Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АНРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 632.9:634.1+634.2

БАКТЕРІАЛЬНИЙ ОПІК І НЕКРОЗ ГРУШІ ТА ЯБЛУНІ,

ЕКОЛОГІЧНІ НІШІ ЇХНІХ ЗБУДНИКІВ

06.01.11 - фітопатологія

АВТОРЕФЕРАТ

на здобуття наукового ступеня кандидата

біологічних наук

Лукач Мирослава Іванівна

КИЇВ-2001



Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана в відділі карантину рослин Інституту захисту рослин Української академії аграрних наук

Науковий керівник - заслужений діяч наук України доктор біологічних наук, професор, Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: заслужений діяч наук України, академік УААН, доктор біологічних наук, Пересипкін Володимир Федорович, Національний аграрний університет, професор кафедри фітопатології

кандидат біологічних наук, Світайло Олександр Макарович, старший науковий співробітник лабораторії біотехнології і оздоровлення садивного матеріалу

Провідна установа: Уманська державна аграрна академія Міністерства аграрної політики України, кафедра захисту рослин, м.Умань.

Захист відбудеться "_2_" березня 2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.004.02 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус № 3, аудиторія 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 11, навчальний корпус № 10.

Автореферат розісланий" 24" січня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Менджул В.І.



Лукач М.І. Бактеріальний опік і некроз груші та яблуні, екологічні ніші їхніх збудників- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук із спеціальності 06.01.11 - фітопатологія. Національний аграрний університет, Київ, 2000. яблуня бактеріальний фітопатогенний

Дисертація присвячена вивченню бактеріальних хвороб плодових культур та встановленню екологічних ніш їх збудників. Встановлено, що збудниками бактеріальних хвороб на Україні є опік та некроз плодових культур. Вивчено морфологічні, культуральні, біохімічні, хемотаксономічні та серологічні властивості виділених фітопатогенних бактерій. Показано, що штами Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al та Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall гетерогенні по інтенсивності засвоєння речовин та агресивності. Встановлено, що профілі жирних кислот загальних клітинних ліпідів Erwinia amylovora та Pseudomonas syringae pv. syringae можуть бути використані як чіткий метод діагностики для ідентифікації бактеріальних хвороб плодових. Проаналізовано стійкість сортів груші до бактеріального опіку плодових. Вперше показано, що буряни є місцем резервації бактеріальної інфекції. Встановлено, що Pseudomonas syringae pv. syringae може перебувати в ендофітній фазі в меристемних тканинах яблуні.

Ключові слова: бактеріальний опік, некроз кори, груша, яблуня, епіфітна фаза, ендофітна фаза, буряни, стійкість.



Лукач М.И. Бактериальный ожог и некроз груши и яблони, экологические ниши их возбудителей Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 06.01.11 - фитопатология. Национальный аграрный университет, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению бактериальных заболеваний груши и яблони в Украине, установлению экологических ниш их возбудителей.

Впервые в Украине (Черновицкая область) выявлено карантинное заболевание - ожог плодовых, возбудителем которого является Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Наиболее распространенным на территории Украины является некроз кори плодовых культур (Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall).

Установлено, что наилучшие условия для развития бактериального ожога в Черновицкой области образуются в июне-июле, а не в мае (период цветения). Впервые показано изменение симптомов ожога в зависимости от сорта. Установлена различная восприимчивость сортов груши и яблони к возбудителю. Сорта груши Парижанка и Конференция рекомендуем для изучения патогенных свойств бактерий. Среди вегетативных органов груши наиболее восприимчивыми к бактериальному ожогу были молодые вегетативные побеги.

Изучены морфологические, культуральные, физиологические, биохимические, хемотаксономические и серологические свойства возбудителей ожога и некроза плодовых культур. Доказано. что штаммы Erwinia amylovora и Pseudomonas syringae pv. syringae гетерогенны по интенсивности усвоения веществ и агресивности. Установлено, что профили жирных кислот клеточных липидов Pseudomonas syringae pv. syringae и Erwinia amylovora могут быть использованы для идентификации. Для Erwinia amylovora характерна 3-окситетрадекановая кислота, а для Pseudomonas syringae pv. syringae - 3-оксидекановая, 2-оксидодекановая и 3-оксидодекановая кислоты.

В местах распространения бактериальных заболеваний плодовых на здоровых листьях груши и сорняках выявлены возбудители болезней в єпифитной фазе. Pseudomonas syringae pv. syringae колонизовали листья плодовых и сорняки весь вегетационный период, а Erwinia amylovora - только некоторые сорняки (Arctium lappa L. Bernh., Amaranthus refroflexus L, Tripleurospermum inodorum (L) Sch. Bip. Увеличение количества инфицированных листьев можно использовать для прогнозирования появления и развития болезни.

Установлено, что на стерильность апикальных меристем яблони влиял срок отбора и сорт. При одинаковых условиях подготовки експлантов большее количество стерильных експлантов получено при использовании меристемных тканей отобранных во время начала активной фазы в сравнения с состоянием спокойствия деревьев. Наименшее количество стерильных експлантов получено из сорта Лодел (42,5%), наибольшее из сорта Деличия (75%).

