Морфологічний стан і життєздатність аутодермотрансплантатів при різних методах консервування

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 616.5-089.844:615.014.41]-018

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МОРФОЛОГІЧНИЙ СТАН І ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ АУТОДЕРМОТРАНСПЛАНТАТІВ ПРИ РІЗНИХ МЕТОДАХ КОНСЕРВУВАННЯ

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

ДОВБУШ АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України.

Науковий керівник:

Волков Костянтин Степанович, доктор біологічних наук, професор, Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач.

Офіційні опоненти:

Стеченко Людмила Олександрівна, доктор біологічних наук, професор Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра гістології, цитології та ембріології, професор.

Костинський Григорій Борисович, доктор медичних наук, професор Київський медичний інститут Української асоціації народної медицини, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач.

Провідна установа: Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, м. Сімферополь.

Захист відбудеться 7 березня 2002 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.00.3.06 при Національному медичному університеті ім. О.О. Богомольця (03057, м. Київ, пр. Перемоги, 34).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 3).

Автореферат розісланий 05.02. 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.00.3.06 доктор медичних наук О.М. Грабовий.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Шкіра відіграє важливу роль у життєдіяльності організму людини. Вона безпосередньо контактує із зовнішнім середовищем, здійснює чисельні функції, виконання яких забезпечується завдяки особливостям будови та високим регенераторним можливостям епідермісу та дерми (Мяделец О.Д., 1997; Denda M., 1997). Пограничне розташування шкіри є однією з причин частих травм різної етіології. Особливо небезпечним для організму людини є пошкодження шкіри на великих за площею ділянках, що часто виникає при гіпер- та гіпотермічних травмах. Найпоширенішим фактором ураження шкіри є опіки, які в загальній структурі травматизму стійко посідають одне з перших місць (Герасимова Л.И., 1990; Федоров В.Д., 1990; Raff G.,1996).

Закриття рани і відновлення шкірного покриву на ділянках з глибоким та обширним ураженням шкіри залишається одним із актуальних і не до кінця вивчених завдань сучасної комбустіології (Сандомирский Б.П., 1992).

У практичній медицині часто виникає необхідність тимчасового або тривалого зберігання аутошкіри. При післятравматичних ранах із відривом шкірних клаптів, які слід зберегти життєздатними і використати після очищення ран (Козинец Г.П., 1993), в комбустіології при великих за площею опікових ранах і проведенні частих аутодермопластик (Саркисов Д.С., 1993, Повстяний Д.С., 1996, Лучанко П.І., 1998). Можливість зберігати аутодермотрасплантати життєздатними дозволить зменшити кількість оперативних втручань. Після ретельної підготовки ран для аутопластики можна використовувати консервовані життєздатні аутоклапті. Тому виникає потреба зберігання аутодермотрансплантатів, для чого використовують різні методи консервування (Сандомирский Б.П., 1992, Frahmy F.S., 1993, Бігуняк В.В., 1994, DeBono R., 1997).

Відомі методи, які комбустіологи використовують для зберігання аутошкіри: зберігання в холодильнику, кріоконсервування (Сандомирский Б.П., 1993), застосування гліцерин-формалінового розчину (Хуйдатов И.С., 1991) і гліцерин-жовткової суміші (Бігуняк В. В, 1994). Але в доступній нам літературі ми не знайшли ґрунтовних гістологічних і, особливо, електронномікроскопічних досліджень морфофункціонального стану аутодермотрансплантатів, за якими можна було би зробити висновок про їх життєздатність.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи кафедри гістології, цитології та ембріології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського "Життєздатність ксено- та аутодермотрансплантатів при різних методах консервування" (планова НДР, номер держреєстрації 0100U005062). Автор є виконавцем даної НДР.

Мета дослідження. Встановити закономірності морфофункціональних змін та оцінити життєздатність аутодермотрансплантатів при різних методах та в різні терміни зберігання.

Задачі дослідження:

1. Провести детальні гістологічні, електронномікроскопічні та морфометричні дослідження шкіри людини в нормі.

2. Дослідити морфофункціональний стан та життєздатність аутодермотрансплантатів у динаміці при гіпотермічному зберіганні (температура 0 …+4 °С).

3. Простежити динаміку структурних змін та встановити життєздатність аутодермотрансплантатів консервованих у гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах. Порівняти ефективність цих методів консервування.

4. Провести структурний аналіз і простежити життєздатність епідермісу та дерми в динаміці при кріоконсервуванні (температура -196 °С).

5. Зробити узагальнення щодо життєздатності аутодермотрансплантатів при різних методах і термінах зберігання і дати рекомендації для їх використання в практичній медицині.

Об'єкт дослідження: аутодермотрансплантати.

Предмет дослідження: морфологічний стан та життєздатність аутодермотрансплантатів при різних методах та в різні терміни зберігання.

Методи дослідження: морфологічні - гістологічні (світлооптичні та електронномікроскопічні), які дозволили встановити зміни на різних рівнях структурної організації аутодермотрансплантатів, консервованих різними методами. Морфометричні методи, які забезпечили отримання кількісних параметрів структур, що вивчалися та провести їх вірогідно-статистичний аналіз. Метод визначення життєздатності клітин, який дав можливість встановити життєздатність окремо виділених епідермоцитів.

Наукова новизна одержаних результатів. Детальні гістологічні та морфометричні дослідження шкіри людини в нормі дозволили вперше встановити три типи епітеліоцитів базального шару епідермісу.

