Некоторые характеристики бактериоциноподобного ингибирующего вещества штамма Lb. Paracasei SPP. Haracasei BN ATS 5W

Размещено на http://www.allbest.ru/

Бакинский Государственный Университет. Баку., Азербайджан.

НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БАКТЕРИОЦИНОПОДОБНОГО ИНГИБИРУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА (БПИВ) ШТАММА LB. PARACASEI SPP. PARACASEI BN ATS 5W

Гюльахмедов С.Г.

Абдуллаева Н.Ф.

Алиева А.А.

Гусейнова Н.Ф.

Ахмедова А.Ф.

Мустафаева Р.С.

Кулиев А.А.

Аннотация

Изучено бактериоциноподобное ингибирующее вещество (БПИВ) из культуральной жидкости молочнокислой бактерии (МКБ) штамма Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w, изолированного из сыра Брынза. БПИВ ингибировало рост Lactobacillus bulgaricus 340, Echerichia coli ATCC 23355, Enterococcus durans, Saccharomyces cerevisiae, а также Candida pseudotropicalis. Протеиназа К и проназа полностью, а трипсин частично подавили его антимикробную активность. Каталаза, липаза и б-амилаза на активность БПИВ не оказали заметное влияние. БПИВ оказалось термостабильным, устойчивым к кислым и щелочным значениям рН, а также толерантным к влиянию поваренной соли (до 9 %) полипептидом. Максимальная активность БПИВ в культуральной жидкости обнаруживалась в конце экспоненциальной фазы роста клеток. Удельная активность БПИВ после катионобменной хроматографии увеличивалась в 274 раза. Его молекулярная масса находится в пределах от 6.5 кД до 14.2 кД.

Введение

Молочнокислые бактерии (МКБ) обладают прикладным потенциалом, так как в качестве стартовых или ко-культур они традиционно используются в процессах производства ферментированных молочных, овощных, мясных, а также рыбных продуктов. МКБ, входящие в состав закваски мучных тестов, повышают качества хлебобулочных изделий. Некоторые их метаболиты прямо или косвенно участвуют в процессах созревании, а также при формировании ароматических, вкусовых и других органолептических качеств этих продуктов [1-3].

Одним из важных свойств МКБ является их способность продуцировать ряд биологически-активных веществ с антимикробными свойствами. Антагонизм МКБ в ферментированных продуктах ассоциируются с главными конечными продуктами их метаболизма, такими, как молочная и уксусная кислоты, перекись водорода, ферменты. литические агенты и/или бактериоцины [4-8].

Бактериоцины, это синтезируемые в рибосомах биологически-активные вещества белковой природы, обладающие антибактериальными и противогрибковыми активностями. В последние годы они находятся в центре внимания многих исследователей, вследствии возможного использования их в качестве естественного пищевого предохранителя а также для приготовления новых антимикробных лекарственных препаратов [9-11].

По своими географическим и природным характеристиками Азербайджан соединяет Европу с Азией. Здесь присутствуют широкие климатические условия и различные экологические ниши, а также богатые древние традиции различных этнических групп населяющих этот регион. Это создает предпосылки для разнообразия кисломолочных продуктов, технологии их производства, а также МКБ, обитающих в этих продуктах и непосредственно участвующих в их ферментации.

Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w впервые выделен и идентифицирован нами из белого сыра (Брынза), изготовленного из коровьего молока на Апшероне. Этот штамм является продуцентом бактериоциноподобного ингибирующего вещества (БПИВ), подавляющего рост ряда Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий, в том числе и микроскопических грибов. В настоящей работе мы частично охарактеризовали ингибирующую активность этого штамма. Начатые нами исследования с традиционными кисломолочными продуктами Азербайджана представляют большой научный и прикладной интерес [12].