Проявление антагонистических свойств у єпифитных штаммов Pantoea agglomeran указывает на их способность защищать растения от фитопатогенных бактерий, и возможность их использования для биологического метода борьбы с бактериальными болезнями.

Ключевые слова: бактериальный ожог, некроз коры, груша, яблоня, єпифитная фаза, єндофитная фаза, сорняки, устойчивость.



Lukach M.I. Fire blight and bark necrosis of pear and apple, ecological niches of their infectious agents. - Manuscript.

The dissertation thesis for candidate degree in biological sciences on speciality 06.01.11.- phytopathology. National Agrarian University, Kyiv, 2000.

Dissertation is devoted to the studying of bacterial diseases in pome fruits and detecting of ecological niches of their agents. It was established that fire blight and necrosis of pome fruits cause bacterial diseases in Ukraine. Morphological, cultural, biochemical, chemotaxonomic and serological capacities of isolated were studied. It was shown that Erwinia amylovora and Pseudomonas syringae pv. syringae strains are heterogenic on intensity acquiring of substance and agressivenness.

It was established that fatty acid profiles of common cell lipids of Erwinia amylovora and Pseudomonas syrigae pv. syringae can be used as a clear diagnostic method for identification of bacterioses in pome fruits.

The resistance of pear sorts to bacterial fire blight in pome fruits was analyzed. For the first time it was shown that weeds are the place of reservation of bacterial infection It was detected that Pseudomonas syringae pv. syringae could stay in endophytous phase in meristemic tissues of apple.

Key words: fire blight, bark necrosis, pear, apple, epiphytous phase, endophytous phase, weeds, resistance.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В Україні на 1998 рік плодові та ягідні культури у всіх категоріях господарств займали 752 тис. га. Питома вага яблуні складає 406,4 тис. га (54,04%), а груші - 50,8 тис. га (6,7%).

За останні роки у світі значно зросла ураженість плодових культур бактеріозами. Особливо небезпечним є карантинне захворювання збудником якого є Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. На жаль, світовий ареал цього захворювання зростає з кожним роком (Звет Т., 1995). В зв`язку з появою бактеріального опіку на території України в 1998 році (Мовчан О.М. та інші, 2000) виникає гостра необхідність в вивченні бактеріальних хвороб плодових груші та яблуні, видового складу фітопатогенних бактерій та дослідженні різних біологічних властивостей цих збудників. Значимість вирішення цієї проблеми і обумовила вибір теми дисертаційної роботи, її структуру та актуальність дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках робочої програми відділу карантину рослин Інституту захисту рослин УААН по завданню 06. - "Вдосконалити методи виявлення карантинних шкідників, хвороб та бур`янів, систему спостережень за ними, способи локалізації і знищення" (номер державної реєстрації 01970012340).

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - встановити бактеріальну етіологію захворювання яблуні та груші в Україні, визначити біологічні властивості виділених фітопатогенних бактерій.

Завдання досліджень передбачають:

-виявити бактеріальні захворювання яблуні та груші в Україні;

-встановити таксономічне положення збудників на основі вивчення патогенних, морфологічних, культуральних, біохімічних, хемотаксономічних та серологічних властивостей;

-визначити стійкість різних сортів яблуні та груші до бактеріального опіку плодових;

-встановити екологічні ніші збудників бактеріозів плодових культур.

Об`єкт дослідження. В зв`зку з появою в Україні нового небезпечного карантинного захворювання - опіку плодових, та розширення відомих хвороб виникла необхідність вивчення етіології бактеріальних хвороб груші і яблуні в Україні.

Предмет дослідження. Етіологія бактеріальних хвороб груші та яблуні, вивчення збудників хвороб, їх ідентифікація, локалізація в тканинах, екологічні ніші.

Методи дослідження. Виділення ізолятів збудниківна різних поживних та селективних середовищах. Вивчення морфологічних ознак клітин з використанням світлової та електронної мікроскопії. Відношення ізолятів бактерій до джерел живлення. Хемотаксономічні ознаки - жирнокислотний склад клітин збудників хвороб. Серологічні методи (аглютинація по методу Грубер-Відаля, преципітація в гелі за Оухтерлоні).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні виявлено збудника бактеріального опіку плодових (Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.). Встановлена гетерогенність штамів фітопатогенних бактерій та вплив екологічних ніш на їх ферментативну активність.

Вивчено стійкість сортів груші та яблуні до Erwinia amylovora. Сорти груші Киргизьке зимове, Трембіта були стійкими.

Показано, що жирнокислотний склад фітопатогенних бактерій може бути використаний як чіткий метод діагностики. 3-оксидеканова, 2-оксидодеканова та 3-оксидодеканова кислоти у Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall та 3-окситетрадеканова кислота у Erwinia amylovora виступають маркерами. які можна використовувати для ідентифікації збудників бактеріального опіку та некрозу плодових культур.

