Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

УДК 619:578.828:57.08

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

РОЗРОБКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

ДЛЯ РАННЬОЇ ДЕТЕКЦІЇ ВІРУСУ ЛЕЙКОЗУ

ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

ТА ВИЗНАЧЕННЯ СТАТІ ПРЕІМПЛАНТАЦІЙНИХ ЕМБРІОНІВ

03.00.20 - біотехнологія

Лиманська Ольга Юріївна

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії повільних інфекцій Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків.

Науковий керівник:

доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Фукс Поліна Павлівна, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків, директор.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Малюта Станіслав Станіславович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, зав. відділу молекулярної генетики;

доктор біологічних наук, професор Горбатенко Ігор Юрійович, Херсонський педагогічний університет, м. Херсон, зав. біотехнологічного центру.

Провідна установа:

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “ 29 ” травня 2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 19 квітня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одними із важливих завдань сучасної біотехнології в галузі тваринництва і ветеринарної медицини є створення ефективної технології отримання тварин iз заданними властивостями, розробка методів ранньої діагностики інфекційних та спадкових захво-рювань. Нині для вирішення цих завдань використовують молекулярно-генетичні методи, які ба-зуються на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). При цьому у більшості досліджень констру-ювання праймерів - основних компонентів ПЛР-тест-систем, які визначають їх специфічність, точність і надійність, - здійснюється або на основі проведення множинного вирівнювання без ура-хування термодинамічних характеристик праймерів, або на основі знання послідовності тільки одного ізоляту. Такий підхід до створення ПЛР-праймерів призводить до зростання кількості помилково негативних і помилково позитивних результатів ПЛР-аналізу.

Вирішення проблеми регуляції статі в потомстві сільськогосподарських тварин має не тільки науково-теоретичне, але і практичне значення як для товарного, так і для племінного тварин-ництва. Це пов'язано з необхідністю отримувати у молочних комплексах більшу кількість телиць, а у м'ясному скотарстві - більшу кількість бичків. У зв'язку з цим актуальним є створення високо-ефективних тест-систем для визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин.

При масовому скринінгу у лабораторній діагностиці вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛ ВРХ) найширше використовують імуноферментний аналіз (ІФА) та реакцію імунодифузії в агарі (РІД). Однак ці методи аналізу мають ряд істотних недоліків. По-перше, це недостатньо ви-сока специфічність і чутливість. По-друге, неможливість детектувати вірус лейкозу у скритій фор-мі у молодих тварин протягом 6-12 місяців після народження, які народилися від серопозитивних корів. По-третє, тварини, які інфіковані ВЛ, з низьким або змінним рівнем антитіл чи взагалі без антитіл, специфічних до ВЛ, за допомогою цих методів важко або неможливо ідентифікувати як інфіковані ВЛ ВРХ. В той же час ці тварини можуть бути джерелом розповсюдження інфекції. То-му актуальним є створення високоспецифічних тест-систем, які дозволяють здійснювати раннє виявлення ВЛ ВРХ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота пов'я-зана з плановою тематикою лабораторії повільних інфекцій Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН “Удосконалити методи діагностики та створити засоби вакцин-ної профілактики лейкозу великої рогатої худоби“ (1997-2000 рр., № держреєстрації 0197V000756) та науково-технічною програмою Української академії аграрних наук “Ветеринарне забезпечення” - Системи захисту сільськогосподарських тварин від захворювань та створення нових лікувально-профілактичних засобів (1996-2000 рр., № держреєстрації 03.04-МВ/19-96). Автор є одним із відповідальних виконавців молекулярно-біологічної частини програм, співавтором розроблених та запатентованих тест-систем для детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби та визначення статі ембріонів.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження була розробка молекулярно-генетичних тест-систем для ранньої детекції ВЛ ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, а також для визначення статі преімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин шляхом детекції Y-специфічного SRY-гена та їх мультилокусного аналізу.

Об'єктом дослідження є широко розповсюджене у світі захворювання великої рогатої худоби - лейкоз та тварини із заданими ознаками - трансгенні тварини.

Предмет дослідження - молекулярно-генетичні тест-системи для раннього виявлення інфек-ційного збудника лейкозу, а також для детекції статі преімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин.