Встановлено морфологічні критерії життєздатності аутодермотрансплантатів, послідовність і характер змін структурної організації епідермісу та дерми при різних термінах зберігання шкіри та проведено порівняльний аналіз при гіпотермічному зберіганні (температура 0…+4 °С), консервуванні у гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах та при кріонсервуванні (температура -196 °С).

Розроблено та вперше застосовано спосіб визначення життєздатності епідермоцитів, який базується на проникності барвника через плазмолему і доводить, що життєздатність клітин залежить від цілісності структурної організації клітинної оболонки (деклараційний патент на винахід № 44040 А від 15.01.2002 р.).

Вперше за допомогою комплексу методів дослідження - мікроскопічного, електронномікроскопічного, морфометричного, методу визначення життєздатності клітин і статистичного аналізу вивчено особливості морфофункціональних змін аутодермотрансплантатів при різних методах зберігання.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті комплексних досліджень отримано дані, які мають як теоретичне так і практичне значення. Результати гістологічних та морфометричних досліджень розширюють уяву про будову епідермісу шкіри людини. Розроблений метод визначення життєздатності клітин може бути широко використаний у науково-дослідних лабораторіях при проведенні аналізу збереженості тканин.

Встановлені терміни тимчасового або тривалого збереження життєздатності аутодермотрансплантатів при використанні низькотемпературного зберігання, консервування у гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах і зберіганні в рідкому азоті дозволяють рекомендувати їх застосування в практичній медицині для підвищення ефективності аутодермопластики.

Наукові результати дисертаційної роботи, які стосуються морфологічного стану і життєздатності аутодермотрансплантатів при різних методах консервування впроваджені в травматологічних та опікових відділеннях Тернопільської міської комунальної лікарні швидкої допомоги, Львівської 8-ої клінічної лікарні, Хмельницької та Рівненської обласних клінічних лікарень, а також впроваджені в навчальний процес та науково-дослідну роботу кафедр гістології, цитології та ембріології, анатомії людини, патологічної анатомії, курсу комбустіології Тернопільської медичної академії та кафедр гістології, цитології та ембріології Вінницького, Харківського, Запорізького, Кримського медичних університетів і Івано-Франківської та Буковинської медичних академій.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проаналізована наукова література за темою дисертації, виконано експериментально-морфологічні дослідження: проведений забір матеріалу, гістологічні, морфометричні, їх статистична обробка, систематизовано та проаналізовано отримані результати. Самостійно написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки та запропоновані практичні рекомендації. У наукових роботах, опублікованих у співавторстві, автору належить фактичний матеріал, отриманий ним при проведенні дослідження.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались і були обговорені на 3, 4 і 5 міжнародних медичних конгресах студентів і молодих вчених (Тернопіль, 1999, 2000, 2001); 18 конгресі польського анатомічного товариства і 34 симпозіумі польського гістохімічного і цитохімічного товариства (Лодзь, 1999); 2 азіатському міжнародному конгресі анатомів (Китай, 1999); всеросійській науково-практичній конференції хірургів (Росія, 1999), науково-практичній конференції комбустіологів (Бердянськ, 2001), науково-практичній підсумковій конференції Тернопільської медакадемії (2000, 2001), наукових читаннях, присвячених 100-річчю професора Б.В. Альошина в Харківському медичному університеті (2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, які повністю відображають зміст проведеного дослідження, з них 4 - у фахових виданнях, 7 - у збірниках робіт симпозіумів і наукових конференцій. Отримано деклараційний патент "Спосіб визначення життєздатності клітин" № 44040 від 15.01.2002 року.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація виконана на 139 сторінках машинописного тексту (обсяг тексту основної частини становить 118 сторінок) Складається з вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали і методи дослідження", трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел, який включає 209 бібліографічних описів, серед яких 99 робіт авторів України та країн СНД, 110 робіт іноземних авторів. Робота ілюстрована 65 рисунками, 4 таблицями, 5 діаграмами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Об'єктом дослідження були епідерміс та дерма аутодермотрансплантатів (товщиною 0,8-1 мм), знятих дерматомом зі стегон 52 хворих опікового відділення Тернопільської міської комунальної лікарні швидкої допомоги. Шматочки аутошкіри зберігали при різних умовах і в різних розчинах. Дослідження їх морфологічного стану та оцінку життєздатності проводили на 1-30 доби досліду. Шматочки шкіри, яку зберігали в холодильнику при температурі 0 - +4 °С, досліджували на 1, 3, 7 та 14 доби. Лоскути шкіри, які консервовані в гліцерин-формаліновій (0,25 % розчин формаліну в 15 % гліцерині) або в гліцерин-жовтковій сумішах (рац. пропозиція № 10 від 10.11.2001 р.) досліджували на 3, 7, 14 та 21 доби зберігання. Кріоконсервовані аутолоскути, які попередньо перед зануренням у рідкий азот (t -196 °С), підготовлювали шляхом еквілібрації у гліцерин-жовтковій суміші (Бігуняк В.В., 1994), забирали для дослідження на 14, 21 та 30 доби зберігання.

Для гістологічних досліджень шматочки аутодермотрансплантатів фіксували в 10 % нейтральному формаліні з наступною заливкою в парафін. Отримані на санному мікротомі зрізи завтовшки 6-8 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином (Саркисов Д.С., Перова Ю.Л., 1996), досліджували у світлооптичному мікроскопі і фотодокументували за допомогою мікроскопа МБИ-6. Ці методи дають можливість вивчати структуру тканин у нормі, а також характер і глибину морфологічних змін у динаміці при різних методах зберігання.

