Розробка та удосконалення живильних середовищ для культивування лептоспір
Створення живильних середовищ для культивування лептоспір з як найменшим вмістом білка. Розгляд модифікування середовища Кортгофа після зміни в ньому вмісту сироватки крові. Створення напівсинтетичного живильного середовища з низьким вмістом альбуміну.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 25.04.2014 |
| Размер файла | 43,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національний аграрний університет
Автореферат
Розробка та удосконалення живильних середовищ для культивування лептоспір
Таран Тетяна Володимирівна
Київ - 2001
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Проблема лептоспірозної природно-вогнищевої інфекції останнім часом набуває все більшого значення, оскільки вона стала найбільш поширеною та наносить значні економічні збитки. Для успішної боротьби з цим тяжким антропозоонозом є потреба в розробці вітчизняних діагностичних препаратів та ефективних вакцин. Культивування лептоспір - початковий важливий етап у цих дослідженнях.
Незважаючи на досягнуті успіхи вітчизняних та зарубіжних вчених у галузі вивчення збудника лептоспірозу, все ще залишаються нерозв'язаними багато питань, зокрема ті, що стосуються культивування лептоспір.
На сьогодні відомо 23 серогрупи і 202 серовари цього мікроорганізму і їх кількість зростає завдяки виділенню та ідентифікації нових штамів лептоспір (Ellis W.A., 1996). Над проблемою виготовлення нових та удосконаленням існуючих живильних середовищ працювало багато дослідників: Терських В.І., Малахов Ю.А., Білоусов В.І., Korthhof G., Fervoort H.-Wolff J., Stuart R., Ellis W.A., Ellinghausen H., Johnson R.C., McCulogh W.G., Harris V.G. та ін. Однак, незважаючи на чисельність запропонованих рецептів живильних середовищ для культивування лептоспір, досі залишаються актуальними проблеми високого вмісту в них сироваткового білка, дефіциту сироватки крові кролів, недостатнього накопичення біомаси, дороговизни синтетичних і напівсинтетичних середовищ та ін.
Поширення лептоспірозу, зростання кількості серогруп та сероварів збудника, необхідність виділення та ідентифікації нових штамів лептоспір спонукає до пошуку нових та удосконалення наявних селективних середовищ для виділення чистих культур та методів їх очищення від сторонньої мікрофлори. культивування лептоспора кров сироватка
Культивування лептоспір у лабораторних умовах виконують в основному на живильних середовищах з вмістом 10% сироватки крові кролів. З огляду на велику ціну компонента, доцільно визначити можливість використання сироватки крові овець у середовищах для культивування лептоспір як дешевшої в декілька разів і доступнішої. Проте поширення лептоспірозу останнім часом призводить до того, що сироватка крові тварин-донорів часто містить антитіла до одного, а частіше до декількох серогруп збудника лептоспірозу. З огляду на це виникає потреба звільнення сироватки крові овець для культивування лептоспір від специфічних імуноглобулінів (Іg), що заважають їхньому росту. Відомий же метод інактивації специфічних Іg при 560С 1 годину не завжди дає позитивний результат. Також важливо дослідити можливість часткового зниження вмісту сироватки крові у середовищі завдяки використанню стимуляторів росту культури лептоспір.
Під час виготовлення вакцин і діагностикумів за міжнародними стандартами слід використовувати синтетичні і напівсинтетичні середовища. У сироваткових середовищах при культивуванні накопичення біомаси не достатнє, тому вакцини, виготовлені на їхній основі, можуть спричиняти анафілактичні реакції у тварин. Важливим позитивним фактором при виготовленні імуноферментних діагностикумів є відсутність у середовищах білків сироватки крові і наявність альбуміну (твін-альбумінові середовища). Альбумін, що є основним фактором росту лептоспір, використовують у напівсинтетичних твін-альбумінових живильних середовищах, і він може з успіхом замінити сироватку крові. Комерційний альбумін, що виготовляють Олайнський (Латвія) та Ставропольський (Росія) заводи, буває непридатним для використання при культивуванні лептоспір через вміст токсичних високоненасичених жирних кислот та баластних високомолекулярних білків (Артюшин І.А., 1981). Альбумін фірми “Sigma” (USA) якісний, але дорогий препарат, тому пошук технологічних методик виготовлення високоочищеного альбуміну, придатного для використання у живильних середовищах для культивування лептоспір, є дуже важливим.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано згідно з Державним планом науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини УААН КН № 0197 И 12755 інв. № 02.02. “Вивчити епізоотологію, розробити моно- і полівалентні вакцини і методи діагностики”; плану: “Основні заходи оздоровлення тварин від лептоспірозу в Україні на 1999 - 2000 роки”, затвердженого наказом № 2 від 18.01.1999 р. Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства Агропрому України.
Мета і завдання досліджень. Метою досліджень було створення ефективних живильних середовищ для культивування лептоспір з якнайменшим вмістом білка.
Для досягнення мети поставлено такі завдання:
-- розробити ефективні селективні середовища для виділення та очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори;
вивчити ростові якості сироватки крові овець у складі живильних середовищ для культивування лептоспір;
розробити метод звільнення сироватки крові овець від гамаглобулінів;
модифікувати середовище Кортгофа, знизивши в ньому вміст сироватки крові;
розробити ефективний і технологічний метод одержання сироваткового альбуміну;
створити напівсинтетичне живильне середовище з низьким вмістом альбуміну.
Об'єкт дослідження - культури лептоспір, живильні середовища.
Предмет дослідження - процес культивування лептоспір на середовищах з вмістом бактерицидних препаратів, сироватки крові та альбуміну.
