Получение витаминов и коферментов биотехнологическими методами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Самарский государственный медицинский университет

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат

на тему:

Получение витаминов и коферментов биотехнологическими методами

Исполнитель:

студентка 573 группы фармацевтического факультета

Кудряшова Мария Николаевна

Руководитель:

кандидат фармацевтических наук

Желонкин Николай Николаевич

Самара 2013

Оглавление

Введение

Глава I. Характеристика витаминов и коферментов

1.1 Характеристика витаминов

1.2 Характеристика коферментов

Глава II. Схема биосинтеза витаминов и коферментов

2.1 Схема биосинтеза витамина В ₂

2.2 Схема биосинтеза витамина В₁₂

2.3 Биосинтез аскорбиновой кислоты (витамина С)

2.4 Схема биосинтеза эргостерина и витамина Д

2.5 Схема биосинтеза витамина Н (биотин)

2.6 Примеры получения витаминов методами клеточной биотехнологии

Заключение

Библиографический список

Введение

Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности. Эти технологии базируются на использовании каталитического потенциала различных биологических агентов и систем - микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. В настоящее время разработка и освоение биотехнологии занимают важное место в деятельности практически всех стран. Определить сегодня, что же такое биотехнология, весьма не просто. Вместе с тем, само появление этого термина в нашем словаре глубоко символично. Оно отражает мнение, что применение биотехнологических материалов и принципов в ближайшие годы радикально изменит многие отрасли промышленности и само человеческое общество.

Глава I. Характеристика витаминов и коферментов

1.1 Характеристика витаминов

витамин кофермент биотехнологический метод

Витамины (от лат. vita - жизнь + амины) - низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, абсолютно необходимые для нормальной жизнедеятельности организмов. Витамин являются незаменимыми пищевыми веществами, т.к. за исключением никотиновой кислоты они не синтезируются организмом человека и поступают главным образом в составе продуктов питания. Некоторые витамины могут производиться нормальной микрофлорой кишечника. В отличие от других жизненно важных пищевых веществ витамины не обладают пластическими свойствами и не используются организмом в качестве источника энергии. Участвуя в разнообразных химических превращениях, они оказывают регулирующее влияние на обмен веществ и тем самым обеспечивают нормальное течение практически всех биохимических и физиологических процессов в организме.

1.2 Характеристика коферментов

Коферменты (син. коэнзимы) - органические соединения небелковой природы необходимые для осуществления каталитического действия многих ферментов, соединяясь с белковой частью молекулы фермента - апоферментом, кофермент образует каталитически активный комплекс - холофермент. Прочно связанные с белками коферменты называются простетическими группами. Коферменты могут участвовать в активировании молекул субстрата, образуя с ними реакционно-способные соединения, которые затем подвергаются ферментативному превращению. Некоторые метаболиты, выступающие в ферментативных реакциях как обычные субстраты, в определенных условиях могут играть роль коферментов. Многие коферменты являются производными витаминов и, поэтому нарушение обмена веществ при витаминной недостаточности опосредовано через понижение активности определенных ферментов.

Коферменты, как правило, термостабильны, разнообразны по химическому строению и механизму действия. [2]

Традиционные способы получения витаминов основаны либо на переработке больших количеств ценного сырья, либо (в редком случае) на химическом синтезе, следовательно, витаминная промышленность нуждается в более эффективных технологиях, и такие технологии успешно создаются.

С помощью лишь генетических манипуляций (воздействием на регуляцию метаболизма) были получены штаммы микроорганизмов, которые производят в десятки тысяч раз больше витаминов, чем необходимо для их роста. Это штаммы Ashbya gossypii - продуцент рибофлавина, штаммы Pseudomonas denitrifikans и Propionibacterium freudonreichii, производящие витамин В₁₂ и др. В России на базе бактерий рода Bacillus subtilis сконструирован эффективный продуцент витамина В_2.

