Вплив іонів важких металів на синтез РНК та фракційний склад білків кукурудзи та картоплі

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. Ю. ФЕДЬКОВИЧА

УДК 581.192.6 + 581.143.32

ВПЛИВ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛIВ НА СИНТЕЗ РНК

І ФРАКЦIЙНИЙ СКЛАД БIЛКIВ

КУКУРУДЗИ ТА КАРТОПЛІ

03.00.04. -- бiохiмiя

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата бiологiчних наук

РОГОЗИНСЬКИЙ Мирон Степанович

Чернiвцi -- 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Чернівецькому державному університеті ім. Ю.Федьковича, Міністерство освіти України

Науковий керівник: доктор біологічних наук Волков Роман Анатолійович, Чернівецький державний університет ім. Ю.Федьковича, пров.н.с.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст.н.с. Ткачук Катерина Семенівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології живлення рослин;

кандидат біологічних наук Феник Степан Йосипович, Тернопільський державний педагогічний університет ім. Володимира Гнатюка, асистент кафедри загальної біології.

Провідна установа: Львівський національний університет ім. Івана Франка, кафедра біохімії.

Захист дисертації відбудеться 14 червня 2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05. при Чернівецькому державному університеті ім. Ю.Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2).

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича (58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий 12 травня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.П.Копильчук



Рогозинський М.С. Вплив іонів важких металів на синтез РНК та фракційний склад білків кукурудзи та картоплі. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. -- біохімія. -- Чернівецький державний університет ім. Ю.Федьковича, Чернівці, 2000 рік.

Захищається дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук, основні положення якої викладені в 16 наукових публікаціях. Дисертація присвячена вивченню впливу іонів ряду важких металів на морфо-фізіологічні та біохімічні показники рослин кукурудзи та картоплі. Встановлено, що відносна фітотоксичність іонів вивчених важких металів відображається наступним рядом: Cd²⁺>Cu²⁺>Co²⁺>Nі²⁺>Cr³⁺>Sr²⁺; а відносна цитотоксичність: Cr³⁺Cd²⁺Cu²⁺>Nі²⁺Co²⁺>Sr²⁺. Максимальна підпорогова доза Cd²⁺, Cu²⁺ і Ni²⁺ (при якій у рослин картоплі та кукурудзи не спостерігається помітних морфо-фізіологічних порушень) становить 0,4 мМ. Знайдено, що підпорогові дози Nі²⁺ і Cu²⁺ викликають підвищення синтезу різних класів РНК у інтактних рослин (80 % для яРНК, 30% для рРНК і 100 % для тРНК у порівнянні до контролю за дії Cu²⁺ та 200 % для яРНК, 90 % для рРНК і 180 % для тРНК за дії Ni²⁺) та його інгібування в системі ізольованих клітинних ядер (інгібування синтезу РНК на 50 % спостерігалося при таких концентраціях: Ni²⁺ -- 0,250 мМ (Solanum tuberosum) і 0,425 мМ (Zea mays); Cd²⁺ -- 0,1 мМ (S.tuberosum) і 0,125 мМ (Z.mays) та Cu²⁺ -- 0,04 мМ для обох досліджених видів). SH-вмісні сполуки в системі ізольованих клітинних ядер (дитіотрийтол) знімають інгібуючий вплив іонів важких металів на синтез РНК. Дія максимальної підпорогової дози Cu²⁺ та Ni²⁺ на рослини кукурудзи приводить до кількісних, якісних та металоспецифічних змін в інтенсивності забарвлення певних білкових смуг у досліді в порівнянні до контролю. Пропонується гіпотеза, що бар'єрна функція кореня еволюційно сформувалася як вибірковий захист від найбільш цитотоксичних елементів грунту. Доведено, що культура рослинних органів іn vіtro є зручною модельною системою для вивчення впливу іонів важких металів на рослини. іон метал інтактна рослина

Ключові слова: кукурудза, картопля, Sr²⁺, Cr³⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, РНК, цитоплазматичні білки.



Рогозинский М.С. Влияние ионов тяжелых металлов на синтез РНК и фракционный состав белков кукурузы и картофеля. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. -- биохимия. -- Черновицкий государственный университет им. Ю.Федьковича, Черновцы, 2000 год.

Защищается диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук, основные положения которой изложены в 16 научных публикациях. Диссертация посвящена изучению влияния ионов ряда тяжёлых металлов (ТМ) на морфо-физиологические и биохимические показатели растений кукурузы и картофеля. В работе показано, что ингибирование синтеза яРНК на 50 % в системе изолированных клеточных ядер наблюдается при таких концентрациях металлов: Ni²⁺ -- 0,250 мМ (Solanum tuberosum) и 0,425 мМ (Zea mays); Cd²⁺ -- 0,1 мМ (S. tuberosum) и 0,125 мМ (Z. mays) и Cu²⁺ -- 0,04 мМ для обоих исследованных видов.

Под влиянием максимальной подпороговой дозы Cu²⁺ и Ni²⁺ у интактных растений кукурузы наблюдается активация синтеза всех классов РНК. Так, относительная интенсивность синтеза РНК у кукурузы при действии Cu²⁺ возрастает на 80% в ядерной фракции РНК, на 30% в рибосомной РНК и на 100% в транспортной РНК по сравнению с контролем. При той же концентрации Ni²⁺ увеличение интенсивности синтеза РНК составляет 200 % для яРНК, 90 % для рРНК и 180 % для тРНК.

SH-содержащие соединения в системе изолированных ядер (дитиотрийтол) снимают ингибирующее влияние ионов ТМ на синтез РНК. У растений кукурузы минимальная из исследуемых доз Cu²⁺, Cd²⁺ и Ni²⁺ (0,08 мM) вызывает увеличение количества SH-содержащих соединений (в 3,4; 6,0; 1,8 раза соответственно по сравнению с контролем); с увеличением концентрации ионов металлов до 0,4 мM их содержание достигает максимума (4,5; 6,2; 2,3 рази). При действии ионов ТМ в концентрации 4 мМ содержание SH-групп достоверно не отличается от контроля. Наиболее сильным индуктором синтеза SH-содержащих соединений является Cd²⁺; Cu²⁺ занимает промежуточное положение, а Ni²⁺ вызывает наименьшие изменения.

