Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГОУ ВПО АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

КУРСОВАЯ РАБОТА

Направленный синтез полисахаридов

Содержание

Введение

Происхождение и строение полисахаридов

Биосинтез

Представители полисахаридов

Использование полисахаридов

Введение

Полисахариды (или гликаны) - полимеры, построенные не менее чем из 11 моносахаридных единиц. Они могут состоять из одного или нескольких типов моносахаров. Соответственно различают гомополисахариды и гетерополисахариды. Полисахариды - обязательные компоненты всех организмов, составляют большую часть углеводов, встречающихся в природе, преобладающую долю в биомассе растений, а следовательно, и основную массу органического вещества на Земле.

Полисахариды встречаются в виде самостоятельных полимеров, а также в комплексах с нуклеиновыми кислотами, белками, липидами, фосфатом. Разнообразны они по мономерному составу и структуре. Особым разнообразием отличаются полисахариды микроорганизмов. Некоторые из них близки или идентичны полилисахаридам растений и животных. Но подавляющее большинство микробных полисахаридов имеет уникальную структуру, специфическую для вида или для серологической группы вида. В микробных гликанах часто обнаруживаются ранее неизвестие моносахара, которые не встречаются ни у животных, ни у растений.

О том, что слизь, образуемая многими микроорганизмами, может иметь углеводную природу, знали еще во времена Пастера. Однако особое внимание микробным полисахаридам стали уделять лишь с начала 20-х годов нашего столетия, когда узнали, что вещества, определяющие серологическую специфичность пневмококков, являются полисахаридами. В настоящее время исследование микробных полисахаридов приобрело особое значение в связи с открывшейся возможностью широкого применения их в медицине и ряде областей народного хозяйства.

Полисахариды микроорганизмов в соответствии с локализацией делятся на внутриклеточные и внеклеточные. К внутриклеточным относят обычно полисахариды цитоплазмы, мембран и клеточных стенок, а к внеклеточным - полисахариды капсул, чехлов (пристеночные структуры) и свободной слизи, не прилегающей к клеточной стенке. Иногда к внеклеточным относят так же полисахариды, локализованные снаружи от цитоплазматической мембраны. В этом случае в группу внеклеточных попадают и полисахариды клеточных стенок. У ряда микроорганизмов действительно трудно различить границу между капсулой и клеточной стенкой.

микроорганизмы полисахариды биосинтез внеклеточные

Происхождение и строение полисахаридов

ПОЛИСАХАРИДЫ (гликаны), полимерные углеводы, молекулы которых построены из моносахаридных остатков, соединенных гликозидными связями.

Степень полимеризации полисахаридов составляет от 10-20 до нескольких тысяч остатков. Каждый моносахаридный остаток в составе полисахарида может находиться в пиранозной или фуранозной форме и иметь а- или р-конфигурацию гликозидного центра. Моносахаридный остаток способен образовывать одну гликозидную связь с соседним моносахаридом, но может предоставить неск. гидроксильных групп для присоединения др. моносахаридов. В соответствии с этим, как и в случае олигосахаридов, молекулы полисахарида могут быть линейными или разветвленными. Линейные полисахариды имеют один невосстанавливающий и один восстанавливающий конец; в разветвленных полисахаридах также м.б. только один восстанавливающий конец, тогда как число невосстанавливающих концевых моносахаридных остатков на 1 превышает число разветвлений. Благодаря гликозидной гидроксигруппе восстанавливающего конца молекулы П. могут присоединяться к молекулам неуглеводной природы, напр. к белкам и пептидам с образованием гликопротеинов и протеогликанов, к липидам с образованием липополисахаридов и гликолипидов и т.д.; в сравнительно редких случаях наблюдается образование циклических полисахаридов.

Гидрокси-, карбокси- и аминогруппы моносахаридных остатков, входящих в полисахариды, в свою очередь могут служить местами присоединения неуглеводных группировок, таких, как остатки органических и неорганических кислот (с образованием ацетатов, сульфатов, фосфатов и др.), пировиноградной кислоты (образующей циклические ацетали), метанола (образующего сложные эфиры с уроновыми кислотами) и т.д.

Полисахариды, построенные из остатков только одного моносахарида, называются гомополисахаридами (гомогликанами); в соответствии с природой этого моносахарида различают глю-каны, маннаны, галактаны, ксиланы, арабинаны и др. Полное название полисахарида должно содержать информацию об абсолютной конфигурации входящих в его состав моносахаридных остатков, размере циклов, положении связей и конфигурации гликозидных центров; в соответствии с этими требованиями строгим названием, например, целлюлозы будет поли(1 : 4)-D-глюкопиранан.