Микробиологические технологии позволили решить и задачу производства аскорбиновой кислоты (витамин С). В Японии разработан эффективный ферментативный способ получения стабильного производного витамина С - аскорбил-2-фосфата, который используют в качестве антиоксиданта.

Помимо широкого применения в медицине в качестве профилактических и лечебных средств, получаемые микробиологическим путем витамины В₂ и В₁₂ добавляют в пищу животным для сбалансирования кормов. [4]

Глава II. Схема биосинтеза витаминов и коферментов

2.1 Схема биосинтеза витамина В₂

Витамин В₂(рибофлавин) по химической природе представляет собой азотистое основание: 6,7-диметилизоаллоксазин, соединенное с остатком спирта D-рибита. Рибофлавин содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов.

Рибофлавин химически не устойчив, легко разрушается при кипячении и на свету. Рибофлавин способен легко окисляться и восстанавливаться, что лежит в основе биологического действия этого витамина.

В₂-авитаминоз у человека выражается в остановке роста, выпадении волос, поражении слизистых оболочек, быстрой утомляемости зрения, понижении работоспособности, нарушении нормального синтеза гемоглобина, патологические изменения возникают и в нервной системе.

Получают витамин В₂ из 3,4-диметиланилина и рибозы (химическим способом), а также микробиологическим способом.

Основными продуцентами рибофлавина являются микроорганизмы - это различные виды бактерий, актиномицеты, дрожжевые клетки, причем некоторые из них способны накапливать в культуральной среде до 1 мг/л витамина В_2.

В качестве промышленных продуцентов кормового рибофлавина используют отселектированные штаммы дрожжей Eremothecium ashbyii или штаммы бактерий Candida guilliermondii, Ashbyii gossypii, способные накапливать в культуральной среде 0,5 и более г целевого продукта. Учитывая изменчивость активных продуцентов указанных видов по способности синтезировать витамин В₂, необходим систематический поддерживающий отбор культур в процессе их эксплуатации на производстве. Рибофлавин накапливается в вакуолях дрожжевых клеток и придает культуре характерную желтую окраску. Для производственной ферментации готовятся отдельно жидкая питательная среда и посевной материал культуры дрожжей, выращенной в специальном посевном аппарате (инокуляторе). [7]

Высокий выход рибофлавина у Eremothecium ashbyii коррелирует с азотом пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых должно быть достаточным. В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира). Жидкие питательные среды для получения инокулята и для основной ферментации могут несколько различаться между собой. Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращивания продуцента на этой среде - 2 суток при 27 - 30°С (в зависимости от штамма продуцента). Ферментационная среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид, ненасыщенный жир. Перед подачей в ферментер она подвергается стерилизации.

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5 - 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 ч) начинает заметно накапливаться витамин В₂, вначале - в мицелии, а затем - в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8 %, содержащий 1,5 - 2,5 % рибофлавина, 20 % белка, тиамна, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.

В случае высоких выходных показателей по рибофлавину, витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине.

По другой схеме получение витамина В₂ осуществляют следующим образом. В качестве посевного материала используются споры E.ashbyii, выращенные на пшене. Промытое пшено в течение 30 -35 мин выдерживают в молочной сыворотке для набухания, затем подсушивают и расфасовывают по 50 - 60 г в простерилизованные флаконы. Во флаконах пшено подвергается трехкратной стерилизации, после чего производят его засев водной суспензией спор культуры дрожжей. Флаконы с засеянной культурой в течение 7 - 8 дней инкубируют при 29 - 30 °С, после чего подсушивают в вакуум-сушильной установке и направляют для приготовления жидкого посевного материала, который после стерилизации подается в производственный ферментер.

Культивирование продуцентов рибофлавина проводят при 28 - 30 °С в течение 72 ч. Через каждые 8 ч по мере осуществления процесса ферментации отбирают пробы для контроля за развитием микробных клеток, составом среды и накоплением целевого продукта. Полученная культуральная жидкость по окончании ферментации содержит 1,4 мг/мл рибофлавина.