Влияние максимальной подпороговой дозы Cu²⁺ и Ni²⁺ на растения кукурузы приводит к количественным изменениям в компонентном составе белков (изменения в интенсивности окрашивания полос) -- уменьшение интенсивности окрашивания полос с молекулярными массами 18,9; 28,3 и 25,6 кДа и увеличение для полос белков с молекулярными массами 8,9 и 20,6 кДа в опыте по сравнению с контролем.

Введение в питательную среду ионов меди и никеля также приводит и к качественным отличиям (появление или исчезновение отдельных полос) в компонентном составе белков: у опытных растений найдены чёткие полосы с молекулярными массами 12,8 и 18,3 кДа.

Наблюдаются металлоспецифические (характерные только для одного из исследуемых металлов) изменения в интенсивности окрашивания определённых белковых полос: содержание белка с молекулярной массой 14,7 кДа наивысшее у растений, культивированных на среде с повышенной концентрацией ионов меди.

Установлено, что относительная фитотоксичность ионов изученных тяжёлых металлов (зависимость между концентрацией ионов металла в питательной среде и токсичностью для растения) отображается следующим рядом: Cd²⁺>Cu²⁺>Co²⁺>Nі²⁺>Cr³⁺>Sr²⁺; а относительная цитотоксичность (зависимость между концентрацией ионов металла в тканях растения и его токсичным влиянием): Cr³⁺Cd²⁺Cu²⁺>Nі²⁺Co²⁺>Sr²⁺. Максимальная подпороговая доза Cd²⁺, Cu²⁺ и Ni²⁺ (при которой у растений картофеля и кукурузы не наблюдается заметных морфо-физиологических изменений) составляет 0,4 мМ.

Изученные ТМ отличаются способностью проникать в растение -- соотношение их распределения между питательной средой и тканями корня составляет: для Co²⁺ -- 1:50-60, для Cd²⁺ -- 1:10, для Cu²⁺ -- 1:3,5-6, для Ni²⁺ -- 1:3,2_6, для Cr³⁺ -- 1:0,5-4 и для Sr²⁺ -- 1:0,5_3. В большинстве случаев ткани корня содержат больше ТМ, чем среда, с которой они непосредственно контактируют.

Изученные ТМ, в большинстве случаев, накапливаются в корнях растений -- соотношение концентраций ТM в надземной и подземной частях растений составляет для картофеля: для Sr²⁺ 1:0,8-1.5; для Ni²⁺ -- 1:1,5-2,5; для Co²⁺ -- 1:4,6_6,0; для Cr³⁺ -- 1:6,0-10,0, для Cu²⁺ -- 1:6,0-18,0 и для Cd²⁺ -- 1:6,0-18,0 та для кукурудзы: для Ni²⁺ -- 1:7,0-11,0; для Cu²⁺ -- 1:10,0-57,0.

Предлагается гипотеза, что барьерная функция корня эволюционно сформировалась как выборочная защита от наиболее цитотоксичных элементов почвы.

Ключевые слова: кукуруза, картофель, Sr²⁺, Cr³⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, РНК, цитоплазматические белки.



Rohozynsky M. S. Influence of heavy metals' ions on RNA synthesis and fractional compositions of the corn and potato proteins. -- Manuscript.

Thesis for the scientific degree of candidate of biological sciences by specialisation 03.00.04. -- biochemistry. -- Fedkovich Chernivtsi State University, Chernivtsi, 2000.

The presented Candidate's thesis is based on main principles published in 16 scientific papers. The thesis is devoted to investigation of influence of some heavy metals' ions on morphological, physiological and biochemical indexes of corn and potato sprouts. It has been found that comparative phyto-toxicity of the heavy metals' ions can be shown as following sequence: Cd²⁺>Cu²⁺>Co²⁺>Nі²⁺>Cr³⁺>Sr²⁺; and their comparative cito-toxicity as the sequence: Cr³⁺Cd²⁺Cu²⁺>Nі²⁺Co²⁺>Sr²⁺. Maximal near-threshold dose of Cd²⁺, Cu²⁺ і Ni²⁺ which doesn't cause any notable physiological abnormalities was found to be 0,4 mM. It has been found that exposition of intact plants to near-threshold doses of Nі²⁺ and Cu²⁺ causes increase of synthesis of various classes of RNA. Thus, exposition of the plants to Cu²⁺ led to increase of 80% for nuclear RNA, 30% for ribosomal RNA and 100 % for transport RNA comparing to the control series and exposition to Ni²⁺ led to increases of 200%, 90% and 180% simultaneously. A system of the closed cells nucles showed decrement of RNA synthesis (50% inhibition of RNA synthesis was found under the following concentrations of Ni²⁺ -- 0,250 mM (Solanum tuberosum) and 0,425 mM (Zea mays); 0,1 mM (S.tuberosum) and 0,125 mM (Z.mays) -- for Cd²⁺ and 0,04 mM for the both species under investigation -- for Cu²⁺). SH-containing substances in a system of the closed cells nucles (dithiotritol) compensate inhibition influence of heavy metal's ions on synthesis of RNA. Influence of the maximal near-threshold doses of Cu²⁺ and Ni²⁺ on the plants of corn causes quantitative, qualitative and some metal-specific changes in the intensity of color of some protein strips comparing to the control series. It is supposed that “barring” function of a root has formed as a selective protection mechanism against the most cito-toxic species of soil. It is proved that іn vіtro tissue of a plant's organs is a suitable model system for investigation of influence of heavy metal's ions on plants.

Key words: corn, potato, Sr²⁺, Cr³⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, RNA, cytoplasmatic proteins.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТEРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важкі метали (ВM) відіграють важливу роль у життєдіяльності клітини. Але у надлишкових кількостях вони належать до одних з найбільш небезпечних для організмів токсикантів [Пинский, 1991]. Останнім часом, у зв'язку з погіршенням екологічного стану природного середовища, підвищився інтерес до вивчення впливу іонів ВM на рослини [Sіngh et al., 1991, Sіaskі, 1992]. Їх надмірне надходження в організм порушує процеси метаболізму, гальмує ріст і розвиток. В даний час одержано низку даних щодо специфіки нагромадження іонів ВM рослинами різних таксономічних груп [Peterson, 1983, Чернавская, 1989] та характеристики викликаних ними ушкоджень [Baron et al., 1995, Han et al., 1991].