Полисахариды, построенные из остатков двух и более моносахаридов, называют гетерополисахаридами (гетерогликанами). К ним относятся глюкоманнаны, арабиногалактаны, араби-ноксиланы и др. Строгие названия гетерогликанов, (а также и гомополисахаридов, содержащих разветвления или нескольких типов связей) громоздки и неудобны в употреблении; обычно пользуются широко распространенными тривиальными назв. (напр., гепарин, гликоген, инулин, ламтаран, хитин), а для изображения структурных формул часто применяют сокращенную запись:

Галактоманнан; ?-D-галактопирано-?-D-маннопиранан (Manp и Galp- соотв. остатки маннозы и галактозы в пиранозной форме)

4-О-Метилглюкуроноксилан; (4-О-метил)-?-D-глюкопиран-уроно-?-D-ксилопиранан (Xylp и GlcpA-соотв. остатки ксилозы и глюкуроновой к-ты в пиранозной форме, Me = СН₃)

Гиалуроновая кислота, глюкозаминоглюкуроногликан; 2-ацет-амидо-2-дезокси-?-D-глюкопирано-?-D-глюкопирануроно-гликан [Ас = СН₃С(О)]

Полисахарид в природе составляют главную массу органического вещества, находящегося в биосфере Земли. Они выполняют в живых организмах три важнейших типа биологических функций, выступая в роли энергетического резерва, структурных компонентов клеток и тканей или же защитных веществ.

Хорошо известными резервными полисахаридами являются крахмал, гликоген, фруктаны, галактоманнаны и некоторые р-глюканы. Эти полисахариды способны быстро гидролизоваться имеющимися в клетках ферментами, и их содержание сильно зависит от условий существования и стадии развития организма.

Структурные полисахариды можно разделить на два класса. К первому относят нерастворимые в воде полимеры, образующие волокнистые структуры и служащие армирующим материалом клеточной стенки (целлюлоза высших растений и нек-рых водорослей, хитин грибов, ?-D-ксиланы и ?-D-ман-наны нек-рых водорослей и высших растений). Ко второму классу относят гелеобразующие полисахариды, обеспечивающие эластичность клеточных стенок и адгезию клеток в тканях. Характерными представителями этого класса полисахаридов являются сульфатированные гликозаминогликаны (мукополисахариды) соединительные ткани животных, сульфатированные галактаны красных водорослей, альгиновые кислоты, пектины и некоторые гемицеллюлозы высших растений.

К защитным полисахаридам относят камеди высших растений (гетеро-полисахариды сложного состава и строения), образующиеся в ответ на повреждение растительных тканей, и многочисленные внеклеточные полисахариды микроорганизмов и водорослей, образующие защитную капсулу или модифицирующие свойства среды обитания клеток.

Большинство полисахаридов - бесцветные аморфные порошки, разлагающиеся при нагревании выше 200 °С. Полисахариды, молекулы которых обладают разветвленной структурой или имеют полианионный характер благодаря карбоксильным или сульфатным группам, как правило, достаточно легко растворяются в воде, несмотря на высокие молекулярные массы, тогда как линейные полисахариды, обладающие жесткими вытянутыми молекулами (целлюлоза, хитин), образуют прочные упорядоченные надмолекулярные ассоциаты, в результате чего практически не растворимы в воде. Известны промежутучные случаи блочных молекул полисахаридов, в которых одни участки склонны к межмолекулярной ассоциации, а другие - нет; водные растворы таких полисахаридов при определенных условиях переходят в гели (пектины, альгиновые к-ты, кар-рагинаны, агар).

Растворимые полисахариды можно осадить из водных растворов смешивающимися с водой органическими растворителями (например, этанолом, метанолом, ацетоном). Растворимость конкретного полисахарида определяет методику выделения его из природного объекта. Так, целлюлозу и хитин получают, отмывая подходящими реагентами все сопутствующие вещества, тогда как прочие полисахариды вначале переводят в раствор и выделяют затем фракционным осаждением растворителями, с помощью образования нерастворимых комплексов или солей, ионообменной хроматографией и т.д.

Солюбилизация сложных надмолекулярных комплексов (например, полисахариды клеточных стенок) требует подчас достаточно жестких условий, не исключающих расщепления некоторых химических связей. Выделенные полисахаридные препараты обычно представляют собой смеси полимергомологичных молекул; в случае нерегулярных полисахаридах дополнительным фактором неоднородности служит так называемая микрогетерогенность - различия отдельных молекул друг от друга по степени протекания постполимеризационных модификаций.