Зважаючи на існуючий стан проблеми, передбачалось вирішення таких завдань:

Створення систем праймерів зі 100 %-им рівнем специфічності для здійснення ранньої детекції провірусної ДНК ВЛ ВРХ за допомогою ПЛР та теоретичне порівняння з існуючими ПЛР-тест-системами.

Розробка системи праймерів зі 100 %-им рівнем специфічності для проведення ПЛР для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби.

Розробка універсальної системи праймерів для визначення статі ембріонів сіль-ськогосподарських тварин - великої рогатої худоби, вівці, кози та свині.

Розробка критеріїв якості та методів оцінки ПЛР-тест-систем для молекулярно-генетичних досліджень.

Експериментальне випробування створених систем праймерів для проведення однораундової та двораундової ПЛР-детекції ДНК провірусу лейкозу ВРХ та визначення ста-ті преімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби.

Експериментальне порівняння створених та існуючих тест-систем для ПЛР-детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби.

Створення тест-системи для мультиплексної ПЛР-детекції у геномі преімплантаційних ембріонів вірусу лейкозу та визначення статі преімплантаційних ембріонів.

У роботі використані сучасні молекулярно-генетичні та біологічні методи досліджень нуклеїнових кислот, а також теоретичний аналіз секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот із баз даних EMBL, GenBank, DDBJ.

Для ампліфікації та детекції фрагментів генів використовували полімеразну ланцюгову реакцію та електрофорез в агарозному гелі. Для виділення лімфоцитів із периферичної крові використовували центрифугування у градієнті густини. Для рестрикції нуклеїнових кислот та їх наступної очистки застосовували ферментативну обробку рестриктазами, очистку з органічними роз-чинниками та рідинну хроматографію. Вимірювання концентрації нуклеозидтрифосфатів та ДНК виконували за допомогою УФ-спектроскопії. Комп'ютерний аналіз (множинне вирівнювання, ста-тистичний аналіз множинного вирівнювання, швидкий пошук гомології за базою даних, пошук функціональних сайтів, філогенетичний аналіз та побудова вторинної структури амплікону) було проведено за допомогою ліцензійного пакету прикладних програм для молекулярної біології GeneBee. Для відбору системи праймерів з урахуванням їх термодинамічних характеристик використовували комп'ютерний аналіз за допомогою програми Oligo.

Наукова новизна одержаних результатів. Всі наведені в роботі дані одержані автором вперше.

Показано, що ключовим параметром, який визначає специфічність, точність і надійність ПЛР-аналізу, є ступінь гомології праймерів.

Для існуючих ізолятів ВЛ ВРХ виявлено висококонсервативні фрагменти гена env зі 100 %-им рівнем специфічності.

Створено нову тест-систему для ПЛР з наборами праймерів для гена env, які характеризу-ються 100 %-им рівнем специфічності та дозволяють здійснювати раннє виявлення ВЛ ВРХ з точ-ністю, наближеною до 100 %.

Розроблено та випробовано систему ПЛР-праймерів для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби зі 100 %-ою специфічністю на основі Y-специфічного гена SRY.

Для вирішення проблеми регуляції статі в потомстві сільськогосподарських тварин сконструйовано універсальну систему ПЛР-праймерів, яка дає змогу визначати стать преімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби, кози, вівці зі 100 %-ою специфічністю, а ембріонів свині - з 96 %-ою специфічністю.

Створено та випробовано системи праймерів для проведення однораундової та двораундової ПЛР-детекції ВЛ ВРХ та визначення статі.

Запропоновано тест-систему для мультиплексної ПЛР-детекції вірусу лейкозу в геномі пре-імплантаційних ембріонів та визначення статі ембріонів. лейкоз вірус худоба детекція

Проведено теоретичне та експериментальне порівняння створених ПЛР-тест-систем для детекції ВЛ ВРХ та визначення статі великої рогатої худоби з існуючими. Показано, що створені набори праймерів характеризуються більш високою специфічністю, а отже, і точністю на відміну від тих, що використовуються у біотехнологічній практиці та ветеринарній медицині.

На основі гена -лактальбуміну створено систему праймерів для внутрішнього контролю ампліфікації, яка може бути використана при проведенні ПЛР-аналізу геному не тільки ВРХ, а й кози.