Показано, що іони ВM викликають чисельні порушення метаболізму у рослинній клітині. Вони впливають на дихання та порушують роботу ферментних систем, структуру клітинних мембран. Виявлено багато механізмів шкідливого впливу ВM, але одним з найважливіших є, безумовно, їх взаємодія з нуклеїновими кислотами та білками. Іони ВM можуть взаємодіяти як з азотистими основами, так і з поліцукридно-фосфатним остовом нуклеїнових кислот. ВМ викликають неспецифічну денатурацію білкових молекул, або специфічно взаємодіють з активними центрами ферментів тощо. Все це викликає порушення структури макромолекул і негативно позначається на їх функціях. З іншого боку, встановлено, що надлишкове надходження ВM до клітин викликає активацію певних ланок метаболізму, що має захисний характер: відбувається синтез стресових білків, фітохелатинів тощо. Проте в більшості робіт вивчалися зміни окремих реакцій обміну речовин або експресія певних генів, при цьому зміни інтегральних показників вивчені недостатньо.

Очевидним є те, що ВM можуть впливати на процеси синтезу РНК як безпосередньо, порушуючи активність РНК-полімераз, так і опосередковано, впливаючи на різні ланки метаболізму. Тому найбільш повну інформацію можна отримати співставивши вплив ВM на синтез РНК як іn vіtro, так і іn vіvo. Зміни у активності синтезу РНК в рослинах мають позначатися на фракційному складі клітинних білків, зокрема цитоплазматичних. Відомо, що зручними параметрами, які дозволять дати інтегральну оцінку стану клітини, є інтенсивність синтезу РНК та зміни фракційного складу білків.

Mета роботи і завдання дослідження. Метою даної роботи стало отримання якнайповнішої картини впливу іонів важких металів на морфо-фізіологічні та біохімічні показники у кукурудзи і картоплі.

В роботі вирішувалися наступні експериментальні завдання:

оцінити цитотоксичність для картоплі (дводольні) та кукурудзи (однодольні) іонів кількох важких металів (Sr²⁺, Cr³⁺, Nі²⁺, Cd²⁺, Сo²⁺ і Cu²⁺) з метою добору найбільш токсичних з них для подальшого вивчення;

вивчити вплив іонів Nі²⁺, Cd²⁺ і Cu²⁺, а також сполук, що містять вільні SH-групи, на синтез РНК у системі ізольованих клітинних ядер картоплі та кукурудзи;

оцінити характер змін у синтезі різних класів РНК інтактних рослин кукурудзи під впливом Nі²⁺ та Cu²⁺;

визначити взаємозв'язок між вмістом ендогенних SH-вмісних сполук (фітохелатини) та концентраціями іонів Nі²⁺, Cd²⁺ і Cu²⁺ в тканинах листків кукурудзи;

вивчити зміни фракційного складу цитоплазматичних білків кукурудзи під впливом Nі²⁺ і Cu²⁺.

Наукова новизна роботи. Показано, що різниця за вмістом іонів важких металів в надземній та підземній частинах рослин зростає зі збільшенням фітотоксичності цих металів.

Сформульовано гіпотезу, що бар'єрна функція кореня еволюційно сформувалася як вибірковий захист від найбільш цитотоксичних елементів грунту.

Встановлено, що інтенсивність включення ³Н-уридину у фракцію новосинтезованої РНК в системі ізольованих клітинних ядер зворотньо корелює з концентрацією іонів ВM в інкубаційному середовищі та залежить від токсичності ВM.

Вперше встановлено, що підпорогові дози Nі²⁺ і Cu²⁺ викликають підвищення синтезу різних класів РНК у інтактних рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Доведено, що культура рослинних органів іn vіtro є зручною моделлю для вивчення впливу іонів ВМ на рослини. Це пов'язано з можливістю проводити експерименти у строго контрольованих умовах незалежно від сезонних змін.

Морфо-фізіологічні та біохімічні зміни, які відбуваються в рослинах під впливом іонів важких металів, допомагають встановити концентрації іонів ВМ, при яких настає забруднення продукції. Отримані результати дають можливість підібрати найстійкіші до проникнення іонів ВМ культури і отримувати екологічно чисту продукцію.

Запропоновані в роботі модифікації методик вивчення синтезу РНК у системі ізольованих клітинних ядер, виділення та фракціонування цитозольних білків, виділення різних типів РНК з паростків кукурудзи успішно використовуються в роботі науково-дослідних лабораторій, при виконанні дипломних робіт та на лабораторному практикумі для студентів кафедри біохімії і експериментальної екології Чернівецького державного університету ім. Ю.Федьковича. Матеріали роботи можуть бути використані при читанні лекцій з курсів “Біохімія рослин”, “Фізіологія рослин”, “Eкологія” та спецкурсів “Культура тканин”, “Організація та еволюція геному еукаріот”.

Координація досліджень. Викладені в роботі результати є частиною науково-дослідних тем, які розроблялися на кафедрі біохімії і експериментальної екології: “Розробка способів отримання і оцінки селекційно-цінних форм сільськогосподарських рослин на основі біотехнологічних підходів” (№ державної реєстрації 01900038640) та “Вивчення експресії геному сільськогосподарських рослин під дією хімічних та інших стресових факторів” (№ державної реєстрації 0194U028026).

Особистий внесок здобувача. В процесі виконання дисертації автор особисто відібрав та критично проаналізував весь обсяг вітчизняної та зарубіжної літератури з теми проведеного наукового дослідження та виконав експериментальну частину роботи. Визначення мети роботи, програми та методів досліджень а також аналіз і обговорення отриманого матеріалу та написання наукових робіт проведено спільно з науковим керівником.

