Значення генетичних відмінностей в реактивності модельних об’єктів і клітин людини при дії електромагнітних випромінювань різних частот і біологічно активних речовин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Значення генетичних відмінностей в реактивності модельних об'єктів і клітин людини при дії електромагнітних випромінювань різних частот і біологічно активних речовин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема неспецифічної стійкості організмів і можливості впливу на цей показник дуже актуальна в теоретичному і практичному плані. Дослідження даного питання на модельному об'єкті - дрозофілі, дозволяє краще зрозуміти природу цього явища. Вплив електромагнітних полів різнихжин хвиль на даний показник, окрім прикладного значення має великий теоретичний інтерес. Дослідження генома еукаріотичних організмів показали, що на рівні клітинного ядра існують специфічні механізми регуляції генетичної активності, зв'язку з чим дослідження інтегральних біофізичних характеристик клітинних ядер набуває особливої актуальності. Вивчення біоелектричних властивостей доповнює наші уявлення про механізми регуляції активності клітинних ядер, дії на клітини різних абіотичних факторів і біологічно активних речовин, стійкості клітин до пошкоджуючих факторів. Результати досліджень за допомогою метода внутрішньоклітинного електрофорезу ядер мають також прикладне значення і знаходять застосування в різних галузях медицини при вивченні стомлюваності, витривалості людини в екстремальних умовах, неспецифічних реакцій організму на різні захворювання, а також у сільському господарстві при виявленні стійкості сільскогосподарських рослин, підвищення врожайності і вивченні природи гетерозису.

Показано, що біоелектричні властивості ядер є лабільний показник, який реагує на зміну їх функціональної активності. Менш вивчені зміни біоелектричних властивостей ядер клітин людини при дії фізіологічно активних речовин і зовнішніх фізичних факторів. Дія фізіологічно активних речовин - гормонів та інгібіторів біосинтезу стосується різних сторін життєдіяльності клітин, зокрема важливим представляється вивчення дії цих речовин на інтегральні показники стану геному.

В зв'язку з цим вивчення біоелектричних та інших інтегральних властивостей ядер клітин людини під час дослідження механізмів дії на клітину фізіологічно активних речовин, лазерного світла та мікрохвильового випромінювання набуває особливу актуальність.

Зв'язок роботи з планом і темою. Робота була виконана в рамках наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України в межах теми «Вивчити генетичні та епігенетичні основи життєздатності та стійкості организмів, розробити методи визначення та підвищення цих властивостей для медицини та селекції» за № держреєстрації 0198 U 005753.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення закономірностей змін прояву кількісних ознак: теплостійкості та репродуктивної здатності дрозофіли, а також змін біоелектричних та інших інтегральних властивостей клітинних ядер, які лежать в основі реакції клітини на дію фізичних і хімічних факторів, у зв'язку з генетичними відмінами.

Для досягнення мети дисертаційної роботи були поставлені наступні задачі:

1 - виявити на модельному об'єкті Drosophila melanogaster вплив лазерного і мікрохвильового опромінювання на прояв кількісних ознак: теплостійкості і репродуктивної здатності.

2 - дослідити вплив світла He-Ne лазера (довжина хвилі 632,8 нм) на електрокінетичні властивості ядер клітин людини in vitro.

3 - дослідити зміни ступеня конденсації хроматину в клітинах людини під впливом світла He-Ne лазера.

4 - вивчити ефекти ЗВЧ і НВЧ випромінювання на електрокінетичні властивості ядер клітин людини і ступінь конденсації хроматину в ядрах.

5 - дослідити дію на електрокінетичні властивості ядер клітин людини in vitro інсуліну та інгібіторів біосинтезу РНК і білка: актиноміцина-Д і циклогексиміда самих по собі і разом з інсуліном.

Наукова новизна роботи. В роботі показані ефекти лазерного світла і ЗВЧ - випромінювання на показники теплостійкості та репродуктивної здатності у дрозофіли.

