Вплив транспортних механізмів на поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії у нейритах на ранніх етапах розвитку в культурі

Размещено на http://allbest.ru

Національна академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

УДК 576.524

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Вплив транспортних механізмів на поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії у нейритах на ранніх етапах розвитку в культурі

03.00.02 - біофізика

Ситник Володимир Миколайович

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в лабораторії біофізики та біоелектроніки Дніпропетровського національного університету

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Корогод Сергій Михайлович, завідувач кафедри експериментальної фізики, науковий керівник лабораторії біофізики та біоелектроніки Дніпропетровського національного університету.

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор Зима Валентин Леонідович,

професор кафедри біофізики Київського національного університету ім. Т.Г.Шевченка,

кандидат біологічних наук Ніконенко Олександр Георгійович, старший науковий співробітник відділу цитології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Провідна установа:Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Захист відбудеться "25" грудня 2001 р. о 14 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий "23" листопада 2001 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вступ

Молекули клітинної адгезії є глікопротеінами, локалізованими переважно у плазматичній мембрані. Ці молекули відіграють важливу роль у адгезивних взаємодіях між клітинами, формуючи гомофільні зв'язки з аналогічними молекулами, розташованими на мембранах прилеглих клітин, чи гетерофільні зв'язки з білками позаклітинного матриксу [Schachner, 1997]. Молекули клітинної адгезії є проміжною ланкою між позаклітинними структурами і цитоскелетом клітини, з яким за посередництвом ряду проміжних білків зв'язуються їх внутрішньоклітинні домени [Fields, Itoh, 1996].

Крім цього, зв'язування цих молекул з лігандом ініціює цілий ряд внутрішньоклітинних біохімічних реакцій, що можуть призводити до зміни стану цитоскелету і впливати на інші внутрішньоклітинні процеси [Doherty, Walsh, 1996; Doherty et al., 1995].

Завдяки цим властивостям, дані молекули грають одну з ключових ролей у процесах міграції клітин, росту і фасцикуляції нейритів, стабілізації міжнейронних контактів, а також процесах, що є основою синаптичної пластичності [Hoffman, 1998; Chiba, Keshishian, 1996; Schachner, 1997].

Встановлено, що молекули клітинної адгезії розподілені на поверхні нейритів нерівномірно. Підвищена щільність цих молекул спостерігається у конусах росту [Krivko et al., 1993; Pollerberg et al., 1987] та розглядається як необхідна умова зростання нейритів [Suter, Forscher, 1998]. Збільшення щільності даних молекул у місцях міжнейронних контактів є важливим для стабілізації останніх [Pollerberg et al., 1987].

Поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії може у значній мірі визначатися особливостями їх транспорту, але механізми, що обумовлюють розподіл цих молекул у плазматичній мембрані, залишаються маловідомими. Вважається, що основним механізмом перерозподілу молекул клітинної адгезії уздовж нейриту є латеральна дифузія [Futerman et al., 1993]. Однак її роль у формуванні розподілів, що спостерігаються, також залишається малодослідженою.

Дана дисертаційна робота присвячена вивченню впливу транспорту молекул клітинної адгезії на формування поверхневого розподілу цих молекул на ранніх етапах розвитку нейронів.

Актуальність проблеми

В теперішній час інтенсивно вивчаються процеси, що лежать в основі формування структур організму взагалі і нервової системи зокрема. Зміни в розподілі молекул клітинної адгезії на поверхні нейронів, що виникають на різних етапах розвитку в рамках таких феноменів, як міграція клітин, формування і ріст відростків, встановлення контактів і формування синапсів, є добре документованим фактом.

Однак, дотепер залишаються слабо вивченими механізми, що обумовлюють ці зміни, і, зокрема, механізми транспорту даних молекул. Ця обставина, а також важливе значення молекул, що розглядаються, визначають актуальність даної проблеми.

Ціль дослідження

Об'єктом дослідження даної роботи є розподіли молекул клітинної адгезії в плазматичній мембрані нейронів на ранніх етапах розвитку клітин.

Предметом дослідження є механізми транспорту молекул клітинної адгезії. Метою даного дослідження є вивчення впливу транспорту молекул клітинної адгезії на формування їх просторових розподілів у мембрані відростків нейронів на ранніх етапах розвитку.

Основні задачі дослідження

Для досягнення даної мети були поставлені наступні задачі:

1.Методами імуноцитохімії вивчити розподіл нейронної молекули клітинної адгезії (NCAM) у плазматичній мембрані відростків нейронів гіпокампу.

2.Провести порівняльний аналіз розподілів NCAM та інших молекул клітинної адгезії, що належать до родини імуноглобулінів.

3.Проаналізувати розподіли NCAM на поверхні нейронів, що культивуються на субстратах з різними адгезивними властивостями.

4.Розробити математичну модель латерального дифузійного транспорту молекул клітинної адгезії в мембрані нейритів, що ростуть, та за допомогою цієї моделі дослідити розподіли NCAM уздовж відростків нейронів гіпокампу.