Встановлена ендофітна фаза виживання Pseudomonas syringae pv. syringae в меристемних тканинах яблуні. Значно більший відсоток стерильних експлантів отримано при використанні меристемних тканин, відібраних під час активної фази росту (70,7%), в порівнянні з станом спокою дерев (47,9%). Найменший вихід стерильних експлантів отримано з сорту Лодел (42,5%), найбільший - Делічія (75,0%).

Встановлено, що в якості епіфітів Pseudomonas syringae pv. syringae може колонізувати практично всі види бур`янів, які ростуть в плодових садах. Штами Erwinia amylovora виявляли тільки на трьох видах (лопух справжній (Arctium lappa L. Bernh.), щириця звичайна (Amaranthus refroflexus L ) та триреберник непахучий (Tripleurospermum inodorum (L) Sch. Bip) з семи досліджених. Сапрофітні епіфітні бактерії негативно впливають на фітопатогеннів і можуть обмежувати їх колонізації рослин.

Практичне значення одержаних результатів. Розробка ефективних методів захисту неможлива без етіологічних досліджень та різнобічного вивчення властивостей збудників захворювань. Тому визначення видового складу бактерій - збудників захворювань груші та яблуні - є основою для подальшої розробки раціональних методів боротьби з небезпечними захворюваннями цих порід.

Виявлені стійкі сорти груші (Киргизьке зимове, Трембіта) можуть стати матеріалом для створення нових стійких форм до збудника опіку плодових. Сорти Парижанка і Конференція можна використовувати, як індикаторні для виявлення патогенності ізолятів.

Вперше в Україні показано, що бур`яни є резерваторами збудників бактеріального опіку та некрозу плодових культур. Тому, боротьба з бур`янами є одночасно профілактичним заходом проти бактеріальних хвороб.

За результатами власних досліджень підготовлені “Методичні рекомендації з ідентифікації збудників бактеріального опіку та некрозу плодових культур”, які опубліковані спільно з спеціалістами Укрголовдержкарантину та передані для обласних станцій карантину і прикордонних пунктів.

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів та їх узагальнення виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладені та обговоренні на наукових конференціях: “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва (Харків, Інститут рослинництва ім. В.Я.Юр'єва УААН, 1999), “Вчимося господарювати” (Київ-Чабани, 22-23 листопада, 1999 року), на ІІ-му установчому з`їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 11-14 вересня 2000 року), 52-му німецькому конгресі по захисту рослин (Вайханштефан, 9-12 жовтня 2000 року). В цілому дисертація заслухана і обговорена на розширеному засіданнівідділу карантину рослин ІЗР УААН, на засіданні відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ, на засіданні вченої ради Інституту захисту рослин УААН в 2000 році.

Публікації. По темі дисертації опубліковано8наукових праць.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 158 сторінках машинописного тексту. Дисертація складається з вступу, загальної характеристики роботи, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 3 розділів експериментальної частини, висновків, переліку посилань. В дисертації міститься 36 таблиць,19 рисунків, з них13 фотознімків. Перелік літературних джерел охоплює 180 найменувань, в тому числі129 іншомовних.

Висловлюю щиру подяку завідувачу Закарпатського територіального відділу карантину рослин УААН к.б.н. Садляк А.М., науковому співробітнику Придністровської науково-дослідної станції УААН Сайко В.І., завідувачу лабораторії біотехнології та оздоровлення садивного матеріалу Інституту садівництва УААН к.б.н. Колесниченко О.В., спеціалістам Укрголовдержкарантину к.б.н. Мовчану О.М. і к.б.н. Устінову І.Д., спеціалістам Прикордонної державної фітосанітарної інспекції по Чернівецькій області за допомогу при виконанні дисертаційних досліджень.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

На підставі узагальнених джерел літератури висвітлено історія вивчення, розповсюдження і шкодочинність бактеріального опіку та некрозу плодових культур. Описано їх симптоми, стан вивчення біології збудників, сортові особливості груші та яблуні, їх значення в стійкості до хвороб. Приведені дані про екологічні ніші збудників бактеріальних хвороб.

Матеріали і методи досліджень

Дисертаційна робота виконувалась протягом 1998-2000 рр. Обстеженняплодових насадженнях та відбір зразків уражених тканин проводили в Чернівецькій (Сторожинецький р-н, Придністровська науково-дослідна станція УААН) та Закарпатській (Тячівський р-н, с.Новобарово, ксп. "Верховина", Ужгородський р-н, с. Худлєво, ксп."Гроно") областях. Також були проаналізовані зразки яблуні та груші отримані з Одеської (Татарбунарський р-н, ксп. "Татарбунарського повстання", Кілійський р-н, с.-з. "Дунайський"), Вінницької (Могилів-Подільський р.-н., с.Бронниця), Донецької (Волновахський р-н, с.-з. "Транспортник"), Київської (Києво-Святошинський р-н., ксп. "Дмитрівка", Харківської (Краснокутська дослідна станція) областей та Автономної республіки Крим (Симферопольський р-н, Кримська дослідна станція садівництва, с.Плодовод, Бахчисарайський р-н, с.-з. "Бурлюк"), в Інституті захисту рослин УААН, Закарпатському територіальному відділі карантину рослин ІЗР УААН, Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ.