Для електронномікроскопічних досліджень маленькі шматочки аутошкіри попередньо фіксували 2,5 % розчином глютаральдегіду, приготованому на фосфатному буфері Міллоніга (рН 7,3-7,4) (Weakly B., 1975). Фіксований 60 хвилин матеріал переносили в буферний розчин і промивали протягом 20-30 хвилин. Постфіксацію шматочків шкіри здійснювали 1 % розчином чотириокису осмію на буфері Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили їх дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в епоксидні смоли згідно загальноприйнятої методики (Weakly B., 1975). Для вибору місця дослідження та орієнтації матеріалу робили напівтонкі зрізи, які забарвлювали метиленовим синім.

Ультратонкі зрізи аутодермотрансплантатів, виготовлені на ультрамікротомі УМТП-7, забарвлювали 1 % водним розчином уранілацетату, контрастували цитратом свинцю згідно методу Рейнольдса (Саркисов Д.С., Перова Ю.Л., 1996) та вивчали в електронному мікроскопі ЕМВ-100ЛМ та ЕМ-125 К.

Морфометричні та кількісні дослідження проводили, використовуючи систему візуального аналізу гістологічних препаратів. Зображення на екран телевізора Panasonic Gaoo 70 TC-2170 R виводили з мікроскопу Jenamed Carl Zeiss за допомогою відео-камери Sony DXC-107AP. При об'єктиві х 25 збільшення на екрані становило 1 600 разів.

Дослідження проводили у визначені терміни досліду на препаратах забарвлених гематоксиліном та еозином. Підраховували кількість змінених клітин від загальної кількості епідермоцитів, розміри, площу тіл та ядер базальних клітин, їх ядерно-цитоплазматичне співвідношення та відсоток епітеліоцитів трьох типів.

Для визначення життєздатності епідермоцитів консервованої шкіри нами запропоновано спосіб (Довбуш А.В., Волков К.С., рішення про видачу деклараційного патенту № 2001031430 від 1.03.2001 р.), згідно якого розчином трипсину отримували суспензію розділених клітин епідермісу. Після центрифугування з нижньої фракції виготовляли мазки, які забарвлювали 0,4 % розчином трипанового синього. Мікропрепарат досліджували у світловому мікроскопі МБИ-6 при збільшенні 900 (ок. х 15, об'єктив х 60), підраховували кількість забарвлених (нежиттєздатних) і незабарвлених (життєздатних) епідермоцитів та визначали їх процентне співвідношення.

Статистичну обробку цифрових даних, отриманих при морфометричних дослідженнях та визначенні життєздатності епідермоцитів здійснювали методом варіаційної статистики. Достовірність різниці середніх величин та їх похибок оцінювали за критерієм Стьюдента-Фішера (Автандилов Г.Г., 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Проведені гістологічні дослідження шкіри людини в нормі підтвердили відомі загальні закономірності структурної організації епідермісу та дерми тонкої шкіри (Alberts B., 1993, Мяделец О.Д., 1997). Клітини епідермісу щільним епітеліальним пластом лежать на хвилястій базальній мембрані формуючи базальний, остистий, зернистий і роговий шари. Дерма представлена сполучнотканинними шарами: сосочковим та сітчастим.

Серед епідермоцитів базального шару прийнято розрізняти два види клітин - малі та великі (Графова Г.Я., 1982; Alberts B., 1993). Результати проведених нами морфометричних та електронномікроскопічних досліджень дозволяють виділити три групи клітин відповідно до їх розмірів і ядерно-цитоплазматичного співвідношення та особливостями ультраструктурної організації: малі, середні і великі. Першу групу складають молоді камбіальні клітини, які мають невеликі розміри (4-6 мкм), зустрічаються зрідка (4,8±0,2 %), а їх ядерно-цитоплазматичний індекс становить 0,79. Для цих епідермоцитів характерна виразна електронна щільність цитоплазми, зумовлена насиченністю тонофіламентами.

Епітеліоцити другої групи (висота 7-9 мкм) мають циліндричну або еліпсоподібну форму, більший об'єм цитоплазми, тому їх ядерно-цитоплазматичний індекс (0,59±0,03) менший у порівнянні з клітинами першої групи. Це багаточисельні (82,6±2,6 %) зрілі функціонально активні клітини.

В базальному шарі епідермісу поодиноко розташовані (12,6±0,5 %) відносно високі (11-13 мкм) епідермоцити з великими ядрами, які входять до складу третьої групи. Їх ядра займають значну частину клітин, а ядерно-цитоплазматичний індекс становить 0,73±0,04, що в 1,24 рази більший відносно епітеліоцитів другої групи. Вони містять пластинчасті кератиносоми, або ламелярні тільця Одланда, які розміщені, переважно, в навколоядерній зоні, що свідчить про початок процесу кератинізації. Дотепер у доступній нам літературі ми не зустрічали дані про наявність кератиносом в епідермоцитах базального шару. Тому, вважаємо доцільним виділити в окрему групу такий тип базальних епідермоцитів з кератиносомами.