В целях стабилизации витамина в процессе высушивания культуральная жидкость подкисляется соляной кислотой до рН 4.5 - 5, после чего она концентрируется в вакуум-выпарной установке, производят дополнительную очистку на ионообменной установке; элюат затем выпаривают и полученный концентрат рибофлавина высушивают на распылительной сушилке. [8]

Для Candida guilliermondii важно регулировать содержание железа в питательной среде; оптимальные концентрации колеблются, в среднем, от 0,005 до 0,05 мкг/мл. При этом определенные штаммы дрожжей могут образовывать за 5 - 7 дней до 0,5 г/л и более витамина. Однако для целей промышленного производства рибофлавина предпочитают использовать более продуктивные виды и штаммы грибов - E.ashbyii и Ashbyii gossypii.

2.2 Схема биосинтеза витамина В₁₂

Витамин В₁₂ (цианкобаламин) представлен группой биологически активных веществ, содержащих в своем составе трехвалентный кобальт, аминные и цианистые группировки, которые могут быть замещены другими радикалами: - ОН-, Cl-, Br-.

Витамин В₁₂ хорошо растворим в воде, спиртах, низших органических кислотах жирного ряда и фенолах, но не растворяется в бензоле, хлороформе и ацетоне. На свету он теряет свою активность, но в темноте может храниться долго и представляет собой очень устойчивое вещество. Витамин В₁₂ оптически активен.

Этот витамин стимулирует образование крови в костном мозге, улучшает усвоение белков, участвует в синтезе аминокислот и азотистых оснований. Витамин В₁₂ не содержится в продуктах растительного происхождения, т.е. при недостатке витамина В₁₂ нарушается нормальное кроветворение в костном мозгу, а это в свою очередь приводит к злокачественной анемии, поэтому данный витамин называется антианемическим. Кроме того, при недостатке данного витамина возможно возникновение дегенеративных изменений в нервной ткани. [1]

Цианкобаламин получают только микробиологическим синтезом. Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium shermani М-82 и Pseudomonas denitrificans М-2436 продуцируют на жидкой среде до 58 - 59 мг/л цианкобаламина.

Учитывая важную роль витамина в организме человека, его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуется на медицинские нужды, а 3,5 т - в животноводстве.

Биотехнологическое производство кормовых препаратов витамина В_12.

Для промышленного получения кормовых препаратов витамина В₁₂ выращивается специально подобранный биоценоз микроорганизмов, осуществляющих термофильное метановое брожение, в который входят целлюлозоразлагающие, аммонифицирующие, углеводсбраживающие, сульфитвосстанавливающие и метанообразующие бактерии. На первом этапе ферментации этих микроорганизмов (в течение 10 - 12 дней) наблюдается бурное развитие термофильных аммонифицирующих и углеводсбраживающих бактерий, которое происходит в слабокислой среде (рН 5 - 7). Другие группы бактерий данного биоценоза достигают интенсивного развития при переходе брожения в щелочную среду (рН 7 - 8,5). Преобладающими в этот период являются метанообразующие бактерии, которые синтезируют в 4 - 5 раз больше витамина В₁₂, чем другие микроорганизмы биоценоза. Главные субстраты для развития метанообразующих бактерий - жирные кислоты, низшие спирты, поэтому их добавление в питательную среду значительно увеличивает выход витамина.

Для приготовления питательной среды обычно используют барду ацетоно-бутилового производства, которая декантацией очищается от твердых примесей, в нее добавляется хлорид кобальта (4 г/м³ и 0,5 % метанола).