Из химических реакций полисахаридов важное значение имеет гидролиз гликозидных связей под действием разбавленных минеральных кислот, позволяющий получить моносахариды, входящие в состав полисахаридов. В отличие от олигосахаридов, восстанавливающие свойства или мутаротация (связанные с наличием в молекуле концевой карбонильной группы) в полисахаридах проявляются слабо из-за их больших молекулярных масс. Наличие множества гидроксильных групп позволяет проводить реакции алкилирования или ацилирования; некоторые из них имеют существенное значение для установления строения или практического использования полисахаридов.

Внеклеточные полисахариды

Внеклеточные полисахариды, как уже отмечалось, обнаруживаются в виде капсул и чехлов, прилегающих к клеточным стенкам, а также свободной слизи. Капсулы, имеющие толщину менее 0,2 мкм, не различимые в световом микроскопе, но хорошо видимые в электронный микроскоп, называют микрокапсулами. Микрокапсулы обычно связанны с клеточной стенкой прочнее, чем капсулы. У многих микроорганизмов капсулы имеют определенную структуру и четко отграничены от слизи. У некоторых бактерий капсульный материал рыхлый, бесструктурный, легко отторгается от клеток, поэтому границу между капсулой и свободной слизью в этом случае определить трудно.

Такие аморфные капсулы имеют сложную структуру. В них нередко различают несколько слоев с разным строением. Количество внеклеточных полисахаридов может во много раз превышать биомассу клеток.

Внеклеточные полисахариды, капсульные или свободные, или те и другие, образуют многие микроорганизмы. Пожалуй, нет такой группы микроорганизмов, представители которой не обладали бы этой способностью. Однако, синтез внеклеточных полисахаридов - не обязательная функция клетки и проявляется она лишь в определенных условиях. Встречаются микроорганизмы, у которых никогда не удавалось наблюдать ни капсул, ни слизи.

Внеклеточные полисахариды большинства видов бактерий - кислые гетерогликаны разнообразного состава, построенные из 2-5, а иногда 6-7 мономеров, линейные и разветвленные, имеющие регулярную структуру из повторяющихся олигосахаридных звеньев. Так, например, Xanthomonas campesyris синтезирует полианионит ксантан, включающий глюкозу, маннозу, глюкуроновую кислоту, О-ацетильную группу и пируват. Некоторые бактерии образуют нейтральные гетерополисахариды.

Установление строения

Установление первичной структуры полисахаридов складывается из последовательного решения трех задач: определения состава, типов связей между моносахаридами и последовательности отдельных моносахаридных звеньев.

Первая задача решается гидролизом и количественным определением (одним из видов количественной хроматографии, а в отдельных случаях - с помощью фотоколориметрии) всех входящих в состав полисахарида моносахаридов, а также неуглеводных заместителей (если они имеются).

Для определения типов связей между моносахаридами обычно служит метод метилирования, который заключается в превращении всех свободных гидроксильных групп полисахаридов в метиловые эфиры. Поскольку эти группировки устойчивы в уcловиях кислотного гидролиза гликозидных связей, то гидролиз метилированного полисахарида дает набор метиловых эфиров моносахаридов. Они различаются числом групп СН₃ в зависимости от положения-моносахаридного остатка в полимерной молекуле. Так, концевые невосстанавливающие остатки гексоз дают тетра-О-метилпроизводные, остатки гексоз из линейных участков цепей-три-О-метилпроизводные, из точек разветвления-ди-О-метилпроизводные и т.д. Наличие свободных гидроксильных групп в метилированных моносахаридах обусловлено тем, что в родоначальном полисахариде эти гидроксилы участвовали в образовании либо циклических форм моносахаридов (пиранозных или фуранозных), либо гликозидных связей. Поэтому определение положения групп СН₃ (а следовательно, и гидроксильных) в каждом таком производном позволяет в принципе установить размер цикла родоначального моносахаридного остатка в полимерной цепи и место замещения его соседним моносахаридным остатком (или остатками).

Существующие методики метилирования полисахаридов (например, метод Хакомори- действие NaH в ДМСО и затем СН₃I) обладают весьма высокой эффективностью и пригодны для микроколичеств вещества. Анализ продуктов метилирования проводится с применением хромато-масс-спектрометрии и дает надежные сведения о положении групп СН₃ в производных моносахаридов.

Сведения о конфигурации гликозидных центров и последовательности моносахаридных остатков в полимере получают, проводя частичное расщепление молекул полисахарида и устанавливая строение образующихся при этом олигосахаридов. Универсальным методом расщепления является частичный кислотный гидролиз, однако в общем случае он дает сложные смеси олигосахаридов с небольшими выходами. Лучшие результаты получаются при более специфическом воздействии на молекулу полисахарида химическими реагентами (ацетолиз, сольволиз безводным HF) или ферментами.