Вивчення ступеня ураженості сортів груші та яблуні збудником бактеріального опіку плодових культур на природному інфекційному фоні проводили в Чернівецькій обл. Сторожинецький р-н, Придністровська науково-дослідна станція УААН за шкалою розробленою в США (Звет Т., 1979).

Мікробіологічний та фітопатологічний аналіз зразків, вивчення патогенних, морфологічних, культуральних, біохімічних. фізіологічних та серологічних властивостей проводили як це описано в роботах: К.И. Бельтюкова з співавторами (1967); М.А. Чумаевская з співавторами (1987), З. Клемент та інші (1990).

Вивчення жирних кислот ізолятів бактерій проводили за методикою описаною О.Е.Жеребило з співваторами (1985), О.А. Кіпріянова та інші (1982).

В якості еталонів використовували штами Erwinia amylovora (Burrill 1882) Winslow LMG 2024 та Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall NCPPB 281, отримані з колекції живих культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології та вірусології НАНУ.

Бактеріальний опік плодових культур

Симптоми бактеріального опіку на груші та яблуні. Потемніння пелюсток квітів та чашолистиків самі ранні симптоми, які можна було спостерігати в Чернівецькій області. На листках груші бактеріоз виявлявся в вигляді плям, які з`являлись спочатку у краю або кінчика листка. Тільки на початку липня створюються сприятливі погодні умови (середньодобова температура - 18⁰С та відносна вологість - 80%) для збудника опіку плодових, коли він, розвиваючись, уражує молоді вегетативні пагони. Під впливом E.amylovora утворювались гачкоподібно зігнуті верхівки молодих хворих пагонів. На корі відмічали утворення клиноподібних виразок.

Сортостійкість яблуні та груші до E.amylovora. Вивчення ступені ураження сортів груші та яблуні збудником бактеріального опіку на природному інфекційному фоні показало, що більшість сортів в тій чи іншій мірі уражались збудником опіку плодових. Не виявляли симптомів прояву опіку плодових на сортах груші Киргизьке зимове та Трембіта. Сорти Яблунівське, Буковинка, Вільямс, Ноябрська проявили відносну стійкість до патогену. Чутливими були сорти Бере Гарді та Вікторія. Найбільш чутливими були сорти Конференція, Старкримсон, Кучерянка, Кюре, Жанна Д`Арк, Улюблена Клаппа та Парижанка (табл.1).

Патогенні властивості бактерій. При штучному зараженні в лабораторних умовах штами Erwinia amylovora викликали усихання бруньок, листків. пагонів груші та яблуні з виділенням ексудату. На зелених плодах груші виділявся ексудат молочно-білого кольору. Сорти груші Парижанка та Конференція рекомендуємо використовувати для вивчення патогенності виділених ізолятів фітопатогенних бактерій. Введення в пагони 1%-го розчину аспарагіну перед інокуляцією патогеном приводило до появи ознак захворювання на 2-3 добу.

Морфологія та культуральні властивості бактерій. Клітини E.amylovora -еліпсовидні рухливі перитрихіальні палички, грамнегативні, факультативні анаероби, спор та капсул не утворювали. Штами E.amylovora на картопляному агарі формували круглі колонії з рівним краєм, плоскі, прозорі, однорідної структури та маслянистої консистенції. На селективному середовищі Д₃ штами E.amylovora через 72 год. утворювали колонії червоно- оранжевого кольору з припіднятою ущільненою центральною частиною.

Фізіологічні, біохімічні, хемотаксономічні властивості бактерій. Штами E.amylovora не відновлювали нітрати, не розкладали крохмаль. Не утворювали індол, сірководень та аміак. При вивченні сахаролітичних властивостей значних відмінностей серед штамів E.amylovora не відмічали, хоч спостерігали деяку варіабельність у штамів виділених в різний період. Штами виділені в період значного прояву захворювання (кінець менш інтенсивно ферментували цукри, ніж штами виділені в весняний період та штами виділені з бур`янів.Штами E.amylovora використовували без утворення газу арабінозу, фруктозу, галактозу, сахарозу та трегалозу, глюкозу аеробно та анаеробно. Не утворювали кислоти на мальтозі, інуліні, лактозі, рамнозі та рафінозі. Були каталазопозитивними, оксидазонегативними та не проявляли пектолітичних властивостей на шматочках картоплі та моркви.



