Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу в сомі та дендритах нейронів центральної нервової системи ссавців

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Гаращук Ольга Віталіївна

УДК 612.822

Механізми регуляції кальцієвого гомеостазу в сомі та дендритах нейронів центральної нервової системи ссавців

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця Національної Академії Наук України та Інституті фізіології Заарландського університету Федеративної Республіки Німеччини.

Консультант: академік, доктор біологічних наук, зав. відділом

фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Кришталь Олег Олександрович

Офіційні опоненти: професор, доктор біологічних наук, зав. відділом фізіології стовбура мозку Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Лиманський Юрій Петрович

професор, доктор біологічних наук, заступник директора Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Костерін Сергій Олексійович

доктор медичних наук, Головний науковий співробітник Інституту фармакології і токсикології АМН України, керівник Центру доклінічного вивчення лікарських засобів Державного нуково-експертного центру МОЗ України Соловйов Анатолій Іванович

Провідна установа: Інститут фізіології ім. Петра Богача при Київському Національному університеті им. Тараса Шевченка

Захист відбудеться 11 квітня 2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої ради Д-96.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Автореферат розіслано 17 лютого 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна Маріна З.О.

Вступ

Актуальність проблеми: Йони кальцію є одними з найбільш важливих і універсальних регуляторів клітинних функцій. Змінами їх внутрішньоклітинної концентрації регулюється ряд фізіологічних та біохімічних процесів, таких як проліферація, секреція, виникнення збудження та його розповсюдження, синтез білків та ін. (Kostyuk, 1992). Підтримання внутрішньоклітинної концентрації йонів кальцію ([Ca2+]i) на дуже низькому рівні (10-8 -10-7 моль/літр) в стані спокою та часовий перебіг підвищення [Ca2+]i під час клітинної активності забезпечується завдяки взаємодії різноманітних структур, розташованих як в цитоплазмі, так і в мембрані клітини.

Останнім часом зусиллями багатьох дослідників (Костюк, 1992) було досягнуто значного прогресу в з`ясуванні молекулярних та функціональних механізмів дії цих структур в ізольованих нейронах та нейронах, культивованих in vitro. Проте ряд важливих аспектів кальцієвого гомеостазу в інтактних нейронах та їх дендритах, місцях розташування синаптичних контактів, все ще залишаються нез`ясованими. Ґрунтовного дослідження вимагають також питання взаємодії цих механізмів як на рівні окремої клітини, так і на рівні нативних мереж нейронів. Особливо це стосується нейронів ЦНС, дослідження яких в умовах, близьких до природних (наприклад, в зрізах мозку), довший час залишалось недоступним із-за відсутності адекватних методичних підходів. В той же час вивчення різноманітних процесів, які в нейронах ЦНС регулюються змінами [Ca2+]i, неможливе без грунтовного знання механізмів регуляції їх кальцієвого гомеостазу, а саме: (1) механізмів входу Ca2+ через канали, розташовані в клітинній мембрані, (2) механізмів вивільнення Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо і (3) механізмів зв'язування Ca2+ в цитоплазмі як відповідними білками, так і внутрішньоклітинними Ca2+-депо.

Мета роботи полягала в з'ясуванні синаптичних та клітинних механізмів, що впливають на рівень [Ca2+]i в цитоплазмі нейронів ЦНС в зрізах мозку, а також у вивченні їхньої взаємодії та зміни в процесі онтогенезу.

Для досягнення даної мети були поставлені такі конкретні завдання:

1.Вдосконалити метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків з метою його застосування для вивчення рецептор-каналів, розташованих в сомі та дендритах нейронів ЦНС в зрізах мозку. Порівняти кальцієву проникність соматичних та дендритних йонотропних глутаматних рецептор-каналів (NMDA- та не-NMDA-типу) в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

2.Охарактеризувати молекулярну будову даних рецептор-каналів. Дослідити взаємозв'язок між кальцієвою проникністю глутаматних рецептор-каналів певного типу та їх молекулярною будовою.

3.Дослідити функціональні властивості соматичних та дендритних внутрішньоклітинних Ca2+-депо, що відповідають за Ca2+-індукований викид Ca2+ в цитоплазму. Порівняти функціональні властивості цих депо в збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС.