Своеобразный способ фрагментации молекул полисахарида -расщепление по Смиту, включающее периодатное окисление, восстановление полученного полиальдегида в полиол действием NaBH₄ и мягкий кислотный гидролиз, разрушающий ацетальные группировки (но не гликозидные связи моносахаридов, не затронутых периодатным окислением). Метод Смита часто позволяет получить фрагменты молекул полисахаридов, недоступные при обычном кислотном или ферментативном гидролизе (стадия образования полиальдегидов не показана):

С химическими методами установления первичной структуры полисахаридов успешно конкурирует спектроскопия ЯМР. Спектры ПМР и ЯМР¹³С содержат ценнейшую информацию о функциональном составе полисахаридов, положениях межмономерных связей, размерах циклов моносахаридных остатков, конфигурациях гликозидных центров и последовательности моносахаридов в цепи; из спектров ЯМР¹³С можно определить абсолютную конфигурации отдельных моносахаридных остатков (если известны абсолютные конфигурации соседних звеньев), а также получить данные о регулярном строении полисахаридов. Если известен моносахаридный состав линейного регулярного полисахарида, построенного из повторяющихся олигосахаридных звеньев, то задача установления его полного строения по спектру ЯМР успешно решается с помощью соответствующих компьютерных программ.

Другие физико-химические методы исследования применяются для определения молекулярных масс полисахаридов (вискозиметрия, светорассеяние, ультрацентрифугирование) и конформации молекул в твердом состоянии (рентгенография напряженных волокон или пленок).

Биосинтез

Все разнообразие структур природных полисахаридов - результат трех типов биосинтетических процессов. Первым из них служит последовательный перенос отдельных моносахаридных остатков от нуклеотидсахаров на растущую цепь с участием специфических ферментов гликозилтрансфераз, обеспечивающих необходимое положение и стереохимию образующейся гликозидной связи; таким способом синтезируются как моно тонные последовательности моносахаридных остатков в го могликанах, так и лишенные признаков регулярности гете-рополисахаридные цепи гликопротеинов.

Второй тип-сборка олигосахаридного "повторяющегося звена" по первому типу реакций и его последующая полимеризация с образованием строго регулярных полимерных молекул, характерных для полисахаридных цепей липополисахаридов грамотрицательных бактерий или для бактериальных капсульных полисахаридов.

Наконец, полисахариды, построенные по первому или второму типу, могут испытывать постполимеризационные модификации (третий тип биосинтеза), которые включают замещение атомов Н гидроксильных групп на ацильные остатки (ацетилирование, сульфатирование), присоединение боковых моно- и олигосахаридных остатков и даже изменение конфигурации отдельных моносахаридных звеньев [таким путем в результате эпимеризации при атоме С-5 образуются остатки L-гулуро-новой к-ты из D-маннуроновой в составе альгинатов (см. Альгиновые кислоты), а также остатки L-идуроновой к-ты из D-глюкуроновой в составе мукополисахаридов]. Последние реакции часто приводят к нарушению (маскировке) первонач. регулярности цепей П. и к образованию нерегулярных (мн. гемицеллюлозы) или блочных (альгиновые к-ты, мукополисахариды) структур.

Синтез природных полисахаридов и их аналогов представляет интерес для установления связи их строения и биологической активности, в первую очередь иммунологических свойств бактериальных полисахаридов.

Поликонденсация моносахаридов под действием кислых катализаторов приводит к полимерным продуктам, содержащим хаотичный набор межмономерных связей, катионная полимеризация защищенных 1,6-ангидридов гексоз - к линейным 1,6-связанным полисахаридам. Для общего решения задачи направленного синтеза сложных природных полисахаридов необходимы методы стереоспецифического гликозилирования, пригодные для полимеризации или поликонденсации олигосахаридов.

Примером такой реакции служит взаимодействия цианоэтилиденовых производных углеводов с тритиловыми эфирами сахаров, приводящее к 1,2-транс-гликозидам:

Поскольку обе группировки (тритиловую и цианоэтилидено-вую) можно ввести в одну молекулу моно- или олигосахарида, поликонденсация такого производного приводит к полисахаридам заданного строения. Этим путем были синтезированы полисахариды, содержащие ди-, три- и тетрасахаридные повторяющиеся звенья, в т.ч. идентичные природным П. бактериального происхождения.

Др. перспективный подход к синтезу полисахаридов - химико-ферментативный метод, в котором наиболее трудные стадии получения олигосахаридных предшественников или их полимеризация проводятся с использованием соответствующих ферментов. Показано, что этим путем можно получать не только природные полисахариды, но и их аналоги; недостатком метода является сравнительно малая доступность необходимых ферментов.