Мікроскопічні, електронномікроскопічні, морфометричні дослідження та метод визначення життєздатності клітин показали, що на 1 добу зберігання аутолоскутів при температурі 0 - +4 °С не спостерігається суттєвих відмінностей у порівнянні з нормальною шкірою людини. В базальному та остистому шарах епідермісу встановлено небагато 6,39±0,03 % просвітлених епідермоцитів, а життєздатність клітин близька до норми і становить 92,32±0,45 %. Структурні компоненти дерми: фібробласти, гемокапіляри, волокна та аморфна речовина на світлооптичному та ультраструктурному рівнях - малозмінені.

На 3 добу гіпотермічного зберігання аутошкіри спостерігаються реактивні морфологічні зміни. Виявляється помірне розширення міжклітинних просторів базального шару. Для частини епідермоцитів характерна базофілія ядер, їх ущільнення, навіть пікноз, що достовірно підтверджується частковим зниженням ядерно-цитоплазматичного співвідношення (0,481±0,02). Вакуолізація навколоядерної зони цитоплазми виражена збільшенням кількості вакуолізованих епідермоцитів до 17,82±0,08 %. Субмікроскопічно в клітинах базального та остистого шарів епідермісу спостерігається часткове порушення тонофібрил, десосом, у мітохондріях спостерігається деструкція крист, просвітлення їх матриксу, що свідчить про порушення енергетичного забезпечення метаболічних процесів у клітинах. В сосочковому шарі дерми встановлені окремі зміни структурної організації гемокапілярів та фібробластів, що погіршує торфіку епідермісу та оновлення міжклітинної речовини. Незважаючи на встановлені неглибокі реактивні зміни, життєздатність епідермоцитів залишається високою (71,63±0,35 %), що дозволяє вважати аутодермотрансплантати добре збереженими протягом 3 діб при низькотемпературному способі.

При зберіганні шкіри людини протягом 7 та 14 діб при температурі 0 - +4 °С спостерігається наростання деструктивних змін, які набувають незворотного характеру. На світлооптичному рівні виявлено часткове відшарування епідермісу від дерми, яке зумовлене руйнуванням базальної мембрани, що свідчить і про порушення можливості трофічного забезпечення епідермісу. Міжклітинні простори базального та остистого шарів епідермісу збільшені. Спостерігається виразне просвітлення парануклеарної зони цитоплазми епітеліоцитів. Тому зростає відсоток вакуолізованих клітин у базальному та остистому шарах (на 7 добу 61,46±0,30 %, а на 14 добу - 87,33±0,43 %), а індекс Гертвіга знижується - 0,359±0,018 на 7 добу і 0,321±0,011 на 14 добу зберігання. Субмікроскопічно встановлено, що вакуолізація парануклеарної зони цитоплазми епідермоцитів зумовлена пікнозом ядер і лізисом органел. У результаті руйнування тонофібрил, які контактують із десмосомами, структура і форма останніх порушується. Деструктивні морфологічні зміни в ці терміни характерні і для компонентів дерми. У фібробластах відбувається порушення структурної цілісності органел, спостерігається вакуолізація цитоплазми, пікноз ядер, збільшення кількості гетерохроматину. Міжклітинна речовина просвітлюється внаслідок лізису волокнистих компонентів та набряку аморфної речовини. глибокі зміни встановлені і в компонентах стінки гемокапілярів. Незворотність деструктивних змін підтверджується результатами визначення життєздатності епідермоцитів. 18,49±0,09 % незабарвлених епідермоцитів свідчить про погану життєздатність шкіри на 7 добу гіпотермічного зберігання, а на 14 добу життєздатних клітин залишається всього 6,82±0,03 %.

Таким чином, вважаємо недоцільним використання шкіри для дермопластики, при гіпотермічному зберіганні більше 3 діб. Результати наших досліджень спростовують клінічні дані DeBono (1997) про можливість збереження життєздатності аутодермотрансплантатів на протягом 7 діб у низькотемпературних умовах.

Дискусійні статті 80-х років Фейгельмана С.С. (1980) і Савельева В.І. (1981) спростовують твердження про життєздатність шкіри, консервованої більше 14 діб у гліцерин-формаліновому розчині (Имаммалиев А.С, 1980). Сучасніші публікації (Хуйдатов И.С., 1994) продовжують розвивати цю тему.

Гістологічні та електронномікроскопічні дослідження дозволили виявити реактивні зміни в будові епідермісу та дерми на 3 та 7 доби консервування шкіри в гліцерин-формаліновому розчині. Міжклітинний простір помірно розширюється, частина (8,67±0,04 % на 3 добу і 28,35±0,14 % на 7 добу) епідермоцитів набувають вакуолізованого вигляду, а індекс Гертвіга зменшується - 0,59±0,025 на 3 добу і 0,554±0,021 на 7 добу спостереження. Помірні зміни характерні для компонентів дерми. Локально просвітлююється міжклітинна речовина, цитоплазма фібробластів вакуолізується, частково порушується стінка гемокапілярів. Відносно збережений морфологічний стан шкіри підтверджується методом визначення життєздатності клітин - 86,35±0,43 % на 3 добу і 52,67±0,026 % на 7 добу світлих епідермоцитів при використанні гліцерин-формалінового розчину свідчать про високий рівень збереженості аутодермотрансплантатів.