Методи досліджень: оцінку накопичення біомаси виконували методом темнопольної мікроскопії; для очищення штамів лептоспір використовували методи: біологічних фільтрів (морські свинки), хімічний (бактерицидні препарати), фільтраційний; альбумін одержували хроматографічним методом; кількість білка в розчині альбуміну визначали біуретовим методом; ступінь чистоти альбуміну встановлювали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі; антигенну активність лептоспір визначали серологічним методом у реакції мікроаглютинації (РМА); життєздатність лептоспір оцінювали методом затримки ділення клітин за допомогою 0,25% акриламіду.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні було запропоновано:
метод звільнення сироватки крові овець від гамаглобулінів за допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ). (Одержано рішення про видачу деклараційного патенту на винахід. Заявка № 2001021257, вих. № 25274);
спосіб виробництва альбуміну бичачого сироваткового методом хроматографії з використанням кремнеземвмісних сорбентів, придатного для культивування лептоспір. (Одержано рішення про видачу деклараційного патенту на винахід. Заявка № 2001021256, вих. № 25273);
модифіковане напівсинтетичне твін-альбумінове середовище з низьким вмістом білка (0,25%);
-- вперше виявлено бактерицидний вплив препарату енрофлок на лептоспір in vitro.
Практичне значення одержаних результатів. Матеріали досліджень використані при розробці нормативної документації (НД), яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини:
1. НД з виготовлення і застосування сироватки крові овець, стандартної для культивування лептоспір № 15-14/107 від 7.06.2001 р.;
2. НД з виготовлення і застосування середовища Кортгофа та його двох модифікацій для культивування лептоспір № 15-14/108 від 7.06.2001 р.;
3. НД з виготовлення і застосування тест-систем діагностичних імуноферментних “ІФА-лептоспіроз”. № 15-14/105 від 31.05.2001 р.;
4. НД з виготовлення і застосування сироваток групових аглютинуючих лептоспірозних. № 15-14/106 від 31.05.2001 р.
Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їхнє узагальнення і статистична обробка, а також оформлення рукопису, нормативної документації виконані дисертантом особисто.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались і були схвалені:
на семінарі завідуючих серологічними відділами обласних і Центральної державної лабораторій ветеринарної медицини на базі лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин Інституту ветеринарної медицини УААН, м. Київ, 1998;
на Всеукраїнському семінарі-нараді: “Шляхи і засоби поліпшення епізоотичного стану господарств України щодо лептоспірозу сільськогосподарських тварин “, м. Дніпропетровськ, вересень 1999 р.;
на Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених:
“Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення ”, м. Київ, жовтень, 2000р.
Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 144 сторінках комп'ютерного тексту і містить: вступ, огляд літератури, загальну методику та основні методи досліджень, результати експериментальних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаних джерел, додатки. Робота ілюстрована 11 рисунками та 16 таблицями.
Основний зміст
Матеріали і методи. Дослідження виконано в лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин з музеєм штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини УААН м. Києва у період з 1998 по 2001 р.
У дослідах використовували 23 штами лептоспір, що належать до 20-ти серогруп: Veldrat Bataviae 46, HS 26, Szwajizak, 493 Poland, Kabura, Perepelicyni, Pomona, Moskva V, Hond Utrecht IV, M 20, LSU, LT 821, CZ 214 K, Patoc 1, Whitcomb, Jez 1, Akiyami A, Vleermuis 3868, Salinem, Mus 127, Jez-bratislava, Hardjoprajitno, Hebdomadis.
У дослідженнях використовували рідкі живильні середовища: Терських, Кортгофа (Малахов Ю.А.,1992), EMJH (Ellinghausen, MmCulogh, Johnson, Harris, 1967), Ігла; сироватку крові кролів і овець та тверде живильне середовище - буферно-сироватковий агар (БСА) .
Для очищення штамів лептоспір використали 200 морських свинок, фільтраційні пластини “СФ-3”, тверде живильне середовище БСА, фурацилін 1:84000, фурагін 1:26000, 5-фторурацил
125 мг/дм3, поліміксин 100 ОД/дм3, налідиксову кислоту 1 мг/дм3. Енрофлок і стрептоміцин при дослідженні їхнього впливу на лептоспір in vitro використовували у концентраціях 1:100, 1:1000, 1:10000.
Забруднення культур лептоспір встановлювали візуально в пронизуючому світлі, темному полі мікроскопа та висівом їхніх культур на середовища МПБ, МПА, Сабуро та Кітт-Тароцци.
Накопичення біомаси оцінювали методом темнопольної мікроскопії. Для кількісного обліку клітин готували 10-ти разові розведення культур у дистильованій воді. З кожного розведення робили препарат “роздавлена крапля” та підраховували лептоспіри в 20-ти полях зору при збільшенні в 400 раз. Накопичення лептоспір у середовищах обчислювали, помноживши кількість лептоспір в 1 полі зору (середнє арифметичне) на кратність розведення культури.
Для звільнення сироватки крові овець від гамаглобулінів використали поліетиленгліколь (ПЕГ-6000).
Альбумін одержували із сироватки крові великої рогатої худоби за методом хроматографії з використанням кремнеземвмісних сорбентів марки “СХ-50”. Для визначення кількості білка в розчині альбуміну застосовували біуретовий метод. Чистоту одержаного препарату визначали електрофорезом у поліакриламідному гелі.