Биосинтез гликанов сводится к созданию гликозидной связи между моносахаридами. В общем виде это можно представить так: глиззидный донор передает гликозил на акцептор-затравку, а сам высвобождается. Полимеризация идет вплоть до образования готового полисахарида. Процесс катализируется специфическими гликозилтрансферазами, а ветвление полимеров - другими, «ветвящими», гликозолтрансферазами, отщепляющими фрагменты линейной цепи недостроенного полисахарида и переносящими их на ту же или аналогичную цепь в определенное положение. В случае биосинтеза гетерополисахаридов существует две возможности: либо регулируемое чередование различных мономерных единиц, либо предварительный синтез, ди- и олигосахаридов, которые остаются присоединенными к донору, а затем полимеризуются.

Акцепторами при биосинтезе полисахаридов выступают олигосахара и недостроенные гликаны. Первичными акцепторами часто бывают олигосахара. Это имеет место, например, в случае синтеза декстранов и леванов (сахароза), целлюлозы (целлодекстрины), хитина (хитодекстрины). Иногда первичным акцептором может быть, по видимому, только недостроенный полисахарид - «затравка».

Доноры моносахаридного остана имеют различную природу.

При биосинтезе декстранов и леванов донором может быть сахароза. Но в большинстве случаев сахара - доноры должны находиться в активированной форме. Активирование моносахаридных единиц происходит при помощи нуклиозидтрифосфатов с образованием нуклиозиддифосфатсахаров (НФФС), которые признаны наиболее распространенными и универсальными донорами гликозидных остатков. Так, в биосинтезе целлюлозы dcetobacter xylinum участвует уридиндифосфатглюкоза, в биосинтезе хитина - Neurospora crossa - уридиндифосфат - N - ацетилглюкозамин, маннана дрожжей - гуанозиндифосфатманнана. Очевидно, что в биосинтезе гетерополисахаридов принимает участие несколько доноров соответствующих гликозидных остатков.

Условия культивирования микроорганизмов и биосинтез полисахаридов

Среда обитания микроорганизмов часто определяет количественный выход, мономерный состав, структуру и молекулярную массу полисахаридов, а нередко - и саму возможность их биосинтеза. Изменение условий культивирования сказывается в первую очередь на образовании внеклеточных и запасных цитоплазматических гликанов. Количество и состав структурных полисахаридов отличается сравнительным непостоянством.

Вследствие большого разнообразия микробных гликанов и физиолого-биохимических особенностей их продуцентов значимость одного и того же фактора для образования различных полисахаридов не всегда одинакова.

Состав питательной среды

Источник углерода. Большинство микроорганизмов синтезируют полисахариды из всех источников углерода, обеспечивающих их рост: углеводов, спиртов, карбоновых кислот, аминокислот, углеводородов, С₁ - соединений. В настоящее время особое внимание привлекают возможность образования микроорганизмами полисахаридов на средах с углеводородами и С₁ - соединениями. На средах с н-алканами экзополисахариды синтезируются многими представителями артробактерий и сапротрофных микобактерий, некоторыми коринебактериями, дрожжами рода candida. Ряд метилотрофных бактерий образует значительные количества внеклеточных полисахаридов приросте на средах с метанолом.

Источник азота. Образование полисахаридов возможно, как правило, при использовании источников азота, способных поддерживать активный рост продуцента. Но природа источника азота может, не изменяя рост микроорганизма, влиять на количественный выход гликанов.

Существуют микроорганизмы, для которых предпочтительнее один источник азота, а для биосинтеза полисахарида - другой. Повышение концентрации азота в среде, как правило, отрицательно сказывается на синтезе полисахаридов. Качественный состав гликанов, по-видимому, не зависит от источников азота.

Другие компоненты среды. На биосинтез полисахаридов могут влиять и другие необходимые для роста микроорганизмов компоненты среды. Большое значение для образования гликанов имеет фосфор. Повышенное содержание фосфора в среде тормозит синтез многих полисахаридов. Но увеличение концентрации фосфора до определенных приделов способствует накоплению левана G. oxydas.

Важное значение имеют различные ионы, необходимые для поглощения субстрата или в качестве кофакторов биосинтеза полисахаридов.

Катионы железа оказывают положительное действие на продукцию полисахаридов Pscudomonas aeroginosa и Methymonas mucosa, на выделение в среду левансахарозы G. oxdans.

Ионы марганца необходимы для образования глюкана Rhyzobium japonicym.