Практичне значення одержаних результатів. В Україні останнім часом, незважаючи на вжиті заходи, актуальною залишається проблема боротьби (діагностики, профілактики, лікування) з лейкозом великої рогатої худоби та іншими повільними інфекціями сільськогосподарських тварин. У країнах із високим рівнем розвитку тваринництва та репродуктивної біотехнології існу-ють наукові програми з викоренення розповсюджених небезпечних інфекційних захворювань. В основі таких програм лежать молекулярно-біологічні методи раннього виявлення інфекційних збудників - етіологічних агентів цих захворювань.

Розроблені у даній роботі молекулярно-генетичні тест-системи для детекції ВЛ ВРХ за до-помогою сучасного методу аналізу - полімеразної ланцюгової реакції - є науковою основою такої програми ліквідації лейкозу в Україні.

В той же час розроблені підходи можуть бути з успіхом використані при створенні тест-систем для ПЛР-детекції будь-яких інфекційних захворювань вірусної, бактеріальної, грибкової етіології, в тому числі і для виявлення таких нових для України збудників повільних інфекцій, як, наприклад, вірус імунодефіциту великої рогатої худоби.

Розроблені тест-системи для ПЛР-детекції ВЛ ВРХ дозволяють вирішити проблему ство-рення методу раннього виявлення сільськогосподарських тварин, інфікованих ВЛ, тобто тварин-вірусоносіїв із низьким рівнем або без антитіл до ВЛ ВРХ, які можуть бути джерелом розповсюдження інфекції і не можуть бути виявлені традиційними методами діагностики - реакцією імунодифузії та імуноферментним аналізом.

Конструювання тест-системи для визначення статі преімплантаційних ембріонів сіль-ськогосподарських тварин є першим кроком у створенні в Україні трансгенних тварин із заданими ознаками.

Застосування серологічних методів діагностики лейкозу разом із профілактичними захода-ми дозволяє значно зменшити ступінь ураженості господарств лейкозом і навіть ліквідувати його. Однак тривалі спостереження показують, що через 3-4 роки після оздоровлення стад у деяких із них знову з'являються хворі тварини, тобто оздоровчі заходи не закінчуються повним викорі-нюванням захворювання. Зважаючи на це, отримані результати можуть бути використані при проведенні заходів із повного викорінювання лейкозу в тваринницьких господарствах України внаслі-док раннього виявлення тварин-носіїв ВЛ ВРХ, які принципово не можуть бути детектовані традиційними методами детекції, а також на завершальному етапі при проведенні робіт із оздоровлення господарств від лейкозу. Впровадження полімеразної ланцюгової реакції як методу ранньої моле-кулярної діагностики в практику і використання запропонованих тест-систем дозволить істотно підвищити якість і надійність кінцевих результатів. Сконструйована універсальна система прай-мерів для визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин може знайти застосування при вирішенні проблеми довільної регуляції статі в племінному скотарстві, створенні стад маточного поголів'я, а також при трансплантації ембріонів, їх клонуванні, генній трансформації. Результати дисертаційної роботи використовують у Харківському НДІ мікробіології та імунології ім. І.І. Меч-никова у формі рекомендацій та розроблених методик.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто було проведено аналітичний огляд лі-тературних даних та отримано експериментальні результати, наведені в рукопису. Теоретичні результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні комп'ютерного аналізу. Обговорення та аналіз результатів проведено спільно з науковим керівником. Ди-сертаційну роботу виконано у тісному співробітництві з академіком УААН, д.в.н. Бусолом В.О. (Національний аграрний університет, м. Київ); д. с.-г. н., професором Безуглим М.Д. (Інститут тваринництва, м. Харків); к.б.н. Лиманським О.П. (НДІ мікробіології та імунології ім. І.І. Меч-никова, м. Харків), з якими автор має спільні публікації.

