Вплив тривалої дії малих доз іонізуючої радіації на протипухлинну резистентність організму

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

УДК: 616-092:612.014.481/.482

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ ТРИВАЛОЇ ДІЇ МАЛИХ ДОЗ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ НА ПРОТИПУХЛИННУ РЕЗИСТЕНТНІСТЬ ОРГАНІЗМУ

ФЕДОСОВА НАТАЛІЯ ІВАНІВНА

14.01.07 - онкологія

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Науковий керівник - доктор медичних наук

Савцова Зоя Дмитрівна,

завідувач відділу імуномодуляції Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти: - доктор біологічних наук, професор

Гамалія Микола Федорович,

завідувач відділу клітинної фотобіології і фотомодуляції пухлинного росту Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

- кандидат біологічних наук

Бендюг Галина Дмитрівна,

провідний науковий співробітник лабораторії клінічної імунології Інституту онкології АМН України.

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра онкології, м. Київ.

Захист відбудеться “22” травня 2002 року о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий 19 квітня 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Н.В. Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. На сьогодні вже не викликає сумніву, що у походженні більшості злоякісних пухлин та онкогематологічних захворювань у людини основну роль відіграють фактори навколишнього середовища (хімічної, фізичної та біологічної природи). Протягом останнього часу чи не найбільшу увагу дослідників привертають фізичні фактори, зокрема, іонізуюче випромінювання низької інтенсивності. Питання про його вплив на організм стало актуальним для сучасної онкології та радіобіології не лише в теоретичному, а і в практичному плані внаслідок забруднення навколишнього середовища радіоактивними речовинами і впливу останніх на значні контингенти населення (особливо після аварії на ЧАЕС). Слід зауважити, що “дочорнобильські” радіобіологія і онкологія були орієнтовані переважно на вивчення дії високих доз опромінення, механізмів променевого ураження, визначення умов для ефективної радіотерапії пухлин. Після 1986 року стали очевидними недостатня вивченість біологічних ефектів опромінення в малих дозах, відсутність адекватних уявлень про механізми їх впливу на організм та необхідність проведення фундаментальних досліджень в умовах натурних “польових” експериментів.

Відомості щодо біологічних ефектів радіації малих інтенсивностей і доз (в тому числі її впливу на канцерогенний ризик) досить суперечливі. Одночасно поступово накопичуються епідеміологічні та клінічні спостереження, які свідчать, що в групах населення, що постраждало від аварії на ЧАЕС, збільшується захворюваність і змінюється клінічний перебіг певних злоякісних новоутворень (А.Р. Туков и др., 1998; А.Е. Океанов и др., 2000; Л.А. Сивак, 2000; В.Г. Бебешко и др., 2001; A. Bounacer, 2000). В розвитку цих ефектів значну роль можуть відігравати повґязані з опроміненням зміни гормонального та імунного гомеостазу організму (А.А. Ярилин, 1997; А.К. Бутенко, 2000; В.Л. Валецький, В.О. Чорний, 2001). Одночасно з імуномодулюючою дією іонізуючого випромінювання низької інтенсивності ряд дослідників пов'язує і протилежний феномен - гальмування росту пухлин (А.А. Дударев и др., 1995; A.J. Kharazi et al, 1994; W. Daoyan et al., 1996). Іншими словами, на сьогодні роль радіаційно індукованих зрушень в імунній системі в патогенезі злоякісних новоутворень досліджена ще недостатньо. Нечисельні експериментальні дослідження, присвячені цьому питанню, проведені переважно в умовах короткочасного модельного зовнішнього опромінення тварин малими дозами радіації. Це не дає змоги для екстраполяції їх результатів на ситуації тривалого опромінення внаслідок крупних радіаційних аварій. Необхідне також детальне вивчення впливу хронічного опромінення в малих дозах на клітинні імунологічні механізми, що зумовлюють протипухлинну резистентність, зокрема, на активність різних популяцій ефекторних клітин, клітин-супресорів та продукцію відповідних цитокінів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами науково-дослідної роботи Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за темами “Вивчення особливостей пухлинного росту та селекції трансформованих клітин при постійному опроміненні організму малими дозами іонізуючої радіації” (державний реєстраційний номер 0200U001636), “Дослідити можливість формування адаптивних змін до дії малих доз іонізуючого випромінювання на різних рівнях організації живих систем” (державний реєстраційний номер 0200U001644), “Розробити нові методичні підходи для ранньої діагностики злоякісних захворювань кровотворної системи та обґрунтувати заходи корекції порушень систем організму, що викликані дією радіаційного фактору в Чорнобильській зоні” (договір № 17/8н-98 від 01.04.1998р з Міністерством України з питань надзвичайних ситуацій та у справах захисту населення від наслідків Чорнобильської катастрофи).

Мета дослідження. Вивчення впливу змін імунного гомеостазу, що були індуковані тривалим комбінованим опроміненням радіонуклідами чорнобильського спектру, на протипухлинну резистентність організму та пухлинну прогресію.

Задачі дослідження:

1. Провести комплексне дослідження стану імунної системи постійно перебуваючих в зоні відчуження ЧАЕС експериментальних тварин (мишей, щурів) у строки, що передують індукції або перещепленню пухлин.

2. Порівняти особливості росту і метастазування експериментальних (індукованих, перещеплюваних) пухлин у тварин, на яких вплив радіації низької інтенсивності почався в різні періоди онтогенезу: в статевозрілому віці (F0) або в антенатальному періоді (F2 постійно утримуваної в зоні відчуження ЧАЕС популяції).

3. Дослідити вплив тривалого комбінованого опромінення мишей-самців на імунологічні показники та протипухлинну резистентність їх нащадків, які народилися і протягом життя утримувалися в умовах без підвищених радіаційних навантажень.