Життєздатність клітин лептоспір оцінювали методом затримки росту клітин за допомогою 0,25% акриламіду. Антигенну активність штамів лептоспір визначали в реакції мікроаглютинації.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методикою Ашмаріна І. П. та Воробйова А.А. (1962). При цьому вираховували середні арифметичні величини, середнє квадратичне відхилення, достовірність різниці між середніми величинами ( критерій значення “ Р ” ).
Результати досліджень
Порівняльна характеристика методів очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори. Зростання кількості штамів лептоспір, поява нових екзотичних штамів на території України, пересіви кожні 10-14 днів музейних штамів, що іноді спричиняє їх забруднення, вимагає розробки ефективних селективних середовищ для виділення культур лептоспір із патматеріалу, об'єктів зовнішнього середовища і очищення їх від сторонньої мікрофлори.
Для визначення кращого методу очищення штамів лептоспір виконано порівняльні дослідження ( табл.1).
Найефективнішим, зручним у виконанні та дешевим виявився хімічний метод для очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори. Для цього доцільно використовувати середовища з вмістом 10% фурациліну 1:84000 або 10% фурагіну 1:26000. Середовище з 5-фторурацилом 125 мг/дм3 найкращі результати показало при виділенні культур лептоспір із патматеріалу. У разі тривалого культивування, що необхідно для виділення культур, 5-фторурацил не впливає негативно на лептоспіри, а на сторонню мікрофлору діє бактеріостатично. При подальшому пасажуванні після очищення лептоспіри зберігають морфологічні, фізіологічні та антигенні властивості.
Завдяки виконаним дослідженням, встановлено, що антибіотик широкого спектра дії - енрофлок, використаний нами для очищення культур лептоспір, має бактерицидну дію щодо цього мікроорганізму. Тому ми порівняли дію енрофлоку та відомого протилептоспірозного засобу - стрептоміцину на культуру лептоспір in vitro. Спостереження здійснювали на початку фази логарифмічного росту (починаючи з 6-ої доби культивування) і в стаціонарній фазі (починаючи з 14-ої доби культивування). Виявилося, що в стаціонарній фазі дія цих препаратів дещо відрізняється від дії в фазі логарифмічного росту. Стрептоміцин і енрофлок діяли на
Таблиця 1
|
Методи очищення культур лептоспір |
Час для очищен-ня, діб |
Знижен-ня накопи-чення біомаси, % |
Кількість пасажей для відновлення властивості накопичення біомаси |
Кількість штамів, які можна очистити за цим методом, % |
||
|
Хімічний (селективні середовища), n=9 |
||||||
|
Середовище Кортгофа з вмістом бактерицидних препаратів |
125 мг/дм3 5-фторурацилу |
30 |
-- |
1 |
100 |
|
|
5-фторурацил 125мг/дм3, поліміксин 100 ОД/дм3, налідиксова кислота 1мг/дм3 |
2 |
54 |
3 |
86 |
||
|
фурацилін 1:84000 |
2 |
53 |
2 |
85 |
||
|
фурагін 1:26000 |
2 |
Пооди-нокі у полі зору |
3 |
88 |
||
|
10% фурациліну (1:84000) |
2 |
34 |
1 |
100 |
||
|
Суміш 10% фурациліну(1:84000) і фурагіну (1:26000) |
2 |
32 |
1 |
100 |
||
|
10% фурагіну (1:26000) |
2 |
33 |
1 |
100 |
||
|
Тверде середовище буферно-сироватковий агар (n=10) |
7-20 |
- |
2 |
64 |
||
|
Біологічний, n=10 |
||||||
|
Морські свинки |
30 - 90 |
62 |
2 |
46,6 |
||
|
Фільтрація, n=7 |
||||||
|
Фільтри з діаметром пор 0,22 мкм |
30 |
Пооди-нокі у полі зору |
3 |
67 |
Методи очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори та їх ефективність культуру лептоспір повільніше в стаціонарну фазу розвитку, ніж під час фази логарифмічного росту. Так, у розведенні 1:100 повний лізис лептоспір у стаціонарній фазі відбувався через 4 доби, тоді як у фазі логарифмічного росту -- вже через 2 доби. У розведенні 1:1000 і 1:10000 повний лізис лептоспір у стаціонарній фазі росту відбувався через 5 діб, а в фазі логарифмічного росту --через 4 доби. Різниця між значеннями у розведеннях 1:100 і 1:1000 та 1:10000 у двох фазах росту відчутна (р < 0,05), а різниця показників між розведеннями 1:1000 і 1:10000 незначна (р > 0,05).
Таким чином ми встановили, що енрофлок і стрептоміцин мають однакову бактерицидну дію на лептоспір in vitro (р > 0,05). Вважаємо за доцільне продовжити дослідження енрофлоку для лікування лептоспірозу, боротьби з лептоспіроносійством та інактивації вакцин.
Використання сироватки крові овець для культивування лептоспір. Нами проведено тривале культивування штамів лептоспір на середовищах з сироваткою крові овець через її більшу доступність та меншу в 2 рази вартість, ніж кроляча.
Під час культивування лептоспір з використанням овечої сироватки крові вже при 10-тому пасажі спостерігали адаптацію, скоротилися фази росту до значень, що є при використанні сироватки крові кролів. Фаза затримки росту (лагфаза) при використанні сироватки крові кролів становить 4±0,15 доби, овець -- 4,9±0,143 доби. Фаза логарифмічного росту при використанні сироватки крові кролів становить 4±0,15 -- 7,95±0,21 діб, овець -- 4,9±0,143 - 11,1±0,28 діб. Продовження стаціонарної фази відповідно -- 7,95±0,21 - 17,6±0,39 та 11,1±0,28 - 23,4±0,49 доби.