Магний способствует синтезу разветвленных декстранов L-mesenteroides.

Физико-химические факторы среды

Кислотность среды. Обычно существуют определенные границы рН, допускающие рост микроорганизмов и синтез полисахаридов; эти интервалы у различных микроорганизмов неодинаковы. У ряда представителей границы, а иногда и оптимальные значения рН для роста и образования гликанов совпадают, но в отдельных случаях они различаются. У некоторых микроорганизмов количество полисахаридов не меняется в зависимости от рН среды.

Чаще всего изменение кислотности среды влияет на выход гликанов, на количественное соотношение полисахаридов, если их образуется несколько, на их молекулярную массу.

Аэрация и температура. Влияние аэрации и температуры на биосинтез микроорганизмов очень разнообразно. Режимы аэрации и температуры, благоприятные для образования того или иного гликана, могут сильно различаться.

Большинство микроорганизмов, образующих экзогликаны. - аэробны, поэтому в условиях хорошей аэрации выход экзогликанов в культурах таких микроорганизмов выше. Однако избыточное аэрирование может угнетать их биосинтез вследствие быстрого окисления углеродного субстрата.

В отношении действия температуры так же наблюдается определенная закономерность. Максимальное образование гликанов часто происходит при температуре ниже оптимальной для роста микрооргинизмов.

Промышленное получение микробных полисахаридов

Расширение спектра микробных полисахаридов, имеющих практическое значение, обусловлено успехом в области организации их производства. В настоящее время микробиологическая промышленность многих стран выпускает ряд ценных экзогликанов: декстран (Россия и другие страны), ксантан (США, Франция), пуллулан (Япония), склерогликан или «политран» (США), занфио (США), курдиан (Япония). Уже решены или решаются вопросы внедрения в производство ряда других полисахаридов, детально изученных в лабораторных условиях, проверенных на практике и производимых в полупромышленном масштабе.

Производство полисахаридов не универсально. Для каждого гликана оно имеет свои особенности, определяемые физиологией продуцента, локализацией и физико-химическими свойствами, областью его применения. Получение экзополисахаридов имеет преимущества перед получение внутриклеточных: так как экзогликаны образуются, как правило, в значительно большем количестве, легче отделяются от биомассы и очищаются от примесей. Однако при производстве экзогликанов имеются свои технологические трудности. Накопление полисахарида в среде приводит к ограничению доступа кислорода к клеткам. У аэробных микроорганизмов это снижает энергетический баланс и тормозит синтез полисахарида.

Повышенная вязкость среды делает невозможным отделение полисахарида от клеток продуцента из нативной культуральной жидкости. Ее приходится разбавлять в десятки раз, а также удаления клеток концентрировать до первоначального или меньшего объема.

Приведем основные этапы производства наиболее широко применяемых сейчас полисахаридов - декстраны и ксентана. Плазмозаменители из декстранов выпускают под названиями: клинический декстран, полиглюкин. Синкол, макродекс, плазмодекс, хемодекс, и др. Для получения декстранов используют штаммы Leuconostoc mesenderoides. Ферментацию ведут в среде с 10-30 % сахарозы, декстраном - «затравкой», дрожжевым экстрактом, минеральными солями. Создоют условия, способствующие синтезу той формы декстрана, которая используется в качестве плазмозаменителей: линейного глюкана, имеющего более 90 % б-1,6-связей, с молекулярной массой 60-80 тыс. Для этого ограничивают содержание в среде магния, стимулирующего синтез разветвленных декстранов, вносят «затравку» в виде декстрана, имеющего молекулярную массу 20-30 тыс. Такой акцептор обеспечивает преимущественной образование необходимого полимера.

Наивысшей биологической активностью обладают декстраны, содержащие менее 70% б-1,6-гликозидных связей, то есть более разветвленные. Синтезу биологически активных декстранов способствует, кроме магния, замена сахарозы мелассой. Оптимальное значение рН для роста продуцента лежит в пределах 6,5-8,0, а для накопления декстрансахарозы - около 7,0. обычно значение рН среды задают в интервале 7,0-8,0.

Представители полисахаридов

Хитин.

Высокомолекулярный линейный полисахарид, построенный из остатков N-ацетил--D-глюкозамина с 14-связями между ними (см. ф-лу). Деацетилированные (частично или полностью) полимеры, встречающиеся в природе или получаемые хим. обработкой X., носят назв. хитозанов.

Xитин широко распространен в природе, являясь опорным компонентом клеточной стенки большинства грибов и нек-рых водорослей, наружной оболочки членистоногих и червей, нек-рых органов моллюсков.