Мікроскопічні та субмікроскопічні дослідження аутошкіри, яка зберігалась протягом 14 і 21 діб у даному розчині, аналогічні описаним вище, але вони виражені більше і свідчать про незворотність деструктивних процесів. Вакуолізація цитоплазми більшої частини (52,52±0,26 % на 14 добу і 73,64±0,36 % на 21 доби) епідермоцитів базального та остистого шарів зумовлено каріопікнозом та лізисом цитоплазми. Ядерно-цитоплазматичний індекс достовірно знижується до 0,409±0,009 на 14 добу і 0,379±0,008 на 21 доби. Зменшується кількість кератиносом внаслідок розчинення їх ліпідного вмісту формаліном як складником консервуючого розчину, тому просвітлені вакуолі з чітко контурованою мембраною можна трактувати як залишки цих ламелярних гранул. Зберігання більше 14 діб негативно діє і на ядра - частина їх пікнотизується, в каріоплазмі збільшується вміст гетерохроматину, розширюється перинуклеарний простір, що свідчить про пригнічення функціональної активності ядерного апарату. Порівняно добре збережені внутрішньоклітинні мембрани та плазмолеми, що пояснюється фіксуючою дією формаліну. Для гемокапілярів дерми в цей період спостережень також характерна значна деструкція. Базальна мембрана і периваскулярний простір внаслідок їх лізису просвітлені, помітно розширені. Плазмолеми ендотеліоцитів із люменальної сторони втрачають чіткість, хоча наявні мікроворсинки та піноцитозні піхурці в цитоплазмі. Ядра ендотеліоцитів мають інвагінації, перинуклеарний простір розширений. В цитоплазмі мало органел, зате є багато електронносвітлих вакуолей. У той же час спостерігаються збереженими і добре контурованими міжклітинні контакти ендотеліоцитів, фрагменти перицитів у розщелинах базальної мембрани. Тому, морфофункціональний стан шкіри, консервованої у гліцерин-формаліновому розчині в ці терміни спостережень різко знижується - на 14 добу встановлено 26,24±0,12 % життєздатних епідермоцитів, а на 21 добу - лише 17,12±0,08 %.

Відомо, що сучасна комбустіологія успішно застосовує гліцерин-жовткову суміш у процесі підготовки та зберіганні матеріалу при кріоконсервуванні. Результати проведених нами досліджень довели ефективність використання такої суміші для зберігання аутодермотрасплантатів і при температурі 0 - +4 °С (рац. пропозиція Довбуша А.В., Волкова К.С., Бігуняк Т.В., 2001). Проведені гістологічні спостереження на 3 і 7 доби встановили реактивні зміни структури епідермісу та дерми. Так, кількість вакуолізованих епідермоцитів становить 9,85±0,48 % на 3 добу і 30,49±0,15 % на 7 добу, а ядерно-цитоплазматичне співвідношення становить 0,586±0,020 на 3 добу та 0,553±0,016 на 7 добу консервування аутошкіри в гліцерин-жовтковій суміші. Незначні зміни спостерігаються в будові фібробластів, міжклітинної речовини і гемокапілярів.

На 14 та 21 добу морфологічні зміни поступово наростають і набувають деструктивного незворотного характеру. Вони проявляються в порушенні базальної мембрани, розширенні міжклітинних просторів, руйнуванні десмосом, каріопікнозі, накопиченні гетерохроматину в ядрах епідермоцитів. Субмікроскопічні дослідження встановили, що просвітлення цитоплазми епідермоцитів відбувається, в першу чергу, за рахунок лізису парануклеарної ділянки цитоплазми та частково каріопікнозу. Тому, збільшується кількість вакуолізованих епідермоцитів (56,13±0,28 % на 14 добу і 79,87±0,39 % на 21 добу), індекс Гертвіга становить 0,419±0,013 на 14 добу, 0,348±0,017 на 21 добу. У дермі лізуються волокнисті компоненти міжклітинної речовини, наявні мієлінові нашарування, значно змінюється структура фібробластів. Деструкція їх цитоплазми проявляється розширенням та фрагментацією цистерн ГЕС і комплексу Гольджі. Більшість ядер пікнотично зморщуються, глибоко посічені інвагінаціями і мають осміофільну каріоплазму.

Методом визначення життєздатності клітин встановлено низький відсоток - 39,47±0,19 % на 14 добу і 23,82±0,11 на 21 добу світлих збережених епідермоцитів.

Порівнюючи гістологічний стан шкіри, консервованої у гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах, можна виділити такі закономірності морфологічних змін. Вища структурна організація характерна для шкіри, яка консервована гліцерин-формаліновим розчином, оскільки формалін як складник-консервант добре впливає на збереженість мембранних та волокнистих структур. Проте, каріопікноз і збільшення вмісту гетерохроматину свідчать про зниження активності білоксинтезуючої функції клітин, що є важливим морфологічним критерієм їх життєздатності.

Дія гліцерин-жовткової суміші проявляється більше вираженими морфологічними змінами епідермісу та дерми. Так, кількість вакуолізованих епідермоцитів в 1,07-1,14 рази більша при консервуванні в гліцерин-жовтковій суміші, ніж при зберіганні в гліцерин-формаліновому розчині. Гірше контуруються базальна мембрана, плазмолеми клітин, тонофіламенти та колагенові волокна. Проте, краще зберігаються мітохондрії, кератиносоми та компоненти ядра: перинуклеарні простори локально розширюються, кількість гетерохроматину збільшується починаючи тільки з 14 доби досліду.