Після періоду адаптації до овечої сироватки крові (10 пасажей) лептоспіри давали накопичення в культурі майже таке ж саме, як при використанні сироватки крові кролів -- 164,15 11,5 клітин у полі зору мікроскопа (р>0,05).
Сироватку крові овець використовували у складі живильних середовищ для культивування 20-ти діагностичних і 8-ми вакцинних штамів лептоспір 4 роки. За цей період було виконано 144 пасажі. При цьому всі штами зберегли свої біологічні властивості.
Для звільнення сироватки крові овець від антитіл до лептоспір, що іноді трапляються, а також неспецифічних гамаглобулінів ми використали поліетиленгліколь. Сироватка крові овець, оброблена 10%-ми ПЕГ порівняно з сироваткою крові, яка проходить теплову обробку (560С 1год) має показники росту культури лептоспір на 10% більше.
Ростстимулююча дія середовища Ігла на культуру лептоспір. Враховуючи потреби лептоспір в амінокислотах, солях, вітамінах групи В, ми виконали досліди щодо культивування лептоспір на середовищі Кортгофа з додаванням до його складу середовища Ігла, яке містить усі ці речовини. Із складу середовища Кортгофа виключили пептон і вітаміни. При цьому було поставлено завдання зменшити відсоток вмісту сироватки у модифікованому середовищі.
Одержані результати свідчать, що 10% середовища Ігла у складі середовища Кортгофа має ростстимулюючу дію на культуру лептоспір та дає змогу знизити вміст сироватки крові овець з 10 до 5%.
1 - середовище Кортгофа з 10% середовища Ігла та 5% сироватки крові овець;
2 - середовище Кортгофа з 5% сироватки крові овець;
3 - середовище Кортгофа з 10% сироватки крові овець.
Згідно з нашими спостереженнями накопичення біомаси на модифікованому середовищі на 37,2% більше порівняно з традиційним. За період 15 пересівів лептоспіри зберегли свою морфологію, фізіологічні та антигенні властивості.
Далі модифіковане середовище Кортгофа використовували протягом 4-х років для культивування: 20-ти діагностичних штамів лептоспір, що належать до 20-ти серогруп, 8-ми вакцинних штамів (7 серогруп), 3-х штамів, одержаних із Польщі (3 серогрупи ); 2-х років для культивування 14-ти штамів, одержаних із Німеччини (10 серогруп), 47-ми штамів, одержаних із Голландії (29 серогруп). Усі 92 штами лептоспір легко адаптувались до модифікованого середовища і за цей період не змінили своєї морфології, фізіологічних та антигенних властивостей. Було виготовлено 186 серій модифікованого середовища та виконано 216 пасажей вказаних вище штамів.
Модифіковане середовище Кортгофа з сироваткою крові овець виявилось цілком придатним для культивування музейних і діагностичних штамів лептоспір та діагностичних досліджень.
8 штамів (Pomona, Perepelicyni, Patoc 1, Jez-bratislava, Hardjoprajitno, Hebdomadis, HS-26, Hond-Utrecht IV) лептоспір також культивували на середовищі Ігла в 10-ти разовому розведенні. Всі вони росли однаково добре на середовищі Кортгофа і середовищі Ігла в 10-ти разовому розведенні з 10% сироватки крові овець. Проте середовище Ігла в 10-ти разовому розведенні має переваги. Воно стандартне, за зміною його кольору можна легко встановити зміну pH, до якого чутливі лептоспіри, та бактеріальне забруднення культур.
Порівняльна характеристика культивування лептоспір на сироваткових та напівсинтетичному середовищах. Для розробки власного середовища ми порівняли ростові властивості широко вживаних сироваткових середовищ Терських і Кортгофа (використовують в Україні) та твін-альбумінового EMJH (використовують у країнах далекого зарубіжжя).
Спостереження свідчать, що в середньому на середовищі Кортгофа накопичення біомаси лептоспір в 1,4 раза більше, ніж на середовищі Терських, а на твін-альбуміновому середовищі EMJH -- у 2,8 раза більше, ніж на досліджених сироваткових середовищах. Порівняння альбумінів Олайнського заводу, київського підприємства “Біофарма”, фірми “Sigma” свідчать, що для культивування лептоспір на середовищі EMJH найпридатніший альбумін фірми “Sigma”, менш придатний альбумін київського підприємства “Біофарма” (накопичення лептоспір у 1,5 раза менше, ніж при використанні альбіміну фірми “Sigma”), зовсім не придатним для використання виявився альбумін Олайнського заводу. Чистоту цих препаратів ми перевіряли за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі. Альбумін фірми “Sigma” та київського підприємства “Біофарма” -- чисті препарати, а Олайнського заводу -- містить фракцію глобулінів. Комерційні альбуміни -- дорогі компоненти, тому пошук шляхів здешевлення живильних середовищ за рахунок власного виробництва альбуміну і зменшення його вмісту у середовищах є необхідною умовою.
Одержання бичачого сироваткового альбуміну. Вітчизняний альбумін одержують методом висолювання його сірчанокислим амонієм із сироватки крові овець та великої рогатої худоби (Малахов Ю.А.,1992). Такий метод досить трудомісткий, дорогий і не дає змоги одержати альбумін високого ступеня чистоти, що особливо важливо для якості живильних середовищ.