1. Материалы и методы исследования

Изолирование штамма и обнаружение его антимикробной активности было выявлено по описанной ранее методике (12). Список тест-организмов и питательных сред приводится в Табл.1. Все используемые питательные среды были производства Difco (Detroit, США). Остальные реактивы - фирмы Sigma-Aldrich (США). Штаммы МКБ и Enterococcus были культивированы в MРС-среде (De Man, Rogosa and Sharpe. Состав среды (в %): дрожжевой экстракт - 0.5; мясной экстракт-1.0; пептон-1.0; глюкоза-2.0; лимоннокислый аммоний-0.2; уксуснокислый натрий-0.5; твин 80-0.1; K2HPO4-0.2; MgSO4*7H2O-0.02; MnSO4*4H2O.+ 370С), L.innocua и St.aureus -BH-среде (Brain-Heart. Состав среды (в %): смесь мозгового и сердечного экстракта-3.7; 87%-ный раствор глицерола-1; цистеин-HCl-0.02; Na2S*9H2O. +370С), E. coli-LB-среде (Luria-Bertani. Состав среды (в %): дрожжевой экстракт с триптоном-3; NaCl-1. +300С), остальные (S.serevisiae,C.pseudotropicalis)-YPD среде. (Yeast extract/Peptone/Dextroza. Состав среды (в %): дрожжевой экстракт-2; пептон-4; декстроза-4; L-триптофан-0.06).

В мягкой агаровой (0,8%) среде, засеянной в чашке Петри клетками пассивной культуры, прорезались лунки (метод луночной диффузии) диаметром 10 мм и в каждую лунку вносили 200 мкл стерильной культуральной жидкости потенциального продуцента. Затем чашки Петри охлаждали в течение 4 часов при +4є С. Это было необходимо для обеспечения радиальной диффузии компонентов, содержащихся в культуральной жидкости. После этого чашки Петри переносили в термостат и инкубировали в течение ночи при оптимальной температуре роста пассивной культуры. В качестве контроля использовали жидкую МРС. Антибактериальная активность культуральной жидкости оценивали посредством анализа критического разбавления (3). Активность БПИВ определяли как величину, обратную наивысшему разбавлению культуральной жидкости, проявляющему зону ингибирование индикаторных штаммов больше чем на 2 мм и выражали в произвольных единицах, деленных на миллилитр культуральной жидкости (ПЕ*мл-1). Для того, чтобы исключить ингибиторный эффект молочной кислоты и Н2О2, рН культуральной жидкости доводили до 6,5 с 1М NaOH и инкубировали с раствором каталазы (КФ 1.11.1.6, 2,39 Е/мг, из печени быка) в течении 2 ч при 370 С. Культуральную жидкость стерилизовали путем пропускания через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Химическую природу активного компонента проверяли инкубацией культуральной жидкости растворами протеиназы К (КФ 3.4.21.14, 11,4 Е/мг, из Bacillus licheniformis), проназы, б-амилазы II-А (КФ 3.2.1.1, 15 Е/мг, из Bacillus subtilis) и липазы VII (КФ 3.1.1.3, 50 Е/мг, из Candida rugosa) в течении 1,5 ч при 370 С. Воздействие фермента на антимикробные компоненты приостановили путем кипячения реакционной смеси 5 мин. Растворы используемых ферментов, конечные концентрации которых составили 1 мг/мл, приготовляли в стерильном 20 мМоль К-фосфатном буфере, рН 7.0. Последний, без добавления фермента, служил контрольным вариантом.

Для выяснения влияния рН на антимикробную активность рН культуральной жидкости доводили до нужных значений (рН 3-12) с помощью 5 N NaOH и 5 N HCl и проинкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем рН в каждой пробирке доводили до 6,5 и определяли антимикробную активность по описанной методике.

Зависимость активности БПИВ от температуры определили путем инкубирования культуральной жидкости во водяной бане со соответствующими температурами и автоклавирования.

С целью определения устойчивости к влиянию хлористого натрия антимикробного компонента в клуьтуральную жидкость вносили различные концентрации соли и проинкубировали 2 ч при 370 С. Антимикробную активность определяли методом диффузии. В качестве контроля брали стерильный жидкий МРС с соответствующей концентрацией поваренной соли. брынза бактериоциноподобный молочнокислый

Динамику продуцирования бактериоцина изучали при 370 С и при неконтролируемых условиях рН. Через каждый определенный интервал времени проверили рост клеток путем измерения оптической плотности суспензии (ОП при 600 нм) и рН. Антимикробную активность определяли методом диффузии после стерилизации культуральной жидкости пропустив ее через фильтр с размером пор 0.22 мкм.