5.За допомогою методів математичного моделювання вивчити вплив дифузійного транспорту на формування градієнтів щільності молекул клітинної адгезії у розгалужених відростках нейронів.

6.Методами імуноцитохімії та цитохімії дослідити вплив внутрішньоклітинних факторів на поверхневий розподіл NCAM у плазматичній мембрані нейронів гіпокампу.

Наукова новизна одержаних результатів

У даній роботі вперше встановлено, що розподіл молекул клітинної адгезії на поверхні нейриту, що росте, включає принаймні два компоненти, обумовлені дифузійним перерозподілом цих молекул з конуса росту і соми нейрона в напрямку центральної частини нейриту та активним транспортом кластерів молекул клітинної адгезії, асоційованих із везикулярними органелами.

Показано, що дифузія NCAM із соми та конуса росту призводить до формування нерівномірних розподілів поверхневої щільності цих молекул вздовж нейритів, причому форма цих розподілів залежить від використаного для культивування нейронів субстрату.

Вперше встановлено, що дифузійний перерозподіл молекул клітинної адгезії між дочірніми і материнською гілками розгалуженого відростку може призводити до виникнення протилежно спрямованих градієнтів поверхневої щільності цих молекул в дочірніх гілках.

Більш того, підвищена щільність молекул клітинної адгезії в конусах росту обох дочірніх гілок, що сприяє їх росту, має місце тільки у певному діапазоні співвідношень їх діаметрів і залежить від типу внутрішньоклітинного транспорту. Це можна розглядати як один з механізмів регуляції геометрії галуження нейриту. Вперше встановлено, що активний перерозподіл кластерів NCAM, асоційований з активним транспортом органел, сприяє накопиченню NCAM в області міжнейронних контактів, що може бути умовою стабілізації структури останніх.

Теоретичне та практичне значення роботи

Зміни в рівні експресії різних молекул клітинної адгезії та їх розподілі у плазматичній мембрані нейронів супроводжують практично всі події морфогенезу нервових клітин і є критичним чинником нормального розвитку організму, регенерації нервової тканини, процесів, що лежать в основі формування пам'яті, а також таких патологій, як злоякісна трансформація та нейродегенеративні захворювання.

З'ясування ролі механізмів формування поверхневих розподілів молекул клітинної адгезії є передумовою ефективного лікування і профілактики згаданих захворювань, а також може допомогти в аналізі процесів, що лежать в основі навчання і пам'яті, і, таким чином, має важливе практичне і фундаментальне значення.

Особистий внесок

Усі лабораторні та модельні дослідження були виконані безпосередньо автором. У розробці концепції роботи активну участь приймали інші співавтори опублікованих робіт.

Культури нейронів гіпокампу були люб'язно надані канд. біол. наук Дитятєвою Г. (Центр молекулярної нейробіології Гамбурзького університету). Фарбування нейронів гіпокампу ліпофільним барвником DiІ було виконано канд. біол. наук Дитятєвим А. Е. (Центр молекулярної нейробіології Гамбурзького університету).

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота Ситника В.М. є частиною робіт, проведених у науково-дослідній лабораторії біофізики та біоелектроніки Дніпропетровського національного університету в рамках держбюджетної науково-дослідної теми №114-95 “Моделювання функцій складних нейронів ссавців” (Державний реєстраційний № 0195U019435), включеної до координаційних планів Міністерства освіти і науки України, а також у рамках міжнародного наукового співробітництва з Центром молекулярної нейробіології Гамбурзького університету.

Апробація роботи

Основні положення роботи доповідалися на семінарах Лабораторії біофізики і біоелектроніки Дніпропетровського національного університету [1996-2001], Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця [Київ, 2000], семінарах Центру молекулярної нейробіології Гамбурзького університету [Гамбург, 1998-2001], на науковій конференції Дніпропетровського національного університету [1997], на 2 з'їзді Українського біофізичного товариства [Харків, 1998], на конференціях Міжнародного і Європейського товариств нейрохімії [Санкт-Петербург, 1998; Берлін, 1999], на спільній міжнародній конференції Американського товариства клітинної біології і Європейського товариства молекулярної біології [Санта Марія Імбаро, 1999].

Публікації

За результатами дисертаційної роботи опубліковано чотири статті і шість тез доповідей на міжнародних конференціях.

Структура й обсяг дисертації

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики і результатів досліджень, обговорення і списку 110 використаних джерел. Робота викладена на 129 сторінках і ілюстрована 28 рисунками.

адгезія нейрит синапс

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень

Дослідження розподілів молекул клітинної адгезії, а також їх транспорту, були виконані на культурах нейронів гіпокампу, отриманих відповідно до загальноприйнятої методики [Malgaroli, Tsien, 1992; Reuter, 1995]. Нейрони висівали на накривні скельця із щільністю близько 700 клітин/мм². Скельця були попередньо вкриті відповідним субстратом: полі-L-лізином, ламінін-подібним білком, ламініном чи поліклональними антитілами до NCAM. Молекули клітинної адгезії в живих чи фіксованих нейронах мітилися антитілами до відповідного епітопу, після чого первинні антитіла детектувалися вторинними, зв'язаними з флуорохромом.