Крім вітчизняного альбуміну, використовують альбумін бичачий сироватковий фірми “Sigma”, методику одержання якого в доступній нам літературі не наведено. Ми використали для одержання альбуміну метод хроматографії із застосуванням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки “СХ-50”. Нами розроблено простий, дешевий, доступний для виконання в лабораторних і виробничих умовах технологічний метод одержання альбуміну із сироватки крові великої рогатої худоби. Фракції очищеного альбуміну збирали у флакони. Контролювали вихід препарату за допомогою ультрафіолетового детектора при довжині хвилі ()-280 нм. Концентрацію білка визначали біуретовим методом, що становив у середньому із 3-х дослідів - 27±0,9 мг/см3. Чистоту одержаного альбуміну визначали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ). Результати цих досліджень наведено на електрофореграмі виготовленого хроматографічним методом:
Завдяки електрофорезу встановили, що одержаний у лабораторних умовах методом хроматографії з використанням кремнеземвмісних сорбентів марки “СХ-50” альбумін -- очищений і його якість можна порівняти з альбуміном фірми “Sigma”. Альбумін, виготовлений запропонованим нами способом, набагато дешевший від комерційних аналогів.
Добутий альбумін використали у середовищі EMJH і порівняли його ростові властивості із зарубіжним аналогом - альбуміном фірми “Sigma” (табл. 2).
Таблиця 2 - Порівняльні результати використання комерційного альбуміну та виготовленого запропонованим методом (клітин у полі зору мікроскопа, М±m.
|
Штам лептоспір |
Середовище EMJH з комерційним альбуміном |
Середовище EMJH з альбуміном, виготовленим методом хроматографії |
|
|
493 Poland |
343±3,2 |
346±1,3 |
|
|
Kabura |
377±2,1 |
376±1,9 |
|
|
Perepelicyni |
398±3,3 |
399±2,9 |
|
|
Pomona |
383±1,1 |
385±0,9 |
|
|
Moskva V |
412±3,2 |
415±1,8 |
|
|
Hond Utrecht IV |
429±2,3 |
427±3,4 |
|
|
M20 |
401±3,6 |
403±3,8 |
|
|
Jez-bratislava |
480±3,7 |
481±3,2 |
Дані таблиці свідчать про те, що якість альбуміну, виготовленого за власною методикою не поступається кращим зарубіжним аналогам. До переваг отриманого препарату можна віднести його дешевизну, технологічність та невелику затрату часу при виготовленні. Отже, альбумін, одержаний за нашою методикою, можна рекомендувати для використання в лабораторній та виробничій практиці для виготовлення напівсинтетичних живильних середовищ, що використовуються для культивування лептоспір, а також для виготовлення профілактичних і діагностичних препаратів.
Модифіковане твін-альбумінове середовище для культивування лептоспір. За основу живильного середовища брали твін- альбумінове середовище EMJH. Під час виготовлення
модифікованого середовища EMJH встановили оптимальні мінімально можливі кількості твіну і альбуміну, що не впливають на морфологію, життєздатність та антигенні властивості культур лептоспір. Дослідним шляхом кількість твіну було зменшено з 0,125 до 0,025%, альбуміну з 1 до 0,25%. До складу експериментального середовища додали 1% середовища Ігла. Шляхом паралельного пасажування порівняли ростові властивості вихідного середовища EMJH та модифікованого нами твін-альбумінового середовища, для виготовлення якого було використано альбумін власного виробництва. Виконали 7 пасажей на цих середовищах.
Культури лептоспір досліджених штамів однаково добре ростуть як на середовищі EMJH, так і на модифікованому нами середовищі з мінімальними концентраціями твіну-80 і альбуміну (р>0,05). Середнє накопичення біомаси при цьому становить 4044,05 клітин у полі зору мікроскопа.
Порівняльна характеристика антигенної активності та життєздатності штамів лептоспір на сироватковому та модифікованому твін-альбуміновому середовищах. Виходячи з неузгоджених літературних даних щодо збереження антигенної активності штамів лептоспір при культивуванні їх на твін-альбумінових середовищах, ми поставили перед собою завдання перевірити антигенну активність лептоспір, що культивувались на модифікованому середовищі. В реакції мікроаглютинації було встановлено, що антигенна активність штамів, які культивувались на модифікованому нами середовищі EMJH після 7-ми пересівів, не знизилась порівняно з тими, що культивувались на сироватковому середовищі за той же період.
Для оцінки адаптації лептоспір до модифікованого середовища ми використали тест затримки ділення лептоспір акриламідом. Цей тест дає змогу визначити кількість життєздатних клітин в культурах (Борзнов Н.И., Чернуха Ю.Г., 1986). До 5-ти добових культур лептоспір додали акриламід до кінцевої концентрації у культурі 0,25%. У такій концентрації акриламід викликав затримку ділення лептоспір, не впливаючи при цьому на ростові властивості. Довжина живих клітин збільшилась в 3-5 разів порівняно з довжиною контрольних або нежиттєздатних клітин. У табл. 3 наведено дані спостережень життєздатності клітин лептоспір на модифікованому середовищі EMJH і середовищі Кортгофа з 10% сироватки крові овець.
Модифіковане нами твін-альбумінове середовище EMJH з низьким вмістом альбуміну було використано при виготовленні високоспецифічних сироваток групових аглютинуючих лептоспірозних з титрами від 1:16000 до 1:128000, що повністю відповідає вимогам.