Автор висловлює щиру подяку академікові УААН, д.в.н., професорові Фукс П.П. за постійну підтримку, плідне обговорення та корисні зауваження.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (м. Харків, 1997); на науково-практичному семінарі “Лабораторна ветеринарна медици-на: фізико-хімічні методи досліджень” (м. Рівне, 1998); на ІІ Міжнародній конференції “Вико-ристання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (м. Одеса, 1998); на 32-ій щорічній конференції товариства із вивчення відтворення (Society for Study of Reproduction) (м. Вашингтон, США, 1999); на ІІІ Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях ” (м. Одеса, 1999); на Всеукраїнському семінарі-нараді “Стан реалізації ос-новних заходів щодо оздоровлення великої рогатої худоби від лейкозу в господарствах України на 1996-2000 рр.” (м. Полтава, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 роботи у фахових наукових журналах, 4 - у журналах і збірниках наукових праць та тези 3 доповідей, отримано два рішення про видачу патентів.

Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 120 сторінках машинописного тексту та оформлено у відповідності з вимогами ВАК України. Вона складається із переліку умовних позначень, символів, одиниць, скорочень і термінів, вступу, п'яти розділів, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 172 найменування, додатків. Дисертацію проілюстровано 15 рисунками та 19 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Для аналізу секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот із баз даних EMBL та GenBank використовували пакет прикладних програм GeneBee. Необхідні для створення ПЛР-тест-систем швидкий пошук гомологій по банках, множинне вирівнювання з наступним статистичним аналізом виконували за допомогою модулів Quick Search, Ma-Tools і Statalign пакету GeneBee. Для відбору ПЛР-праймерів з урахуванням їх термодинамічних характеристик застосовували програму Oligo. Для одержання інформації про схожість послідовностей фрагментів генів, з точки зору еволюційного розвитку, відповідних видів тварин були сконструйовані філогенетичні дерева з використанням модуля Tree пакету GeneBee. Клінічним матеріалом для ПЛР були:

1) зразки периферичної крові ВРХ та овець, експериментально інфікованих вірусом лейкозу, а також зразки крові ВРХ з господарств Харківської області;

2) 7-8-денні ембріони ВРХ. Амплі-фікацію проводили з використанням ПЛР з гарячим стартом. Для візуалізації продуктів ампліфікації застосовували метод горизонтального електрофорезу в агарозному гелі.

Як маркер молекулярної ваги використовували ДНК бактеріофага , оброблену рестриктазами Hind III, EcoRV та EcoRI. Як позитивний контроль при детекції ВЛ ВРХ використовували культуру клітин нирки ембріонів вівці, інфіковану ВЛ ВРХ, а також плазміду pBLV344, яка містила провірусну ДНК вірусу лейкозу ВРХ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Детекція вірусу лейкозу великої рогатої худоби

Головною проблемою розробки методів детекції ретровірусів, заснованих на ПЛР, є висока мінливість генетичного матеріалу інфекційних агентів, зокрема вірусів, а також необхідність визначення консервативних послідовностей у його структурних або регуляторних генах і вдалий підбір праймерів до них.

Оскільки праймери є ключовими елементами, які визначають спецфічність, чутливість, точність та надійність ПЛР, було удосконалено основні принципи створення наборів праймерів для ПЛР-детекції:

Праймери повинні обмежувати фрагмент нуклеїнової кислоти довжиною не менше ста пар основ, що пов'язано з подальшою візуалізацією ампліфікованого фрагмента за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Необхідність збільшення довжини праймера з метою підвищення специфічності ПЛР, а отже, точності та надійності аналізу.

Ступінь гомології праймерів повинен бути максимально високим, внаслідок чого буде знижено відсоток помилково позитивних та помилково негативних результатів ПЛР-аналізу.

Вибір оптимальної температури плавлення (і отже, температури відпалу) праймера з урахуванням ступеня гомології з метою запобігання появи додаткових ампліконів.

Відсутність у праймерів та у продуктів ПЛР самокомплементарних ділянок і комплементарних фрагментів між праймерами.

6. Необхідність внутрішнього контролю ампліфікації.

Першим етапом створення системи праймерів для ПЛР-детекції ВЛ ВРХ був пошук консер-вативних ділянок у геномах ізолятів ВЛ із високим ступенем гомології. Для комп'ютерного аналізу було створено підбазу гена env відомих ізолятів ВЛ ВРХ із баз даних EMBL та GenBank. Знайдено оптимальні параметри пошуку мотивів та множинного вирівнювання для восьми і більше фрагментів гена env з метою виявлення висококонсервативних ділянок зі 100 %-им рівнем гомології.