Методом визначення життєздатності клітин встановлено, що при однакових термінах спостережень краща збереженість епідермоцитів, виявлена при консервованні у гліцерин-жовтковій, ніж у гліцерин-формаліновій сумішах (на 7 добу в 1,4 рази, а на 14 добу - в 1,5 рази).

Таким чином, морфологічні та морфометричні критерії життєздатності аутошкіри дають підставу зробити заключення про доцільність використання гліцерин-жовткової суміші для консервування аутодермотрансплантатів не довше 7 діб.

Рис. 1. Життєздатність аутодермотрансплантатів при різних методах консервування

Згідно методики, розробленої Бігуняком В.В. (1995) кріоконсервування шкіри проводять із попередньою еквілібрацією в гліцерин-жовтковій суміші. Оскільки зберігання в рідкому азоті використовують на тривалий період часу та помірні зміни епідермісу і дерми ідентичні в різні терміни досліду, ми проаналізували стан аутошкіри на 14, 21 та 30 доби. Встановлено, що тільки незначна частина (5,87±0,28 % на 14 добу, 6,03±0,03 % на 21 добу і 6,34±0,03 % на 30 добу) епідермоцитів набувають вакуолізованого вигляду, їх ядерно-цитоплазматичний індекс близький до норми і становить 0,581±0,023 на 14 добу, 0,579±0,019 на 21 добу і 0,564±0,020 на 30 добу кріоконсервування. При кріоконсервуванні частково порушуються мембранні та волокнисті структури, локально пошкоджується цілісність базальної мембрани, розширюються міжклітинні простори. Проте, тільки в окремих епідермоцитах базального та остистого шарів ядра пікнотично змінюються, навколоядерна зона цитоплазми просвітлюється, але хроматин залишається неконденсованим у всі досліджувані терміни кріоконсервування. Клітини Ланґерганса також не зазнають виражених деструктивних змін. Ядра внутрішньоепідермальних макрофагів зберігають лопатйву форму, в каріоплазмі переважає еухроматин, перинуклеарний простір локально розширений. В цитоплазмі наявні мітохондрії з просвітленим матриксом та невисока щільність помірно змінених органел. Малозміненими у всі терміни досліду виявляються структурні компоненти сосочкового шару дерми. Спостерігаються чітко контуровані волокнисті структури міжклітинної речовини. Помірні зміни характерні для ендотеліоцитів, базальної мембрани та просвітів кровоносних капілярів. Тому, при зберіганні трансплантатів у рідкому азоті життєздатність окремо виділених епідермоцитів залишається досить високою: на 14 добу - 89,0 %, на 21-88,5 % і на 30 добу досліду - 85,9 %.

Гістологічні та морфометричні дослідження та визначення життєздатності епідермоцитів дають підставу рекомендувати кріоконсервування для використання в практичній медицині, зокрема, в комбустіології при необхідності тривалого зберігання аутодермотрансплантатів.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляються у встановленні закономірностей морфологічних змін аутодермотрансплантатів та визначенні їх життєздатності при різних умовах зберігання. За результатами проведених мікроскопічних, ультраструктурних, морфометричних досліджень та способом визначення життєздатності епідермоцитів встановлені терміни зберігання аутошкіри при різних методах її консервування.

2. Детальні гістологічні та морфометричні дослідження шкіри людини в нормі дозволили виділити три типи епітеліоцитів базального шару, які відрізняються розмірами, ядерно-цитоплазматичними співвідношеннями та морфофункціональною організацією. Крім двох загальновизнаних типів клітин, встановлені великі базальні епідермоцити з кератиносомами.

3. Гіпотермічне зберігання аутодермотрансплантатів (темпераратура 0…+4 °С) призводить до реактивних морфофункціональних змін у ранні терміни досліду (1, 3 доби). У пізніші терміни (7, 14 доби) зберігання деструктивні зміни епідермісу та дерми поступово наростають та набувають незворотного характеру, що підтверджено збільшенням кількості вакуолізованих епідермоцитів, зниженням їх ядерно-цитоплазматичного співвідношення, руйнуванням органел та значним зменшенням кількості (18,5 % на 7 добу і 6,8 % на 14 добу) життєздатних клітин.

4. Структурна організація та життєздатність шкіри людини при консервуванні в гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах протягом 7 діб залишається малозміненою. У наступні терміни зберігання (14, 21 доби) поступово погіршується морфологічний стан епідермоцитів базального та остистого шарів, порушується структура базальної мембрани, відбувається значна деструкція клітинних і волокнистих компонентів дерми. Життєздатність епідермоцитів при зберіганні 14 діб і більше у цих сумішах значно знижується (26,2 % на 14 добу, 17,2 % на 21 добу при консервуванні гліцерин-формаліновим розчином; 39,5 % на 14 добу, 23,8 % на 21 добу при зберіганні в гліцерин-жовтковій суміші).

5. Морфологічні критерії життєздатності аутошкіри довели, що гліцерин-формаліновий розчин краще зберігає структурну організацію епідермісу та дерми внаслідок фіксуючої дії формаліну. Проте, спосіб визначення життєздатності епідермоцитів встановив достовірно нижчий рівень їх збереженості (в 1,50 рази на 14 добу і в 1,39 рази на 21 добу), ніж при консервуванні аутодермотрансплантатів у гліцерин-жовтковій суміші в однакові терміни досліду.

