азоту у воді за участю водоростей підтверджено при використанні такого показника, як кількість хлорофілу "а" в одиниці об'єму води.

Табл. - Активність ферментів, що зв'язують аміак, у зелених і синьо-зелених водоростей:

Значну частку серед розчинених у воді органічних азотовмісних сполук водоростевого походження становлять речовини білкової природи, що надходять у воду, в основному, внаслідок автолізу чи лізису відмерлих клітин (Семенов, 1967). Результати наших досліджень свідчать, що кількість білковоподібних речовин у р. Прип'ять знаходиться у межах 0,026-0,062 мг/л, у р. Здвиж - 0,026-0,103 і в р. Ірпінь - 0,038-0,073 мг/л. Порівняння вмісту досліджуваних сполук з біомасою фітопланктону виявило наявність між зазначеними показниками позитивного зв'язку (r = 0,23 - 0,55 при P = 0,95). Показано, що підвищення концентрації речовин білкової природи у водотоках басейну Дніпра здебільшого спостерігається в періоди зростання біомаси планктонних водоростей. Дослідженнями азотовмісних сполук, які потрапляють у воду внаслідок розкладу біомаси природних популяцій основного збудника "цвітіння" води у дніпровських водосховищах - Microcystis aeruginosa, поряд з уже відомими речовинами цієї природи (Мельниченко и др., 1974, Осипов, 1980, Сакевич, 1985, Клоченко, 1988), були виявлені метилетиламін, метилізобутиламін, метил-циклопентиламін, метил-н-гексиламін, ізопропіл-н-пентиламін і диізобутиламін.

Узагальнення літературних даних (Шаларь, 1971, Харитонова, 1984, Харитонова и др., 1995) свідчить про те, що неорганічні сполуки азоту можуть впливати на продуктивність прісноводних екосистем шляхом посилення розвитку деяких груп водоростей. Для одержання переконливого доказу участі азотовмісних сполук у формуванні угруповань рослинного планктону ми використали різні співвідношення амонійного та нітратного азоту, оскільки природна вода характеризується різноманітним хімічним складом. Встановлено, що внесення в експериментальні скляні посудини калійної селітри та вуглеамонійних солей супроводжувалося посиленням вегетації фітопланктону. Найістотніші зміни відбувалися в його домінуючому комплексі. Так, додавання в посудини тільки нітратного азоту спричинювало збільшення в планктоні кількості синьо-зелених водоростей, тоді як внесення у воду амонійного азоту посилювало вегетацію переважно представників Chlorophyta.

Досліджені форми азоту у різних співвідношеннях посилювали розвиток тієї чи іншої групи прісноводних водоростей. Зміни відбувалися не лише у кількісному складі водоростевих угруповань, а й у їх видовій структурі. Серед представників фітопланктону, які першими реагували на внесення у воду амонійного азоту шляхом збільшення своєї біомаси, були вольвоксові і хлорококові водорості, зокрема Chlamydomonas sp. та Pacotus coccifer, тоді як збудники "цвітіння" води Aphanizomenon flos-aquae і Anabaena flos-aquae при цьому досить швидко зникали із рослинних угруповань. При внесенні азотовмісних сполук безпосередньо у природні та штучні водойми поряд з посиленням розвитку зелених водоростей під впливом ВАС, збільшувалась кількість евгленових і динофітових водоростей, а при зменшенні у воді вмісту амонійного азоту відновлювалась вегетація синьо-зелених водоростей. Одержані результати щодо різної реакції синьо-зелених і зелених водоростей на наявність у культуральному середовищі сечовини послужили підставою для з'ясування особливостей впливу цієї сполуки на природні угруповання рослинного планктону. Встановлено, що сечовина при внесенні у природну воду під дією ферментних систем, перш за все водоростей, розкладається з утворенням амонійного азоту, концентрація якого досить швидко зростає. Як наслідок цього - фіксувалися відповідні зміни в інтенсивності вегетації фітопланктону. Так, зокрема, із збільшенням вмісту іонів NH4+ чисельність синьо-зелених водоростей зменшувалась, а зелених -зростала. Це стосувалося, перш за все, вольвоксових водоростей, а саме таких видів, як Furcilla stigmatophora, F. quadriloba, Chlamydomonas sp. і Phacotus coccifer. Ці факти узгоджуються з матеріалами, викладеними раніше, і свідчать про значну витривалість зелених водоростей щодо високих концентрацій амонійного азоту та елімінацію представників Cyanophyta.