4.З'ясувати роль Ca2+-зв'язуючих білків (на прикладі кальбіндину) та їх вплив на часовий перебіг внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів.

5.Вивчити механізми генерації кальцієвих сигналів в період раннього постнатального розвитку. З'ясувати роль ГАМК-активованого підвищення [Ca2+]i в сомі та дендритах.

6.Дослідити взаємодію різних механізмів регуляції [Ca2+]i та їх роль в процесі формування функціональної глутаматергічної синаптичної мережі під час раннього постнатального розвитку.

Наукова новизна. В процесі виконання роботи метод точного вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків було вдосконалено та вперше застосовано для визначення Ca2+-проникності глутамат-активованих рецептор-каналів, розташованих на сомі та дендритах нейронів в зрізах мозку щурів. Завдяки цьому вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність дендритних глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в фізіологічних умовах. Встановлено, що Ca2+-проникність дендритних, ймовірно синаптичних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу, збігається з проникністю соматичних, позасинаптичних рецептор-каналів і становить 11.12% та 0.6% відповідно.

Досліджено особливості молекулярної будови рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу в принципових збуджуючих (на прикладі пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципових гальмівних (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) нейронах, а також інтернейронах (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки) в зрізах мозку щурів. Виявлено, що властивості глутамат-активованих рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються присутністю домінантної NR2В-субодиниці.

Досліджено функціональні властивості соматичних та дендритних рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку щурів. Показано, що в умовах фонової клітинної активності вони виступають в ролі кальцієвого буферу, чим сприяють підтриманню [Ca2+]i на низькому рівні. У період підвищеної клітинної активності, навпаки, ці депо здатні значно підсилювати Ca2+-сигнали в цитоплазмі завдяки процесові Ca2+-активованого викиду Ca2+.

Виявлено механізм ємнісного входу Ca2+ в нейрони ЦНС. Показано, що цей трансмембранний Ca2+-потік відповідає за наявність Ca2+ всередині депо, а отже, за їх дієздатність в стані спокою. Показано, що рианодин-чутливі Ca2+-депо мають надзвичайно велику буферну ємність і під час потужної клітинної активності здатні накопичувати до 20 разів більше йонів кальцію, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Виявлено, що йони кальцію, вміст яких всередині депо збільшується пропорційно до підвищення [Ca2+]i, повільно витікають звідти протягом наступних хвилин після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i. Завдяки цим властивостям рианодин-чутливі кальцієві депо здатні виступати в ролі елементу "пам'яті" або "детектора спів падіння", значно підсилюючи лише ті внутрішньоклітинні Ca2+-сигнали, котрі виникають під час посиленої клітинної активності.

Використовуючи методи генної інженерії створено мишей-мутантів, позбавлених кальцій-звўязуючого білку кальбіндину. Показано, що кальбіндин виступає в ролі швидкодіючого кальцієвого буферу, що драматично зменшує наявність вільного кальцію в цитоплазмі нейрону протягом перших 100 мс після активації входу Ca2+.

Досліджено механізми генерації внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в період раннього постнатального розвитку щурів. Показано, що на ранніх стадіях постнатального розвитку, коли глутаматергічні синаптичні зв'язки перебувають в зародковому стані, ГАМК, що є основним гальмівним нейромедіатором ЦНС у дорослому віці, викликає синаптичне збудження та генерацію внутрішньоклітинних Ca2+-сигналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів гіпокампу внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів, а також Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Виявлено, що 85 % нейронів в зрізах гіпокампу щурів віком 1-7 днів бере участь в генерації спонтанних періодичних (0.007-0.03 Гц) Ca2+-сигналів, які виникають в усіх нейронах одночасно. Ці кальцієві осциляції в період раннього постнатального розвитку мають синаптичне походження і критично залежать від активації збуджуючих ГАМК-ергічних синапсів. Встановлено, що виявлена нейрональна активність здатна трансформувати зародкові глутаматергічні синаптичні контакти в функціональні синаптичні контакти зрілого типу і, таким чином, сприяти формуванню повноцінної мережі синаптичних зв`язків. В основі цієї здатності лежить синхронна активація описаних в роботі механізмів регуляції [Ca2+]i, як то глутамат- та ГАМК-активованих рецептор-каналів, потенціал-залежних Ca2+-каналів та внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Зважаючи на те, що зародкові глутаматергічні синаптичні контакти було виявлено при народженні, крім гіпокампу, також в корі (Isaac, 1997; Rumpel, 1998) та спинному мозку (Li, 1998) ссавців та оптичному тектумі амфібій (Wu, 1996), вперше описаний в даній роботі механізм переходу зародкових глутаматергічних синаптичних контактів в функціональні синаптичні контакти зрілого типу може мати універсальне значення.