Апробація роботи. Основні результати роботи були викладені на І Всесоюзній планово-звітній конференції “Генна та клітинна інженерія” (Москва, 1991); Всесоюзній конференції “Досягнення біотехнології -- агропромисловому комплексу” (Чернівці, 1991); ІІ з'їзді Українського товариства фізіологів рослин (Київ, 1993); І Міжнародному симпозіумі “Медико-екологічні проблеми охорони здоров'я в Україні” (Чернівці, 1994); науковій конференції, присвяченій 120-річчю заснування Чернівецького університету (Чернівці, 1995); VІ Конференції молодих вчених, присвяченій 50-річчю заснування Інституту фізіології рослин та генетики НАН України (Київ, 1996), VІІ Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997) на наукових семінарах молекулярної і клітинної біології кафедри біохімії і експериментальної екології Чернівецького державного університету ім. Ю. Федьковича.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 16 робіт (7 статей та 9 тез), усі у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, висновків, списку літератури (289 робіт, в т.ч. 128 іноземними мовами). Дисертація викладена на 139 сторінках, має у своєму складі 18 рисунків та 9 таблиць.



MАТEРІАЛИ ТА MEТОДИ ДОСЛІДЖEНЬ

Об'єкти досліджень та їх характеристика. Обєктами дослідження були безвірусні рослини картоплі (Solanum tuberosum L.) сортів Ласунак (суперранній) і Зов (середньопізній-пізній) та паростки кукурудзи (Zea mays L.) міжлінійного гібрида Г-01 (ПЛС 61 х Уч 22). Mатеріал картоплі наданий науково-дослідною станцією по сортовипробовуваннях (м. Городенка Івано-Франківської області). Насіння кукурудзи отримане з рослин, вирощених на науково-дослідній ділянці кафедри біохімії і експериментальної екології ЧДУ.

Культивування рослин методом іn vіtro проводили за відомою методикою [Катаева, 1981] на середовищі Mурасіге Т. і Скуга Ф. [Murashіge et al., 1962] при інтенсивності освітлення 3000-4000 лк при 16-годинному фотоперіоді та t=+25^o С.

Картоплю вирощували в оранжереї в грунтовій суміші торфу, піску та дернової землі (3:1:1) при t=21-25^o та 16-ти годинному світловому дні. Для роботи використовувалися молоде листя, яке відбирали протягом вегетаційного періоду до фази бутонізації.

Насіння кукурудзи обробляли 1% розчином KMn0₄, гідратували 14-16 годин та пророщували в термостаті при t = 28^o1^о С на дистильованій воді протягом трьох діб; потім паростки висаджували на розчин Кнопа [Калинин и др., 1980] і вирощували при 27^о2^о С, 16-годинному світловому дні та інтенсивності освітлення 2200 лк до фази трьох листків.

1. Нагромадження ВM у рослинах. Як джерело іонів ВM використовували солі Sr(NO₃)₂, Cr(NO₃)₂, Co(NO₃)₂, NіCl₂, CdCl₂ та СuCl₂, які вводилися в поживне середовище до відповідної кінцевої концентрації. Мінералізацію проб проводили методом сухого озолення (ГОСТ 26657-85). Аналіз проб проводили на атомно-адсорбційному спектрофотометрі типу: ААСФ-115-M1 (п/я В 2613, СРСР). Вміст іонів ВМ виражали в мг/кг сухої маси [Алексеев, 1987; Хавезов, 1983].

Bплив іонів ВM на рослини картоплі в культурі іn vіtro та паростки кукурудзи визначали, як описано раніше [Рогозинський та ін., 1998 б].

2. Визначення інтенсивності синтезу РНК в системі ізольованих клітинних ядер проводили за відомими методиками: виділення інтактних ядер [Slater et al., 1978] з модифікаціями [Рогозинский и др., 1998а]; виділення ДНК [Волков и др., 1992]; визначення вмісту ДНК в суспензії ядер [Tіtus, 1991]; визначення інтенсивності синтезу яРНК [Рогозинский и др., 1998а]

3. Вплив іонів важких металів на синтез різних класів РНК іn vіvo проводили за відомими методиками: включення міченого попередника [Язловицька та ін., 1998]; визначення швидкості надходження міченого попередника [Остерман, 1983]; виділення клітинних ядер [Булко, 1986]; виділення яРНК [Маниатис и др., 1984], рРНК [Борисюк и др., 1989] та тРHК [Булко, 1986]; розділення ДНК та РНК [Das et al., 1990].

4. Визначення поліморфізму цитозольних білків у рослин. Виділення цитозольних білків проводили за описаним методом [Дощанов и др., 1981] з модифікаціями [Скоупс, 1985]. Вміст білку у цитозолі визначали за методом Лоурі [Lowry et al, 1951]. Цитозольні білки розділяли на фpакції шляхом висолювання (NH₄)₂SO₄ і розділяли на мікpоколонці з аніонообмінником “DEAE-целюлоза” [Остерман, 1985; Белоусова и др., 1987]. Білки підфpакцій розділяли методом SDS-дискелектрофорезу [Laemmlі, 1970] і фарбували в 0,05% pозчині Кумасі СВВ R-250 [Гааль и др., 1982; Райдер и др., 1983].

Полімоpфізм фенолоксидази і пеpоксидази вивчали методом диск-електpофоpезу в ПААГ [Гааль и др., 1982; Райдер и др., 1983]. Сканування гелів пpоводили лазеpним денситометpом 2202 Ultroscan (LKB Aroma). Eлектpофоpегpами обчислювали на компьютеpі Apple (пpогpама YelScan LKB) та на ІBM PC/AT використовуючи складену нами пpогpаму. Результати опрацьовували методами багатоміpної статистики [Мандель, 1988].

5. Кількість SH-вмісних сполук у рослин визначали за описаним в літературі методом [Травина, 1955].

Mатематична обpобка експеpиментальних даних виконувалась за методом ваpіаційної статистики [Маслов, 1978].

РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Порівняльна оцінка фітотоксичності солей важких металів. Виходячи з результатів проведених нами дослідів, побудувано ряд фітотоксичності іонів ВМ (зв'язок між концентрацією ВM в поживному середовищі і ушкодженнями рослин): Cd²⁺ > Cu²⁺ > Co²⁺ > Nі²⁺ > Cr ³⁺ > Sr²⁺

Особливості розподілу в тканинах та токсичність іонів важких металів. Вивчені ВМ відрізняються за здатністю нагромаджуватися в рослинних тканинах. Співвідношення між концентраціями іонів ВM у поживному середовищі та їх вмістом у коренях складало: для Co²⁺ -- 1:50-60, для Cd²⁺ -- 1:10, для Cu²⁺ -- 1:3,5-6, для Nі²⁺ -- 1:3,2-6, для Cr³⁺ -- 1:0,5-4 і для Sr²⁺ -- 1:0,5-3. Відповідно, ряд, що відображає нагромадження ВM в коренях: Co²⁺ > Cd²⁺ > Cu²⁺ Nі²⁺ > Cr³⁺ Sr²⁺ (ряд 2а). Ряд, що відображує нагромадження ВM в надземній частині рослин: Co²⁺ > Nі²⁺ Sr²⁺ > Cd²⁺ > Cu²⁺ > Cr³⁺ (ряд 2б). Коефіцієнти розподілу між вмістом ВM в над- і підземній частинах рослин картоплі склали: для Sr²⁺ 1:0,8-1.5; для Nі²⁺ -- 1:1,5-2,5; для Co²⁺ -- 1:4,6-6,0; для Cr³⁺ -- 1:6,0-10,0; для Cu²⁺ -- 1:6,0-18,0 і для Cd²⁺ -- 1:6,0-18,0. І для кукурудзи: для Nі²⁺ -- 1:7,0-11,0; для Cu²⁺ -- 1:10,0-57,0.

При цьому для Nі²⁺ коефіцієнт розподілу суттєво не змінювався зі зміною часу експозиції та концентрації металу у середовищі. Іншою була картина для Cu²⁺: 1) зростання концентрації (0,001/0,005/0,01) призводило до зниження коефіцієнту розподілу (49,0-57,0/14,0-30,0/10,0-28,0); це свідчить, що при підвищенні вмісту Cu²⁺ в оточуючому середовищі ефективність фізіологічного бар'єру корінь-стебло знижується; 2) збільшення часу експозиції рослин (1 день/3 дні) іонами Cu²⁺ супроводжується зростанням коефіцієнту розподілу в 1,2-2,8 рази в залежності від концентрації. Це наводить на думку про посилення бар'єру корінь-стебло внаслідок адаптації до впливу Cu²⁺.

Для оцінки токсичності металів на клітинно-тканинному рівні (цитотоксичність) співставили вміст ВM в тканинах надземної частини рослин і характер викликаних ними порушень і отримали ряд: Cr³⁺ Cd²⁺ Cu²⁺ > Nі²⁺ Co > Sr²⁺ . При оцінці фітотоксичності ВM враховують такі групи факторів: 1) взаємодія металу з грунтом (доступність ВM для рослин); 2) здатність металу проникати в рослини і характер його розподілу в різних органах та тканинах; 3) ступінь токсичності на клітинно-тканинному рівні. Вивчення впливу ВM на рослини в культурі іn vіtro є особливо зручним для вивчення фітотоксичних факторів груп 2 і 3. В той же час подібні експерименти можуть представляти інтерес і для вивчення факторів групи 1: результати, отримані в культурі іn vіtro можуть бути використані для порівняння при вивченні впливу абіогенних компонентів біогеоценозу на фітотоксичність ВM.

2. Вплив іонів важких металів на синтез РНК в ізольованих клітинних ядрах кукурудзи та картоплі вивчали на прикладі cередньотоксичного Nі²⁺ та сильнотоксичних Cu²⁺ і Сd²⁺. В результаті проведених експериментів встановлено, що досліджувані ВM в різній мірі викликали зниження рівня включення ³Н-УТФ в яРНК.

Низькі концентрації Cd²⁺ (1 мкM) і Nі²⁺ (125 мкM) активували синтез яРНК (в межах 10%). При наявності в інкубаційному середовищі Cd²⁺ в концентрації 1000-4000 мкM чи Nі²⁺ 10000 мкМ і вище інтенсивність синтезу РНК була низькою для обох досліджуваних видів рослин і складала лише приблизно 10% від контролю.

В той же час в присутності Cu²⁺ зростання синтезу яРНК не спостерігалося навіть при найнижчій з досліджуваних концентрацій (3 мкM). З підвищенням концентрації Cu²⁺ інгібування відбувалося інтенсивніше, ніж для Cd²⁺ i Ni^2+. Практично повне пригнічення синтезу яРНК в ізольованих ядрах (рівень включення ³Н-УТФ -- не більше 10% порівняно з контролем) як для картоплі, так і для кукурудзи спостерігалося при концентрації Cu²⁺ 800 мкM та вище.

Для співставлення величини ефектів, викликаних різними ВM, зручно порівнювати концентрації, які призводять до інгібування синтезу яРНК на 50%. Ці концентрації склали: для Nі²⁺ -- 250 мкM (картопля) і 425 мкM (кукурудза); Cd²⁺ -- 100 мкM (картопля) і 125 мкM (кукурудза); для Cu²⁺ -- 40 мкM для обох досліджуваних видів (рис. 3). Таким чином, грунтуючись на результатах наших досліджень, побудовано ряд, що відображає вплив іонів вивчених ВM на синтез яРНК в ізольованих ядрах рослин: Cu²⁺ > Cd²⁺ > Nі²⁺.

Також зазначимо, що в ядрах, виділених з кукурудзи, під дією іонів Cd²⁺ та Nі²⁺ синтез яРНК інгібувався менше, ніж в ядрах, виділених з картоплі (у випадку Cu²⁺ ця різниця між видами була недостовірною), що узгоджується з даними [Snowden et al., 1993] про більшу стійкість однодольних рослин порівняно з дводольними до впливу ВM. Даний факт, на нашу думку, можна пояснити вищою стійкістю ферментних систем клітинного ядра, які відповідають за синтез РНК.