Получение культуральной жидкости для очистки бактериоцина проводили следующим образом. В 500 мл жидкую МРС-среду добавляли 25 мл (5%) ночной культуры Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w и инкубировали 10 часов при 37°C. Клеток осаждали путем центрифугирования 20 мин (8000 g) при 4°C. Далее, рН культуральной жидкости доводили до 6.5 с помощью 5 N NaOH. 200 мл культуральной жидкости наносили на быстротечную колонку катионобменной хроматографии заполненной SP-сефарозой (2.5 x 20 cm, GE Healthcare, Amersham, Uppsala, Sweden), затем промывали 50 мM фосфатным буфером (pH 7). Элюицию осуществляли при линейном градиенте NaCl (0 - 1 M) того же буфера в течении 30 мин, со скоростью 10 мл.мин-1. Оптическая плотность фракций зарегистрировались при л 220 нм. Антимикробную активность собранной фракции объемом 20 мл проверяли методом диффузии против Lb. bulgaricus 340. Всю процедуру частичной очистки бактериоцина проводили при комнатной температуре с помощью прибора АРС (Дkta Purifier System) с программным обеспечением ЮК (Unicorn Control).

Далее образец был концентрирован в 10 раз, разделен на 3 части. Первая часть оставили без изменения, вторую и третью части инкубировали в присутствии ферментов протеиназы К и проназы как описаны ранее. Для определения молекулярной массы биоактивного пептида был использован метод Трисцин-Na-додецил-сульфат-полиакриламидный гель электрофорез (Трисцин-ДСNa-ПААГ) с концентрацией акриламида 16.5% (Schagger and von Jagow, 1987). В качестве белков-стандартов использовали маркерные белки с низкими молекулярными массами (от 1.06 до 26.60 кДа) (Sigma). Образцы были нанесены на гель в симметричном порядке. После электрофореза гель разделили на две ровные части. Для определения молекулярной массы первая часть гели, содержащей полосы с белками-маркерами была окрашена Кумасси синим R-250 по стандартному протоколу. Вторую часть гели промывали дистиллированной водой в течение 3 часов, затем вложили в чашку Петри и наслаивали тонким слоем мягкого МРС-агара (0,7 %), засеянного клетками L. bulgaricus 340 в концентрации 1.2х105 КОЕ/мл и инкубировали в течение ночи при 370С. Чистая зона на гели указывала место локализации белковой полосы активной фракции.

2. Результаты и их обсуждение

Активный компонент выделенного штамма МКБ ингибировал рост клеток проверенных тест-организмов, хотя степень ингибирования варьировала у разных штаммов в зависимости от видовой принадлежности пассивных культур. Клетки E.coli и S. aureus в этом смысле составили исключение. Они оказались резистентными против влияния активного компонента изолированного штамма МКБ.

Изучение влияний таких протеолитических ферментов, как протеиназа К, проназа и трипсин, показало, что активный компонент исследуемого штамма при их инкубации с вышеперечисленными ферментами, потеряли практически всю свою антимикробную активность (Табл. 3). Это указывает на белковую природу активного компонента. В присутствии трипсина антимикробная активность исследуемого компонента по сравнению с изначальной была редуцирована всего на 2,2 %. Обнаруженная устойчивость, по видимому, связана отсутствием трипсин-специфических аминокислотных последовательностей в первичной структуре активного полипептида. Полная резистентность исследуемого активного компонента была обнаружена также против влияний каталазы, что исключает присутствии перекиса водороды в проявлении антимикробной активности данного штамма. Устойчивость антимикробного компонента к воздействиям амилолитического и липолитического ферментов указывает на отсутствие углеводных и липидных компонентов при формировании его активного домена.