Розподіли інтенсивності імунофлуоресцентного мічення молекул досліджувалися з використанням зображень нейронів гіпокампу, отриманих за допомогою лазерного конфокального мікроскопа LSM 510 (Zeiss, Німеччина). Візуалізація розподілу органел здійснювалася з використанням флуоресцентного барвника FM1-43 (Molecular Probes, США). Нейрони підтримувалися протягом 20 годин у культуральному середовищі, що містило 10 mM FM1-43.

Відеозапис проводили за допомогою мікроскопу Axiovert 10 (Zeiss), оздобленого цифровою відеокамерою (AVT-Horn, Німеччина) або з використанням вищезгаданого конфокального мікроскопу.

Дослідження впливу латеральної дифузії на поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії виконувалося шляхом порівняння експериментальних даних з розподілами, отриманими за допомогою математичної моделі. Рівняння математичної моделі являли собою рівняння масоперенесення в часткових похідних другого порядку еліптичного типу. У даній роботі аналітично знаходили стаціонарні рішення даних рівнянь.

РЕЗУЛЬТАТИ

Дослідження просторового розподілу молекул клітинної адгезії на поверхні відростків нейронів гіпокампу, що ростуть

Аналіз результатів імунофлуоресцентного мічення нейронів гіпокампу антитілами до різних молекул клітинної адгезії сімейства імуноглобулінів (NCAM, L1, CHL1, TAG-1, Thy-1) показав, що дані молекули нерівномірно розподілені вздовж нейритів. У розподілі всіх досліджених молекул можна було виділити ряд загальних рис. Підвищена щільність молекул спостерігалася, як правило, у проксимальній (що контактує з сомою клітини) ділянці відростку.

Інший пік імунофлуоресценції спостерігався у найбільш дистальній (максимально віддаленій від соми) частині нейриту, що включала також конус росту.

Крім того, у центральній частині нейритів були виявлені кластери молекул клітинної адгезії - інтенсивно мічені антитілами ділянки мембрани площею 0,4 - 4,0 мкм2. Вони визначали наявність відповідного піку на графіку розподілу інтенсивності імунофлуоресцентного сигналу уздовж відростку. Інтенсивність мічення даних кластерів значно перевищувала середній рівень імунофлуоресцентного світіння і інколи була вища за рівень імунофлуоресцентного сигналу у дистальній чи проксимальній частині нейритів.

Приймаючи до уваги, що розподіли усіх досліджених молекул клітинної адгезії мали загальні риси, подальший аналіз було зосереджено на молекулі клітинної адгезії NCAM. Усереднені розподіли інтенсивності імунофлуоресцентного мічення NCAM мали пік в області проксимальної та дистальної ділянок нейриту.

Форма розподілів залежала від субстрату. На субстратах з полі-L-лізину і поліклональних антитіл до NCAM усереднена інтенсивність імунофлуоресцентного мічення NCAM плавно спадала в напрямку від конуса росту та соми до центральної частини нейриту.

Навпаки, на субстратах із ламінин-подібного білку чи ламінину усереднена інтенсивність імунофлуоресцентного мічення NCAM різко знижувалася до базового рівня безпосередньо біля конуса росту чи соми, залишаючись майже незмінною в центральній частині нейриту.

Найбільш виражений пік усередненого імунофлуоресцентного сигналу в області конуса росту був виявлений в нейритах клітин, що культивували на субстраті з ламінину.

Спектральний аналіз розподілів інтенсивності імунофлуоресценції NCAM показав, що для жодного з використаних субстратів у розподілі усередненої спектральної щільності неможливо виділити переважні частоти. Це означає, що кластери NCAM були розподілені уздовж нейритів нерегулярним чином.

Дослідження механізмів транспорту молекул клітинної адгезії в плазматичній мембрані нейритів

Відповідно до сучасних уявлень основним механізмом перерозподілу білкових молекул і, у тому числі, молекул клітинної адгезії в плазматичній мембрані нервових клітин є латеральна дифузія [Futerman et al., 1993]. Ґрунтуючись на цьому, можна очікувати, що розподіл молекул клітинної адгезії на поверхні нейриту, що росте, обумовлюється дифузією даних молекул уздовж латеральних градієнтів їх концентрації.

Подібні градієнти можуть виникати за рахунок переважного вбудовування цих молекул у плазматичну мембрану певних ділянок нейриту, якими на ранніх етапах розвитку нейрона є конус росту нейриту і, можливо, сома нейрону [Craig et al., 1995; Vogt et al., 1996; Zakharenko, Popov, 1998].