4. Вивчити динаміку змін протипухлинної резистентності та селекцію пухлинних клітин в організмі статевозрілих тварин в залежності від тривалості опромінення в зоні відчуження.

Об'єкт дослідження. Експериментальні тварини: миші ліній C57Bl, CC57W і щури Вістар, які отримували постійне комбіноване (зовнішнє і внутрішнє) опромінення, перебуваючи в зоні відчуження ЧАЕС, або були нащадками опромінених тварин; інтактні тварини тих же ліній.

Предмет дослідження. Стан імунної системи (в т.ч. основні реакції протипухлинного імунітету) та особливості росту і метастазування різних експериментальних пухлин (хімічноіндукованих, перещеплюваних, індукованих введенням трансформованих клітин лінії А 5) за умов впливу малих доз іонізуючого випромінювання.

Методи дослідження. Цитологічні, радіологічні, імунологічні методики, моделі та методи експериментальної онкології. Всі результати проаналізовані статистично.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що зрушення в імунному гомеостазі, які виникали у тварин різних видів при тривалому комбінованому опроміненні в зоні відчуження ЧАЕС (діапазон поглинутих доз 30-770 мГр), можуть справляти суттєвий вплив на частоту виникнення, динаміку росту і метастазування експериментальних пухлин. Показано, що характер впливу іонізуючої радіації на протипухлинну резистентність (відсутність ефекту, підвищення або зниження) в дослідженому діапазоні доз значною мірою залежить від тривалості опромінення та від того, в якому періоді індивідуального розвитку воно почалося. Встановлено, що зміна протипухлинної резистентності може бути як соматичним, так і генетичним наслідком тривалого впливу на організм радіації низького рівня. Доведено, що при тривалій дії малих доз іонізуючого випромінювання можливість варіювання протипухлинної резистентності обумовлена динамікою співвідношення активності клітин-ефекторів неспецифічних і специфічних протипухлинних реакцій та рівня імуносупресорних механізмів, а також змінами процесу селекції пухлинних клітин в опроміненому організмі.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть скласти фундаментальне підґрунтя при прогнозуванні виникнення детермінованих і стохастичних ефектів опромінення, оцінки погіршення стану здоров`я та розвитку певних захворювань (зокрема, онкологічних), а також при обґрунтуванні і розробці рекомендацій відносно необхідності проведення та індивідуалізації методів імунокорекції у різних категорій населення, яке зазнало дії іонізуючого опромінення низької інтенсивності. Розроблені і охарактеризовані в умовах натурних експериментів моделі можуть бути використані для проведення доклінічних досліджень нових лікарських засобів та харчових добавок з радіопротекторними властивостями, що призначені для корекції наслідків опромінення інкорпорованими радіонуклідами, в тому числі для підвищення протипухлинної резистентності.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто зібрана та проаналізована література за темою дисертації; проведене дослідження впливу малих доз іонізуючого випромінювання на ріст і метастазування експериментальних пухлин. Здійснено визначення показників, що характеризують стан імунокомпетентних органів (тимусу, селезінки, периферичних лімфатичних вузлів), активності ефекторних клітин (ПКК і ЦТЛ) в цитотоксичних тестах, здатності Т-лімфоцитів продукувати ІЛ-2 і макрофагів - ФНП та ІЛ-1. Самостійно проведено статистичну обробку та теоретичне узагальнення результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені на конференції молодих вчених ІЕПОР НАНУ (Київ, 1997); IV науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 1999); ІІІ конференції молодих вчених “Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2000); II з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000), міжнародній конференції “П`ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання.” (Київ, 2001).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, серед яких 5 статей у провідних фахових виданнях, 2 - в збірниках наукових праць, 3 - тез.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку літератури, який включає 251 першоджерело, в тому числі 154 вітчизняних та 97 зарубіжних. Робота ілюстрована 3 рисунками та 20 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на лінійних тваринах: 120 щурів лінії Вістар, 261 миша лінії C57Bl та 80 мишей лінії CC57W, які тривалий час перебували в умовах підвищених радіаційних навантажень в зоні відчуження ЧАЕС. Радіаційні навантаження формувались за рахунок зовнішнього і, переважно, внутрішнього опромінення. Останнє було обумовлене радіонуклідами чорнобильського викиду, які надходили в організм тварин з їжею та питною водою. Активність добового раціону та питної води формувалась, головним чином, за рахунок 134Сs, 137Сs, 90Sr, 90Y. Дозові навантаження від трансуранових ?-випромінювачів не визначались. Загальні поглинені дози, а також дози опромінення окремих органів і тканин варіювали в діапазоні 30-770 мГр в залежності від виду, віку тварин та тривалості утримання в зоні відчуження. Дані про сумарні дози опромінення наведені в табл. 1. Дозовий супровід досліджень провадили співробітники відділу радіобіології ІЕПОР НАН України, використовуючи комплекс методів, розрахунків і показників, що детально описані раніше (А.А. Мойсеев, В.И. Иванов, 1990; Я.И. Серкиз и др., 1991; В.Ф. Козлов, 1991).

Щури Вістар (самці) були завезені в зону відчуження ЧАЕС у віці 2 міс та утримувались там протягом життя. Терміни обстеження тварин - 4, 8, та 16 міс опромінення.