Таблиця 1 - Ступінь ураження сортів груші E.amylovora (Придністровська дослідна станція)

Сорти	Ураження (%)	Середнє
	1998	1999	2000
Киргизьке зимове Трембіта Яблунівське Буковинка Вільямс Ноябрська Бере Гарді Вікторія Парижанка Улюблена Клаппа Жанна ДАрк Кюре Кучерянка Старкримсон Конференція	0,0 0,0 5,0 9,0 18,2 20,4 29,7 53,4 61,1 66,6 69,7 85,6 79,6 99,0 100	0,0 0,0 0,6 2,2 8,0 9,1 16,0 45,3 53,8 54,5 62,1 68,8 73,0 88,3 91,0	0,0 0,0 0,9 4,0 11,0 17,2 22,0 48,4 54,5 58,1 60,4 71,6 73,8 81,5 90,6	0,0 0,0 2,2 5,1 12,4 15,6 22,6 49,0 56,5 59,7 65,3 75,3 75,5 89,6 93,7
НІР05	6,15	5,44	5,79	-

Жирнокислотний склад штамів E.amylovora, виділених в Чернівецькій області був подібним до типового штаму E.amylovora 2024 (табл. 2.). Більше половини загальної суми жирних кислот в клітинaх штамів E.amylovora припало на долю гексадеценової - 26,4% та гексадеканової -33,1%, так само як і у музейного штаму (25,0% та 34,8% - відповідно). У всіх досліджених нами штамів виявлені незначні кількості 3-окситетрадеканової кислоти -1,6%. В наших дослідах у клітинних ліпідах штамів E.amylovora виявлено 36,8% ненасичених жирних кислот, 50,9% насичених та 12,3% циклопропанових з значним переважанням кислоти з 17 атомами вуглецю.

Серологічні властивості. При наявності антигенів в уражених тканинах характерних для E.amylovora в реакції кільцепреципітації антисироватки з екстрактом тканин спостерігали утворення через 15-30 хв. чіткого кільця преципітації на кордоні двох рідин - екстракту та антисироватки. Найшвидше, через 12 хв., кільце преципітації утворилось з штамами 7-10, 122-124. Аналізуючи результати реакції аглютинації можна відмітити, що всередині групи штамів E.amylovora, спостерігається досить стійка серологічна спорідненість. Всі штами аглютинували з антисироваткою до типового штаму з високим титром. Це підтверджено і в реакціях агарпреципітації.

Бактеріальний некроз кори плодових культур

Симптоми некрозу кори. Перші прояви ознак некрозу на яблуні в Закарпатській області виявлені на корі молодих гілочок. На штамбах поодиноких дерев відмічені здуття у вигляді міхурів, м`яких на дотик, які нагадували маленькі подушечки. Квітки уражались в основному до розкриття, що дозволяє припустити, що збудник знаходився під лусочками бруньки до їх розпускання. Листки були практично повністю чорними, гофрованими, зів'ялими, але не відділялись від пагону, середня жилка служила одним з країв некротичної плями.

Патогенні властивості бактерій. При штучному зараженні кори груші та яблуні штами P.syringae pv.syringae з груші були менш агресивними в порівнянні з штамами з яблуні. Такої відмінності по патогенності між штамами з яблуні та груші, як на гілках, не спостерігали при зараженні листків, бруньок та плодів. Тільки, в середньому по агресивності штами з яблуні були трохи кращими за штами з груші.

Морфологія, культуральні властивості бактерій. Клітини P.syringae pv.syringae - це поліморфні палички, з полярно розташованими джгутиками, грамнегативні, не утворюють спор. Колонії P.syringae pv.syringae на картопляному агарі при боковому освітленні характеризувались виявленою концентричністю в будові. Структура колоній тонко-радіальна. Штами продукували дифундуючий жовто-зелений пігмент при вирощуванні їх на середовищі Кінга В.



Таблиця 2 - Жирнокислотний склад клітинних ліпідів штамів E.amylovora

Жирні кислоти	E.amylovora (9 штамів)	E.amylovora 2024
С 10:0 С 10:0 3-ОН С 12:0 С 12:0 2-ОН С 12:0 3-ОН С 13:0 С 14:0 С 15:0 С 14:0 3- ОН С 16:1 С 16:0 С 17:0 ЦП С 18:1 С 18:0 С 19:0 ЦП	- - 4,8 0,3 - - сл. 5,20,4 0,70,1 1,60,3 26,41,2 33,12,4 11,80,1 12,20,2 3,70,3 0,50,1	- - 5,2 - - сл. 5,6 0,9 1,2 25,0 34,8 11,3 12,1 3,5 0,4

Фізіологічні, біохімічні та хемотаксономічні властивості бактерій. Всі штами продукували аміак, каталазу та уреазу, підлужнювали лакмусову сироватку. Не використовували трегалозу, дульцитол, саліцин, лактозу, мальтозу. На таких джерелах вуглецю, як глюкоза, сахароза, манітол, галактоза, арабіноза, манноза, рафіноза, інозитол, сорбітол всі штами утворювали кислоту, але без газу. Спостерігалась велика різниця серед штамів P.syringae pv.syringae в відношенні інтенсивності ферментації цукрів. Чим на більшій кількості цукрів відмічали ріст штаму, тим менш сильно у нього були виражені агресивні властивості. Яблуневий штам 18, який ріс лише на лактозі, целобіозі та трегалозі, але не ріс на сорбітолі, дульцитолі, саліцині - мав середньо виражені патогенні властивості. А штами 103, 213, що росли на всіх перерахованих цукрах були слабоагресивними. Всі штами P.syringae pv.syringae проявляють тирозиназну, ліполітичну, каталазну активністю, не володіють оксидазною, лецитиназною та амілазною активністю.