Таблиця 3 - Оцінка життєздатності лептоспір на різних середовищах на 5 добу культивування ( клітин у полі зору мікроскопа, М±m, n=5, р>0,05)
|
Штам лептоспір |
Модифіковане середовище EMJH |
Середовище Кортгофа |
|||
|
Життєздатних клітин |
Загальна кількість клітин |
Життєздатних клітин |
Загальна кількість клітин |
||
|
493 Poland |
332±4,1 |
340±3,5 |
131±3,3 |
138±3,6 |
|
|
Kabura |
356±3,8 |
375±4,3 |
152±3,6 |
157±5,7 |
|
|
Perepelicyn |
401±3,6 |
412±3,9 |
186±4,3 |
190±4,5 |
|
|
Pomona |
382±3,7 |
390±4,1 |
147±3,8 |
151±3,9 |
|
|
Moskva V |
391±4,9 |
400±5,2 |
156±4,0 |
169±4,1 |
|
|
Hond Utrecht IV |
407±3,8 |
421±4,9 |
179±3,6 |
187±4,6 |
|
|
M20 |
381±34 |
386±5,2 |
121±4,9 |
129±5,2 |
При виготовленні сироваток групових аглютинуючих лептоспірозних слід використовувати середовище з низьким вмістом білка. Антиген, одержаний на такому середовищі, не викликає
анафілактичної реакції у імунізованих тварин та завдяки високому накопиченню біомаси дає високі титри, що робить аглютинуючі сироватки високоспецифічними і активними.
Подібні вимоги до живильних середовищ за міжнародними стандартами встановлюються і при виготовленні імуноферментних діагностикумів. На основі модифікованого середовища EMJH було виготовлено якісні антигени для тест-систем діагностичних імуноферментних “ІФА-лептоспіроз”.
Висновки
1. Необхідність виготовлення ефективних вітчизняних протилептоспірозних вакцин та діагностичних препаратів потребує застосування сучасних біотехнологічних методик для створення нових та удосконалення існуючих живильних середовищ для культивування лептоспір. Завдяки дослідженням створено систему культивування культур лептоспір на основі розроблених селективних та живильних середовищ з невисоким вмістом білка.
2. Розроблений метод очищення культур лептоспір за допомогою фурациліну в концентрації 1:840000 або фурагіну -- 1:260000 дає змогу за дві доби повністю очистити культури лептоспір від сторонньої мікрофлори.
3. Вивчено вплив енрофлоку на культуру лептоспір in vitro і встановлено, що він має аналогічну до стрептоміцину бактерицидну дію. Це відкриває перспективу використання даного препарату для інактивації вакцин, лікування лептоспірозу, боротьби з лептоспіроносійством.
4. Доведено, що у складі живильних середовищ для культивування лептоспір доцільно використовувати сироватку крові овець. Накопичення біомаси на таких середовищах становить 164,1511,5 клітин у полі зору мікроскопа, що не відрізняється від цього показника при використанні сироватки крові кролів.
5. Вперше в Україні розроблено метод звільнення сироватки крові овець від гамаглобулінів за допомогою 10% поліетиленгліколю, що повністю відновлює її ростові властивості.
6. Оптимальна стимулююча доза середовища Ігла (10%) у складі середовища Кортгофа, дає змогу знизити вміст сироватки крові овець з 10 до 5% та збільшити накопичення біомаси лептоспір на 37,2%.
7. Вперше в Україні розроблено хроматографічний метод одержання бичачого сироваткового альбуміну із застосуванням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки “СХ-50”. Альбумін, одержаний цим методом, є чистим препаратом і за якістю відповідає кращим зарубіжним аналогам. Його доцільно використовувати для виготовлення напівсинтетичних живильних середовищ.
8. Модифіковане середовище EMJH, яке містить мінімальну кількість (0,25%) альбуміну, дає накопичення біомаси в 2,8 раза більше порівняно з сироватковими середовищами та не змінює біологічні властивості лептоспір.
Пропозиції виробництву.
У роботі лабораторій ветеринарної медицини у разі забруднення культур лептоспір сторонньою мікрофлорою пропонуємо використовувати хімічний метод їх очищення за допомогою фурациліну в концентрації 1:840000 або фурагіну -- 1:260000. Для підтримки музейних та діагностичних штамів лептоспір пропонуємо використовувати модифіковане середовище Кортгофа та сироватку крові овець.
Під час виготовлення вакцин та діагностичних препаратів слід застосовувати модифіковане середовище EMJH.
Альбумін, одержаний методом хроматографії, доцільно використовувати в медичній, ветеринарній, мікробіологічній, вірусологічній та біотехнологічній промисловостях. Він може бути використаний для виробництва напівсинтетичних живильних середовищ при культивуванні мікроорганізмів, зокрема лептоспір, у лабораторних та виробничих умовах, для виготовлення профілактичних та діагностичних препаратів.
Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації
Таран Т.В. Ростстимулююча дія середовища Ігла на культуру лептоспір // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Актуальні проблеми ветеринарної медицини.-Біла Церква, 1999.- Вип.8. - Ч.1.- С. 242-246.
Таран Т.В. Досвід використання середовища Ігла для культивування лептоспір // Вісник аграрної науки. - 1999.-№10. - С.76-77.
Таран Т.В. Методи очищення культур лептоспір від сторонньої мікрофлори // Вісник Сумського державного аграрного університету. -1999.- Вип. 4. - С.178-180.
Таран Т.В. Порівняння впливу енрофлоку і стрептоміцину на культуру лептоспір in vitro // Вісник аграрної науки. - 2001.-№ 5. - С.84.
Резуненко Є. В., Кучерявенко О-й. О., Кучерявенко О-р. О., Таран Т.В. Спосіб виробництва альбуміну бичачого сироваткового (БСА). Рішення про видачу деклараційного патенту на винахід за заявкою № 2001021256. Заявл. 21.02.2001. Вих. № 25273 (Експериментальні дослідження виконані особисто).