Літературні дані містять також інформацію про різнобічну дію N-нітрозосполук на окремі види водоростей в умовах культур (Рубенчик та ін., 1990, Ступина, Борисова, 1999). Тому важливим було з'ясування питання про вплив цих речовин на розвиток природних угруповань планктонних водоростей. Для цього були проведені досліди, спрямовані на вивчення дії маркерної сполуки із групи N-нітрозамінів - НДМА на фітопланктон р. Ірпінь (притока Київського водосховища). Найбільші зміни у вегетації фітопланктону виявлені у пробах при додаванні НДМА в концентрації 200 мкг/л. Протягом усього досліду (14 діб) кількість видів була тут найнижчою у порівнянні з результатами інших варіантів (6, 40 і 60 мкг/л). Відмічено також чітко виражені зміни в інтенсивності вегетації планктонних водоростей: до кінця досліду кількість їх клітин зменшилась у 3,3, а біомаса - у 2,4 рази в порівнянні з вихідними показниками. Однак у цьому варіанті, як і в інших, спостерігалось посилення розвитку представників Euglenophyta.

ВИСНОВКИ

1. Дослідження асиміляції сполук азоту прісноводними водоростями дозволило встановити, що зелені (хлорококові) водорості в умовах культур характеризуються засвоєнням переважно амонійної форми азоту, тоді як синьо-зелені більш активно асимілюють азот у нітратній формі. Негативний вплив амонійного азоту на інтенсивність росту представників Cyanophyta найвиразніше проявляється при його концентрації в середовищі > 5 мг/л;

2. Асиміляція нітратного азоту клітинами водоростей супроводжується накопиченням у середовищі екологічно небезпечних сполук - нітритів, питомий вміст яких найбільший в період інтенсивного росту культур. Характер процесу нітратредукції у хлорококових водоростей пов'язаний з їх таксономічною приналежністю;

3. Між інтенсивністю вегетації фітопланктону та вмістом амонійного і нітратного азоту у водосховищах Дніпра і водотоках його басейну існує обернена залежність, тоді як для нітритів вона може бути як прямою, так і оберненою, що визначається домінуючим комплексом планктонних водоростей. Доведена участь водоростей, що вегетують на вищих водяних рослинах, в асиміляції і трансформації неорганічних сполук азоту;

4. Водорості планктону та епіфітону здатні здійснювати ферментативний гідроліз сечовини, який супроводжується накопиченням у воді амонійного азоту. Інтенсивність цього процесу у зелених водоростей видоспецифічна, а наявність в їх культурах бактерій-супутників призводить до зменшення в середовищі кількості іонів NH4+;

5. У синьо-зелених і зелених водоростей виявлено суттєві відмінності в активності ферментних систем, які здійснюють зв'язування аміаку, що має істотне значення для процесів формування альгоугруповань. Особливості асиміляції амонійного азоту є основною причиною домінування у фітопланктоні представників Chlorophyta при збагаченні води сполуками, які містять іон амонію;

6. Функціонування рослинного планктону в притоках Дніпра істотно впливає на вміст у воді речовин білкової природи та вільних амінокислот. Підвищення концентрації цих азотовмісних сполук здебільшого збігається з максимумами біомаси фітопланктону;

7. Дослідження амінокислотного складу білків синьо-зелених та зелених водоростей, що росли в умовах культур, дозволило ідентифікувати моноаміномонокарбонові, моноамінодикарбонові, диаміномонокарбонові та гетероциклічні амінокислоти. Кількісні співвідношення окремих амінокислот видоспецифічні;