В дисертаційній роботі вперше отримані дані про зміну електрокінетичних властивостей ядер клітин людини in vitro в зв'язку із впливом різних біологічно активних речовин, а також світла He-Ne лазера, НВЧ і ЗВЧ - опромінювання. Вивчені біологічно активні речовини, які змінюють активність синтетичних процесів у клітині, змінюють також біоелектричні властивості ядер клітин букального епітелія; напрямок змін електрокінетичних властивостей ядер відповідає відомим ефектам даних речовин. Вперше показано, що інсулін підвищує ЕНЯ, актиноміцин-Д і циклогексимід знижують ЕНЯ. Показано, що інсулін великої рогатої худоби здійснює менший ефект на показник, що вивчається, ніж інсулін свиней.

В цілому, отримані результати свідчать про зв'язок показника ЕНЯ клітин букального епітелія людини з біосинтетичною активністю клітини.

Отримані нові дані про вплив світла He-Ne лазера, ЗВЧ і НВЧ опромінювання на електрокінетичні властивості ядер клітин людини і стану хроматину в ядрах. Ці дані засвідчують про значне підвищення ЕНЯ при мікрохвильовому і лазерному опромінюванні та підвищення вмісту гетерохроматинових гранул в ядрах при вказаних впливах.

Практична цінність роботи. Отримані результати дозволяють рекомендувати вивчення електронегативності клітинних ядер людини під час дослідження дії фізіологічно активних речовин.

В роботі показано, що ефект інсуліну на електронегативність ядер залежить від його концентрації та видової специфічності. Це дає можливість розглядати метод визначення електронегативності ядер клітин букального епітелія людини як один з перспективних методів порівняльної оцінки препаратів інсуліну при умові подальшої доробки методу.

Результати дослідження і методика мікроелектрофореза застосовуються в учбовій роботі на кафедрі генетики і цитології ХНУ.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина здобувачем зроблена повністю самостійно. Аналіз отриманих даних був проведений спільно з керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень по темі дисертації були представлені на VIII Міжнародній науково-практичній конференції «Застосування лазерів в медицині та біології» (Харків, 1-5 квітня 1997 р.), на II З'їзді біофізиків Росії (Москва, 23-27 серпня 1999 р.), на 9-й Міжнародній Кримській конференції «НВЧ техніка і телекомунікаційні технології». Севастопольський державний технічний університет (Крим, 13-16 вересня 1999 р.), на XII Міжнародній науково практичній конференції «Застосування лазерів в медицині і біології» (Харків, 20-23 квітня 1999 р.).

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 4 статті, 4 тезисів.

Зміст і обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, 3 глав, висновку, висновків, рекомендації, додатку, списку літератури (318 джерел).

У вступі розглянуто актуальність, мета і задачі роботи. Також вказані об'єкти і основні методи дослідження, перераховані нові результати, які були отримані в роботі і які захищаються автором, приведені дані про апробацію роботи і публікаціях.

Перша глава представляє собою огляд літератури.

В другій главі розглянуті об'єкти і методи дослідження.

В третій главі розглядаються результати впливу He-Ne лазера на модельний об'єкт Drosophila melanogaster при вивченні таких показників як теплостійкість і репродуктивна здатність, приведені результати досліджень електронегативності ядер людини під впливом НВЧ, ЗВЧ і лазерного опромінювання, інсуліну, інгібіторів біосинтезу РНК і білку. У

висновку обговорюються основні результати, отримані в роботі.

У висновках коротко сформульовані результати досліджень.

Текст дисертації викладений на 140 сторінках машинописного тексту, містить 15 таблиць, між ними 7 рисунків, 318 літературних джерел.

Робота виконана на кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету в 1996-2000.

Об'єкти та методи досліджень

Класичний об'єкт генетики-Drosophila melanogaster був об'єктом досліджень в експериментах по вивченню впливу світла лазера і мікрохвильового випромінювання на прояви теплостійкості і репродуктивної здатності. Використовували лінії дрозофіли з високою статевою активністю самців і з низькою статевою активністю і також іх прямі і реципрокні гібриди.

Були проведені дослідження на клітинах букального епітелія людини in vitro. Ці клітини були підвержені впливу випромінювання He-Ne лазера, НВЧ і ЗВЧ, а також біологічно активних речовин, таких як інсулін, актиноміцин-Д і циклогексимід.

У роботі для оцінки теплостійкості імаго інбредних ліній і гібридів дрозофіли був застосований метод термотеста. Були вивчені також такі показники, як репродуктивна здатність і вихід імаго. Вплив світлом лазера і випромінювання надвисокі частоти (НВЧ) на дрозофілу проводили на ранніх етапах онтогенезу: під час ембріогенезу і на личинок 1-2 віку.

На кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету розвивається біофізичний підхід до проблем генетики, зокрема, досліджуються біоелектричні властивості клітинного ядра і стану хроматину в ядрах. Вивчення заряду клітинного ядра і хроматинових структур дозволяє отримати нову цінну інформацію про процеси, що лежать в основі регуляції функціональної активності ядер і механізмів порушення функції ядер. Метод внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу ядер дозволяє робити висновки про заряд цілого ядра і хроматинових структур в ядрі. З допомогою цього методу можна робити висновки про електронегативність ядер (ЕНЯ), яку оцінювали по проценту негативно заряджених ядер.

Застосовували також метод дослідження стану хроматину, який оцінювали по вмісту в ядрах клітин гранул гетерохроматину (ВГГ).

В якості джерела НВЧ випромінювання (довжина хвилі 7,1 мм, щільність потужності-0,2 мВт/см²) використовували апарат для мікрохвильової терапії ЯВЬ-1. Джерелом випромінювання надвисокої частоти (ЗВЧ, довжина хвилі 1,6 см, щільність потужності 0,2 мВт/см²) був прилад, сконструйований на кафедрі прикладної електродинаміки ХНУ. Джерелом лазерного опромінювання (довжина хвилі 632,8 нм, щільность потужності 5 і 1 мВт/см²) були лазери ЛГ-78 і ЛГН-120. Статистична обробка результатів проведена за методом Стьюдента.

Основні результати досліджень

З метою виявлення ефектів електромагнітного випромінювання на організменому рівні на модельному об'єкті Drosophila melanogaster було вивчено вплив мікрохвильового випромінювання на експресію кількісних ознак - теплостійкості і плодовитості. Вплив здійснювали на ранніх етапах онтогенезу: під час ембріогенезу і на личинок 1-2 віку.

Дослідження проведено в двох незалежних експериментах, результати яких приведені на рисунку 1.

Із наведених даних видно, що внаслідок опромінювання світлом лазера на протязі 1-5 хвилин спостерігалось підвищення теплостійкості самців лінії НА.

Самці ліній НА та ВА проявляли меншу теплостійкість, ніж самиці. Лінія НА за нашими даними і за даними інших авторів характеризувалась зниженою теплостійкістю у порівнянні з лінією ВА. Вплив лазерного опромінювання яєць та личинок дрозофіли на показники плодючості і виходу імаго досліджували в двох незалежних експериментах, результати яких наведені на рисунку 2.

Дослідження впливу мікрохвильового випромінювання на показники теплостійкості та плодючості D. melanogaster також наведені в двох незалежних експериментах. Результати експериментів наведені на рисунках 3 і 4.

Із даних на рисунку 3 видно, що опромінювання яєць та личинок дрозофіли хвилями ЗВЧ діапазону на протязі 1 хвилини викликало значне зростання показників у самців і самиць лінії НА. В першому досліді також спостерігали збільшення цього показника і у гібридів НАхВА.

Із наведених на рисунку 4 даних видно, що мікрохвильове опромінення як і лазерне викликало підвищення показників плодючості і виходу імаго у ліній та плодючості. гібридів дрозофіли. Однак, в варіантах ВАхНА в другому експерименті и НАхВА у першому експерименті були відмічені випадки зниження виходу імаго при зростанні

Таким чином говорити про достовірну стимуляцію виходу імаго у гібридів на відміну від лінії немає підстав.

Ми вважаємо, що провідним фактором впливу лазерного світла на клітину є вплив світла на клітинне ядро - центр, що інтегрує і координує різні клітинні реакції. В зв'язку з цим були проведені дослідження впливу світла He-Ne лазера на електрокінетичні властивості клітинних ядер людини.

Використовували клітини трьох груп донорів: донорів дитячого віку, донорів середнього віку і донорів похилого віку.

Із даних, наведених на рисунку 5, видно, що в контролі, тобто без впливу лазерного випромінювання, показник ЕНЯ різний у різних груп донорів.