Кучерявенко О-й. О., Кучерявенко О-р. О., Таран Т.В. Спосіб переробки сироватки крові овець для культивування лептоспір. Рішення про видачу деклараційного патенту на винахід за заявкою № 2001021257. Заявл. 21.02.2001. Вих. № 25274. (Експериментальні дослідження виконані особисто).
Таран Т.В., Хоменко В.Г. Порівняльна характеристика методів очистки культур лептоспір від сторонньої мікрофлори // в кн.: Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених. Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення. - Київ, 2000.- С.5-7. (Експериментальні дослідження виконані особисто).
Таран Т.В. Розробка та удосконалення живильних середовищ для культивування лептоспір. -- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16. 00. 03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національний аграрний університет, Київ, 2001.
Дисертація присвячена питанню культивування лептоспір. Розроблено дешевий та зручний метод очищення культур лептоспір за допомогою фурациліну 1:84000 та фурагіну 1:26000, 10% яких додають до середовища Кортгофа з 5% сироватки крові овець і витримують на цьому середовищі 2 доби. Встановлено, що антибіотик широкого спектра дії - енрофлок in vitro на лептоспір діє бактерицидно аналогічно до стрептоміцину. В фазі логарифмічного росту лептоспіри чутливіші до впливу антибіотиків, ніж у стаціонарну фазу. Розроблено методику отримання та використання овечої сироватки крові для культивування лептоспір. Удосконалено середовище Кортгофа для культивування лептоспір. До його складу введено 10% середовища Ігла як стимулятора росту та виключено пептон і вітаміни. Завдяки цьому вдалося зменшити вміст сироватки крові овець у середовищі з 10 до 5% та збільшити накопичення біомаси на 37,2 % порівняно із традиційним середовищем Кортгофа. Доведено можливість використання середовища Ігла в 10-ти разовому розведенні для культивування лептоспір на рівні з середовищем Кортгофа. Розроблено спосіб одержання високоочищеного альбуміну методом хроматографії із застосуванням макропористих кремнеземвмісних сорбентів марки “СХ-50”. Модифіковано твін-альбумінове середовище EMJH шляхом зниження вмісту альбуміну до 0,25% та твіну до 0,025% і додаванням 1% середовища Ігла.
Ключові слова: лептоспіри, живильні середовища, сироватка крові, альбумін, очищення.
Таран Т.В. Разработка и усовершенствование питательных сред для культивирования лептоспир. -- Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология. Национальный аграрный университет, Киев, 2001.
Диссертация посвящена вопросу культивирования лептоспир. Разработан дешевый и удобный метод очистки культур лептоспир при помощи фурацилина 1:84000 и фурагина 1:26000, 10% которых добавляют к среде Кортгофа с 5% сыворотки крови овец и выдерживают на этой среде 2 суток. Установлено, что антибиотик широкого спектра действия - энрофлок в разведениях 1:100, 1:1000, 1:10000 in vitro на лептоспир действует бактерицидно аналогично стрептомицину. В фазе логарифмического роста лептоспиры более чувствительны к влиянию антибиотиков, чем в стационарную фазу.
Разработано нормативную документацию на получение и использование овечьей сыворотки крови для культивирования лептоспир вместо кроличьей, которая в 2 раза дороже. Установлено, что после адаптационного периода (10 пассажей) лептоспиры одинаково хорошо растут на среде Кортгофа с использованием как овечьей сыворотки крови, так и кроличьей (р>0,05). Лептоспиры при культивировании на среде Кортгофа с 10% сыворотки крови овец сохраняют морфологию, физиологические и антигенные свойства и дают накопление бакмассы 164,1511,5 клеток в поле зрения, что почти соответствует показателям при использовании кроличьей сыворотки. Оптимальный режим инактивации овечьей сыворотки крови 560С на протяжении 2 часов. Разработан метод освобождения сыворотки крови овец от гаммаглобулинов при помощи
10% полиэтиленгликоля, что дает возможность использовать ее для культивирования лептоспир.
Усовершенствована среда Кортгофа для культивирования лептоспир. В ее состав введено 10% среды Игла как стимулятор роста и исключены пептон и витамины. Благодаря этому удалось уменшить содержание сыворотки крови овец в среде с 10 до 5% и при этом получить увеличение накопления биомассы на 37,2% в сравнении с традиционной средой Кортгофа. Доказана возможность использования среды Игла в 10-ти кратном разведении для культивирования лептоспир равно как на среде Кортгофа (р>0,05). На приготовление и использование модифицированной среды Кортгофа разработана нормативная документация.
Выполнена сравнительная характеристика ростовых свойств сывороточных сред (Терских и Кортгофа) и твин-альбуминовой EMJH. Накопление биомассы на среде Кортгофа оказалось в 1,4 раза больше, чем на среде Терских, а на среде EMJH в 2,8 раза больше, чем на среде Кортгофа. Установлено, что для приготовления полусинтетических сред пригоден альбумин только высокого качества. Методом электрофореза в полиакриламидном геле установлено, что альбумин Олайнского завода не пригоден для культивирования лептоспир, так как содержит глобулиновую фракцию. Альбумин киевского предприятия “Биофарма” и фирмы “Sigma” - чистые препараты, которые можна использовать в питательных средах.