Термін “100 % рівень гомології” тут і далі означає, що для всіх відомих ізолятів (тобто для тих, які присутні у базах даних EMBL, GenBank, DDBJ) на момент проведення комп'ютерного аналізу ступінь гомології дорівнює 100 %. В той же час є вірогідність, що існують варіанти ВЛ ВРХ, секвенс яких невідомий, або з часом буде секвеновано ізоляти гена env ВЛ ВРХ, для яких ступінь гомології визначених нами фрагментів гена env буде меншим, ніж 100 %.

На другому етапі за допомогою програми Oligo з цих висококонсервативних фрагментів ге-на env методом ітерацій були визначені праймери BLV1-4, послідовності яких наведено у табл. 1. Усі праймери BLV1-4 мають 100 %-ий ступінь гомології, і отже, 100 %-ву специфічність, що обумовлює надзвичайно високу точність та чутливість ПЛР при її використанні для детекції ін-фекційних збудників. Праймери BLV1-4 було сконструйовано з урахуванням можливості проведення гніздової ПЛР.

Аналіз температур плавлення праймерів показав, що наявність одного помилкового (неспареного) нуклеотида у комплексі праймер-однонитковий продукт ПЛР призводить до зниження температури відпалу Тan приблизно на 4 ^оС, двох неспарених нуклеотидів - на 8 ^оС і т.д. З експе-риментальних досліджень плавлення нуклеїнових кислот відомо, що ширина плавлення Т корот-ких олігонуклеотидів довжиною 20-40 нуклеотидів (якими є праймери для ПЛР-детекції) становить ~ 10 ^оС. Це означає, що праймер буде відпалюватися на ампліконі, і продукт реакції буде синтезуватися за умови правильного вибору Тan за наявності не більше двох неспарених нуклеотидів у комплексі праймер-однонитковий амплікон.

Таблиця 1

Послідовності сконструйованих нами праймерів для детекції ДНК провірусу лейкозу ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Набір праймерів SRY1-4 для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби, вівці, кози та свині

Для апробаціїї сконструйованих праймерів SRY1-4 на першому етапі було використано лімфоцити периферичної крові ВРХ, а на другому етапі - 10 ембріонів ВРХ та їх біоптати. Розроблені праймери дозволили правильно визначити стать всіх досліджених тварин.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено нове вирішення проблем раннього виявлення збудника лейкозу великої рогатої худоби та визначення статі преімплантаційних ембріонів шляхом створення високоспецифічних молекулярно-генетичних тест-систем. Існуючі в Україні серологічні та імунологічні методи детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби дозволяють детектувати ВЛ ВРХ у тварин на стадії синтезу антитіл до вірусних антигенів, починаючи тільки з шести-дванадцяти місяців. В той же час за допомогою цих методів неможливо здійснювати раннє виявлення тварин-носіїв ВЛ ВРХ із скритим (латентним) характером вірусоносійства. Тривалі спостереження за тваринницькими господарствами протягом 3-4 років показують, що за допомогою існуючих в Україні традиційних профілактичних заходів та методів боротьби з лейкозом великої рогатої худоби неможливо повністю викоренити це захворювання. Як правило, відокремлення РІД-позитивних тварин, вакцинопрофілактика призводять до тимчасового покращення показників стада щодо вірусу лейкозу, і через деякий час у стаді з'являються нові тварини, хворі на лейкоз. З іншого боку, в Україні не існує тест-систем для виявлення інфекційних агентів у спермі биків-плідників, ембріонах, середовищах для культивування ембріонів.

2. Для вирішення проблем раннього виявлення вірусу лейкозу великої рогатої худоби, детекції статі преімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин використано методи полімеразної ланцюгової реакції, комп'ютерного аналізу генів із баз даних секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот.

3. За допомогою комп'ютерного аналізу послідовностей секвенованих ізолятів вірусу лейкозу великої рогатої худоби із баз даних EMBL, GenBank та DDBJ ідентифіковано висококонсервативні та гіперваріабельні ділянки геному ВЛ ВРХ. Визначено фрагменти геному інфекційного агента зі 100 %-им ступенем гомології для існуючих ізолятів.