Виділені штами P.syringae pv. syringae за своїм складом жирних кислот клітинних ліпідів подібні до типового штаму P.syringae pv. syringae 281 та відрізняються від штамів E.amylovora (табл. 2). Однією з найбільш характерних ознак - є відсутність у них 3-окситетрадеканової кислоти, яка є у E.amylovora, та наявність 3-оксидеканової, 2-оксидодеканової та 3-оксидодеканової кислот. Також у штамів P.syringae pv. syringae наявні тільки незначні кількості циклопропанових кислот - 0,6%, на відміну від штамів E.amylovora, у яких їх 12,3%.

Таблиця 3 - Склад жирних кислот клітинних ліпідів штамів Р.syringae pv. syringae

Жирні кислоти	Р.syringae pv. syringae (9 штамів)	Р.syringae pv. syringae 281
С 10:0 С 10:0 3-ОН С 12:0 С 12:0 2-ОН С 12:0 3-ОН С 13:0 С 14:0 С 15:0 С 14:0 3- ОН С 16:1 С 16:0 С 17:0 ЦП С 18:1 С 18:0 С 19:0 ЦП	сл. 2,70,1 4,60,3 2,80,2 4,00,1 - - сл. - 37,73,4 26,21,3 0,90,4 19,41,6 1,60,5 -	сл. 2,5 4,9 2,9 4,2 - - 0,1 - 38,6 26,4 0,4 18,6 1,2 -

Екологічні ніші Рseudomonas syringae pv. syringae van Hal та Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.

Епіфітна фаза Рseudomonas syringae pv. syringae van Hal та Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. на плодових культурах. Штами E.amylovora були виділені з здорових листків сортів груші Бере Гарді та Кюре (рис. 1.). Найчастіше штами виділяли з сорту Кюре та Бере Гарді в червні (з 34,4% та 20, 4% листків, відповідно), за два-три тижні до активного прояву захворювання. Протягом липня-серпня E.amylovora виділяли в середньому з 25, 6% листків, а у вересні їх кількість знижувалась до 5-8%. Отже, фізіологічні особливості стану поверхні листків значно впливають на популяцію епіфітних мікроорганізмів. Збільшення відсотку листків, що заселені фітопатогеном може бути показником наступного спалаху захворювання

Штами P.syringae pv. syringae з листкової поверхні частіше виділяли в травні та червні (в середньому з 18,0 відсотків відібраних листків) (рис. 2.). В липні-вересні найбільшу кількість виділяли з сорту Лісова Красуня (з 12,5%). Значне зниження заселення листків P.syringae pv. syringaе в липні та серпні співпадає зі зниженням, або, навіть, припиненням інфекційного процесу в цей час. Таким чином, нами виявлені фітопатогенні штами E.amylovora та P.syringae pv. syringae на здорових листках дерев груші.

Фітопатогенні бактерії апікальних меристем яблуні. Відомо, що фітопатогенні бактерії можуть зберігатись всередині тканин рослини, не викликаючи при цьому симптомів захворювання. Для виявлення ендофітної фази патогену ми використали апікальні меристеми яблуні. При однакових умовах підготовки експлантів значно більший відсоток стерильних експлантів отримано при використанні меристемних тканин зрізаних під час початку активної фази росту (70,7%) в порівнянні з станом спокою дерев (47,9%). Сорт яблуні теж впливав на вихід стерильних апікальних меристем бруньок. Найменший вихід стерильних експлантів отримано з бруньок сорту Лодел незалежно від терміну відбору проб (42,5%), тоді як з сорту Делічія -75,0%. З отриманих уражених меристемних тканин виділено штами ендофітних бактерій, які на основі їх властивостей визначено як Pantoеa agglomerans, Pseudomonas syringae pv. syringae, Pseudomonas fluorescens, Bacillus sp. (табл. 4).



Таблиця 4 - Склад ендофітних бактерій, виділених з експлантів яблуні

Сорти	Типи уражень	Виділені штами, %
		P.s.pv.syringae	P.fluorescens	P.agglomerans	Bacillus sp.
Рішельє, Лодел, Голден Делішес	І	38	20	14	28
Флоріна, Делічія, Пінова	ІІ	0	30	21	49
Гала Маст	ІІІ	44	27	12	17

Бактерії-антагоністи до Рseudomonas syringae pv. syringae van Hal. та Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Оцінка штамів Pantoea agglomerans показала різний прояв їх антагоністичних властивостей до тест-культур (табл. 5.). Серед епіфітних штамів P.agglomerans найкращі антагоністичні властивості проявив штам P.agglomerans 84е, якийоднаково інгібував розвиток штамів P.syringae pv. syringae та E. amylovora. Зона інгібування в середньому складала 22,1 мм. Штам P.agglomerans 61е проявив слабкий антагонізм по відношенню до штамів E. amylovora. По відношенню до P.syringae pv. syringae штами P.agglomerans проявили майже однакові антагоністичні властивості.