Таким образом, активный компонент культуральной жидкости штамма Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w, обладающий антимикробными свойствами, имеет белковую природу, что позволяет отнести его к бактериоциноподобным ингибирующим веществам (БПИВ).

В следующей серии экспериментов мы попытались частично очистить активный пептид и определить его молекулярную массу. С этой целью мы использовали метод катионобменной хроматографии. Условия проведения хроматографии были изложены в методической части. На Рис. 2 показан профил елюции антимикробного компонента культуральной жидкости с рН 6.5. Отсюда следует, что антимикробной активностью обладают фракции, елюируемые, в основном, при концентрации соли 0,4 и 0,6 M. Объем активной фракции был приблизительно 20 мл. Собранная активная фракция была концентрирована в 10 раз. После катионобменной хроматографии препарат активной фракции удалось очистить 274 раза.

Таким образом, методом катионобменной хроматографии был получен частично очищенный препарат активного компонента культуральной жидкости штамма Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w, активность которого увеличивалась в 274 раза. Бактериоцины в основном являются веществами белковой природы и нейтральное значение рН на них положительно действует. Использование катионобменную хроматографию при нейтральном значении рН позволяет в течении короткого времени выделять бактериоцины среди многих примесей без всяких негативных влияний. При этом также быстро уменьшается объем исследуемого образца, что значительно облегчает его дальнейшие биохимические исследования по уточнению нужных физико-химических параметров.

Результаты ДС-Na ПААГ электрофореза активной фракции, концентрированной в 10 раз, показаны на рис 2. Как видно из рисунка, четкая полоса активного полипептида проявляется только на третьей дорожке, в которую вносили концентрированную активную фракцию. Значение молекулярной массы данного полипептида находится в интервале 6.5 - 14.2 кД (Рис.2 А). На второй дорожке наблюдается диффузионное окрашивание в районе локализации полосы активной фракции. На дорожках 4 и 5, куда были внесены части активной фракции, обработанные протеиназой и проназой, соответственно, заметное окрашивание не наблюдалось. Видимо, под действием протеолитических ферментов происходит сегрегация молекулы полипептида, вследствие чего заметное интенсивное окрашивание вдоль дорожки не наблюдается. На второй половине гели, наслаиваемой тонким слоем мягкого МРС-агара (0,7 %), содержащий клетки L. bulgaricus 340 в концентрации 1.2х105 КОЕ/мл, видны чистые зоны в виде просветления (Рис. 2 Б). Чистые зоны на гели указывают места локализации белковых молекул с антимикробной активностью. Как видно из рисунка, вдоль дорожек 1, 4 и 5, которые соответствуют местам внесения маркерных пептидов (1), а также активных фракций, обработанных протеиназой (4) и проназой (5), просветленные зоны не обнаруживаются. Чистые зоны наблюдаются только на ареалах, соответствующих местам локализации полос активной фракции - на дорожках 2 и 3.

Таким образом, полученные результаты подтверждают белковую природу активного компонента. Молекулярная масса полипептида с антимикробной активности находится в пределах от 6.5 кД до 14.2 кД.

Следующая серия экспериментов была посвящена к изучению влияние рН, температуры культуральной жидкости а также хлористого натрия на проявление антимикробной активности БПИВ исследуемого штамма. При практическом использовании БПИВ, в зависимости от вида ферментированных продуктов и технологии их производства, бактериоцины могут подвергаться влиянию различных значений температуры и рН среды, а также концентраций минеральных солей, в частности поваренной соли. Следовательно, эксперименты подобного рода имеют большие прикладные значения. Результаты этих исследований также суммированы на Табл. 3. В пределах значений рН 5.0 - 9.0 антимикробная активность БПИВ изолированного штамма практически не менялась. При сильно кислотной (рН 3.0) и щелочной (рН 11.0) средах наблюдалось уменьшение активности БПИВ на 40 % и 56 %, соответственно. Интересно, что при увеличении рН культуральной жидкости до значении 12.0, антимикробная активность БПИВ практически не проявилась.