Так у донорів середнього віку він досягає найбільших значень (75,5%), дещо нижче у донорів дитячого віку (66,2%) і нижче всього у донорів похилого віку (36,7%). Ці результати в цілому відповідають виявленим раніше даним про вікові зміни цього показника. Із представлених даних видно, що опромінювання клитин світлом лазера призводить до значного підвищення ЕНЯ у всіх груп донорів, причому ефективно діючою виявляється уже мінімальна експозиція (1 секунда). У донорів дитячого і середнього віку збільшення експозиції до 20-40 секунд призводило до значного росту ЕНЯ, подальше збільшення експозиції не призводило до видимого збільшення ЕНЯ. Декілька інша картина спостерігалась під час опромінювання клітин донорів похилого віку. Збільшення експозиції до 150 і 300 секунд викликало підвищення ЕНЯ до максимальних значень. Можливо, це пов'язано з початково низьким рівнем ЕНЯ у цих донорів.

В наступній серії експериментів ми вивчали, як розвивається реакція клітин на лазерне опромінювання в часі. Досліджували зміну ЕНЯ через 10, 30 і 60 хвилин після одноразового опромінювання світлом лазера на протязі однієї секунди і п'яти хвилин. Отримані дані наведені на рисунку 6.

З наведених даних видно, що при експозиції одна секунда у донорів дитячого і похилого віку спостерігається підвищення ЕНЯ через 10, 30 і 60 хвилин після впливу, причому ефект опромінювання зростає при збільшенні витримки після опромінювання. Клітини донорів групи середнього віку виявилися більш стійкими до впливу лазерного світла. Через 10 хвилин після опромінювання ЕНЯ не змінилася, через 30 хвилин спостерігається незначний ріст ЕНЯ, через 60 хвилин-падіння цього показника. П'ятихвилинне опромінювання достовірно підвищувало ЕНЯ клітин донорів дитячого і похилого віку, причому ефект опромінювання посилюється із збільшенням часу після впливу.

Далі ми досліджували ефекти ЗВЧ і НВЧ випромінювання на стан ядер клітин людини.

Результати експериментів по опромінюванню клітин ЗВЧ наведені на рис. 7. Опромінювання ЗВЧ викликало значне підвищення величини ЕНЯ в клітинах всіх обстеженних донорів. Ефективним виявився вже мінімальний час опромінювання ЗВЧ (1 сек.), збільшення експозиції призводило до росту ЕНЯ, найбільш вираженому у донорів середнього і похилого віку.

На рисунку 7 наведені дані експериментів з НВЧ опромінювання клитин. Опромінювання НВЧ також призводило до росту значень ЕНЯ вже при мінімальній експозиції, однак монотонного росту ЕНЯ із збільшенням експозиції не спостерігалось.

Так, при експозиції 30 сек. в клітинах донорів дитячого віку і при експозиції 60 сек. в клітинах донорів середнього і похилого віку спостерігали зниження значень ЕНЯ відносно рівня, досягнутого при меншій експозиції.

Результати експериментів стосовно дії електромагнітних випрамінювань (лазер, ЗВЧ і НВЧ опромінювання) на стан хроматину в ядрі клітин наведені в таблиці 2.

Вже односекундне опромінювання світлом лазера, ЗВЧ і НВЧ викликало достовірне підвищення ВГГ.

Підвищений рівень ВГГ зберігається і через 24 години після опромінювання. Через 4 години після опромінювання світлом лазера підвищення ВГГ не досягало статистично значимого рівня. В таблиці 10 наведені дані про вплив лазерного опромінювання на показник ВГГ в клітинах донорів різного віку. Отримані результати свідчать про підвищення ВГГ і підвищення ступеня конденсованості хроматину під час опромінювання світлом лазера.

Ми також досліджували вплив біологічно активних речовин на величину електронегативності ядер (ЕНЯ) клітин людини.

Вивчали зміну показника ЕНЯ під час дії на клітину таких біологічно активних речовин, як інсулін, що викликає, як відомо, активацію синтезу РНК і білка та інгібіторів біосинтезу РНК і білка актиноміцина-Д і циклогексиміда.

В дослідженні використовували клітини букального епітелія десяти донорів віком від 7 до 78 років.

Результати досліджень впливу інсуліну великої рогатої худоби на клітини людини у 10 донорів різного віку на протязі 20 хвилин наведені на рис. 8

Як видно з даних рисунку 8, рівень ЕНЯ в контролі (без впливу інсуліну) різний у різних донорів відповідно до їхнього віку. Найменших значень ця величина досягала у донорів молодшого і похилого віку.