Практична цінність роботи полягає у вдосконаленні методів вимірювання з метою дослідження Ca2+-проникності агоніст-активованих рецептор-каналів, розташованих в місцях синаптичних контактів, та у висвітленні механізмів регуляції кальцієвого гомеостазу як в нейронах дорослих тварин, так і в нейронах, що знаходяться в процесі постнатального розвитку. Отримані в роботі дані про домінантну роль NR2В-субодиниці дають основу для створення високоселективних фармакологічних засобів, здатних протидіяти викликаній глутаматом під час травматичних пошкоджень та ішемії цитотоксичності. Висвітлення збудливої дії ГАМК під час раннього постнатального розвитку сприяє створенню ефективних лікарських засобів, які могли б застосовуватись при лікуванні дитячої епілепсії. Натепер найбільш поширеним терапевтичним засобом для лікування дитячої епілепсії є пентобарбітал, речовина, що підсилює ГАМК-активовані синаптичні струми. Не дивлячись на успішну дію цього препарату при лікуванні епілепсії у дорослих, чисельні дослідження вказують на обмежений успіх цього препарату при лікуванні новонароджених (Holmes, 1998), в ЦНС яких дія ГАМК є, найбільш ймовірно, збуджуючою. Більше того, дослідження, проведені на тваринах, вказують на негативний вплив пентобарбіталу на збільшення ваги мозку та розвиток сенсорних функцій під час постнатального розвитку (Mikati, 1994).

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Інституту біофізичної хімії імені Макса Планка (Гьоттінген, Німеччина), Інституту фізіології Заарландського Університету (Гомбург, Німеччина), Конференціях фізіологічного (Мюнхен, 1993; Йена, 1994; Мюнстер, 1995; Росток, 1997; Бонн 1999) та фармакологічного (Майнц, 1998) товариств Німеччини, Конференції фізіологічного товариства Великобританії (Лондон, 1993), Конференції Європейської асоціації з нейронаук (Відень, 1994; Берлін, 1998), Об'єднаній конференції німецького та швейцарського фізіологічних товариств (Цюріх, 1996), Конференціях нейрофізіологічного товариства Німеччини (Гьоттінген, 1995; 1997; 1999), Міжнародному симпозіумі з кальцій-звўязуючих білків (Лунд, 1997), Міжнародному симпозіумі з властивостей та функції глутаматних рецепторів (Тюбінген, 1998), Конференціях американського товариства з нейронаук (Вашінгтон, 1996; Нью-Орлеан, 1997; Лос Анджелес, 1998, Майамі, 1999) та лекціях, прочитаних на запрошення центру молекулярної медицини ім. Макса Дельбрюка (Берлін, 1998), відділу біохімії інституту психіатрії ім. Макса Планка (Мюнхен, 1998), біологічного факультету Бохумського університету (Бохум, 1999), медичного факультету університету ім. Мігеля Хернадеца (Аліканте, 1999) і біологічного факультету Кайзерслаутернського університету (Кайзерслаутерн, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 45 статей у наукових журналах та книгах.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 230 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 73 малюнками і 4 таблицями. Дисертація складається з вступу, опису сучасного стану досліджень, методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел з 220 найменувань.