Просторовий розподіл молекул клітинної адгезії уздовж відростка нейрону, обумовлений їх дифузією у площині мембрани, був описаний за допомогою математичної моделі.

У стаціонарному випадку розподіл поверхневої щільності молекул клітинної адгезії nr уздовж відростка прямо пропорційно залежить від величини їх потоків I1 і I2 на кінцях відростку і описується таким рівнянням:

(1),

де , а L і X - довжина нейриту і координата вздовж нього, відповідно, що вимірюються у одиницях константи латерального переносу , Dr - коефіцієнт дифузії, ke - швидкість ендоцитозу.

Розраховані таким чином розподіли поверхневої щільності молекул клітинної адгезії являли собою монотонні гладенькі криві з максимумами на кінцях модельованого відростка.

Поверхнева щільність молекул клітинної адгезії монотонно спадала з віддаленням від кінців модельованого нейриту, тобто від зон переважного вбудовування мембранного матеріалу, розташованих в області соми і конуса росту. Розрахунки показали, що форма розподілів залежала від константи латерального переносу ld .

При цьому більш крутий спад поверхневої щільності відповідав меншим значенням ld. Асиметрія просторового розподілу молекул клітинної адгезії уздовж відростка залежала від параметра b - співвідношення між потоками молекул на кінцях відростку.

При малих значеннях константи латерального переносу просторові розподіли молекул клітинної адгезії у кінцевих відділах відростка не залежали один від одного. При збільшенні значення даної константи молекули прагнули рівномірно розподілитися уздовж модельованого нейриту, і їх розподіл менш залежав від параметра b.

З метою вивчення впливу латеральної дифузії на розподіл молекули NCAM експериментальні усереднені розподіли інтенсивності імунофлуоресценції були апроксимовані функцією виду (1) на ділянках довжиною 10 мкм, що контактували з сомою і конусом росту. Аналіз показав, що в проксимальній зоні розподіл інтенсивності імунофлуоресценції можна було описати функцією виду (1) з коефіцієнтом множинної кореляції R=0,834 (ламінин), R=0,175 (ламінин-подібний білок), R=0,96 (полі-L-лізин) і R=0,88 (поліклональні антитіла до NCAM).

У дистальній частині відростку апроксимація розподілу інтенсивності імунофлуоресценції NCAM вищезгаданою функцією дала відповідні значення R: R=0 (ламінін), R=0,1 (ламінін-подібний білок), R=0,75 (полі-L-лізин) і R=0,44 (поліклональні антитіла до NCAM).

Апроксимація усереднених експериментальних кривих дозволила визначити константу латерального переносу на використаних субстратах, що у проксимальній частині нейриту дорівнювала ld=12,0±0,4 мкм (p<0,0001) (ламінин), ld=6,5±0,1 мкм (p<0,0001) (полі-L-лізин), і ld=9,7±0,4 мкм (p<0,0001) (антитіла до NCAM). На дистальній ділянці константа латерального переносу дорівнювала ld=9,0±0,4 мкм (p<0,0001) (полі-L-лізин) і ld=13,9±1,2 мкм (p<0,0001) (антитіла до NCAM).

З огляду на те, що значення коефіцієнту латеральної дифузії молекули NCAM знаходяться у діапазоні [10,3ё15,4]*10-11 см2/с [Pollerberg et al., 1986], а швидкість ендоцитозу може варіювати в межах [10-6ё10-2] с-1 [DiMilla et al., 1991], можна вважати, що отримані оцінки латеральної константи переносу ld відповідали фізіологічно реальному діапазону в районі його нижньої межі.

Імунофлуоресцентний аналіз показав, що у центральній частині нейриту молекули клітинної адгезії утворюють кластери, присутність яких не відповідає моделі дифузійного перерозподілу цих молекул.

Порівняльний аналіз зображень відростків нейронів, отриманих за допомогою імунофлуоресцентного методу і методу диференціального інтерференційного контрасту, показав, що кластери NCAM у центральній частині відростка здебільшого локалізовані поруч з везикулярними органелами.

Відеозапис дозволив встановити, що органели швидко стрибкоподібно пересуваються уздовж нейритів в обох напрямках. Лише невелика частина органел знаходилася в стані руху в один окремо взятий момент. Максимальна швидкість руху в момент стрибка складала близько 0,5 мкм/с. Подальше імунофлуоресцентне мічення, яке було виконане за умови інтактної плазматичної мембрани, показало, що деякі з органел, що рухалися під час відеозапису, були локалізовані поблизу кластерів NCAM на поверхні нейритів.

Для аналізу руху кластерів NCAM і асоційованих з ними везикулярних органел нейрони протягом 24 годин інкубувалися в середовищі, що містило флуоресцентний барвник FM1-43, після чого вони були прижиттєво мічені антитілами до NCAM.