Таким чином, епіфітні бактерії можуть приймати участь в регулюванні кількості патогенів на органах рослин.

Епіфітна фаза Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. та Pseudomonas syringae pv. syringae van Hal. на бур`янах плодових садів. В Закарпатській області на бур`янах виявлено P.syringae pv.syringae, а в Чернівецькій області P.syringae pv.syringae та E.amylovora. Аналіз мікрофлори бур`янів в плодових насадженнях Закарпатської області показав, що штами P.syringae pv.syringae виділяли в середньому з 47-49% рослин бур'янів. Найбільшу кількість виділяли з кульбаби лікарської -56,6%, в період цвітіння дерев груші та яблуні та з триреберника непахучого -52,1%. Найменшу кількість виділяли з деревію звичайного (45,0%) та кропиви жалкої (45,8%). Штами E.amylovora під час аналізу бур'янів Чернівецької області виділяли не більше як з 12-14% та трьох видів бур'янів, а саме: лопуха справжнього - 13,6%, щириці звичайної - 14,2%, триреберника непахучого - 11,5%.

Штами E.amylovora виділяли в травні-липні, тобто в період візуального прояву захворювання на деревах груші та яблуні (рис. 3.). На відміну від них штами P.syringae pv.syringae виділяли протягом всього вегетаційного періоду. Найчастіше P.syringae pv.syringae виділяли в травні , в період цвітіння дерев яблуні та груші, практично з 60% бур`янів. Найменшу кількість псевдомонасів виділяли в березні (19%).

Отже, E.amylovora, як патоген, здатний викликати інфекційний процес на плодових, але не пристосований до епіфітного виживання на бур`янах. Тому ми виявляли E.amylovora на бур`янах тільки тоді, коли відбувався інтенсивний розвиток захворювання. В цей час, бур`яни, які росли під ураженими деревами, увесь час поповнювались патогеном. Але виживати на них E.amylovora не зміг, на що вказує відсутність їх восени На відміну від них бактерії P.syringae pv.syringae виживають протягом всього вегетаційного періоду. Тобто, бур`яни є екологічною нішею для P.syringae pv.syringae, нішею, яка дає їм змогу виживати як епіфітам.



ВИСНОВКИ

Вперше в Україні (Чернівецька область) виявлено небезпечнекарантинне захворювання - опік плодових культур, викликане Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. В Чернівецькій області кращі умови для розвитку інфекційного процесу створюються не в травні (період цвітіння), а в червні-липні.

Найбільш поширеним на території України є некроз кори плодових культур, збудником якого є Pseudomonas syringae pv.syringae van Hall, який виявляли в усіх обстежених садах.

Вперше в Україні показано змінність симптомів бактеріального опіку плодових культур в залежності від сорту. Встановлена різна сприйнятливість сортів груші та яблуні до Erwinia amylovora. Сорти груші Киргизьке зимове та Трембіта були стійкими. Сприйнятливими були сорти Бере Гарді, Вікторія, Конференція, Старкримсон, Кучерянка, Кюре, Жанна Д`Арк, Улюблена Клаппа та Парижанка. Чутливими виявились зимові сорти яблуні (Вагнера Призове, Джонатан, Мантуанське, Айдаред). Відносну стійкість проявили осінні та літні сорти.

Встановлено, що сорти груші Парижанка та Конференція є індикаторами для встановлення патогенних властивостей свіже виділених та колекційних штамів Erwinia amylovora. Серед вегетативних органів груші найбільш чутливими до збудника бактеріального опіку виявились молоді вегетативні пагони.

Штами P.syringae pv.syringae та E.amylovora гетерогенні по інтенсивності засвоєння речовин та агресивності. На їх властивості впливають екологічна ніша та час виділення протягом вегетаційного періоду. Штами, виділені в період активного інфекційного процесу більш агресивні, але менш активні при використанні поживних речовин.

Профіль жирних кислот загальних ліпідів P.syringae pv.syringae та E.amylovora є сталим і відмінний один від одного, і може бути використаний як чіткий метод діагностики. Для P.syringae pv.syringae характерна 3-оксидеканова, 2-оксидодеканова та 3-оксидодеканова кислоти, для E.amylovora - 3-окситетрадеканова кислота.

В місцях розповсюдження бактеріальних захворювань плодових на здорових листках груші, бур`янах виявлені збудники хвороб в епіфітній фазі. Штами P.syringae pv.syringae та Erwinia amylovora колонізують листя груші увесь вегетаційний сезон. Збільшення відсотку інфікованих листків можна використовувати для прогнозування появи та розвитку хвороби. Штами P.syringae pv.syringae виявляли на всіх досліджуваних бур'янах (кропива жалка (Urtica urens L.), лопух справжній (Arctium lappa L. Bernh.), кульбаба лікарська (Taraxacum officinale Wigg.), щириця звичайна (Amaranthus refroflexus L.), триреберник непахучий (Tripleurospermum inodorum (L) Sch. Bip.), деревій звичайний (Achillea millefolium L.), грицики звичайні (Capsella bursa pastoris (L) Medik) протягом сезону. E.amylovora розповсюджені тільки на листках лопуха справжнього, щириці звичайної і триребернику непахучому в період інтенсивного розвитку хвороби на груші.