Таблиця 1

Сумарні дози опромінення експериментальних тварин

Тварини (покоління) Тривалість опромінення в постнатальному періоді, міс Поглинута доза (мГр)

пренатального опромінення постнатального опромінення на

все тіло червоний кістковий мозок

Щури Вістар, F0 3 не опромін. 110 139

6 244 314

12 508 632

Миші C57Bl F0 F2 3,5 не опромін. 69 114

3,0-3,5 12 27 45

Миші CC57W 3,0-3,5 11 43 71

Опромінення мишей C57Bl (самці, F0) починалося з двохмісячного віку і тривало 3,5 міс, після чого тварин повертали до віварію ІЕПОР НАН України. Популяції мишей ліній CC57W (F0-F4) і C57Bl (F0-F3) постійно утримувалися та розмножувалися на експериментальній базі в зоні відчуження. Опромінення самців і самок F0 обох ліній починалося в статевозрілому віці, нащадків наступних поколінь - в ембріональному періоді. Обстежували тварин F2 обох ліній віком 3,0-3,5 міс. Для дослідження змін протипухлинної резистентності як генетичного наслідку опромінення, частину самців F0 C57Bl після повернення до м. Києва парували з неопроміненими самками. Обстеженню підлягали їх нащадки (F1-F2) віком 3,0-3,5 міс, які народжувались і протягом життя утримувались в умовах без підвищених радіаційних навантажень.

Контролем в усіх дослідженнях були неопромінені миші та щури тих же ліній, віку і статі з розплідників, звідки в зону ЧАЕС були завезені тварини батьківського покоління (F0), які утримувались на експериментальній базі ІЕПОР НАН України в м. Києві.

Досліджували вплив малих доз іонізуючого випромінювання на стан імунної системи та на особливості росту і метастазування різних експериментальних пухлин: меланоми В-16; карциноми легенів Льюїс; пухлин, щеплених трансформованими клітинами лінії А 5; рабдоміосарком, що були індуковані введенням 20-метилхолантрену. Для характеристики перебігу пухлинного процесу визначали: частоту виникнення первинних пухлин; латентний період; розміри пухлинного вузла; частоту метастазування, кількість і об`єм метастазів; тривалість життя тварин з пухлиною; частоту регресії первинного пухлинного вузла; розраховували відносний ризик виникнення пухлин (В.С. Турусов, Ю.Д. Парфенов, 1986).

Дослідження стану імунної системи включало визначення: відносної маси та клітинності лімфоїдних органів (тимусу, селезінки, периферичних лімфатичних вузлів); вмісту зрілих Т-, В-лімфоцитів, бластів і великих лімфоцитів в периферичних лімфовузлах (фарбування за Штокінгером і Келльнером); проліферативної активності нестимульованих лімфоцитів лімфоїдних органів та їх відповідь на введення поліклональних Т- (Конканавалін А (Кон А), “Sigma”, США) і В-клітинного (Декстрансульфат (ДС), “Lobo-Chemie”, Австрія) мітогенів in vivo (за допомогою радіометричного методу); активності лімфоцитів в реакції “трансплантат проти хазяїна” (локальний варіант); спонтанної продукції in vitro лімфоцитами селезінки ІЛ-2; антигеннеспецифічної супресорної активності в системі адоптивного переносу спленоцитів обстежуваних тварин сингенним реципієнтам, за ступенем зменшення реакції останніх на Кон А (Дж. Клаус, 1990); антигенспецифічної пухлиноасоційованої імуносупресії в реакції бласттрансформації in vitro (в якості мітогена використовували гомологічні пухлинні клітини, оброблені мітоміцином С (MPS Laboratories (Pty) Ltd, Japan)) (Л.Н. Чередеев и др., 1985); активності ПКК та ЦТЛ в цитотоксичному тесті in vitro (M. Hokland et al, 1982); функціональної активності макрофагів за спонтанною продукцією in vitro ФНП (H. Fisch, G. Gifford, 1983), ІЛ-1 та за результатами тесту відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) (Дж. Клаус, 1990). Функціональний стан імунної системи як цілого (К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 1988) оцінювали згідно з рекомендаціями ВООЗ та Інституту здоров`я США за чутливістю тварин до прищеплення пухлинних клітин, а також розраховували показник відносного порушення імунного гомеостазу за методикою З.І. Калмикової з співавт. (1996) у модифікації, яка полягала в тому, що враховували не тільки статистично значуще зменшені, але й збільшені імунологічні показники (І.М. Воєйкова, 1997).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Ст'юдента, критерію Пірсона (ч2) та, в окремих випадках, коефіцієнтів кореляції (r) (Г.Ф. Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Першим фрагментом дослідження було вивчення впливу тривалого комбінованого опромінення малими дозами іонізуючої радіації на протипухлинну резистентність статевозрілих тварин (самці C57Bl, F0). Показано, що за дослідженими показниками імунної системи миші, які зазнали опромінення в зоні відчуження протягом 3,5 міс практично не відрізнялись від тварин контрольної групи. З усіх вивчених параметрів достовірно зміненим був лише один - збільшена реакція лімфоцитів на неспецифічний Т-мітоген. Після перещеплення цим тваринам клітин меланоми В-16 також не відмічали суттєвої зміни показників, які характеризують пухлинний ріст. Пухлини виникали у 85,7% дослідних і 87,5% контрольних тварин, латентний період складав 8,4±1,6 і 9,0±1,4 діб відповідно. Середній розмір пухлин, кількість і об`єм метастазів, тривалість життя достовірно не відрізнялись в обох групах. Тобто, опромінення в зоні відчуження ЧАЕС протягом 3,5 міс не мало суттєвого впливу на дискретні імунологічні характеристики і протипухлинну резистентність тварин, опромінення яких почалося в статевозрілому віці.