Об'єкти та методи дослідження

Робота виконувалась на візуально ідентифікованих нейронах в трансверсних зрізах гіпокампу, фронтальних зрізах серединної перетинки та сагітальних зрізах мозочку щурів (Garaschuk, 1995; Garaschuk, 1996; Garaschuk, 1997; Plant, 1997; Garaschuk, 1998). В дослідженнях використовували нейрони, розташовані на відстані 20-40 µм від поверхні зрізу, що сприяло збереженню будови нейронів та їх нативних синаптичних контактів. В більшості експериментів було поєднано електрофізіологічні та флюорометричні методи дослідження з метою одночасної реєстрації змін внутрішньоклітинної концентрації Ca2+ ([Ca2+]i) та асоційованих змін потенціалу на мембрані нейрону. Для реєстрації електричних сигналів використовували підсилювач EPC-9 (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Процеси запису даних, електричної стимуляції клітин та аплікації хімічних речовин контролювалися за допомогою комп`ютерної програми "Pulse" (HEKA, Ламбрехт, Німеччина). Для реєстрації флюорометричних Ca2+-сигналів використовували як установку на базі CCD-камери (charge-coupled device camera) (Garaschuk, 1998), так і установки на базі конфокального мікроскопу з одно- та двофотонним збудженням барвника. Забарвлення нейронів Ca2+-чутливим барвником fura-2 проводили або шляхом включення барвника у склад внутрішньоклітинного розчину, або шляхом інкубації зрізів в зовнішньоклітинному розчині.

Для вимірювання трансмембранних Ca2+-потоків, викликаних активацією глутаматних рецепторів, Ca2+-чутливий барвник fura-2 у високій концентрації (1-2 мМ) додавали до внутрішньоклітинного розчину. За цих умов fura-2 витісняє ендогенні кальцієві буфери, зв'язує всі йони Ca2+ і тому дає змогу вимірювати загальну кількість йонів кальцію, що проходять через клітинну мембрану. Щоб дослідити взаємозв`язок між властивостями ліганд-активованих рецептор-каналів та їх молекулярним складом, ми використовували методи зворотної транскрипції та ланцюгової реакції полімерази на окремих нейронах в зрізах (Lambolez, 1992). Після закінчення флюорометричних і/або електрофізіологічних вимірювань вміст цитоплазми нейрону висмоктували через ту саму піпетку, що використовувалась для внутрішньоклітинного діалізу, і досліджували на вміст мРНК, що кодує певні субодиниці ліганд-активованих рецептор-каналів (Garaschuk, 1996; Tempia, 1996; Plant, 1997).

Результати досліджень

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в пірамідних нейронах СА1 регіону гіпокампу.

Для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецептор-каналів в сомі та дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу метод фіксації потенціалу на мембрані окремого, візуально ідентифікованого пірамідного нейрону, було поєднано з внутрішньоклітинною перфузією цього нейрону розчином, що містить високу концентрацію (1-2 мМ) Ca2+-чутливого барвника fura-2. Щоб встановити частку Ca2+ в агоніст-активованому катіонному струмі було визначено величину f, яка є відношенням зміни флюоресценції fura-2 на Ca2+-чутливій довжині хвилі (DF380) до загального катіонного струму через клітинну мембрану: f= DF380/ I dt (Neher, 1992; Schneggenburger, 1993; Garaschuk, 1996). Якщо катіонний струм переноситься виключно Ca2+, то f наближається до константи "fmax", що дорівнює DF380 на одиницю кальцієвого заряду. Якщо ж катіонний струм переноситься різними йонами, то f/fmax є "фракційним кальцієвим струмом", що скорочено позначається Pf. Значення Pf показує, який відсоток загального катіонного заряду переноситься йонами кальцію.

Проаналізувавши дані, отримані в результаті 302-х йонофоретичних аплікацій NMDA до соми 37 пірамідних нейронів регіону СА1, ми отримали значення PfNMDA, що дорівнює 10.69 ± 2.13%. Отже, при потенціалі на клітинній мембрані -60 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ приблизно 11 % загального заряду через соматичні рецептор-канали NMDA-типу переноситься йонами кальцію. Мал. 1 ілюструє залежність NMDA-активованих трансмембранних струмів і викликаних ними флуоресцентних сигналів від потенціалу на клітинній мембрані в присутності 1 мМ Mg2+ в зовнішньоклітинному розчині. Як показано на мал. 1Б, потенціал-залежність часових інтегралів NMDA-активованих трансмембранних струмів (QNMDA) відображає добре відому потенціал-залежність струму через NMDA-рецептор-канали, що зумовлюється потенціал-залежним блокуванням NMDA-рецептор-каналів йонами Mg2+ (Nowak, 1984; Mayer, 1987). Зауважте, що при потенціалах на мембрані від -70 до -20 мВ зміна амплітуди Ca2+-чутливих сигналів (DF380) відбувалась паралельно до зміни амплітуди QNMDA (мал.3Б), залишаючи, таким чином, PfNMDA без змін. Цікаво, що значний вхід Ca2+ через NMDA-активовані рецептор-канали спостерігався навіть тоді, коли загальний потік йонів через ці канали дорівнював 0 або набував протилежного напрямку (при потенціалах на мембрані від 0 до +30 мВ).