Разработан способ получения высокоочищенного альбумина методом хроматографии с использованием макропористых кремнеземсодержащих сорбентов марки “СХ-50”. Модифицирована твин-альбуминовая среда EMJH, в которой снизили содержание твина с 0,125 до 0,025%, альбумина с 1 до 0,25% и добавили 1% среды Игла. Проведена оценка адаптации культур лептоспир к новой среде с помощью теста задержки деления клеток 0,25% акриламида. Жизнеспособность клеток на модифицированой среде EMJH и контрольной среде Кортгофа одинакова. На модифицированой среде после 7 пассажей культуры лептоспир сохраняют морфологию, физиологические и антигенные свойства и при этом дают хорошее накопление биомассы. Накопление бакмассы на модифицированой среде EMJH составляет 4044,05 клеток, что равно накоплению бакмассы при использовании традиционной среды EMJH с высоким содержанием альбумина (1%). Модифицированная среда оказалась пригодной для производства иммуноферментных тэст-систем “ИФА-лептоспироз” и активных, высокоспецифичных агглютинирующих типирующих лептоспирозных сывороток с титрами от 1:16000 до 1:128000. Разработана нормативная документация по изготовлению и использованию агглютинирующих сывороток и тест-систем “ИФА-лептоспироз”, основой производства которых есть модифицированная среда EMJH.
Ключевые слова: лептоспиры, питательные среды, сыворотка крови, альбумин, очистка.
Taran T.V. Developing and impruvement feeding mediums for leptospires cultivating.
Dissertation in seek for scientific degree of veterinary scince candidate on the speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virusology. National Agricaltural University, Kyiv, 2001.
Dissertation is consideved questions of leptospires cultivating. Were developed cheap and useful method of leptospire strains purification by using furacilinum 1:84000 and furagini 1:26000, 10% of them were added to Korthgof supporting medium with 5% sheep sera, and keep them up to 48 h determined that wide spectrum antibiotic enrophloc under the in vitro cultivation with leptospire has the same action as classical antibiotic streptomycin. In logarifmic phase of grwing leptospire more sensitive for antibiotic influens, then in stationary phase. Were developed methodics of obtaining and using sheep sera for leptospires cultivating. Freeing of sheep sera from immunoglobulins that forebidding leptospires growingcan be possible with 10% polyethylenglycol. Were improved Korthgof feeding medium for leptospires cultivating. To the composition of known medium was added 10% of Eagle medium as growing factor and taked off all vitamins and pepthon.Thus this can be possible to discrease serum quantity from 10% to 5% and take increasing of biomass quantity up to 37,2% comparing with traditional Korthgof medium. Was proved possibility of using Eagle medium in 10-fold dilution for leptospires cultivating on the same level as Korthgoph medium. Were developed new method of obtaining highly-purified albuminum using macropore silica sorbents “CX-50”. The EMJH medium was modified by discreasing of albumin containing to 0,25%, twin to 0,025% and added 1% of Eagle medium.
Key words: feeding mediums, serum, albumin, strains, purification.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Оптимізація складу живильних середовищ для культивування продуцентів біологічно активних речовин, способи культивування. Мікробіологічний контроль ефективності методів стерилізації. Методи очищення кінцевих продуктів біотехнологічних виробництв.
методичка [1,9 M], добавлен 15.11.2011Характеристика біотехнології отримання ембріонів in vitro, напрямки та перспективи її вдосконалення. Умови середовища культивування ооцит-кумулюсних комплексів. Впровадження біоритмічно осцилюючих параметрів культивування біологічних мікрооб’єктів.
статья [150,5 K], добавлен 21.09.2017Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу, об’єму ферментера та кількості виробничих циклів. Біотрансформація ростового субстрату у цільовий продукт.
дипломная работа [274,0 K], добавлен 09.02.2017Вивчення середовища для виробництва білкових концентратів із водоростей, бактерій, рослин, дріжджів та грибів. Огляд ферментаторів для стерильного культивування мікроорганізмів. Аналіз флотації, сепарування, випарювання й сушіння для одержання протеїнів.
дипломная работа [126,7 K], добавлен 07.05.2011Основні процеси, за допомогою якого окремі клітини прокаріотів і еукаріотів штучно вирощуються в контрольованих умовах. Здатність перещеплених клітин до нескінченного розмноженню. Культивування клітин поза організмом. Основні види культур клітин.
презентация [1,3 M], добавлен 16.10.2015Дослідження властивостей гіберелінів, групи гормонів рослин, які регулюють ріст і різноманітні процеси розвитку. Характеристика етапів синтезу гіберелінів. Огляд методу зануреного культивування грибів фузарій. Вплив аерації та температури на біосинтез.
реферат [961,4 K], добавлен 10.01.2014Морфологічні та біохімічні зміни в організмі гідробіонтів за дії пестицидів. Залежність стійкості риб до токсикантів від температури середовища та пори року. Вплив гідрохімічних показників при визначенні токсичного ефекту. Патологоанатомічні зміни у риби.
курсовая работа [71,5 K], добавлен 22.12.2014Науково-методичні та екологічні засади створення і розвиток дитячого ботанічного саду. Напрямки діяльності дендропарку та заходи щодо пропаганди охорони навколишнього природного середовища. Колекційні фонди реліктових, ендемічних і декоративних рослин.
курсовая работа [8,5 M], добавлен 21.09.2010Післязародковий (постембріональний) розвиток тварини починається після вилуплення або народження. За характером після зародкового розвитку розрізняють: прямий і непрямий. Вплив генотипу і факторів навколишнього середовища на розвиток організму.
реферат [36,9 K], добавлен 22.03.2008Фізіологічні та біологічні характеристики крові. Кількість крові у тварин. Значення депонованої крові, механізми перерозподілу крові між депонованої і циркулюючої. Еритроцити як дихальні пігменти, які здійснюють перенесення кисню і діоксиду вуглецю.
реферат [15,5 K], добавлен 12.11.2010