Подальший аналіз показав наявність численних кластерів NCAM і везикулярних органел, розподілених уздовж відростків. Аналіз відеозапису флуоресцентних зображень дозволив встановити, що переміщалися вздовж відростків тільки кластери NCAM, асоційовані з міченими FM1-43 органелами. При цьому, як правило, найбільш швидко рухалися кластери меншого розміру, асоційовані з найбільш інтенсивно міченими органелами .

Роль дифузійного транспорту у формуванні градієнтів поверхневої щільності молекул клітинної адгезії

Однією з передумов росту нейриту вважається наявність у плазматичній мембрані його конусу росту підвищеної, у порівняні з центральними ділянками відростку, концентрації молекул клітинної адгезії [Suter, Forscher, 1998].

Роль дифузійного транспорту у регуляції просторових розподілів молекул клітинної адгезії була вивчена нами за допомогою математичної моделі дифузійного перерозподілу молекул клітинної адгезії у розгалуженому нейриті.

Вважали, що молекули клітинної адгезії, які внутрішньоклітинно транспортуються у дочірні гілки, рівномірно вбудовувалися по всій їх поверхні.

З місця вбудовування молекули за рахунок дифузії перерозподілялися в площині мембрани у напрямку материнської гілки уздовж градієнта їх поверхневої щільності. В області розгалуження внутрішньоклітинний транспортний потік молекул клітинної адгезії розподілявся між дочірніми гілками.

Було розглянуто три типи поділу даного потоку: нарівно, пропорційно до поперечного перерізу дочірніх гілок та пропорційно до площі поверхні дочірніх гілок. У випадку асиметрично розгалуженого відростка з дочірними гілками різного діаметру дифузія молекул клітинної адгезії з дочірніх гілок у материнську призводила до виникнення якісно різних розподілів поверхневої щільності молекул уздовж дочірніх гілок при різних типах поділу внутрішньоклітинного транспортного потоку у місці галуження.

У випадку поділу нарівно поверхнева щільність молекул клітинної адгезії в більш тонкій гілці була більше, ніж у більш товстій. Поділ транспортного потоку пропорційно до площі поперечного перерізу дочірніх гілок, приводив до зворотної ситуації, коли поверхнева щільність молекул у більш товстій гілці була більше.

Поділ транспортного потоку пропорційно до площі поверхні дочірніх гілок приводив до виникнення однакових розподілів молекул клітинної адгезії уздовж обох дочірніх гілок незалежно від діаметрів останніх.

Характер просторового розподілу молекул клітинної адгезії в дочірніх гілках визначався також співвідношенням їх діаметрів, d1/d2 =. Коли параметр знаходився в межах діапазону

,

де ,

lL - довжина дочірніх гілок,

Поверхнева щільність молекул адгезії зростала уздовж обох дочірніх гілок.

У випадку, якщо параметр виходив за межі цього діапазону, поверхнева щільність зростала уздовж більш тонкої гілки і зменшувалась уздовж більш товстої при поділі внутрішньоклітинного транспортного потоку у місці галуження нарівно між дочірніми гілками, і зростала уздовж більш товстої і зменшувалась уздовж більш тонкої гілки при поділі транспортного потоку пропорційно до площі поперечного переріза дочірніх гілок.

Межі даного діапазону залежали від інших геометричних параметрів нейриту і константи латерального переносу.

Діапазон відношень діаметрів дочірніх гілок, у якому поверхнева щільність зростала уздовж обох дочірніх гілок, був найбільш вузьким при найбільших значеннях довжини відростка.

При цьому він був найбільш широким при малій довжині дочірніх гілок, довжина дочірніх гілок (a) - 10%, (b) - 20%, (c) - 30%, (d) - 40%, (e) - 50% довжини усього відростка).

Збільшення константи латерального переносу призводило до розширення діапазону. Константа латерального переносу дорівнює (a) - 5 мкм, (b) - 10 мкм, (c) - 15 мкм, (d) - 20 мкм, (e) 25 - мкм). При великих значеннях константи границі діапазону прагнули досягти деякої межі, що залежала від довжини дочірніх гілок.

Довжина дочірніх гілок (a) - 10%, (b) - 20 %, (c) - 30 %, (d) - 40 %, (e) - 50 % довжини усього відростка).

У такий спосіб при збільшенні довжини нейриту і довжини дочірніх гілок слід очікувати, що розподіл молекул клітинної адгезії на їхній поверхні буде сприяти виникненню і зростанню гілок приблизно однакового діаметра.

Роль транспорту кластерів NCAM у накопиченні NCAM у зонах міжклітинних контактів

Нами показано, що нейрони гіпокампу, культивовані протягом 2-3 днів, утворюють численні міжнейронні контакти. Імунофлуоресцентний аналіз дозволив встановити, що ці контакти містять значну кількість NCAM. Ці результати підтверджуються даними Поллерберг із співавторами [Pollerberg et al., 1987].

Оскільки механізм акумулювання NCAM у місцях міжклітинних контактів до сьогодні залишається невідомим, нами був виконаний відеозапис процесу утворення контакту між нейронами гіпокампу за умов їх прижиттєвого забарвлення на NCAM.