А, NMDA-опосередковані трансмембранні струми (внизу) та відповідні зміни F380 (вгорі) при різних підтримуваних потенціалах на мембрані нейрону. Б, залежність значень часового інтегралу відповідного NMDA-активованого струму (QNMDA) та значень амплітуди відповідних змін флюоресценції DF380 від підтримуваного потенціалу.

Порівнюючи безпосередньо Ca2+-проникність дендритних рецептор-каналів NMDA-типу з Ca2+-проникністю соматичних рецептор-каналів одного й того ж самого нейрону (мал. 3), майже ідентичні значення PfNMDA було отримано попарно в сомі та дендритах кожної з пірамідних клітин (n=7, мал. 4).

А, комбіноване епіфлюоресцентне та світлове зображення пірамідного нейрону СА1-регіону гіпокампу. Криві, представлені в Б і В, є кривими зміни флюоресценції в соматичному (1) та дендритному (2) регіонах відповідно. Б та В ілюструють синхронні зміни флюоресценції та трансмембранного струму внаслідок йонофоретичних аплікації NMDA почергово до соми (Б) та дендритів (В). А - ілюструє місце розташування йонофоретичної піпетки під час дендритних аплікацій NMDA.

А, графік залежності декременту зміни флюоресценції DF380 від часового інтегралу QNMDA відповідного трансмембранного струму під час локальних соматичних (n=20, заштриховані символи) та дендритних (n=17, порожні символи) аплікацій NMDA. Б, порівняння значень PfNMDA, отриманих попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (n=7). В кожній з пар дендритне значення є нормалізованим до значення PfNMDA, отриманого в сомі відповідного нейрону.

Отже, Ca2+-проникність соматичних та дендритних глутаматних рецептор-каналів NMDA-типу є подібною, складаючи приблизно 11%.

До останнього часу рецептор-канали не-NMDA-типу вважались непроникними для Ca2+ (Jonas, 1992). В подальших експериментах ми дослідили можливу роль цих рецепторів як джерела глутамат-активованого входу Ca2+ в клітину. Йонофоретичні аплікації як АМРА, так і каїнату до апікальних дендритів пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу викликали чітко окреслені Ca2+-сигнали, засвідчуючи ненульову Ca2+-проникність цих рецептор-каналів. Варто, однак, зауважити, що для реєстрації АМРА- та каїнат-активованих Ca2+-сигналів було необхідно викликати значно більші трансмембранні струми, ніж у випадку NMDA-активованих сигналів. За цих умов середнє значення Pf для соматичних та дендритних каїнат-активованих рецептор-каналів дорівнювало 0.68 ± 0.20% (n= 12) та 0.61 ± 0.16% (n= 7) відповідно. Подібне значення Pf було отримано для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів. Мал. 5А ілюструє експерименти, в яких дендритні Ca2+-сигнали викликали за допомогою йонофоретичної аплікації АМРА. І в цьому випадку активація АМРА-рецепторів приводила до входу Ca2+ всередину клітини. В середньому, ми отримали значення Pf 0.66 ± 0.25% (n = 5 нейронів) для дендритних та 0.58 ± 0.34% (n = 9 нейронів) для соматичних аплікацій АМРА.

Щоб порівняти Ca2+-проникність соматичних та дендритних не-NMDA-рецепторів, відповідні значення Pf було виміряно попарно в сомі та дендритах одних і тих же нейронів (мал. 5Б). Дані досліди не виявили значної відмінності між Ca2+-проникністю соматичних та дендритних АМРА- та каїнат-активованих рецепторів. Отже, в даній роботі нам вперше вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+, і встановити, що їх Ca2+-проникність становить 0.6%.