Точка зору, згідно з якою зміни активності різних ферментів відіграють важливу роль при токсикації ВM досить поширена. Так, концентрації ВM, які знижували активність ряду очищених ферментів на 50% [Школьник, 1974, Mathys, 1975] становлять: для Nі²⁺ -- 150-500 мкM, для Cd²⁺ -- 2-30 мкM, для Cu²⁺ -- 0,7-30 мкM. Дані концентрації близькі до отриманих в наших експериментах. Mожна припустити, що і у нашому випадку зниження активності синтезу РНК під дією ВM пов'язане з їх безпосереднім впливом на білки клітинного ядра.

Наступним етапом досліджень було встановлення концентрацій іонів ВМ, які впливають на синтез РНК на рівні інтактних рослин. Описані вище результати розглядаються як базис для вивчення аналогічних процесів іn vіvo.

3. Визначення інтенсивності синтезу РНК іn vіvo у кукурудзи. У розділі 1 встановлено, що максимальній підпороговій дозі Cu²⁺ та Cd²⁺ (0,4 мM розчини, 3-и доби) відповідає їх вміст в тканинах листків кукурудзи до 0,1 мM, Nі²⁺ -- до 0,5 мM. В той же час дані розділу 2 свідчать, що ці концентрації викликають зниження синтезу РНК на 30-50% в ізольованих клітинних ядрах. Тому постало питання: які зміни у синтезі РНК викликає така ж доза у дослідних рослин? Для відповіді на це питання було проведено відповідний експеримент.

Встановлено, що під впливом підпорогової дози Cu²⁺ та Nі²⁺ інтенсивність включення міченого попередника ³Н-уридину в новосинтезовану РНК паростків кукурудзи помітно зростає.

Більш виражено збільшується інтенсивність синтезу яРНК та тРНК, менш виражено рРНК. Так, порівняно з контролем, відносна інтенсивність синтезу РНК кукурудзи за дії Cu²⁺ зростає на 80 % в яРНК, на 30 % в рРНК та на 100 % в тРНК. При такій же концентрації іонів Nі²⁺ збільшення інтенсивності синтезу РНК становило 200 % для яРНК, 90 % для рРНК та 180 % для тРНК. Таким чином, Nі²⁺ викликає більш помітну зміну даного показника в порівнянні з Cu²⁺. Mенше зростання інтенсивності синтезу рРНК можливо пов'язане з тим, що ця фракція РНК характеризується дещо меншою швидкістю обміну [Инге-Вечтомов, 1983].

Отримані дані свідчать, що однакові концентрації Cu²⁺ і Nі²⁺ викликають інгібування синтезу РНК в умовах іn vіtro та його активацію в умовах іn vіvo. Механізми задіяні у зростанні синтезу РНК в умовах досліду обговорено у розділі 4.

4. Вплив важких металів на кількість SH-вмісних сполук у кукурудзи. Відомо, що під впливом ВM у рослин підвищується вміст металохелатуючих речовин різної природи. Однак невідомо, чи це явище має місце в умовах нашого досліду. Тому нами вивчено залежність між концентрацією Cu²⁺, Cd²⁺ і Nі²⁺ в середовищі та кількістю SH-вмісних сполук у клітинах кукурудзи.

Використовувалися концентрації 0,08, 0,4, 0,8, 2,0 та 4,0 мM, на яких рослини вирощувалися протягом 3-х днів.

Аналіз отриманих даних показав, що вже при мінімальній концентрації усіх ВМ (0,08 мM) вміст вільних SH-груп помітно зростав. З підвищенням їх концентрацій до 0,4 мM (максимальна підпорогова доза) вміст вільних SH-груп досягав максимуму; при 0,8 і 2,0 мM відбувалося його достовірне зниження, а при 4,0 мM вміст даних речовин знижувався до рівня контролю. Найсильнішим індуктором синтезу SH-вмісних сполук є Cd²⁺, Cu²⁺ займає проміжне положення, а Nі²⁺ викликає найменші зміни.

Підвищення кількості SH-вмісних речовин в клітинах за дії низьких концентрацій металів, на нашу думку, можна пояснити таким чином: при проникненні іонів ВМ в клітину відбувається “включення” механізмів захисту і продукування SH-груп відбувається у більшій кількості, ніж потрібно для нейтралізації цих іонів. При подальшому збільшенні концентрації ВM відбувається їх зв'язування, що призводить до поступового вичерпання пулу вільних SH-груп. Отримані дані свідчать, що зменшення вмісту вільних SH-груп нижче контролю відповідає появі помітних ушкоджень у рослин.

Таким чином, одним з механізмів, що пояснює відсутність інгібування синтезу РНК іn vіvo під впливом підпорогових доз ВM, є зростання вмісту вільних SH-груп.

5. Вплив іонів важких металів на фракційний склад білків кукурудзи. Наше припущення, що активація синтезу РНК під дією підвищених доз ВМ може бути пов'язана зі змінами в експресії геному, що призводить до змін у компонентному складі білків було перевірено експериментально.

У ряді випадків, при порівнянні електрофореграм досліджуваних рослин, спостерігалась різниця в інтенсивності забарвлення білкових спектрів. Встановлено зменшення інтенсивності забарвлення смуг з M_r 18,9 кДа (підфракція 1в), 28,3 кДа та 25,6 кДа (підфракція 2а) в досліді при порівнянні з контролем. В той же час у рослин, які вирощувались на середовищі з важкими металами, яскрава смуга білків з M_r 20,6 кДа та 8,9 кДа відповідає слабозабарвленій у контрольних рослин.

Додавання в поживне середовище Cu²⁺ та Ni²⁺ також призводило до якісних відмінностей в компонентному складі білків. При порівнянні електрофореграм контрольних рослин з дослідними, при фарбуванні гелів у останніх було знайдено чіткі смуги для білків з M_r 12,8 кДа (підфракція 1в) та з M_r 18,3 кДа (підфракція 2а).

Крім того, спостерігались металоспецифічні зміни в інтенсивності забарвлення певних білкових смуг. Так, у підфракції 2б вміст білку з M_r 14,7 кДа був найвищий у рослин, які культивувались на середовищі з підвищеною концентрацією Cu²⁺.