Изучение влияние температуры на активность БПИВ выявило термостабильности исследуемого активного компонента. Инкубация культуральной жидкости при температуре 1000С, практически не повлияла на антимикробную активность БПИВ, а ее автоклавирование (1 атм. 1210С) привело к потери активности только на 33%.

Что касается влияний концентраций хлористого натрия в пределах от 3% до 9%, здесь наблюдалась обратная корреляция между концентрацией и антимикробной активностью. Так, низкая концентрации NaCl (3%) не оказывала заметного влияния на активность БПИВ исследуемого штамма. Его 6%-ная концентрация привела к потери активности на 30 %, а увеличение концентрации соли до 9 % - на 56 %. Сравнительная толерантность антимикробных компонентов к влиянию NaCl позволяет использовать их продуценты в качестве стартовых культур при изготовлении различных кисломолочных и ферментированных растительных продуктов, в том числе сыров, оливок и соленой капусты [2,7,14,15].

Результаты по изучению динамики продуцирования бактериоцина показали, что уже спустя 4 часа после культивирования бактерий в культуральной жидкости обнаруживается антимикробная активность (Рис. 3). Это наводить на мысль, что БПИВ изученного штамма относится к группе первичных метаболитов бактериальной клетки. Активность культуральной жидкости достигает своего максимального значения спустя 8 ч, которое соответствует концу экспоненциальной фазы роста клеток и составляет 180 ПЕ/мл и остается на этом уровне, по крайней мере, еще на16 ч.

Таким образом, из культуральной жидкости штамма Lactobacillus paracasei spp. Paracasei BN ATS 5w был выделен, частично очищен и охарактеризован антимикробный компонент белковой природы. Этот компонент можно отнести к бактериоцинам, однако, ввиду отсутствия чистого белкового препарата данного компонента, это принято называть БПИВ. Последний является термостабильным, устойчивым к кислым и щелочным значениям рН, а также толерантным к влиянию поваренной соли полипептидом, молекулярная масса которого находится в пределах от 6.5 кД до 14.2 кД.

Литература

1. Klaenhammer,T.R. FEMS Microbiol.Rev.,12: 1993. p. 39-86.

2. Schilinger,U. In: Bills, D.D. and Kung, S.(eds).Biotechnology and Food Safety. Butterworth-Heinemann, Boston, 1990. p.55-74.

3. Suma K., Misra M.C, Varadaraj M.C. Int. J Food Microbiol 40: 1998. p. 17-25.

4. Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F. and Chikindas, M.L. Int.J.Food Microbiol.71: 2001. p. 1-20.

5. Jack, R.W., Tagg, J.R. and Ray, B. Microbiol. Rev. 59: 1995. p. 171-200.

6. Messens,W. and De Vuyst,L. Int.J.Food Microbiol.,72: 2002. p. 31-43.

7. Daeschel, M.A. Food Technol., 43: 1989. p. 164-167.

8. De Vuyst,L. and Vandamme, E.J. In: De Vuyst & Vandamme (eds). Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Microbiology, Genetics and Application. Chapman & Hall, New York, 1994, p.1-12.

9. Piard, J. and Desmazeaud, M. Le lait. 72: 1992. p. 113-142

10. Schillinger, U. and Holzapfel, W.H. Int.J.Food Microbiol., 33: 1996. p. 3-5.

11. Atrih,A.,Rekhif,N.,Moir, A.J.G., Lebrihi, A. and Lefebvre, G. Int.J.Food Microbiol.,68: 2001. p. 93-104.

12. Gulahmadov, S.G., Batdorj, B., Dalgalarrondo, M., Chobert, J-M., Kuliev, A.A., and Haertlйe, T. Eur Food Res Technol.,224. 2006. p.229-235.

13. Sambrook J, Fitsch E.F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press 1989.

14. Ross, R.P., Morgan, S. and Hill, C. Int.J.Food Microbiol.79: 2002. p. 3-16.

15. Webber A., Osborn M. J. Biol. Chem. 244: 1969. p. 4406-4412.

Размещено на Allbest.ru