Дослідження стану імунної системи нащадків F2 постійно опромінюваних в зоні відчуження популяцій мишей (C57Bl та CC57W) показало, що у тварин цього покоління суттєво змінена значна кількість досліджуваних показників. Зокрема, у мишей F2 C57Bl, в порівнянні з контрольними тваринами, спостерігали суттєве зменшення відносного вмісту зрілих Т-лімфоцитів та збільшення вмісту В-лімфоцитів у периферичних лімфатичних вузлах (ІМ -6,3 та +15,1% відповідно, Р < 0,05). Відмічали зниження включення 3Н-тимідину в нестимульовані лімфоцити периферичних лімфовузлів (Р < 0,05) та зменшення реакції останніх на Кон А (ІМ -50,7%, 0,05 < P < 0,1), пригнічення активності ПКК та перитонеальних макрофагів (ІМ -73,0 та -37,5% відповідно, Р < 0,05). Для мишей F2 CC57W спектр достовірно змінених імунологічних показників був дещо іншим. Спостерігали вірогідне збільшення клітинності тимусу (на 100%); зменшення загальної клітинності і зміни субпопуляційного складу периферичних лімфатичних вузлів - зменшення відносної кількості зрілих Т-лімфоцитів та різке підвищення кількості бластів (ІМ -20,2 і +302,0% відповідно, Р < 0,05); посилення проліферативного потенціалу нестимульованих клітин цих субпопуляцій та зниження реакції лімфоцитів периферичних лімфовузлів на неспецифічні мітогени (ІМ реакції на Кон А -99,2, на ДС -39,2%, Р < 0,05); пригнічення РТПХ (Р < 0,05); зменшення активності ПКК (ІМ -75,1%, Р < 0,05). Показники, що характеризують особливості перебігу пухлинних процесів, наведені в табл. 2. Як після перещеплення клітин карциноми Льюїс (C57Bl), так і після індукції пухлин 20-метилхолантреном (CC57W) у опромінених тварин спостерігали тенденцію до збільшення частоти виникнення пухлин, суттєве скорочення латентного періоду (Р < 0,05), зростання відносного ризику виникнення пухлин. Водночас тривалість життя після появи пухлини у дослідних тварин порівняно з контрольними мала тенденцію до збільшення. Тобто, незважаючи на більш раннє виникнення пухлин, пухлинний процес у опромінених мишей прогресував повільніше, ніж у контрольних. При вивченні динаміки розвитку асоційованої з ростом пухлин імуносупресії, було показано, що остання виникає у опромінених тварин пізніше, ніж у контрольних та виражена в меншій мірі. Можливо, зниження Т-супресії і уповільнення розвитку пухлиноасоційованого імунодефіциту є однією з причин збільшення тривалості життя мишей дослідних груп.

Таблиця 2

Динаміка росту експериментальних пухлин у тварин F2 постійно опромінюваних в зоні відчуження популяцій мишей C57Bl та CC57W

Примітки: 1. * - Р < 0,05 у порівнянні з контролем; 2. ** - 0,05 < Р < 0,1 у порівнянні з контролем

Співставлення особливостей стану імунної системи та характеристик перебігу пухлинного процесу у мишей F0 C57Bl, які зазнали тривалого опромінення в статевозрілому віці, та мишей F2, опромінення яких почалося з ембріонального періоду, показало, що за умов впливу на організм іонізуючої радіації низької інтенсивності розвиток змін протипухлинної резистентності значною мірою залежить не тільки від величини сумарної дози опромінення, але й від тривалості останнього як в онтогенезі даної тварини, так і в попередніх (батьківських) поколіннях. Зі збільшенням тривалості опромінення, як відомо, змінюється співвідношення проявів пошкодження окремих ланок імунної системи та її компенсаторно-адаптивних реакцій, що, вірогідно, є важливим механізмом зниження протипухлинної резистентності у мишей F2. Крім того, надфонових радіаційних навантажень зазнавали як власне тварини F2, так і передуючі їм покоління (F0-F1), тобто, до соматичних додавались ще й генетичні ефекти іонізуючої радіації.

Наступним етапом дослідження було вивчення протипухлинної резистентності нащадків опромінених мишей-самців C57Bl за умови відсутності надфонових радіаційних навантажень як в ембріональному, так і в постнатальному періодах життя цих нащадків. При дослідженні імунного статусу тварин F1 були відмічені суттєві зміни відносної маси тимусу та периферичних лімфоїдних органів (селезінки і лімфовузлів). Виявлено зменшення вмісту лімфоцитів в периферичних лімфовузлах (ІМ -12%, P < 0,05) та пригнічення їх реакції на поліклональний Т-мітоген (ІМ -65,6%, P < 0,05); зниження активності ПКК (ІМ -86,2%, P < 0,05). Однак, як видно з даних, що характеризують ріст у цих тварин меланоми В-16, такий рівень змін в імунній системі виявився недостатнім, щоб справити значний вплив на частоту і латентний період виникнення пухлин (табл. 3). Водночас, динаміка росту і метастазування меланоми В-16 у нащадків опромінених самців була прискореною, а тривалість життя значно меншою порівняно з контролем.

Таблиця 3

Особливості росту і метастазування меланоми В-16 у нащадків F1 тривало опромінених самців C57Bl

Примітки: 1. 1 - розраховано з поправкою Ван дер Вардена; 2. * - P < 0,05 у порівнянні з контролем

Враховуючи, що меланома В-16 належить до високоантигенних пухлин, ми припустили, що в феномені прискорення перебігу пухлинного процесу в дослідній групі значну роль можуть відігравати особливості зміни імунної відповіді на пухлинний ріст. Було показано, що на 16-ту добу після прищеплення меланоми В-16 рівень антигенспецифічної пухлиноасоційованої імуносупресії у тварин дослідної групи був істотно більшим, ніж у контрольних. В контрольній групі додатні індекси РБТЛ in vitro на клітини меланоми В-16, оброблені мітоміцином С, були зафіксовані в усіх варіантах постановки реакції (в культурах лімфоцитів з регіонарних і контрлатеральних по відношенню до пухлини лімфовузлів та з селезінки), в дослідній - всі досліджувані лімфоцити мали від'ємний індекс РБТЛ (індекси супресії були збільшеними порівняно з контрольною групою в 1,3; 2,7; 4,2 рази відповідно). Виходячи з сукупності імунологічних даних, можна припустити, що в зміні перебігу пухлинного процесу у тварин дослідної групи значна роль належить пригніченню як природної цитотоксичності лімфоцитів, так і реакцій Т-клітинного імунітету на тлі активації пухлиноасоційованої імуносупресії.