Аналогия в химическом строении хитина и целлюлозы приводит к близости их физико-химических свойств, что позволяет им выполнять сходные функции в живых системах. Как и молекулы целлюлозы, молекулы хитина обладают большой жесткостью и выраженной склонностью к межмоллекулярной ассоциации с образованием высокоупорядоченных надмолекулярных структур. Известно несколько типов таких кристаллических образований ( -хитины), которые различаются степенью упорядоченности и взаимной ориентацией отдельных полимерных цепей. Xитин не растворяется в воде, и его удается растворить только в присутствии агентов, эффективно разрывающих водородные связи (насыщенный водный раствор LiSCN, 5-10%-ный р-р LiCl в ДМСО или N,N-диметилацетамиде).

Биосинтез хитина происходит в особых клеточных органеллах (хитосомах) с участием фермента хитинсинтетазы путем последовательного переноса остатков N-ацетил-D-глюкозамина из уридиндифосфат-N-ацетил-D-глюкозамина на растущую полимерную цепь. Хитозан, наличие которого особенно характерно для клеточных стенок некоторых грибов, образуется путем ферментативного N-деацетилирования хитина.

В природе хитин находится в комплексе с др. полисахаридами и минеральными веществами и ковалентно связан с белком. Для выделения хитина пользуются его нерастворимостью и большой химической стойкостью, переводя в раствор сопутствующие компоненты сырья. Так, панцири крабов или омаров, содержащие до 25% хитина, деминерализуют соляной кислотой, белки растворяются в горячей щелочи, отбеливание хитина проводят Н₂О₂. Более мягкие условия выделения заключаются в деминерализации комплексонами и обработке окислителями при нейтральных рН. Получаемый таким способом хитин имеет молекулярную массу порядка несколько миллионов.

Xитин медленно растворяется в концентрированной НС1 и H₂SO₄ с деструкцией полимерных цепей. Для препаративного получения хитоолигосахаридов разработаны условия частичного кислотного гидролиза, сольволиза жидким HF и ферментативного расщепления. При продолжительном нагревании с сильными минеральными кислотами образуется D-глюкозамин. При нагревании с сильными щелочами происходит N-деацетилирование с образованием хитозана; практически получаемые образцы хитозанов обычно имеют молекулярную массу порядка (1-5) х 10⁵ и могут различаться остаточным содержанием ацетильных групп.

Xитин является вторым после целлюлозы по распространенности природным биополимером. Его ежегодное образование составляет несколько десятков миллиардов тонн. Наиболее доступными источниками хитина служат отходы промысла морских беспозвоночных и мицелий низших грибов. Практическое использование немодифицированного хитина сдерживается его плохой растворимостью. Хотя волокна и пленки изхитина обладают ценными свойствами, до сих пор отсутствует экономичный и удобный с технологической точки зрения метод их получения. Более перспективен хитозан, который растворяется в кислотах с образованием солей, дающих высоковязкие растворы. Хитозан дает прочные соединения с белками, анионными полисахаридами, образует хелатные комплексы с металлами и т. д., на чем основано его применение для удаления белка из сточных вод в производствеве пищевых продуктов (мясная, рыбная, молочная промышленность, сыроделие), создания хелатирующих ионообменников, иммобилизации живых клеток в биотехнологии, при изготовлении медицинских препаратов, отделке бумаги и текстильных волокон. Некоторые N-ацилпроизводные хитозана - хорошие гелеобразователи; при ацилировании хитозана производными дикарооновых кислот получают поперечносшитые гели, удобные для иммобилизации ферментов. Алкилирование аминогрупп хитозана можно проводить действием альдегидов или кетонов с последующим восстановлением оснований Шиффа. Получаемый по этой схеме из хитозана и глиоксиловой кислоты N-карбоксиметилхитозан обладает высоким сродством к переходным металлам за счет хелатирования.

Xитн, подобно многим растительным полисахаридам, активирует макрофаги и способствует увеличению продукции антител В-клетками. Xитин и хитозан стимулируют животные клетки, участвующие в иммунологической защите против раковых клеток и патогенов. Хитозан обладает выраженной гипохолестеринемич. и гиполипидемической активностью. Xитин и хитозан ускоряют заживление ран, различные сульфатированные производные хитозана, особенно сульфат N-карбоксиметилхитозана, обладают св-вами антикоагулянтов крови.