В апікальних меристемах яблуні виявлені P.syringae pv.syringae та ряд сапрофітних бактерій. На стерильність апікальних меристем яблуні впливав термін відбору проб та сорт. При однакових умовах підготовки експлантів значно більший відсоток стерильних експлантів отримано при використанні меристемних тканин зрізаних під час початку активної фази росту (70,7%) в порівнянні з станом спокою дерев (47,9%). Найменший вихід стерильних експлантів отримано з бруньок сорту Лодел (42,5%), найбільший з сорту Делічія (75%).

Прояв антагоністичних властивостей у епіфітних штамів Pantoea agglomerans вказує на здатність їх захищати рослини від фітопатогенних бактерій та можливість їх використання для біологічного методу боротьби з бактеріальними хворобами плодових.

Пропозиції виробництву

Для своєчасного виявлення опіку та нерозу плодових культур на основі літературних даних та власних досліджень складені "Методичні рекомендації з ідентифікації збудників бактеріального опіку та некрозу плодових культур", Київ, 2000 р.

-діагностику збудників бактеріальних хвороб плодових, особливо опіку, необхідно проводити всіма описаними методами, не обмежуючись швидкими методами діагностики;

-при застосуванні профілактичних заходів необхідно враховувати погодні умови (середньодобову температуру та відносну вологість), сприйнятливі для появи та розвитку інфекційного процесу;

-обстеження плодових насаджень для виявлення бактеріального опіку необхідно проводити не тільки в період цвітіння, а і в період активного росту та розвитку дерев (червень-липень);

-необхідною є боротьба з бур`янами, а особливо з лопухом справжнім (Arctium lappa L. Bernh.), щирицею звичайною (Amaranthus refroflexus L ), триреберником непахучим (Tripleurospermum inodorum (L) Sch. Bip), які колонізує збудник опіку плодових.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Садляк А.М., Бокшан О.Я., Лукач М.І. Бактеріальний опік - нова загроза ландшафтному різноманіттю Закарпаття // Зб. наук. праць. “Аграрний вісник Причорномор`я”.- 1999.- випуск 3 (6).- С.175-176. (Особистий внесок здобувача60%. Проведено експерименти. Зроблено висновки).

2. Садляк А.М., Бокшан О.Я., Кіш І.Б., Лукач М.І. Бактеріальний опік плодових. Нова небезпека для садів України // Захист рослин. - 1999. - № 6. - С. 22. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено лабораторні дослідження. Зроблено висновки).

3. Лукач М.І. Опік плодових - небезпечна карантинна хвороба // Вісник аграрної науки.- 2000.- №6.- С.19-20.

4. Гвоздяк Р.І., Лукач М.І. Жирнокислотний склад ізолятів Erwinia amylovora та Pseudomonas syringae pv. syringae // Бюлетень Інституту сільськогосподарської мікробіології. 2000.- №6.- С.71-72 (Особистий внесок здобувача 90 %. Проведено лабораторні дослідження. Зроблено висновки).

5. Лукач М.І. Бур`яни як носії бактеріальної інфекції в садах //Матеріали наук.-практич. семінару мол. вчених та спец. “Вчимося господарювати”.- Київ-Чабани, 22-23 листопада 1999.- К., 1999.- С. 95-96.

6. Садляк М.І., Бокшан О.Я., Лукач М.І. Інтродукція стійких сортів - основний напрямок захисту плодових культур від бактеріального опіку (Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.) // Тези допов. міжнар. конф. “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва”.- Харків, 1999.- С.306. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено експерименти, зроблено висновки).

7. Садляк А.М., Бокшан О.Я., Лукач М.І. Деякі аспекти діагностики збудника опіку плодових (Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.) // Тези допов. міжнар. конф. “Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва”.- Харків, 1999.- С.306. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено експерименти, зроблено висновки).

8. Kondratenko P.V., Kolesnytscenko O.V., Hvozdjak R.I., Lukatsch M.I. Die endophytische Mikroflora der ApfelapicalmeristemeEndophytic microflora of explants of apples // 52. Deutsssche Pflanzenschutztagung.- Freising-Weihenstephan, 2000.- P.398. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено експерименти, зроблено висновки).

9. Мовчан О.М., Устінов І.Д., Гвоздяк Р.І., Лукач М.І. Методичні рекомендації з ідентифікації збудників бактеріального опіку та некрозу плодових культур. (Особистий внесок здобувача 60%. Проведено аналіз літератури, експерименти, зроблено висновки).

Размещено на Allbest.ru