При дослідженні протипухлинної резистентності мишей F2 отримані інші результати. За показниками, що характеризують стан імунної системи до перещеплення пухлин, тварини контрольної і дослідної груп не мали суттєвих відмінностей. В той же час спостерігали зменшення частоти прищеплення пухлин у мишей F2 в порівнянні з контрольними: відповідно 40,0 і 79,3% (меланома В-16) та 58,3 і 92,9% (карцинома Льюїс) (0,05 < Р < 0,1). Латентний період, динаміка росту та метастазування пухлин, тривалість життя в контрольних і дослідних групах статистично суттєво не відрізнялись. Дослідження розширеного спектру імунологічних показників мишей F2, у яких не прищепилися пухлини, показало, що у цих тварин були збільшені активність ПКК та ЦТЛ (по відношенню до гомологічних пухлинних клітин) (рис. 1А); підвищені рівні продукції ФНП, ІЛ-1 та ІЛ-2 (рис. 1Б). При дослідженні спонтанної антигеннеспецифічної супресії встановлено, що у тварин, які були резистентними до перещеплення карциноми Льюїс, індекс супресії (ІС) в 2 рази менший, ніж у інтактних. ІС у мишей, стійких до перещеплення меланоми В-16, не мав статистично значущої відмінності від контрольного (рис. 1В). Така різниця може бути пов'язана з різними співвідношеннями супресорної і ефекторної ланок імунної системи в процесі формування специфічної імунної відповіді після введення в організм високоантигенних (меланома В-16) або низькоантигенних (карцинома Льюїс) клітин. Отже, підвищена стійкість до прищеплення пухлин у частини нащадків F2 опромінених самців C57Bl, очевидно, пов`язана з активацією ефекторів природної резистентності (ПКК, ЛАК-клітин, макрофагів), підвищенням рівня специфічної цитотоксичної дії лімфоцитів щодо високоантигенних пухлинних клітин та зі зниженням антигеннеспецифічної супресії.

Вивчення особливостей росту і метастазування пухлин, індукованих введенням щурам Вістар трансформованих клітин А5 (прищеплення після 4, 8 та 16 міс опромінення), показало, що зміни протипухлинної резистентності опромінюваних щурів, як і зміни дискретних імунологічних характеристик, мали коливальний характер та залежали від тривалості опромінення. Після 4 міс опромінення спостерігали підвищення активності ПКК (ІЦ 60,4±8,7% проти 35,1±6,1% в контролі, 0,05 < Р < 0,1) та макрофагів (ЦПА 12,0±1,8% проти 8,4±1,0% в контролі, 0,05 < Р < 0,1), збільшення в 1,6 рази вмісту лімфоцитів в периферичних лімфовузлах (0,05 < Р < 0,1). Після 8 міс опромінення жодна з досліджених імунологічних характеристик у піддослідних тварин не мала суттєвих відмінностей від контрольної групи. У 18-місячних щурів (термін опромінення 16 міс) активність ПКК значно знижувалась порівняно з першим терміном обстеження (ІЦ у дослідній групі 19,6±10,2%, Р4-16 міс < 0,05). Була зниженою активність макрофагів в порівнянні з першим терміном обстеження, але суттєво перевищувала таку в контролі (ЦПА відповідно 7,0±1,1 і 3,7±0,3%, P < 0,05; 0,05 < Р4-16 міс < 0,1).

радіація тварина резистентність пухлина

А

В

Б

Рис. 1. Активність ПКК і ЦТЛ (А), рівень продукції in vitro ФНП, ІЛ-1, ІЛ-2 (Б) та рівень антиген-неспецифічної супресії (В) у інтактних мишей C57Bl ( ) і резистентних до прищеплення карциноми Льюїс ( ) або меланоми В-16 ( ) нащадків F2 опромінених самців тієї ж лінії. ІЦ - індекс цитотоксичності; ІС - індекс супресії; Сн-супернатант

Включення 3Н-тимідину в нестимульовані лімфоцити периферичних лімфовузлів опромінених щурів було знижене порівняно з контролем в 3,6 рази (P < 0,05). Описані зміни імунологічних характеристик опромінюваних щурів асоціювались з підвищенням протипухлинної резистентності після 4 міс опромінення, її поверненням до рівня вікового контролю після 8 міс та зниженням після 16 міс опромінення (рис. 2). Одночасно слід зазначити, що у старих щурів, які зазнавали дії радіації низької інтенсивності протягом 16 міс, метастазування пухлин було загальмованим. Відомо, що за певних умов неспецифічні реакції протипухлинної резистентності можуть сприяти селекції в організмі трансформованих клітин в бік підвищення злоякісності (збільшення їх метастатичного потенціалу). Одним із фенотипічних проявів підвищення метастатичної активності є збільшення стійкості клітин до дії Н2О2 (Г.И. Дейчман, Е.Л. Вендров, 1985; З.Д. Савцова и др., 1993).