Кальцієва проникність глутаматних рецептор-каналів в клітинах Пуркіньє мозочку

На сьогодні загальноприйнятою є думка, що глутаматні рецептори в клітинах Пуркіньє мозочку представлені виключно рецепторами не-NMDA-типу, оскільки клітини Пуркіньє не мають функціональних NMDA-рецепторів (Perkel, 1990; Farrant, 1991; Llano, 1991). Оскільки до цього часу Ca2+-проникність класичних рецептор-каналів не-NMDA-типу вважалась мізерною, їх вплив на [Ca2+]i систематично не вивчався. Однак, як показано на мал.6, за умов присутності 1 мМ fura-2 у внутрішньоклітинному розчині йонофоретична аплікація як АМРА, так і каїнату викликала великі трансмембранні струми, кожен з яких супроводжувався значною зміною флюоресценції на Ca2+-чутливій довжині хвилі F380. В середньому, значення Pf для соматичних АМРА-активованих рецептор-каналів складало 0.57 ± 0.33 % (n=4), а значення Pf для соматичних каїнат-активованих рецептор-каналів складало 0.63 ± 0.12 % (n= 4) при потенціалі на клітинній мембрані від -60 до -80 мВ та зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 1.6 мМ.

Таким чином, клітини Пуркіньє дійсно експресують рецептор-канали не-NMDA-типу з низькою Ca2+-проникністю, що нагадує проникність рецептор-каналів не-NMDA-типу в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу. Однак, зважаючи на велику амплітуду глутамат-активованих струмів в цих нейронах, за фізіологічних умов їх активація може викликати значну зміну [Ca2+]i.

Кальцієва проникність рецептор-каналів NMDA-типу в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки

Для отримання більш повного уявлення про властивості нативних глутаматних рецепторів в різних типах нейронів ЦНС ми провели дослідження NMDA-рецепторів в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки, котрі є одним з типів гальмівних інтернейронів.

Оскільки морфологічно ці нейрони не відрізняються від холінергічних нейронів, присутніх в цьому регіоні мозку (Naumann, 1992), всі досліджені клітини було ідентифіковано на основі наявності в них глутаматдекарбоксилази (GAD), специфічного маркера ГАМК-ергічних нейронів (Gritti, 1993). Мал. 7 ілюструє типовий ГАМК-ергічний нейрон серединної перетинки і зареєстровані в цьому нейроні зміни Ca2+-чутливої флюоресценції fura-2 (F390) та трансмембранного струму у відповідь на йонофоретичну аплікацію NMDA. Отримане в дослідах даного типу значення Pf для соматичних NMDA-активованих рецептор-каналів складало 12.0 ± 3.9% (n=10 клітин). Цікаво, що це значення майже співпадало зі значенням Pf, отриманим для пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу, засвідчуючи, що збудні та гальмівні нейрони в різних відділах ЦНС експресують функціонально схожі NMDA-рецептори.

Отже, в даній роботі ми вдосконалили метод, розроблений свого часу Неєром та Августином для вивчення кальцієвого гомеостазу в секреторних хромафінних клітинах (Neher, 1992), вперше пристосувавши його для вимірювання Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів, розташованих на нейронах в зрізах мозку, де ці нейрони зберігають своє надзвичайно розгалужене дендритне дерево. Це дало можливість виміряти частку йонів кальцію, що проникають в нейрон через рецептор-канали NMDA- та не-NMDA-типу. Завдяки високій чутливості застосованого методу нам вдалося виміряти Ca2+-проникність "класичних" глутаматних рецепторів не-NMDA-типу, що довгий час вважались непроникними для Ca2+. Проведене нами дослідження дало змогу порівняти властивості глутаматних рецептор-каналів в основних типах нейронів ЦНС, таких як: принципові збуджуючі нейрони (на прикладі нейронів СА1-регіону гіпокампу), принципові гальмівні нейрони (на прикладі клітин Пуркіньє мозочку) та гальмівні інтернейрони (на прикладі ГАМК-ергічних нейронів серединної перетинки). Таким чином, дана робота є найбільш повним, на сьогодні, порівняльним дослідженням Ca2+-проникності нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС. Крім того, в даній роботі ми розробили підхід (Garaschuk, 1998; Garaschuk, 1999), за допомогою якого метод вимірювання трансмембраних потоків можна застосувати для вивчення дендритних глутаматних рецепторів. На сьогодні, дана робота є єдиним дослідженням Ca2+-проникності дендритних глутаматних рецепторів за фізіологічних умов. В той час, як соматичні рецептори є в переважній більшості позасинаптичними, ймовірно, що велика частка досліджених нами дендритних рецепторів репрезентує синаптичні глутамат-активовані рецептори. Таким чином, нами встановлено близькість функціональних властивостей позасинаптичних (соматичних) та синаптичних глутаматних рецептор-каналів як NMDA- так і не-NMDA-типу.