В процессе промышленного культивирования бактерий вначале выращивают посевной материал (15 - 20 дней) в аппаратах вместимостью 250 м³. Затем посевной материал подают в железобетонные ферментеры вместимостью 4200 м³, в которых происходит метановое брожение. Свежую барду подают в нижнюю часть ферментера в количестве 25 - 30 % от его объема за сутки. Отбор метановой бражки, содержащей витамин В₁₂, производится в верхней части ферментера. В течение рабочего цикла в ферментере строго контролируют рН среды, концентрацию летучих жирных кислот, содержание аммонийного азота, поддерживают оптимальную температуру (55 - 57 °С). В результате брожения образуется газовая смесь, состоящая главным образом из метана (65 %) и диоксида углерода (30 %), которая может быть использована как источник тепла.

Готовая культуральная жидкость, образующаяся как продукт ферментации, обычно содержит 2 - 2,5 % сухих веществ и 1,1 - 1,7 мг/л витамина В₁₂. Для предотвращения разрушения витамина в процессе сушки культуральную жидкость подкисляют соляной или фосфорной кислотой до рН 6,3 - 6,5 и в нее добавляют 0,2 - 0,25 % сульфита натрия.

Полученная таким образом культуральная жидкость дегазируется, упаривается на вакуум-выпарной установке, полученный концентрат высушивают в распылительной сушилке до 5 - 10 %.

Биотехнологическое получение высокоочищенного препарата витамина В_12.

Данный препарат получают микробиологическим способом с помощью стрептомицетов, продуцирующих антибиотики, пропионовокислых или метанобразующих бактерий. Впервые был синтезирован в 1972 г Р.Б. Вудвордом.

Витамин В₁₂ получают путем культивирования Propionobacterium в анаэробных условиях, в периодическом режиме. Питательная среда содержит в своем составе: глюкозу, кукурузный экстракт, соли кобальта, сульфат аммония. рН питательной среды около 7,0, что достигается добавлением гидроксида аммония.

В процессе ферментации выделяются органические кислоты, которые нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Процесс культивирования длителен (продолжительность ферментации 6 суток); спустя 72 ч после начала культивирования в ферментер вносят 5,6-диметилбензимидозол (ДМБ) - предшественник витамина В₁₂, в качестве затравки. Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому по окончании ферментации биомассу отделяют от культуральной жидкости методом сепарации. Витамин В₁₂ экстрагируют из биомассы водой, подкисленной до рН 4,5 - 5 при температуре 85-90°C. Процесс экстракции длится приблизительно 1 ч; в воду вводят стабилизатор - 0,25 % раствор нитрита натрия для предотвращения уменьшения активности витамина. Затем раствор охлаждают, нейтрализуют до рН 6,8 - 7, добавляя гидроксид натрия; добавляют сульфат алюминия и хлорид железа в качестве коагулянтов белков, полученный раствор фильтруют с помощью фильтр-пресса, образующийся при этом фильтрат содержит витамин В_12, очищают с помощью ионообменных смол и после промывки витамин В₁₂ элюируют с ионообменной смолы аммиаком. Для обеспечения более глубокой очистки проводят экстракцию витамина органическими растворителями, после чего упаривают, концентрируют, снова очищают на колонке, заполненной оксидом алюминия, очищают ацетоном и выдерживают 1 - 2 суток при температуре 3 - 4 °C в результате чего выпадают кристаллы витамина В₁₂, их отфильтровывают на холоде, промывают в ацетоне и сушат в экстракторе. [6]

Кристаллический цианкобаламин можно получить с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукаты, которые легко разлагаются на составные компоненты.

2.3 Биосинтез аскорбиновой кислоты (витамина С)

Витамин С - группа соединений - производных L-(+)-гулоновой кислоты. Этот витамин имеется у всех высших растений и животных, только человег и микроорганизмы не синтезируют его, но людям он необходим для жизнедеятельности, тогда как микробы не нуждаются в нем. И, тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты - L-сорбозы. Биологические функции витамина связаны с участием в биосинтезе стероидов, в реакциях гидроксилирования, в частности, в превращении пролина в оксипролин (биосинтез коллагена). При недостатке витамина С нарушается обмен в соединительной ткани, повышается проницаемость капилляров, что ведет к кровоизлияниям и цинге. Основными способами получения данного витамина является выделения из растительного сырья, химический синтез из Д-глюкозы через Д-сорбит, биотехнологический способ (по сути, представляет собой комбинированный химико-ферментативный процесс). [7]

Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвязанной полиолдегидрогеназой, а химическая включает последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон-L-сорбозы, окисление диацетон-L-сорбозы до диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты, подвергаемой затем гидролизу с получением 2-кето-L-гулоновой кислоты; последнюю подвергают энолизации с последующей трансформацией в L-аскорбиновую кислоту.