6. Кріоконсервування шкіри людини забезпечує високий ступінь збереженості структур епідермісу та дерми і життєздатність більшості (від 89,0 % на 14 добу і до 85,9 % на 30 добу) епідермоцитів протягом усього терміну спостережень. Цей метод можна рекомендувати для довготривалого зберігання аутодермотрансплантатів.

7. Отримані результати дослідження життєздатності аутошкіри при гіпотермічному зберіганні, консервуванні гліцерин-жовтковою сумішшю та при кріоконсервуванні можуть бути використані у практичній медицині, зокрема, комбустіології при необхідності проведення віддаленої у часі аутодермопластики.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Довбуш А.В. Ультраструктурна характеристика ксено- та аутодермотрансплантатів при низькотемпературному зберіганні та кріоконсервуванні // Науковий вісник Волинського державного університету. - 2000. -№ 7. - С. 80-82.

2. Довбуш А.В. Морфологічний стан та життєздатність аутодермотрансплантатів при гіпотермічному зберіганні в гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах // Вісник морфології. - 2001. -№1. - С. 67-69.

3. Довбуш А.В., Волков К.С. Засоби та методи закриття опікової рани // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету. Серія: біологія. - 2000. -№3(10). - С. 88-91. (Довбуш А.В. провів пошук літературних джерел, зробив аналіз та узагальнення даних, особистий внесок становить 70 %. Волков К.С. узагальнив результати та сформулював висновки даного дослідження).

4. Бігуняк Т.В., Довбуш А.В., Волков К.С. Ультраструктура ксенодермотрансплантатів при використанні гліцерин-жовткової суміші для низькотемпературного зберігання та кріоконсервування // Буковинський медичний вісник. - 2001. -Т.5. -№3-4. -С. 16-17. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, інтерпретації даних особистий внесок становить 40 %. Бігуняк Т.В. виконувала експериментальну частину роботи та узагальнила результати, Волков К.С. сформулював висновки).

5. Довбуш А.В., Волков К.С. Рішення про видачу деклараційного патенту №2001031430 від 03.10.2001 року на винахід "Спосіб визначення життєздатності клітин". (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 70 %. Волков К.С. узагальнив результати та сформулював висновки даного дослідження).

6. Волков К.С., Якубишина Л.В., Андріїшин О.П., Довбуш А.В., Бігуняк Т.В., Сокольська В.О. Ультраструктурний стан епідермоцитів ксенотрансплантатів при консервуванні у гліцерин-жовтковій суміші // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. -2001. -№ 6. -С. 79-80. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 30 %).

7. Довбуш А., Котик А., Бігуняк Н., Швед А. Морфологія аутодермотрансплантатів при низькотемпературному зберіганні // Матер. 3 міжнар. медичного конгресу студентів і молодих вчених. - Тернопіль. -1999. - С. 295. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 40 %).

8. Volkov K., Dovbush A., Bigunyak N., Falendysh L. Morphologic changes in liofilized xenodermografts // Paper presented during 18th Congress of the Polish Society of Histochemistry and Cytochemistry. - Polish. - 1999. - P.270. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 40 %).

9. Довбуш А.В., Волков К.С., Бигуняк В.В., Федонюк Л.Я. Морфология аутодермотрансплантатов в условиях длительной криоконсервации и низкотемпературном хранении // Матер. всерос. научн. -практич. конференции хирургов. - Россия. - 1999. - С. 233. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 70 %).

10. Довбуш А., Бігуняк Т., Котик В. Морфометричні дослідження епітеліоцитів базального шару епідермісу // Матер. 4 міжнар. конгресу студентів і мол. вчених. - Тернопіль, 2000. - С. 294-295. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 40 %).

11. Довбуш А.В., Бігуняк Т.В., Котик В.О., Тураш І.Б. Ультраструктура аутодермотрансплантатів при консервуванні в гліцерин-жовтковій суміші // Матер. 5-й міжнар конгресу студентів та молодих вчених. -Тернопіль, 2001. - С. 179. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 40 %).

12. Бігуняк Т.В., Волков К.С., Довбуш А.В. Субмікроскопічні зміни епідермоцитів кріоконсервованих ліофілізованих ксенотрансплантатів // Матер. наук. читань, присвячених 100-річчю від дня народження проф. Б.В. Альошина. - Харків. -2001. - С. 5. (Довбуш А.В. брав участь у постановці експерименту, заборі матеріалу, описанні спостережень, їх аналізі, особистий внесок становить 40 %).

АНОТАЦІЯ

Довбуш А.В. Морфологічний стан і життєздатність аутодермотрансплантатів при різних методах консервування. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія. - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, Київ, 2002.

Дисертація присвячена вивченню морфологічного стану і життєздатності аутодермотрансплантатів при різних методах консервування. Гістологічні та морфометричні дослідження дозволили встановити три типи епідермоцитів у базальному шарі епідермісу шкіри в нормі, які відрізняються розмірами, ядерно-цитоплазматичним індексом, морфофункціональною організацією.

При гіпотермічному зберіганні шкіри у ранні терміни (1-3 доби) встановлені незначні структурні зміни епідермісу і дерми та велика кількість життєздатних епідермоцитів. Починаючи з 7 доби значно погіршується морфофункціональний стан структурних компонентів та знижується рівень життєздатності шкіри. Консервування аутошкіри в гліцерин-формаліновій та гліцерин-жовтковій сумішах дозволяє зберегти її відносно життєздатною протягом 7 діб.