При цьому клітини попередньо протягом 24 годин підтримувалися у середовищі, що містило барвник FM1-43, з метою виявлення розподілу органел.

Аналіз отриманих відеозаписів дозволив встановити, що при утворенні контакту в центральній частині відростку швидке накопичення NCAM у зоні контакту досягається за рахунок “захоплення” кластерів NCAM, або вже присутніх у місці контакту, або принесених сюди органелами. Захоплення кластерів NCAM у місці контакту найчастіше супроводжувалося акумулюванням у цьому місці органел, мічених FM1-43.

ОБГОВОРЕННЯ

Відповідно до задач даної дисертаційної роботи нами був вивчений вплив різних видів транспорту молекул клітинної адгезії на їх розподіл у нейритах на ранніх етапах розвитку нейронів гіпокампу, культивованих в умовах дисоційованої культури. Наші дослідження дозволили встановити, що на ранніх етапах розвитку гіпокампальних нейронів молекули клітинної адгезії мають характерний нерівномірний розподіл уздовж їх відростків, що визначається декількома транспортними механізмами.

Найбільш добре описаним у літературі механізмом перерозподілу мембранних білків є латеральна дифузія [Futerman et al., 1993, DiMilla et al., 1991]. Нами було здійснене порівняльне дослідження розподілів, отриманих в експериментах in vitro, з розподілами, розрахованими за допомогою математичної моделі латеральної дифузії мембранних білків у нейриті. Усереднені експериментальні розподіли добре відповідали цій дифузійній моделі, однак на індивідуальних розподілах спостерігалися істотні відхилення від гладеньких просторових профілів дифузійного розрідження молекул у вигляді нерегулярно розташованих ділянок підвищеної щільності. Ці дані дають підстави для висновку про те, що латеральна дифузія дійсно впливає на поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії, однак є не єдиним механізмом перерозподілу мембранних білків.

Використання відеомікроскопії в комбінації з імуноцитохімічними методами дало можливість вперше спостерігати зміни в часі перерозподілу мембранних білків безпосередньо в живих нейронах.

Було показано, що молекули клітинної адгезії активно рухаються в плазматичній мембрані за рахунок їх асоціації з везикулярними органелами і швидкість такого руху значно вища, ніж очікувана за умов лише пасивної дифузії.

Подібний швидкий спосіб перерозподілу мембранних білків і, зокрема, даної молекули вже був описаний у конусах росту нейритів [Sheetz et al., 1990; Schmidt et al., 1995]. Однак нами вперше було показано, що цей механізм характерний також і для інших ділянок нейриту.

Таким чином, можна дійти до висновку, що розподіл молекул клітинної адгезії в плазматичній мембрані нейронів гіпокампу визначається принаймні двома механізмами - пасивною дифузією й активним перерозподілом за рахунок асоціації з рухомими везикулярними органелами.

Наступне питання даної дисертаційної роботи стосувалося можливої ролі даних видів транспорту у визначенні функціонально значущих характеристик розподілу молекул клітинної адгезії.

Зокрема, нами було показано, що латеральна дифузія може бути одним із критичних факторів, який визначає градієнти щільності молекул клітинної адгезії у відростках розгалуженого нейриту, що сприяють зростанню дочірніх гілок [Suter and Forscher, 1998].

Нами також було встановлено, що у випадку розгалуженого відростка поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії визначався не тільки їх рухом у площині плазматичної мембрани, але також і способом їхньої внутрішньоклітинної доставки. Активний механізм перерозподілу молекул клітинної адгезії за рахунок їх асоціації з везикулярними органелами виконував іншу, не менш важливу ніж сприяння росту нейритів, функцію.

Нами було показано, що цей вид транспорту сприяв швидкому накопиченню молекул клітинної адгезії, зібраних у кластери на поверхні мембрани, у місцях міжклітинних контактів, що є умовою стабілізації цих контактів [Pollerberg et al., 1987], і, можливо, закріпленню в контактній області внутрішньоклітинних органел.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що молекули клітинної адгезії сімейства імуноглобулінів NCAM, L1, CHL1, TAG-1 і Thy-1 мають характерний нерівномірний розподіл вздовж нейриту, що росте. Щільність даних молекул є найбільшою у дистальній та проксимальній частинах відростку і зменшується у напрямку до проміжної частини. Спостерігаються також кластери цих молекул, розташовані нерегулярним чином вздовж нейриту.

2. Показано, що усереднені просторові розподіли молекули клітинної адгезії NCAM залежать від субстрату, що використовується для культивування нейронів. Ці розподіли відповідають математичній моделі, яка передбачає переважне вбудовування молекул NCAM у мембрану соми та конусу росту та подальше пасивне транспортування цих молекул у центральну частину відростка за рахунок латеральної дифузії.