Ферментацию G. oxydans проводят на средах, содержащих сорбит (20 %), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной аэрации (8 - 10 г О₂/л/ч). Выход L-сорбозы может достичь 98 % за 1 - 2 суток. При достижении культурой лаг-фазы можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25 %. Также установлено, G. oxydans может окислять и более высокие концентрации полиспирта (30 - 50 %), создаваемые на последних стадиях процесса, что происходит благодаря полиолдегидрогеназе, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме. Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в полиакриламидном геле.

Аскорбиновую кислоту используют как антиоксидант в медицине и пищевой промышленности.

2.4 Схема биосинтеза эргостерина и витамина Д

Витамин D(кальцеферол) - группа родственных соединений, обладающих антирахитичным действием, в основе которых находится эргостерин, обнаруженный в клеточных мембранах эукариот. Поэтому, например, пекарские или пивные дрожжи применяют для получения эргостерина, как провитамина, обладающего антирахитическим действием. Содержание эргостерина в дрожжевых клетках в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2 - 11 %.

Витамин D₃образуется на коже под действием ультрафиолетовых лучей и 7-дегидрохолестерина; его физиологически активной формой является 1,25-диоксихолекальцеферол. При недостатке этого витамина у детей развивается рахит, аналог рахита у взрослых - остеомаляция.

Витамин D₂получают при облучении светом дрожжей. Данный витамин получают фотоизомеризацией провитамина - эргостерина и 7-дегидрохолестерина.

Физиологическая активность витаминов D₂ и D₃ равноценна.

Витамины D₂ и D₃не растворимы в воде, но хорошо растворяются в жирах и растворителях жиров. Они оба малостабильны и быстро разрушаются под действием окислителей и минеральных солей.

Промышленными продуцентами эргостерина являются дрожжи и мицелиальные грибы - аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2 - 2,2 % эргостерина. Наибольшее количество эргостерина присутствует в пекарских дрожжах (до 10 %). Обнаружено, что полиеновые антибиотики, действующие на клеточную мембрану дрожжей, заметно стимулируют их содержание в биомассе.

Получение эргостерина в производственных условиях можно подразделить на следующие этапы: размножения исходной культуры и накопление инокулята, ферментация, сепарирование клеток, облучение клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание и упаковка целевого продукта.

Условия образования эргостерина:

Применительно к дрожжам, инокулят получают на средах, обеспечивающих полноценное развитие клеток, после чего основную среду с ацетатом (активатором биосинтеза стеринов), обогащенную источником углерода и содержащую пониженное количество азота, засевают сравнительно большим объемом инокулята. Культивирование дрожжей проводят при температуре, близкой к максимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации (2 % кислорода в газовой фазе). Спустя 3 - 4 суток, в зависимости от ростовых характеристик и биосинтетической активности культуры, клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию. Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами - УФЛ (длина волны 280 - 300 нм) в течение оптимального по продолжительности времени, при требуемой температуре и с учетом примесей. Эти контролируемые показатели, установленные опытным путем, указываются в регламентирующей документации. Облучение дрожжей можно проводить до сепарирования клеток в тонком слое 5 % суспензии, учитывая малую проникающую способность УФЛ.

Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в промышленности их выпускают под названием «кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D₂». В таком препарате содержится не менее 46 % сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 МЕ витамина D_2.