Рис. 2. Зміни частоти прищеплення клітин А5 ( ), латентного періоду виникнення пухлин ( ), частоти регресії пухлин ( ), частоти спонтанного метастазування ( ) та тривалості життя ( ) в залежності від терміну опромінення щурів Вістар в зоні відчуження.

* - Р < 0,05; ** - 0,05 < Р < 0,1 в порівнянні з контролем; ІМ - індекс модуляції

Результати дослідження цієї характеристики у клітинах вихідної лінії А5, а також в культурах пухлинних клітин, експлантованих від контрольних та опромінених щурів різного віку, дозволяють припустити, що гальмування метастазування пухлин А5 у старих щурів, особливо в дослідній групі, можливо, пов`язане з уповільненням темпів такої селекції.

Можливість імунологічно опосередкованого підвищення протипухлинної стійкості організму після короткочасного модельного опромінення експериментальних тварин в малих дозах описана рядом дослідників (А.А. Дударев и др., 1995; A.J. Kharazi et al., 1994; J.Aoxing et al, 1997). Одержані нами результати показують, що за умов тривалої дії радіації низької інтенсивності протипухлинна стійкість може зростати на ранніх етапах опромінення, але такий феномен є транзиторним. Зі збільшенням часу опромінення протипухлинна стійкість організму прогресивно знижується.

Для порівняння та оцінки функціональної спроможності імунної системи за різних умов (доза, тривалість, радіаційний анамнез) радіаційного впливу у тварин різних ліній та видів (за неспівпадаючої реакції на нього) було запропоновано визначати показник відносного порушення імунного гомеостазу (ПВПІГ) у опромінених тварин (З.И. Калмыкова и др., 1996). Показано, що розрахункові величини ПВПІГ мають сильний кореляційний зв`язок з чутливістю до патогенного вірусу, яка є однією з узагальнюючих експериментальних характеристик повноцінності імунної системи (І.М. Воєйкова, 1997). Ми провели розрахунки показників відносного порушення імунного гомеостазу в усіх досліджених групах тварин та визначили кореляційні зв'язки ПВПІГ зі зміною окремих показників, що характеризували ріст модельних пухлин. Між ПВПІГ та частотою пухлин виявлений додатній кореляційний зв'язок середньої сили - r = 0,60 (tЦ = 1,75 < tst = 2,45, Р > 0,05), між ПВПІГ і латентним періодом - сильна зворотня кореляція - r = -0,82 (tЦ = 3,48 > tst = 2,45, Р < 0,05). Це посередньо підтверджує результати клінічних спостережень, згідно з якими серед онкологічних хворих, які мають в анамнезі вплив іонізуючої радіації внаслідок аварії на ЧАЕС, зростає (порівняно з даними доаварійного періоду) кількість осіб молодого віку (В.Л. Валецький, В.О. Чорний, 2001). Тобто, розраховані за використаною методикою величини ПВПІГ чітко відображують зміни протипухлинної резистентності, зафіксовані в дослідженнях. Між тим, кореляція між ПВПІГ і тривалістю життя тварин з пухлиною була низькою - r = 0,29 (tЦ = 0,67 < tst = 2,57, Р > 0,1), що, на нашу думку, вказує на залежність перебігу пухлинного процесу при тривалому комбінованому опроміненні не тільки від безпосередніх змін активності ефекторів протипухлинної резистентності, але й від інших механізмів.

ВИСНОВКИ

1. Порушення імунного гомеостазу є типовим наслідком тривалого комбінованого опромінення в зоні відчуження ЧАЕС, виникає незалежно від виду і лінії лабораторних тварин та може справляти суттєвий вплив на їх стійкість до росту експериментальних пухлин.

2. Розвиток змін в імунній системі може бути як соматичним, так і генетичним ефектом іонізуючої радіації низької інтенсивності, а спектр, напрямок та вираженість таких змін залежать від генетично обумовлених особливостей імунної системи, від періоду індивідуального розвитку, на якому почався радіаційний вплив, та від наявності такого впливу на попередні покоління.

3. За умов постійної дії радіації на індивідуальний організм або на декілька поколінь тварин рівні як дискретних протипухлинних реакцій, так і протипухлинна резистентність організму в цілому коливались: на ранніх етапах опромінення не зазнавали суттєвих змін або підвищувались, при збільшенні тривалості опромінення - знижувались. За умов відсутності надфонових радіаційних навантажень у нащадків опромінених самців динаміка протипухлинної резистентності була протилежною: зниження в F1 та підвищення у 30-40% тварин F2.

4. Негативні зміни протипухлинної резистентності у опромінених тварин мають в підгрунті ушкодження ефекторних лімфоцитарних ланок (ПКК та ЦТЛ) і посилене формування пухлиноасоційованої імуносупресії; активність моноцитарної ланки змінюється значно менше. У випадках, коли паралельно зі зниженням ефекторних реакцій зменшувалась активність і супресорних клітин, при збільшенні частоти пухлин спостерігали уповільнення їх росту і метастазування.

5. Підвищення стійкості щурів Вістар після 4 міс опромінення та нащадків F2 опромінених самців C57Bl до прищеплення експериментальних пухлин пов`язане з активацією ефекторів природної резистентності (ПКК, ЛАК, макрофаги), а в останньому випадку і з підвищенням рівня специфічної цитотоксичної реакції лімфоцитів щодо пухлинних клітин на тлі зниженої антигеннеспецифічної супресії.