4. Створено чотири тест-системи для однораундової та одна для двораундової ПЛР-детекції провірусної ДНК ВЛ ВРХ, набори праймерів яких мають 100 %-ий ступінь гомології і характеризуються 100 %-ою специфічністю для всіх відомих ізолятів гена env ВЛ ВРХ. Удосконалено метод ПЛР-аналізу для раннього виявлення тварин-носіїв ВЛ ВРХ, яких неможливо детектувати за допомогою існуючих серологічних методів діагностики.

5. Виявлено висококонсервативні фрагменти Y-специфічного гена SRY головних видів сільськогосподарських тварин: великої рогатої худоби, вівці, кози, свині та коня. Філогенетичний аналіз показав, що SRY-ген свині та особливо коня еволюційно віддалений від SRY-гена тварин родини Bovidae. Зважаючи на це, розроблено універсальну тест-систему для ПЛР-детекції статі преімплантаційних ембріонів ВРХ, вівці, кози та свині. Сконструйовані набори праймерів SRY1-4 характеризуються 100 %-ою специфічністю для детекції статі ембріонів ВРХ, вівці, кози та 96 %-ою специфічністю для детекції статі ембріонів свині.

6. Розроблені набори праймерів SRY1-4 можна використовувати для проведення стандартного варіанту гніздової ПЛР, а також як чотири незалежні набори праймерів для однораундової ПЛР-детекції статі. Створені пари праймерів дозволили правильно визначити стать усіх досліджених тварин.

7. Теоретичне та експериментальне порівняння створених та існуючих ПЛР-тест-систем для детекції ВЛ ВРХ показало, що всі створені набори праймерів мають більш високий ступінь гомології (100 % для всіх відомих ізолятів), а отже, більш високі специфічність та чутливість на відміну від існуючих аналогів.

8. Удосконалено критерії якості та оцінки існуючих ПЛР-тест-систем для молекулярно-генетичних досліджень. Показано, що ступінь гомології праймерів є ключовим параметром, який визначає специфічність, чутливість і точність ПЛР-аналізу. В той же час доведено необхідність при конструюванні праймерів брати до уваги можливість утворення вторинної структури однонитковим ампліконом.

9. За допомогою аналізу механізму процесів денатурації-ренатурації ДНК удосконалено принципи конструювання молекулярно-генетичних тест-систем для ПЛР-аналізу.

10. На основі розроблених праймерів для детекції статі та виявлення ВЛ ВРХ створено тест-систему для мультиплексної ПЛР, тобто одночасної ідентифікації статі та виявлення ВЛ ВРХ у геномі преімплантаційних ембріонів.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації:

1. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Нехороших Е.М., Бусол В.А., Цымбал В.И. Детекция вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием полимеразной цепной реакции // Вісник аграрної науки. - 1999. - № 9. - С. 35-39.

2. O. Limanskaya, A. Limansky. Universal test-system for PCR sexing of cattle, sheep, goat and pig embryos // Journal Biology of Reproduction. - 1999. - Vol. 60, Suppl. 1. - P. 195.

3. Лиманська О.Ю., Лиманський О.П. Тест-система для генотипування ембріонів великої рогатої худоби // Биологический вестник. - 1999. - Т. 3, № 1-2. - С. 102-106.

4. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Безуглый Н.Д. Определение пола преимплантационных эмбрионов сельскохозяйственных животных с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. - 2000. - № 2. - С. 66-72.

5. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Ветеринария. - 1999. - № 6. - С. 27-32.

6. Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Безуглый Н.Д. Конструирование ПЦР-тест-системы для определения пола эмбрионов сельскохозяйственных животных // Науково-технічний бюллетень Інституту тваринництва. - 1999. - № 75. - C. 160-165.

7. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Ветеринарна медицина. - 1998. - вып. 74. - С. 35-44.

8. Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. Тест-система для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота полимеразной цепной реакцией // Збірник матеріалів міжнародної науково-практичної конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобут ки та проблеми”. - Харків (Україна). - 1997. - С. 108-112.

9. Бабкин В.Ф., Бусол В.А., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Цымбал В.И. ПЦР-детекция вируса лейкоза крупного рогатого скота // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”. - Одеса (Україна). - 1998. - С. 75-77.