Технология получение витамина D₂

На выход витамина D₂ влияет длительность облучения эргостерина, температура процесса, наличие примесей.

Для производства кристаллического витамина D₂ используют дрожжи или мицеллиальные грибы, которые подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при температуре 110 °C, затем гидролизат обрабатывают спиртом при 75 - 78 °C, после чего охлаждают до температуры 10 - 15 °C и фильтруют. Фильтрат упаривают (до 40 % абсолютно сухого вещества (АСВ)). Используют осадок, содержащий витамин D₂, который промывают, размельчают, дважды обрабатывают при 98 °C трехкратным объемом спирта, образующиеся спиртовые экстракты объединяют и затем сгущают до 70 % АСВ, полученный «липидный концентрат» подвергают омылению гидроксидом натрия. Эргостерин содержится в неомыленной фракции и выпадает в осадок при температуре - 0 °C; затем его растворяют в спирте или бензоле с целью дополнительной очистки. Выпавшие кристаллы сушат в эфире. Чистый препарат эргостерина облучают ультрафиолетовым светом для получения витамина D₂, эфир отгоняют, раствор витамина D₂ концентрируют и кристаллизуют.

«Кислотный фильтрат» обычно упаривают до 50 %-го содержания сухих веществ. Производят также масляный концентрат витамина D_2.

2.5 Схема биосинтеза витамина Н (биотин)

Витамин Н не пользуется такой широкой известностью, как, например, витамины А, С и D, но значение его для всех живых организмов от этого ни чуть не умаляется.

Витамин Н (биотин) - кофактор не менее десяти ферментов, ведущих в клетке синтез многих жизненно необходимых веществ. Это значит, что только в соединении с биотином белковые молекулы ферментов обретают каталитическую активность и получают возможность выполнять свою функцию. В отсутствии этого витамина многие важнейшие для клетки процессы прекращаются.

Человека снабжают определенным количеством биотина микроорганизмы, живущие в кишечнике, кроме того, биотин поступает в организм человека вместе с пищей (особенно много его содержится в яичном желтке, дрожжах и цветной капусте), но при нарушении естественной микрофлоры кишечника, что бывает, например, после длительного приема антибиотиков - производительность ее падает и может возникнуть дефицит биотина. К биотиной недостаточности может привести и употребление в пищу больших количеств сырого яичного белка, т.к. в нем содержится гликопротеин, который жадно присоединяет к себе биотин. В результате образуется прочный комплекс, который не переваривается и не усваивается организмом.

Признаками биотиновой недостаточности у человека являются: пепельно-бледная кожа, атрофия сосочков языка, боли в мышцах, сонливость, потеря аппетита, снижение содержания эритроцитов и холестерина в крови.

У животных дефицит биотина выражается в замедленном росте, появлении дерматитов, депигментации, нарушении роста волос: крысы, например, при недостатке биотина становятся почти голыми. Особенно болезненно реагируют на недостаток биотина свиньи и птицы.

Необходим биотин и некоторым видам микроорганизмов, не способным его самостоятельно вырабатывать. К ним относятся, в частности, Corinebacterium, которая широко используется в микробиологической промышленности для синтеза незаменимой аминокислоты лизина - ценной добавки к кормам.

Следовательно, в потребителях биотина недостатка нет. Промышленного производства этого витамина в нашей стране пока не существует, и поэтому его практическое применение сильно ограниченно.

Добывать биотин из природных источников крайне невыгодно, так как для выделения 1 мг витамина необходимо переработать почти 230 кг сухого яичного желтка. Разработаны и методы химического синтеза биотина, но химики получают всего несколько сотен граммов витамина в год, а потребность в нем в тысячи раз выше. Кроме того, химический синтез дает смесь изомеров, которую потом приходится разделять, чтобы получить активный D-биотин.