3. Показано, що у розгалуженому нейриті розподіл молекул клітинної адгезії у мембрані дочірніх гілок залежить від типу внутрішньоклітинного транспорту даних молекул, а знак градієнту їх поверхневої щільності визначається геометрією розгалуження. Розподіл молекул клітинної адгезії, що сприяє зростанню обох дочірніх гілок, може бути отриманий лише у вузькому діапазоні відношень їх діаметрів, що може розглядатися як один з механізмів регуляції галуження відростка.

4. Встановлено, що кластери молекули NCAM активно пересуваються вздовж мембрани відростків нейронів гіпокампу із швидкістю, що перевищує очікувану в умовах лише латеральної дифузії. Можливим механізмом цього транспорту може бути зв'язок кластерів із везикулярними органелами, що активно рухаються всередині нейритів.

5. Показано, що активний транспорт кластерів молекули NCAM вздовж нейритів сприяє швидкому накопиченню молекули NCAM в зонах первинних контактів поміж нейронами, що є важливою умовою формування функціонально активних синапсів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті:

1.Sytnyk V.N., Berezin V.A., Korogod S.M. Geometry-induced inhomogeneity of distribution of cell-adhesion molecules along branching processes // Neirofiziologija/Neurophysiology. - 1998. - N30(3). - P. 197-205.

2.Sytnyk V.N. Simulated distributions of density of cell adhesion molecules over branching processes with different geometry and intracellular trafficking // Neirofiziologija/Neurophysiology. - 1999. - N 31(4). - P. 290-295.

3.Sytnyk V.N., Dityatev A.E., Korogod S.M. Distribution of cell adhesion molecules (CAMs) on the surface of branching neurites: model-inherited effects of branch diameters and mode of transport // Neirofiziologija/Neurophysiology. - 2001. - N 33(1) - Р. 15-19.

4.Sytnyk V.N., Korogod S.M., Dityatev A.E. Diffusion and active transport of NCAM within the neuronal plasma membrane // Neirofiziologija/Neurophysiology. - 2001. - N 33(3) - Р. 166-172.

Тези доповідей:

1.Sytnyk V. Les recherches de la morphogenese des cellules a l'aide du mathematique modele // 4-e Conference Internationale, Experience du dialogue des cultures nationales France et Ukraine. - Dniepropetrovsk (Ukraine). - 1997. - P. 125-126.

2.Sytnyk V.N., Korogod S.M., Berezin V.A. Simulated distributions of density of cell adhesion molecules over branching processes with different geometry and intracellular trafficking // Joint Meeting of ISN and ESN. - St. Petersburg (Russia). - Journal of Neurochemistry. - N71 (Supplement). - 1998. - P. S14B.

3.Sytnyk V.N., Korogod S.M. and Berezin V.A. Mechanisms of geometry-induced inhomogeneity of distribution of cell adhesion molecules along branching processes // Joint Meeting of ISN and ESN. - St. Petersburg (Russia). - Journal of Neurochemistry. - N71 (Supplement). - 1998. - P. S66B.

4.Ситник В.Н., Корогод С.М. Спричинена геометрією нерівномірність розподілу молекул клітинної адгезії уздовж розгалужених відростків // Тези доповідей ІІ з'їзду Українського біофізичного товариства. - Харків (Україна). - 1998. - С. 148.

5.Sytnyk V.N., Korogod S.M., Schachner M., Dityatev A.E. Non-uniform distribution and transport of the neural cell adhesion molecule (NCAM) along growing neurites // Sixth joint meeting of the American Society for Cell Biology and European Molecular Biology Organization on Membrane trafficking and the cytoskeleton: An integrated view. - Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (Italy) - 1999. - P. 67.

6.Sytnyk V.N., Korogod S.M., Schachner M., and Dityatev A.E.. (1999) Non-uniform distribution of surface neural cell adhesion molecule (NCAM) along growing neurites: inferences about mechanisms of its transport // Joint Meeting of ISN and ESN. - Berlin (Germany). - Journal of Neurochemistry. - N 73 (Supplement). - P. S60D.

АНОТАЦІЯ

Ситник В.М. Вплив транспортних механізмів на поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії в нейритах на ранніх етапах розвитку у культурі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. - Київ. - 2001.

Дисертацію присвячено вивченню впливу механізмів транспорту молекул клітинної адгезії на поверхневий розподіл даних молекул у нейритах.

Доведено, що на ранніх етапах розвитку нейронів поверхневий розподіл молекул клітинної адгезії включає принаймні два компоненти.

Перший обумовлюється дифузійним перерозподілом молекул клітинної адгезії з місць вбудовування молекул у плазматичну мембрану, що розташовані у конусі росту і сомі нейрона, у центральну частину нейриту.

Даний компонент розподілу описується як експоненціальне згасання поверхневої щільності молекул у напрямку від конуса росту і соми до центральної частини відростка.

Другий компонент обумовлюється активним перерозподілом кластерів молекул клітинної адгезії, асоційованих із внутрішньоклітинними органелами.

Обидва типи латерального перерозподілу молекул клітинної адгезії є функціонально важливими.