10. Бабкин В.Ф., Лиманская О.Ю., Лиманский А.П., Нехороших Е.М., Безуглый Н.Д. Определение пола эмбрионов сельскохозяйственных животных // Збірник матеріалів ІІ Міжнародної конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”. - Одеса (Україна). - 1998. - С. 77-78.

11. Лиманская О.Ю. Полимеразная цепная реакция в ветеринарной медицине // Науково-практичний семінар “Лабораторна ветеринарна медицина: фізико-хімічні методи досліджень”. - Рівне (Україна). - 1998. - С. 138-148.

АНОТАЦІЇ

Лиманська О.Ю. Розробка молекулярно-генетичних тест-систем для ранньої детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби та визначення статі преімплантаційних ембріонів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено проблемі створення молекулярно-генетичних тест-систем для ранньої детекції збудників інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин та детекції статі преімплантаційних ембріонів. Удосконалено основні критерії оцінки тест-систем для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та принципи конструювання праймерів. Показано, що ключовим параметром, який визначає специфічність і точність ПЛР-аналізу, є ступінь гомології праймерів. Сконструйовано набори праймерів для ранньої детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби на основі множинного вирівнювання послідовностей env гена відомих ізолятів із баз даних EMBL/GenBank та термодинамічного аналізу праймерів та ампліконів. За допомогою теоретичного та експеримен-тального порівняння створених та існуючих наборів праймерів показано, що сконструйовані прай-мери мають більш високі специфічність і точність порівняно з існуючими аналогами. Створено універсальну ПЛР-тест-систему для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби, вівці, кози та свині.

Ключові слова: детекція статі, ембріон, множинне вирівнювання, ступінь гомології, SRY-ген, ген env, амплікон, лейкоз, провірусна ДНК.

Лиманская О.Ю. Разработка молекулярно-генетических тест-систем для ранней детекции вируса лейкоза крупного рогатого скота и определения пола преимплантационных эмбрионов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена проблеме конструирования молекулярно-генетических тест-систем для ранней детекции возбудителей инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и определения пола преимплантационных эмбрионов. В обзоре литературы приведены общие сведе-ния о медленных инфекциях сельскохозяйственных животных, к числу которых относится лейкоз крупного рогатого скота (КРС). Дан сравнительный анализ серологических и молекулярно-генети-ческих методов детекции вируса лейкоза (ВЛ) КРС, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Рассмотрены принципы, механизм, различные модификации и основные характе-ристики ПЦР. Изложены преимущества и возможности использования метода ПЦР при решении биотехнологических задач в области ветеринарной медицины и животноводства. Дана характерис-тика различных методов детекции пола эмбрионов, а также генов, ответственных за образование мужского пола организма.