6. Встановлено кореляційний зв`язок між величиною показників відносного порушення імунного гомеостазу (ПВПІГ) опромінених тварин та змінами частоти прищеплення (або індукції) пухлин (r = 0,60) і тривалості їх латентного періоду (r = -0,82). Водночас низька кореляція між ПВПІГ та тривалістю життя тварин з пухлинами (r = 0,29) підтверджує роль і інших механізмів у зміні перебігу пухлинного процесу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Savtsova Z.D., Dzhaman N.I., Voyejkova I.M., Yudina O.Y., Kovbasiuk S.A., Zaritskaya M.Y., Indyk V.M. Changed antitumor resistance as a genetic consequence of prolonged exposure to natural spectrum radionuclides of the Chernobyl discharge // Experim. Oncol. - 2001. - Vol. 23, № 1. - P. 61-65. (автором досліджено вплив тривалого комбінованого опромінення батьків на особливості росту і метастазування перещеплюваних пухлин (меланома В16 і карцинома Льюїс), активність ПКК, ЦТЛ, продукцію макрофагами ФНП та ІЛ-1 у їх нащадків F1-F2).

2. Савцова З.Д., Федосова Н.И., Воейкова И.М., Юдина О.Ю., Новиченко Н.Л., Индык В.М. Изменение противоопухолевой резистентности крыс Вистар при длительном облучении в зоне отчуждения ЧАЭС // Эксперим. онкология. - 2001. - Т. 23, №3. - С. 183-188. (автором досліджено вплив опромінення на особливості росту пухлин, індукованих введенням клітин А 5, проведено статистичну обробку результатів).

3. Савцова З.Д., Воєйкова І.М., Індик В.М., Юдіна О.Ю., Зарицька М.Ю., Джаман Н.І., Серкіз Я.І. Зміни в імунній системі експериментальних тварин внаслідок постійного опромінення кількох поколінь в зоні відчуження ЧАЕС // Укр. Радіол. Журн. - 2000. - Т. 8, №1. - С. 71-76. (автором досліджено вплив постійного опромінення на імунологічні показники, що характеризують лімфоїдні органи, проліферативну активність нестимульованих і стимульованих мітогеном лімфоцитів, активність ПКК, перитонеальних МФ, здійснено статистичну обробку результатів).

4. Савцова З.Д., Воєйкова І.М., Джаман Н.І., Юдіна О.Ю., Індик В.М., Ковбасюк С.А. Генетичні наслідки тривалого комбінованого опромінення експериментальних тварин в зоні відчуження ЧАЕС // Укр. Радіол. Журн. - 2000. - Т. 8, №2. - С. 158-163. (автором досліджено вплив тривалого комбінованого опромінення батьків на показники, що характеризують імунокомпетентні органи, активність МФ та ПКК у їх нащадків F1-F2, здійснено статистичну обробку результатів).

5. Савцова З.Д., Джаман Н.І., Воєйкова І.М., Юдіна О.Ю. Вивчення в експерименті особливостей імуномодулюючої дії малих доз радіації при формуванні різних дозових навантажень // Наукові записки НаУКМА. Серія: Біологія та екологія (Національний університет “Києво-Могилянська академія”). - 2000. - Т. 18 - С. 8-24. (автором проведено дослідження впливу постійного опромінення на клітинність лімфоїдних органів, проліферативну активність нестимульованих лімфоцитів, активність ПКК і МФ).

6. Савцова З.Д, Джаман Н.І. Вплив радіоактивного випромінювання на імунну систему живих організмів // Чорнобиль. Зона відчуження. Збірник наукових праць. - К.: Наукова думка, 2001. - С. 410-422. (автором підібрано наукову літературу щодо змін імунного гомеостазу та розвитку спадкових (генетичних) наслідків постійного опромінення малими дозами іонізуючої радіації у людей і експериментальних тварин; проведений аналіз і співставлення власних даних, отриманих внаслідок експериментальних досліджень, і літературних відомостей).

7. Савцова З.Д., Воєйкова І.М., Юдіна О.Ю., Джаман Н.І., Меньок Т.А., Усач О.М. Корекція стану імунної системи в умовах тривалого впливу на організм шкідливих чинників аварії на ЧАЕС // Шляхи та перспективи розвитку експериментальної онкології в Україні. - К.: ДІА, 2001. - С. 191-202. (автором підібрано наукову літературу щодо впливу малих доз іонізуючої радіації на стан імунної системи опромінених людей і експериментальних тварин та змін канцерогенного ризику внаслідок опромінення; показана можливість корекції негативних наслідків впливу на організм факторів аварії на ЧАЕС за допомогою препаратів біологічного походження).

8. Никольский И.С., Савцова З.Д., Джаман Н.И., Никольская В.В., Воейкова И.М. Тимогормонозависимый эффект иммуногенетических различий / Матеріали ІV наук.-практ. конф. з актуальних питань алергології та клінічної імунології // Імунологія та алергологія. - 1999. -№3. - С. 85. (автором узагальнені в тезовій формі результати вивчення впливу опромінення на показники, що характеризують Т-ланку системи імунітету мишей ліній C57Bl та CC57W).

9. Савцова З., Юдина О., Воейкова И., Джаман Н., Зарицкая М., Усач О. Изменение противоопухолевой резистентности как биологический эффект длительного облучения экспериментальных животных в зоне отчуждения ЧАЭС / Тез. ІІ съезда онкологов стран СНГ. Украина, Киев 23-26 мая 2000г // Experim. oncol. - Vol. 22 (Suppl.) - Р. 106. (автором узагальнені в тезовій формі результати вивчення впливу тривалого комбінованого опромінення малими дозами іонізуючої радіації на протипухлинну резистентність експериментальних тварин).