Отримані дані свідчать, що в наслідок впливу іонів ВМ якісні та кількісні зміни поліпептидного складу спостерігаються не у всіх фракціях. Різниця в інтенсивності забарвлення смуг виявлена тільки для фракцій 0-40% та 0-60% насичення сульфатом амонію. Таким чином підвищена концентрація Cu²⁺ і Ni²⁺ викликає в рослинах більш виражені зміни в компонентному складі глобулінів. Зміни в інтенсивності забарвлення смуг спостерігаються, переважно, для слабокислих та нейтральних білків. Аналіз електрофореграм вказує на те, що відмінності в поліморфізмі цитоплазматичних білків за дії іонів ВМ характерні для низько- (до 20 кДа) та середньомолекулярних (20-70 кДа). Причому, зміни в останніх представлені ширше.

Кількісна та якісна різниця в компонентному складі цитоплазматичних білків за дії Nі²⁺ та Cu²⁺ очевидно зумовлена зміною поліморфізму окремих ферментів. Нами досліджено поліморфізм фенолоксидази та пероксидази у паростків кукурудзи, що росли в умовах впливу іонів ВМ.

Дослідження ізоферментного складу пероксидази паростків кукурудзи показало наявність п'яти ізоформ з відносною електрофоретичною рухливістю (Rf) 0.03, 0.06, 0.48, 0.74 та 0.86. При вивченні поліморфізму фенолоксидази встановлено існування восьми ізоферментів з Rf -- 0.03, 0.06, 0.07, 0.11, 0.16, 0.48, 0.74 та 0.77. Різниці в ізоферментних спектрах між контрольними рослинами та рослинами, що зазнали впливу Cu²⁺ і Nі²⁺, не знайдено. Виявлена висока подібність ізоферментного складу пероксидази та фенолоксидази при порівнянні контрольних та дослідних форм, що свідчить про те, що ці ізоформи володіють як пероксидазною, так і фенолоксидазною активністю.

Отже, вирощування проростків кукурудзи протягом 3-ох діб на середовищі, що містить 0,4 мM CuCl₂ або NiCl₂, викликає кількісні та якісні зміни в компонентному складі цитозольних білків. В той же час, попередні дослідження показали відсутність помітних морфологічних змін у рослин за дії даних доз металів (максимальна підпорогова доза).

Виявлені зміни в компонентному складі білків можна пояснити декількома причинами, які виникають в результаті як беспосередньої, так і опосередкованої дії ВМ. Однією з них є репресія та активація регуляторних генів. Зміна активності регуляторних генів може викликати підвищення інтенсивності процесів білкового синтезу або посилення катаболічних явищ, активацію метаболічних шляхів, які альтернативні інгібованим. Це, в свою чергу, може викликати зміни в інтенсивності синтезу білків та відповідних РНК.

Встановлені нами зміни в компонентному складі білків можуть бути результатом різноманітних за механізмом протеолітичних процесів (зокрема, убіквітин-залежний протеоліз). Це узгоджується з результатами наших досліджень, оскільки за дії Nі²⁺ та Cu²⁺ спостерігається зростання інтенсивності забарвлення смуги для білку з молекулярною масою 8,9 кДа, що приблизно відповідає молекулярній масі убіквітину [Lage et al., 1994]. Іншою причиною зміни у білкових спектрах може бути експресія генів захисних білків, як це було показано для різних видів стресу [Блехман, 1987].

Отже, зміни у спектрах білків цитозолю відображають перебудову метаболізму рослинної клітини у відповідь на вплив іонів важких металів. Ці перебудови мають бути пов'язані зі змінами у синтезі РНК, як це і було продемонстровано в розділі 3.



ВИСНОВКИ

1. Інгібування синтезу яРНК на 50 % в системі ізольованих клітинних ядер відбувається при таких концентраціях досліджених іонів важких металів: Ni²⁺ -- 0,250 мМ (Solanum tuberosum) і 0,425 мМ (Zea mays); Cd²⁺ -- 0,1 мМ (S. tuberosum) і 0,125 мМ (Z. mays) та Cu²⁺ -- 0,04 мМ для обох досліджуваних видів.

2. Під впливом максимальної підпорогової дози Cu²⁺ та Ni²⁺ у інтактних рослин кукурудзи відбувається активація синтезу всіх класів РНК. Так, відносна інтенсивність синтезу РНК у кукурудзи за дії Cu²⁺ зростає на 80% в ядерній фракції РНК, на 30% в рибосомній РНК та на 100% в транспортній РНК в порівнянні до контролю. При такій же концентрації Ni²⁺ збільшення інтенсивності синтезу РНК становить 200 % для яРНК, 90 % для рРНК та 180 % для тРНК

3. SH-вмісні сполуки в системі ізольованих ядер (дитіотрийтол) знімають інгібуючий вплив іонів важких металів на синтез РНК. У рослин кукурудзи мінімальна з досліджених доз Cu²⁺, Cd²⁺ і Ni²⁺ (0,08 мM) викликає підвищення кількості SH-вмісних сполук (в 3,4; 6,0; 1,8 рази відповідно) порівняно з контролем; з підвищенням концентрацій іонів металів до 0,4 мM вміст даних сполук досягає максимуму (4,5; 6,2; 2,3 рази). При дії іонів важких металів в концентрації 4 мM вміст SH-сполук вірогідно не відрізняється від контролю. Найсильнішим індуктором синтезу SH-вмісних сполук є Cd²⁺; Cu²⁺ займає проміжне положення, а Ni²⁺ викликає найменші зміни.

4. Дія максимальної підпорогової дози Cu²⁺ та Ni²⁺ на рослини кукурудзи призводить до кількісних змін в компонентному складі білків (зміни в інтенсивності забарвлення смуг) -- зменшення інтенсивності забарвлення смуг з молекулярними масами 18,9; 28,3 та 25,6 кДа та збільшення даного показника для смуг, що відповідають білкам з молекулярними масами 8,9 та 20,6 кДа у досліді в порівнянні до контролю.

Додавання в поживне середовище іонів міді та нікелю призводить до якісних змін (поява чи зникнення окремих смуг) в компонентному складі білків: на відміну від контролю у дослідних рослин знайдено чіткі смуги з молекулярними масами 12,8 та 18,3 кДа.