Проведен сравнительный анализ тест-систем, основанных на ПЦР-детекции Y-специфических генов SOX, SRY и аллель-специфических генов ZFX/ZFY, для определения пола преимплантационных эмбрионов сельскохозяйственных животных. Усовершенствова-ны основные принципы конструирования тест-систем для ПЦР. Показано, что ключевым параметром, определяющим надежность, точность и специфичность ПЦР-анализа, является степень гомо-логии праймеров. Сконструированы наборы праймеров BLV1-4 для ранней детекции ВЛ КРС на основе проведения множественного выравнивания секвенированных последовательностей гена env различных изолятов ВЛ КРС из баз данных EMBL/GenBank и последующего статистического анализа с учетом термодинамических характеристик праймеров. Построены теоретические профили плавления праймеров BLV1-4, определены их температуры плавления и, следовательно, температуры отжига с учетом ионной силы реакционной смеси. Продемонстрирована зависимость тем-ператур отжига праймеров от степени гомологии. Показано, что наличие каждого “ошибочного” (неспаренного) основания в комплексе праймер-продукт ПЦР приводит к понижению температуры отжига праймера на ~ 4 ^оС. Поскольку ширина плавления олигонуклеотидов длиной 20-30 нуклеотидов составляет 8-10 ^оС, в случае двух и более некомплементарных нуклеотидов затруднен отжиг праймера на ампликоне. Это может приводить к ложноотрицательному результату анализа. На основе проведения компьютерного анализа с возрастающим количеством известных секвенсов гена env по мере поступления информации о новых изолятах ВЛ КРС в базы данных EMBL и GenBank доказаны достоверность и корректность выбора праймеров. Показано, что четыре на-бора праймеров, образованные комбинацией олигонуклеотидов BLV1-4, можно использовать как четыре независимые тест-системы для выявления ВЛ КРС с помощью однораундовой, а также двухраундовой ПЦР. Проведено теоретическое и экспериментальное сравнение сконструирован-ных и существующих наборов праймеров для детекции ВЛ КРС. Показано, что праймеры BLV1-4 имеют более высокую степень гомологии (100 % для всех известных изолятов ВЛ КРС) и, следовательно, более высокую точность в отличие от существующих. Обоснована необходимость выбора праймеров из консервативных фрагментов генома вируса лейкоза с высокой степенью гомологии. Изучено влияние неспецифических комплексов, которые могут образоваться между праймером и ампликоном, а также возможных вторичных структур ампликона на результат ПЦР-ана-лиза. Проведена оптимизация параметров ПЦР для детекции ВЛ. На основе компьютерного анали-за изолятов гена -лактальбумина КРС разработана тест-система для внутреннего контроля амп-лификации, которая может быть использована при проведении ПЦР-детекции инфекционных воз-будителей не только КРС, но и коз. Проведен филогенетический анализ изолятов SRY-гена КРС, овцы, козы, свиньи, лошади, а также зубра. Показана их эволюционная близость для КРС, овцы и козы в то время, как SRY-ген свиньи и особенно лошади эволюционно удален от SRY-гена членов семейства Вovidae. В соответствии со сформулированными принципами конструирования праймеров для ПЦР разработана универсальная система праймеров SRY1-4 для определения пола преимплантационных эмбрионов КРС, овцы, козы и свиньи на основе детекции SRY-гена с учетом возможности проведения гнездовой ПЦР. Сконструированные наборы праймеров характеризуются 100 %-ой специфичностью для детекции пола эмбрионов КРС, овцы и козы и 96 %-ой специ-фичностью для детекции пола эмбрионов свиньи. Проведен анализ каждого набора праймеров с точки зрения возможного образования вторичной структуры однонитевым ампликоном в процессе перехода от этапа денатурации ПЦР-продукта к этапу отжига праймера. На основе разработанных праймеров для детекции пола и выявления ВЛ КРС создана тест-система для мультиплексной ПЦР - одновременной идентификации пола и определения провирусной ДНК ВЛ КРС в геноме преим-плантационных эмбрионов. Проведена апробация сконструированных праймеров на лимфоцитах периферической крови КРС. С помощью разработанных праймеров пол всех исследуемых животных был определен правильно. Проведена оптимизация параметров ПЦР для определения пола преимплантационных эмбрионов - определены значения температуры отжига и количество необходимых циклов амплификации при проведении реакции с одним бластомером. Для 30 % исследованных эмбрионов КРС был определен XY-кариотип.

Ключевые слова: детекция пола, эмбрион, множественное выравнивание, степень гомологии, SRY-ген, ген env, ампликон, лейкоз, провирусная ДНК.

Limanskaya O.Yu. Design of molecular genetic test-systems for early detection of bovine leukemia virus and preimplantation embryo sexing. - Manuscript.

Thesis for degree of Philosophy Doctor (Ph. D.) in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics, Kyiv, 2001.

This Ph. D. thesis is devoted to design of molecular genetic test-systems for early detection of farmer animals infectious agents and preimplantation embryo sexing. Polymerase chain reaction (PCR) principles, mechanism, different modifications and main characteristics are considered. Main principles of PCR test-system characterization and primers design are modified. It is shown primers homology degree is a key parameter for PCR effectiveness, accuracy and specificity. Primer sets for early bovine leu-kemia virus (BLV) detection are designed on the basis of multiple alignment of gene env sequences of different BLV isolates from EMBL/GenBank and following thermodynamical analysis of primers and amplicons. Theoretical and experimental comparison of designed and known primer sets for BLV detec-tion is carried out. It is shown designed primers have higher specificity and accuracy than known primers. The universal primer system for preimplantational cattle, sheep, goat and pig embryo sexing is created.

Keywords: sexing, embryo, multiple alignment, homology degree, SRY-gene, gene env, amplicon, leucousis, provirus DNA.

Размещено на Allbest.ru