Остается еще один путь получения биотина - микробиологический синтез. Основной проблемой при получении биотина данным способом явилось то, что микроорганизмы синтезируют биотин в мизерных количествах. Поэтому вначале исследования были сосредоточены на поиске такого микроорганизма, который по своей производительности годился бы на роль продуцента. Было обследовано множество штаммов плесневых грибов, дрожжей, грибов, актиномицетов. Большинство из них оказались неподходящими продуцентами: бактерии ведут обычно очень экономичный образ жизни, строго контролируют свои затраты и лишнего биотина почти не производят.

Более перспективными оказались грибы, особенно те из них, которые растут на богатых органических субстратах. В конце концов, исследователи остановили свой выбор на грибах рода Rhizopus delemar. Это настоящий «рекордсмен» среди микробов: он образует около 1 мг биотина на 1 л среды и большую его часть выделяет наружу. [1]

Следующая проблема, связанная с получением витамина Н микробиологическим путем - проблема масштабирования.

В ходе отбора продуцентов было обнаружено то, что многие штаммы микроорганизмов активно поглощают биотин из внешней среды, накапливая его в своих клетках. Особенно выделяются в этом отношении дрожжи рода Trichosporon; они отличаются способностью поглощать многие органические, в том числе и ароматические вещества, поэтому их широко используют для очистки сточных вод от различных загрязнений. Даже небольшое их количество за час аккумулировало 60 % биотина, содержащегося в культуральной жидкости, а дорогостоящий процесс концентрирования сильно разбавленного раствора биотина данные дрожжи осуществляли быстро и элегантно. К тому же биомасса их нетоксична и может использоваться как кормовая добавка.

Казалось бы, достаточно насытить дрожжи биотином - проблема создания препарата решена, но все оказалось не так просто. Выяснилось, что дрожжи не только поглощают биотин, но еще и разрушают его, и поэтому часть витамина теряется.

На первый взгляд казалось странным, что в природе существуют организмы, разрушающие столь ценное и достаточно химически стойкое соединение, но позже было установлено, что это вовсе не редкое явление. Одни штаммы разрушают биотин, если получают его слишком много, потому что в высоких концентрациях он может быть для них токсичен; другие используют витамин не по назначению, а как источник углерод и азот. Таким образом, дрожжи рода Trichosporon на роль поглотителя витамина явно не подходили - пришлось продолжить поиск. [5]

Предположили, что более бережно будут относиться к витамину организмы, которые, не синтезируя витамина сами, нуждаются в поступлении его извне (ауксотрофы). Поэтому для этой цели были выбраны метилотрофные дрожжи, которые микробиологическая промышленность выращивает на метаноле, и применяющиеся как белковая добавка к кормам животных. Эти дрожжи поглощают биотин даже лучше, чем дрожжи Trichosporon: 95 % биотина, находящегося в среде, переходит в их клетки всего за 20 - 30 мин и биотин при этом остается в целости и сохранности. Таким образом, метилотрофные дрожжи стали вторым компонентом биотинового препарата.

Схема приготовления препарата:

На оптимизированной по составу питательной среде выращивают грибы рода Rhizopus - продуцент биотина. Биомассу гриба отфильтровывают, а к культуральной жидкости, в которую ризопус выделяет большое количество биотина, добавляют метилотрофные дрожжи, которые за короткое время поглощают почти весь имеющийся в среде витамин. Смесь биомассы ризопуса и дрожжей, богатая биотином, и есть биотиновый препарат.

Первая партия, полученная по рассмотренной технологии на Серебрянопрудском биохимическом заводе, была испытана на одной из подмосковных птицефабрик. Цыплята, получившие здесь корм с добавкой разработанного препарата, быстрее росли, меньше болели.

Также препарат был испытан и в совсем другой области - при искусственном выкармливании личинок тутового шелкопряда специально составленными кормами. Было установлено, что в таких кормах при наличии, казалось бы, всех питательных веществ очень мало биотина, а биотиновая недостаточность у шелкопряда приводит к тому, что у него нарушается липидный обмен, снижается содержание С₁₈ - жирных кислот, насекомые болеют и погибают, и поэтому в данном случае препарат приносит немалую пользу.