Встановлено, що у випадку розгалуженого відростка дифузійний механізм перерозподілу молекул клітинної адгезії може визначати формування градієнтів їх поверхневої щільності у дочірніх гілках, що сприяють чи, навпаки, перешкоджають зростанню останніх.

Активний транспорт кластерів молекул клітинної адгезії, асоційованих із везикулярними органелами, забезпечує накопичення даних молекул в місцях міжклітинних контактів, що може сприяти стабілізації їх структури та накопиченню органел в місці контакту.

Ключові слова: молекули клітинної адгезії, нейрон, транспорт, дифузія, органели.

АННОТАЦИЯ

Сытник В.Н. Влияние транспортных механизмов на поверхностное распределение молекул клеточной адгезии в нейритах на ранних этапах развития в культуре. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. О.О. Богомольца НАН Украины. - Киев. - 2001.

Диссертация посвящена вопросам влияния механизмов транспорта молекул клеточной адгезии на их поверхностное распределение в нейритах. Показано, что на ранних этапах развития нейронов молекулы клеточной адгезии имеют характерное неравномерное распределение вдоль нейритов.

Плотность молекул клеточной адгезии наиболее велика в области сомы и конуса роста нейрита и спадает в направлении промежуточных участков. Наблюдаются также кластеры данных молекул, расположенные нерегулярным образом по всему нейриту.

Методами иммуноцитохимии и цитохимии в комбинации с конфокальной и видеомикроскопией было установлено, что данное поверхностное распределение молекул клеточной адгезии включает в себя по крайней мере два компонента, обусловленных двумя различными механизмами перераспределения белков плазматической мембраны. Первый компонент представляет собой экспоненциальное убывание поверхностной плотности данных молекул в направлении от конуса роста и сомы к центральной части отростка.

Данный компонент описывается математической моделью диффузионного перераспределения молекул клеточной адгезии из мест встраивания, которыми является конус роста и сома нейрона, в центральную часть нейрита. Второй компонент обусловливается активным перераспределением кластеров молекул клеточной адгезии, ассоциированных с клеточными органеллами. Эти кластеры быстро скачкообразно перемещаются вдоль нейрита, при этом скорость движения кластера в момент скачка может достигать 0,5 мкм в секунду. В данной работе установлено, что описанные типы поверхностного перераспределения молекул клеточной адгезии выполняют две различные функции. Диффузия молекул клеточной адгезии обуславливает формирование градиентов их поверхностной плотности.

В случае разветвленного отростка знак этих градиентов в дочерних ветвях зависит от геометрических параметров ветвления и способа распределения внутриклеточных транспортных потоков между дочерними ветвями, т.е. от типа внутриклеточного транспорта.

Поверхностная плотность молекул клеточной адгезии возрастает в направлении конуса роста вдоль обеих дочерних ветвей, либо только вдоль одной из них, уменьшаясь при этом вдоль другой. Данное распределение молекул клеточной адгезии, соответственно, способствовует росту обеих или только одной ветви.

Активное перераспределение кластеров молекул клеточной адгезии выполняет другую функцию. Показано, что активный транспорт кластеров молекул клеточной адгезии способствует быстрому накоплению последних в местах межклеточных контактов, что может быть условием стабилизации их структуры, а также условием стабилизации в области контактов клеточных органелл.

Ключевые слова: молекулы клеточной адгезии, нейрон, транспорт, диффузия, органеллы.

ANNOTATION

Sytnyk V.N. Influence of the trafficking mechanisms on the surface distribution of cell adhesion molecules in neurites at early stages of the development in culture. - Manuscript.

Thesis for candidate of science degree by speciality 03.00.02 - Biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Science of Ukraine. - Kyiv. - 2001.

The dissertation investigates the influence of trafficking of cell adhesion molecules belonging to the immunoglobuline family on the surface distribution of these molecules in neurites of hippocampal neurons in culture. It was shown that at the early stages of neuronal development the surface distribution of the cell adhesion molecules includes at least two components. The first is formed due to diffusive redistribution of the cell adhesion molecules from the growth cone and soma of the neuron to the central part of the neurite and is charachterized by exponential decay of the surface density of the molecules in the direction from the growth cone and soma towards the central region of the neurite. The second component is represented by the clusters of cell adhesion molecules associated with intracellular organelles which move actively and rapidly along the neurites. Both types of lateral trafficking of the cell adhesion molecules in the plasma membrane could be functionally important. It is shown that in the case of the branching neurite diffusion can lead to the formation of the gradients of the cell adhesion molecule surface density in the daughter branches that could promote or retard growth of the daughter branches. Active transport of the clusters of the cell adhesion molecules led to accumulation of these molecules at the sites of intercellular contacts that could promote stabilization of the contact structure and accumulation of intracellular organelles at contact sites.

Key words: cell adhesion molecules, neuron, transport, diffusion, organelles.

Размещено на Allbest.ru