10. Джаман Н.І., Воєйкова І.М., Юдіна О.Ю., Індик В.М., Савцова З.Д. Зміни протипухлинної резистентності організму як соматичні та генетичні ефекти тривалого комбінованого опромінення експериментальних тварин в зоні відчуження ЧАЕС // Матеріали Міжнар. конф. “П`ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання.” - Київ, 2001. - 2-61. (автором резюмовано відомості про зміни протипухлинної резистентності експериментальних тварин під впливом постійного опромінення радіонуклідами чорнобильського спектру та про можливі механізми таких змін).

АНОТАЦІЯ

Федосова Н.І. Вплив тривалої дії малих доз іонізуючої радіації на протипухлинну резистентність організму. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07. - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню впливу змін імунного гомеостазу, що були індуковані тривалим комбінованим опроміненням в зоні відчуження ЧАЕС, на протипухлинну резистентність експериментальних тварин та пухлинну прогресію. Показано, що такі зміни належать до числа як соматичних, так і генетичних наслідків опромінення та виникають у тварин різних видів і ліній (миші, щури). Спектр, напрямок і ступінь імунологічних зрушень та загальна протипухлинна резистентність можуть значно варіювати залежно не тільки від дози опромінення, але і його тривалості; від того, в якому періоді онтогенезу почався радіаційний вплив, та від наявності такого впливу на попередні покоління. На ранніх етапах опромінення стійкість організму до пухлинного росту не зазнавала суттєвих змін або підвищувалась, на більш пізніх - знижувалась. Характер змін протипухлинної резистентності при дії іонізуючого випромінювання низької інтенсивності обумовлений співвідношенням проявів пошкодження різних ланок імунної системи та її компенсаторно-адаптивних реакцій в різні терміни.

Ключові слова: іонізуюче випромінювання низької інтенсивності, зона відчуження ЧАЕС, експериментальні тварини, протипухлинна резистентність

АННОТАЦИЯ

Федосова Н.И. Влияние длительного воздействия малых доз ионизирующей радиации на противоопухолевую резистентность организма. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению влияния длительного воздействия ионизирующего излучения низкой интенсивности на противоопухолевую резистентность организма. Исследовали дискретные иммунологические характеристики и особенности роста и метастазирования экспериментальных опухолей (карцинома Льюис, меланома В-16; опухоли, прививаемые трансформированными клетками линии А5; рабдомиосаркома, индуцированная введением 20-МХ) у животных разных видов (крысы, мыши), подвергавшихся длительному комбинированному облучению в зоне отчуждения ЧАЭС, или их потомков. Результаты исследований показали, что развитие изменений в иммунной системе может быть как соматическим, так и генетическим последствием облучения, возникать независимо от вида и линейной принадлежности животных, оказывать существенное влияние на их резистентность к росту экспериментальных опухолей. Спектр, направление, выраженность отдельных иммунологических нарушений и общая противоопухолевая резистентность организма зависели не только от дозы, но и длительности облучения, линейных особенностей иммунной системы; от того, в каком периоде индивидуального развития началось радиационное воздействие, а также от наличия такого воздействия в предыдущих поколениях. При исследовании животных, непосредственно подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения, на ранних этапах (3,0-3,5 мес облучения индивидуального организма, F0 популяции) наблюдали отсутствие существенных изменений или повышение противоопухолевой резистентности, на более поздних (16 мес облучения индивидуального организма, F2 облучаемой популяции) - ее снижение. Подобные колебания, вероятно, обусловлены изменением соотношения проявлений повреждения отдельных звеньев иммунной системы и ее компенсаторно-адаптивных реакций по мере увеличения длительности облучения. При условии отсутствия надфоновых радиационных нагрузок у потомков облученных самцов динамика противоопухолевой резистентности была противоположной - снижение в F1 и увеличение у части (30-40%) животных F2. Повышенная резистентность ассоциировалась с активацией неспецифических (макрофаги, ЕКК), а в некоторых случаях и специфических (ЦТЛ) эффекторов реакций клеточного иммунитета на фоне снижения антигеннеспецифической супрессии. Снижение противоопухолевой резистентности было связано, в первую очередь, с повреждением лимфоцитарного звена противоопухолевого иммунитета; активность моноцитарного звена изменялась в значительно меньшей степени. В случаях, когда параллельно со снижением эффекторных реакций уменьшалась и активность супрессорных клеток, при увеличении частоты возникновения опухолей наблюдали замедление их роста и метастазирования.

Ключевые слова: ионизирующее излучение низкой интенсивности, зона отчуждения ЧАЭС, экспериментальные животные, противоопухолевая резистентность.

ANNOTATION

Fedosova N.I. Effect of Long-term Exposure to Small-dose Ionizing Radiation on the Anti-tumor Resistance. - Manuscript.

Thesis for the title of а Candidate of Biological Sciences; by speciality: 14.01.07. - Oncology. - R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology, and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The thesis deals with investigation of the effect of changes in the immune homeostasis induced by a long-term exposure to combined irradiation in Ch.A.P.P. alienation zone on the anti-tumor resistance of experimental animals and tumor progression. It is shown that these changes stem from both somatic and genetic consequences of irradiation and arise in animals of various species and strains (mice, rats). The range, direction, and degree of immunological alterations and the overall anti-tumor resistance may vary considerably depending not only upon the dose of irradiation but also upon the duration of exposure, the stage of ontogenesis when this exposure began, and the presence or absence of exposure in earlier generations. At the early stages of exposure, the resistance to tumor growth was either unchanged or increased; at later stages it was decreased. The character of changes in the anti-tumor resistance induced by influence of a low-intensive ionizing irradiation was determined by the relationship between the impairment of various links of the immune system and compensatory/adaptive responses at different times of exposure.

Key Words: low-intensive ionizing irradiation, Ch.A.P.P. alienation zone, experimental animals, anti-tumor resistance

Размещено на Allbest.ru