Спостерігаються металоспецифічні (характерні тільки для одного з досліджуваних металів) зміни в інтенсивності забарвлення певних білкових смуг: вміст білку з молекулярною масою 14,7 кДа найвищий у рослин, які культивувались на середовищі з підвищеною концентрацією іонів міді.

5. Залежність між концентрацією іонів важких металів в поживному середовищі та його токсичністю для рослини (відносна фітотоксичність) відображується наступним рядом: Cd²⁺ > Cu²⁺ > Co²⁺ > Nі²⁺ > Cr³⁺ > Sr²⁺

а залежність між концентрацією іонів важких металів у тканинах рослин та його токсичним впливом (відносна цитотоксичність): Cr³⁺ Cd²⁺ Cu²⁺ > Nі²⁺ Co²⁺ > Sr²⁺.

6. Максимальна підпорогова доза іонів Cd²⁺, Cu²⁺ і Ni²⁺ (при якій у рослин картоплі та кукурудзи не спостерігається помітних морфо-фізіологічних порушень) становить 0,4 мМ.

7. Досліджені іони важких металів відрізняються за здатністю проникати у рослини -- співвідношення розподілу іонів важких металів між поживним середовищем та тканинами кореня складає: для Co²⁺ -- 1:50-60, для Cd²⁺ -- 1:10, для Cu²⁺ -- 1:3,5-6, для Ni²⁺ -- 1:3,2_6, для Cr³⁺ -- 1:0,5-4 і для Sr²⁺ -- 1:0,5_3. В більшості випадків тканини кореня містять більше іонів важких металів, ніж середовище, з яким вони безпосередньо контактують.

8. Вивчені іони важких металів переважно нагромаджуються в коренях рослин -- співвідношення концентрації іонів важких металів в надземній і підземній частинах рослин складає для картоплі: для Sr²⁺ 1:0,8-1.5; для Ni²⁺ -- 1:1,5-2,5; для Co²⁺ -- 1:4,6_6,0; для Cr³⁺ -- 1:6,0-10,0, для Cu²⁺ -- 1:6,0-18,0 і для Cd²⁺ -- 1:6,0-18,0 та для кукурудзи: для Ni²⁺ -- 1:7,0-11,0; для Cu²⁺ -- 1:10,0-57,0.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Волков Р.А., Костышин С.С., Рогозинский М.С., Панчук И.И. Изменения в повторяющихся полинуклеотидных последовательностях при анеуплоидии у табаков // Журн. эволюционной биохим. и физиол. -- 1992. -- 28, № 4 -- C. 417_425.

Рогозинський М.С., Язловицька Л.С., Мардаревич М.Г., Волков Р.А. Вплив іонів важких металів на інтенсивність синтезу РНК іn vіtro та іn vіvo у рослин // Наук. вісник Чернівецького ун-ту. Серія Біологія. 1997. -- Вип. 17. -- С. 38-49.

Рогозинський М.С., Язловицька Л.С., Волков Р.А. Нагромадження важких металів рослинами картоплі та кукурудзи // Наук. вісник Чернівецького ун-ту. Серія Біологія. 1998. -- Вип. 20. -- С. 77-83.

Рогозинский М.С., Костышин С.С., Волков Р.А. Влияние ионов тяжелых металлов на синтез РНК в изолированных клеточных ядрах растений // Физиол. и биох. культ. растений. -- 1998. -- 30, № 3. -- С. 209_214.

Рогозинский М.С., Шелифост А.Е., Костышин С.С., Волков Р.А. Действие ионов тяжелых металлов на растения в культуре іn vіtro // Физиол. и биохим. культ. растений. -- 1998. -- 30, № 6. -- С. 465-471.

Язловицька Л.С., Рогозинський М.С., Костишин С.С., Волков Р.А. Вплив Cu²⁺ та Nі²⁺ на інтенсивність синтезу РНК у проростках кукурудзи // Укр. біохім. журн. -- 1999. -- 71, № 1. -- С. 56-60.

Рогозинский М.С. Вплив іонів важких металів на синтез фітохелатинів у рослин кукурудзи // Наук. вісник Чернівецького ун-ту. Серія Біологія. 1999. -- Вип. 39. -- С. 78-83.

Волков Р.А., Костышин С.С., Панчук И.И., Рогозинский М.С., Толстюк С.М., Шелифост А.Е. Разработка способов получения и оценки селекционно-ценных форм сельськохозяйственных растений на основе биотехнологических подходов // Тез. докл. І Всесоюзн. планово-отчетной конф. “Генная и клеточная инженерия”. М., 1991. -- С.91.

Рогозинський М.С., Тімошик Б.З., Волков Р.А. Накопичення іонів важких металів та їх вплив на картоплю в культурі іn vіtro // Тези доп. ІІ з'їзду Укр. товариства фізіологів рослин. -- К., 1993. -- Т.ІІ. -- C.62-63.

Давидюк Ю.М., Рогозинський М.С., Язловицька Л.С., Костишин С.С., Волков Р.А. Використання системи синтезу РНК іn vіtro для оцінки токсичної дії важких металів // Тези І Міжнародного сімпозіуму “Медико-екологічні проблеми охорони здоров'я в Україні”. -- Чернівці, 1994. -- С.20-21.

Volkov R., Rohozynskyj M., Yazlovіtskaya L. Cu and Nі іnfluence on transcrіptіonal actіvіty іn plants // 23-rd Meetіng of the FEBS. -- Basel, Swіtzerland, August 13-18, 1995. -- P. 153.

Язловицька Л.С., Харабара І.І., Рогозинський М.С. Поліморфізм цитоплазматичних білків за дії іонів міді та нікелю // Тези доп. VІ Конф. молодих вчених, присвяч. 50-річчю заснування Інституту фізіології рослин та генетики НАН України. -- К., 1996. -- С. 60-61.

Язловицька Л.С., Рогозинський М.С., Волков Р.А. Поліморфізм цитоплазматичних білків за дії стресових факторів // Тези доп. VІІ Укр. біохімічного з'їзду. К., 1997. -- С. 103-104.

Размещено на Allbest.ru