8. У процесі життєдіяльності та при розкладі біомаси прісноводних водоростей у воді накопичуються леткі аміни, серед яких нами вперше виявлені н-бутиламін, н-гептиламін, метилетиламін, метил-циклопентиламін, н-пропіл-циклопентиламін, диізобутиламін, метилізобутиламін, метил-н-гексиламін, етил-н-гексиламін, ізопропіл-н-пентиламін, аліл-ізопентиламін, ди-н-пропіл-н-бутиламін і 2,6-диметилпіридин. Показано, що клітини мікроводоростей, поряд з виділенням, здійснюють асиміляцію амінів, яка стимулюється наявністю світла;

9. Синьо-зелені водорості, які широко поширені у водоймах України, синтезують і виділяють у водне середовище токсичні азотовмісні сполуки - мікроцистини, концентрація яких у біомасі водоростей коливається від 0,01 до 726,3 мкг/г сухої речовини, а у воді - від 5 до 500 мкг/л. Високий вміст альготоксинів тісно пов'язаний з розвитком їх основного продуцента - Microcystis aeruginosa;

10. Прісноводні синьо-зелені водорості в процесі своєї життєдіяльності синтезують низькомолекулярні азотовмісні метаболіти з високою токсичністю щодо мікроскопічних грибів з роду Fusarium. Її рівень залежить від біологічних особливостей водоростей, що показано на прикладі представників родів Anabaena, Calothrix, Nostoc та Oscillatoria;

11. Експериментально встановлено, що концентрація N-нітрозосполук (відомих канцерогенів), які утворюються в процесі трансформації азотовмісних метаболітів водоростей, знаходиться в прямій залежності від кількості речовин, що вступають у реакцію, і знижується з підвищенням рН середовища. В свою чергу, N-нітрозаміни суттєво впливають на розвиток рослинного планктону; водойм фітопланктон біомаса

12. Встановлені закономірності та особливості асиміляції, трансформації і виділення азотовмісних сполук прісноводними водоростями мають важливе значення для пізнання механізмів функціонування водних екосистем, а також є науковою основою для обґрунтування заходів, спрямованих на підвищення продуктивності водойм і управління процесами формування якості води.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Главин А.А., Тиктин Л.А., Клоченко П.Д. Образование летучих нитрозаминов из продуктов разложения зеленых и синезеленых водорослей // Альгология. - 1991. - 1, №1. - С. 96-100.

2. Клоченко П.Д., Медведь В.А. Трансформация азотсодержащих удобрений в процессе роста некоторых зеленых и синезеленых водорослей // Гидробиол. журн. - 1992. - 28, №6. - С. 56-60.

3. Клоченко П.Д., Митківська Т.І. Фітопланктон приток верхнього Дніпра // Укр. ботан. журн. - 1993. - 50, №2. - С. 69-79.

4. Клоченко П.Д., Митковская Т.И. Фитопланктон некоторых притоков Каневского и Кременчугского водохранилищ (Украина) // Альгология. - 1993. - 3, №2. - С. 53-60.

5. Клоченко П.Д. Содержание неорганических соединений азота и развитие фитопланктона в некоторых типах водоемов // Гидробиол. журн. - 1993. - 29, №6. - С. 88-95.

6. Сакевич А.И., Клоченко П.Д., Беспалько С.М. Отделение синезеленых водорослей от воды на очистных сооружениях водопроводных станций // Химия и технология воды. - 1993. - 15, №9-10. - С. 696-702.

7. Клоченко П.Д. Амины - экзо- и эндометаболиты водорослей // Гидробиол. журн. - 1994. - 30, №5. - С. 42-62.

8. Сакевич А.И., Клоченко П.Д., Беспалько С.М., Шевченко Т.Ф. Влияние углеаммонийных солей на развитие планктонных водорослей // Гидробиол. журн. - 1994. - 30, №6. - С. 41-49.

Размещено на Allbest.ru