Кріоконсервування шкіри з попередньо проведеною еквілібрацією в гліцерин-жовтковій суміші дозволяє зберегти структурні компоненти життєздатними протягом 30 діб, що дозволяє рекомендувати цей метод для довготривалого зберігання шкіри людини.

Kлючові слова: аутодермотрансплантати, морфологія, життєздатність, методи консервування.

життєздатність аутодермотрансплантат кріоконсервування морфофункціональний

АННОТАЦИЯ

Довбуш А.В. "Морфологическое состояние и жизнеспособность аутодермотрансплантатов при различных методах консервирования". - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.09 - гистология, цитология, эмбриология. - Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению морфологического состояния и жизнеспособности аутодермотрансплантатов при различных методах и в разные сроки консервирования.

Объектом исследования были эпидермис и дерма аутодермотрансплантатов (толщиной 0,8-1,0 мм), снятых дерматомом с бедер 52 больных. Клапти аутокожи хранили при разных условиях и в разных растворах. Исследование их морфологического состояния и оценку жизнеспособности проводили на 1-30 сутки. Кусочки кожи, которую хранили в холодильнике при температуре 0 - +4 °С, исследовали на 1, 3, 7 и 14 сутки. Лоскуты кожи, консервированные в глицерин-формалиновой (0,25 % раствор формалина в 15 % глицерине) или в глицерин-желтковой смесях (рац. предложение № 10 от 10.11.2001 г.) исследовали на 3, 7, 14 и 21 сутки хранения. Криоконсервированные аутолоскуты, которые перед погружением в жидкий азот (t -196 °С) предварительно готовили путем эквилибрации в глицерин-желтковой смеси (Бигуняк В.В., 1994), забирали для исследования на 14, 21 и 30 сутки хранения.

Проведено комплексное исследование морфологического состояния аутодермотрансплантатов с исследованием микроскопических (окраска гематоксилин-еозином), электронномикроскопических, морфометрических (количественные, определение линейных размеров эпителиоцитов, площадей тел, ядер, ядерно-цитоплазматических соотношений). Использован разработанный нами метод определения жизнеспособности отдельно выделенных эпителиоцитов, окрашенных трипановым синим.

На основании детально проведенных микроскопических, морфометрических, электронномикроскопических исследований кожи человека в норме установлено три типа эпидермоцитов в базальном слое эпидермиса кожи в норме, которые отличаются размерами, ядерно-цитоплазматическим соотношением, ультраструктурной организацией и морфофункциональным назначением. К первой группе относятся небольшие эпидермоциты со сравнительно высоким ядерно-цитоплазматическим индексом - это малодифференциированные клетки. Эпителиоциты второго типа наиболее многочисленные зрелые клетки. Высокие эпидермоциты третьей группы имеют большое ядро, а наличие кератиносом в парануклеарной зоне свидетельствует о начале процесса кератинизации.

При гипотермическом хранении кожи (t= 0 - +4 °С) в ранние сроки (1-3 сутки) установлены незначительные структурные изменения эпидермиса и дермы, которые носять реактивный характер, а также большое количество жизнеспособных эпидермоцитов. Начиная с 7 суток наростают деструктивные изменения, значительно ухудшается морфофункциональное состояние структурных компонентов аутодермотрансплантатов и снижается уровень жизнеспособности эпидермоцитов. Консервирование аутокожи в глицерин-формалиновой и глицерин-желтковой смесях позволяет сохранить ее относительно жизнеспособной на протяжении 7 суток. Глицерин-формалиновый раствор лучше сохраняет структурную организацию эпидермиса и дермы вследствии фиксирующего действия формалина. Однако, способ определения жизнеспособности эпидермоцитов установил достоверно низший уровень их сохранности, чем при консервировании в глицерин-желтковой смеси в одинаковые сроки наблюдений.

Гистологические и морфометрические исследования криоконсервированной кожи с предварительно проведенной эквилибрацией в глицерин-желтковой смеси свидетельствует о высокой сохранности структурных компонентов эпидермиса и дермы и жизнеспособности эпителиоцитов на протяжении 30 суток. Это служит основанием для рекомендации криоконсервирования для длительного хранения аутодермотрансплантатов и исслодования его в практической медицине.

Ключевые слова: аутодермотрансплантаты, морфология, жизнеспособность, методы консервирования.

ANNOTATION

Dovbush A.V. "Morphologic State and Viability of Autodermografts in Different Preservation Methods"- Manuscript.

Thesis for a Master's degree of biology in Specialty 14.03.09 - histology, cytology, embryology - O.O. Boghomolets National Medical University, Kyiv, 2002.

The work is dedicated to the study of the morphological state and viability of autodermografts in different preservation methods. The histologic and morphometric investigations of the normal human skin have permitted to define three types of basal epitheliocytes, that differ by the sizes, their nuclear-cytoplasm index, morphofunctional organization.

In early terms (1-3 days) of hypothermal storage of autodermografts insignificant structural changes of epidermis and derma and many viable epidermocytes are revealed. Since the 7th days the structural components morphofunctional state has considerably worsened and the skin viability has decreased. Autoskin preservation in Glycerol-formalin and Glycerol-yolk mixture allows to keep it relatively viable during 7 days.

Skin cryoconservation with previous equilibration in Glycerol-yolk mixture enables the protection of the viable structural components during 30 days, which allows to recommend this method for a long-term storage of human skin.

Key words: autodermografts, morphology, viability, methods of conservation.

Размещено на Allbest.ru