Ксантан

Имеет поли-в (1>4) -D-глюкопиранозную структуру, напоминающую целлюлозу, но содержит три боковые цепи сахаров. Некоторые цепи сjдержат заряженные группы пирувата b ацетата. Молекулярная масcа варьирует от 2 до 12·10⁶ в зависимости от образца и способа приготовления препарата. Ксантан обладает уникальными свойствами: образует очень вязкие растворы при низких концентрациях, причем вязкость заметно снижается с увеличением дробления (псевдопластичность); растворы ксантананечувствительны к крнцентрации соли, рН и температуре в широких пределах. Водные растворы ксантана имеют тенденцию образовывать упорядоченную структуру, так как полисахарид имеет гребнеиодобную молекулу, напоминающую модель двойной спирали. Ксантан применяют при приготовлении пищи, зубных паст, гелевых дезодорантов, при окраске ковров, при суспендировании сельскохозяйственных химикалиев для повышения добычи нефти. В связи с уникальными реологическими свойствами ксантан и в будущем остается главным микробным полимером, выпускаемым в промышленности.

Альгинат

Важное свойство альгинатов - способность образовывать гели в реакциях с солями Сa. Скорость образования геля, его качество и консистенция контролируются добавлением Са. В мире производят более 22 тыс. т альгината в год. Это самый большой сектор в промышленности водорослей поскольку большую часть альгинатов получают из морских коричневых водорослей. Бактериальные альгинаты могли бы иметь широкое применение (в приготовлении мороженого, желе, пива, также в печатании текстиля), но рынок бактериальных альгинатов находится в острой конкуренции с водорослевыми альгинатами, что задерживает внедрение первых в промышленность.

Курдлан

Курдлан - это полимер глюкозы, а сукциноглюкан кроме глюкозы содержит ещё янтарную кислоту и галактозу, Промышленно важное свойство курдлана: образование термически необратимых гелей. При нагревании курдлан набухает в воде и образует эластичный гель. Гелеобразование необратимо. Применяется как уплотнитель в диетических блюдах, особенно в тех, которые при приготовлении нагреваются. Поскольку курдлан не разлагается животными он служит ингредиентом малокалорийной пищи, например желе. Ацетильные производные курдлана в Японии используют в качестве основы ультрафильтрационных полупроницаемых мембран для фракционирования веществ с молекулярной массой 200-2000. Селективность таких мембран по фуранозе 96%, по витамину В₁₂ - 97%.

Использование полисахаридов

Многие полисахариды производят в крупных масштабах, они находят разнообразное практическое применение. Так, целлюлозу используют для производства бумаги и искусственного волокна, целлюлозы ацетаты - для волокон и пленок, целлюлозы нитраты, а водорастворимые метилцеллюлозу гидроксиэтилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу - как стабилизаторы суспензий и эмульсий.

Крахмал используют в пищевой промышленности, где находят применение в качестве текстурированных агентов также пектины, альгинаты, каррагинаны и галактоманнаны. Перечисленные полисахариды имеют растительное происхождение, но с ними все успешнее конкурируют бактериальные полисахариды, получаемые в результате промышленного микробиологического синтеза (ксантан, образующий стабильные высоковязкие растворы, и другие полисахариды со сходными свойствами).

Весьма перспективны разнообразные технические применения хитозана (кагионного полисахарида, получаемого в результате дезаце-тилирования природного хитина).

Многие полисахариды применяют в медицине (агар в микробиологии, гидроксиэтилированный крахмал и декстраны в качестве плазмозамещающих растворов, гепарин как антикоагулянт, некоторые глюканы грибов как противоопухолевые и иммуностимулирующие агенты), биотехнологии (альгинаты и каррагинаны как среда для иммобилизации клеток) и лабораторной технике (целлюлоза, агароза и их производные как носители при различных способах хроматографии и электрофореза).

В настоящее время полисахариды микроорганизмов достаточно широко используются в практике. Они находят применение в самых различных сферах человеческой деятельности: в медицине, фармацевтической, пищевой, химической и текстильной промышленности, в гидрометаллургии, при добыче нефти и в ряде других областей народного хозяйства. При этом внимание исследователей и практиков привлекают и внутриклеточные и внеклеточные гликаны, однако в технико-экономическом плане предпочтительнее последнее - масштаб их производства и применения значительно шире. Возможность и перспективность использования полисахаридов в медицине в значительной мере определяется их биологической активностью.

Многие микробные полисахариды обладают лечебным и профилактическим действием: повышают устойчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям, обладают противоопухолевой активностью, способствуют заживлению ран и регенерации тканей, благоприятно влияют на течение и исход вспомогательных процессов, устраняют болевой синдром, снижают побочное действие лекарственных препаратов.

Возможности практического применения полисахаридов микроорганизмов полностью еще не раскрыты.

Всестороннее изучение гликанов в этом плане открывают новые перспективы и, несомненно, приведет к расширению соответствующей области микробиологической промышленности.

Размещено на Allbest.ru