Ми досліджували вплив на клітини різних донорів інсуліну великої рогатої худоби і інсуліну свиней в різних концентраціях на протязі 20 хвилин. Результати цього експерименту наведені в таблиці 3.

Із наведених даних видно, що інсулін свиней і інсулін великої рогатоїи худоби викликали достовірне підвищення ЕНЯ в клітинах всіх донорів в концентрації 0,2 мОд/мл.

Інсулін свині в концентраціях 0,2 і 0,1 мОд/мл підвищував ЕНЯ в більшій мірі, ніж інсулін великої рогатої худоби. В таблиці 13 наведені дані про вплив інгібіторів біосинтезу РНК і білка та інсуліну великої рогатої худоби на показник ЕНЯ в клітинах донорів різного віку. Інгібітор синтезу РНК - актиноміцин-Д викликав значне зниження ЕНЯ при всіх експозиціях. У донорів похилого віку спостерігали посилення ефекту актиноміцину-Д при збільшенні експозиції від 1 години до 24 годин.

Подібну картину спостерігали і під час дії інгібітора білкового синтезу-циклогексиміда. Циклогексимід викликав зниження ЕНЯ у всіх донорів, однак у донорів дитячого віку достовірне зниження ЕНЯ спостерігали тільки при експозиціях 1 години і 24 годин.

Інсулін великої рогатої худоби в концентрації 0,05 мОд/мл викликав підвищення ЕНЯ у донорів молодшого і похилого віку під час всих експозицій, але не впливав на ЕНЯ деяких донорів середнього віку. Під час комбінованого впливу інсуліну та інгібіторів біосинтезу у донорів дитячого і похилого віку спостерігали зниження ЕНЯ відносно рівня, що спостерігали під час дії одного інсуліну.

Висновки

дрозофіла репродуктивний клітинний генетичний

Опромінювання світлом лазера яєць та личинок дрозофіли викликає підвищення показників теплостійкості імаго у лінії дрозофіли, яку відселектували за ознакою низької статевої активності самців (НА), яка характеризується і низькою теплостійкістю. У більш теплостійкої лінії, відселектованої за ознакою високої статевої активності самців (ВА) та гібридів, таких ефектів не спостерігалось.

Низькоенергетичне опромінювання яєць і личинок дрозофіли ЗВЧ викликало підвищення теплостійкості імаго дрозофіли лінії НА, але не впливало на цей показник імаго лінії ВА і гібридів.

Опромінювання яєць і личинок дрозофіли ЗВЧ і світлом лазера призводить до підвищення показників репродуктивної здатності і виходу імаго у лінії НА і гібридів НАxВА та ВАxНА. У лінії ВА такого ефекту не спостерігалось.

Дія лазерного світла і ЗВЧ-випромінювання на показники стійкості і репродуктивної здатності, що вивчалися, обумовлена їх неспецифічною дією на організм.

Низькоенргетичне випрамінювання світла He-Ne лазера, ЗВЧ і НВЧ викликає підвищення ЕНЯ ядер клітин людини вже при мінімальній із досліджуваних експозицій (1 секунда).

Під час опромінювання клітин електромагнітними випромінюваннями ЗВЧ і НВЧ діапазону спостерігається підвищення кількості гранул гетерохроматину в ядрах клітин.

Біоелектричні якості ядер змінюються під час дії на клітини біологічно активних речовин. Інсулін викликає підвищення ЕНЯ, інгібітори біосинтезу РНК і білка: актиноміцин-Д і циклогексимід - зменшення цього показника і знімають дію інсуліну на показник електронегативності ядер. Таким чином, величина електронегативності ядер корелює з рівнем функціональної активності ядра і клітини в цілому.

Виявлені відмінності в дії інсуліну різного походження на показник електронегативності ядер. Інсулін свині в більший мірі підвищував електронегативність ядер, чим інсулін великої рогатої худоби.

Результати даної роботи свідчать про значні ефекти мікрохвильового і лазерного опромінювання на клітинному та організменному рівні, реакція на вклазані фактори визначена генотипічно

Зміна показників електронегативності ядер і стану хроматину в ядрах під час опромінювання може розглядатися як неспецифічні реакції клітини на опромінювання.

Список опублікованих праць