Таким образом, можно сделать вывод, о том, что созданный биотиновый препарат найдет широкое применение, но для получения чистого биотина, его пока использовать еще нельзя. Точнее, невыгодно, потому что для налаживания экономичного биотехнологического производства чистого биотина нужно, по крайней мере, в 100 - 150 раз увеличить выход целевого продукта, а это за пределами возможностей разработанного штамма - продуцента, следовательно, требуется изменение его генетики, что обычно достигается действием мутагенов, но в данном случае имеется одно трудно преодолимое препятствие: для таких манипуляций гриб не подходит, т.к. после отработки мутагеном популяцию микроорганизмов рассевают на плотную питательную среду, чтобы получить отдельные колонии и отобрать среди них те, в которых произошли нужные мутации, но ризопус не растет в виде отдельных колоний, а быстро занимает всю поверхность плотной среды, так что обычный способ отбора мутантов здесь не годится. Нельзя применить к ризопусу и методы генной инженерии, поскольку его генетика совсем не изучена.

Поэтому в поисках пути получения чистого препарата биотина ученые сосредоточили свое внимание на другом биообекте - бактерии E.coli, хорошо изученной в генетическом отношении. В настоящее время обнаружены несколько перспективных ее штаммов, у которых в результате мутации механизм управления синтезом биотина изменен и нарушен - эти штаммы лишены внутренних тормозов, которые заставляют обычные бактерии производить биотин очень экономно, и синтезируют его бесконтрольно, но для того чтобы довести выработку витамина бактериями до нужного уровня, предстоит очень много работы, но уж очень заманчива цель: ведь микробиологического производства чистого биотина, который так необходим медицине, нет пока нигде в мире.

2.6 Примеры получения витаминов методами клеточной биотехнологии

Всестороннее исследование различных культур тканей позволило установить способность некоторых из них к синтезу витаминов.

Например, культуры ткани Nicotina tabacum способны использовать убихинон-10. Его содержание в клетках (0,036 %) в 10 раз больше, чем в листьях табака (0,003 %).

Культура ткани Cytisus scoparius содержала больше пиридоксина (витамин В₆), чем растение. Во многих культурах был обнаружен биотин. Особенно высокое его содержание (в 15 раз выше, чем в растении) отмечено в культуре ткани Lavandula vera.

Аскорбиновая кислота (13 мг на 100 г сырой ткани) накапливалась в культуре ткани Rosa rugosa. В несколько раз увеличилось ее содержание при выращивании ткани на свету (38 мг), но все-таки было меньше, чем в плодах шиповника. В культуральной среде, вероятно, в связи с его быстрым окислением витамин не накапливается.

Заключение

Достижение превосходства в биотехнологии является одной их центральных задач в экономической политике развитых стран. Лидерами биотехнологии являются сегодня США и Япония, накопившие многолетний опыт биотехнологий для сельского хозяйства, фармацевтической, пищевой и химической промышленности. Прочное положение в производстве ферментных препаратов, аминокислот, белка, медикаментов занимают страны Западной Европы (ФРГ, Франция, Великобритания), а также Россия. Эти страны характеризуются мощным потенциалом новой техники и технологии, интенсивными фундаментальными и прикладными исследованиями в различных областях биотехнологии.

Библиографический список

1. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. - М.: Высш.шк. - 1988.

2. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. - М.: Мир. - 1988.

3. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. - 1995.

4. Микробиологические продуценты биологически активных соединений: Методические указания к лабораторным занятиям/ Сост. Гурина С.В., Потехина Т.С., Н.Н. Елинова. - СПб: СПХФА - 1997. 28 с.

5. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. - СПб.: СПХФИ. - 1992.

6. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. - М.: Мир. - 1987.

7. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. - М.: Высш. шк. - 1988. - 416 с.

8. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. - Волгоград. - 2002.

Размещено на Allbest.ru