Взаємозв'язок між молекулярним складом та функціональними властивостями нативних глутаматних рецепторів

Щоб встановити, чи існує взаємозв'язок між молекулярною будовою нативних глутаматних рецепторів та їх Ca2+-проникністю, а також іншими функціональними властивостями, досліджені вище типи нейронів ЦНС було проаналізовано на вміст мРНК, що кодує різні субодиниці глутаматних рецепторів.

Молекулярна будова нативних NMDA-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Нативні NMDA-рецептори складаються з пўяти різних субодиниць, названих NR1 та NR2A-D (щурі, (Monyer, 1992)) або z1і e1-e4 (миші, (Kutsuwada, 1992)). Попередні молекулярно-біологічні дослідження рекомбінантних рецепторів показали, що NR1-субодиниці зустрічаються у всіх відділах ЦНС та є необхідними для утворення функціональних NMDA-рецепторів (Monyer, 1994; Zukin, 1995). Різноманітні ж властивості рекомбінантних NMDA-рецепторів визначаються присутністю певного типу NR2-субодиниць (McBain, 1994). Тому ми зосередили свою увагу на виявленні мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці.

Для встановлення взаємозв`язку між функціональними властивостями та молекулярним складом NMDA-рецепторів в нейронах певного типу вміст мРНК окремих клітин було досліджено за допомогою методу зворотної транскрипції та ланцюгової реакції полімерази (Lambolez, 1992). Після закінчення електрофізіологічних та флюорометричних вимірювань вміст цитоплазми клітини було висмоктано через ту саму піпетку, що застосовувалась для внутрішньоклітинної перфузії, та проаналізовано на вміст мРНК, що кодують різні NR2-субодиниці. Використовуючи праймери, специфічні для комплементарних ДНК, які кодують NR2A-, NR2B- та NR2C-субодиниці, було показано, що в ГАМК-ергічних нейронах серединної перетинки 96% клітин експресують NR2B-субодиницю. При цьому 20% проаналізованих клітин експресували виключно NR2B, 40% - NR2B та NR2A, 28% - NR2B та NR2C, і, нарешті, 8% експресували NR2B-, NR2C- та NR2A-субодиниці. Лише в одній з усіх проаналізованих клітин NR2B-субодиниці не було виявлено, натомість було знайдено виключно NR2A-субодиниці.

Дійсно, коли цю гіпотезу було провірено більш детально для нейронів серединної перетинки, виявилось, що в них NMDA-рецептори з високою ефективністю блокуються зовнішньоклітинними йонами магнію, що характерно для рекомбінантних рецепторів, які включають NR2B-субодиницю. В подальших дослідах було показано, що NMDA-рецептори нейронів серединної перетинки з високою ефективністю блокуються також специфічним блокатором NR2B-субодиниці іфенпродилом.

Більше того, основний рівень провідності окремих NMDA-активованих каналів, зареєстрованих у фрагментах клітинної мембрани цих ГАМК-ергічних нейронів, складав 42 pS та 49 pS при зовнішньоклітинній концентрації Ca2+ 2 та 1 мM відповідно. Подібні значення було отримано при вивченні провідності окремих каналів рекомбінантних NMDA-рецепторів, що складаються з NR1-, NR2A- або NR1-, NR2B-субодиниць (50/51pS; (Stern, 1992; Tsuzuki, 1994)).

Молекулярна будова нативних АМРА-рецепторів в глутамат- та ГАМК-ергічних нейронах ЦНС

Дослідження, подібні до описаних вище для NMDA-рецепторів, було проведено також для нативних АМРА-рецепторів в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу та клітинах Пуркіньє мозочку. В цьому випадку цитоплазму нейронів було проаналізовано на вміст мРНК, що кодують GluRА-D субодиниці (Lambolez, 1992). З особливою увагою ми поставились до виявлення GluRB-субодиниці, що визначає Ca2+-проникність рекомбінантних АМРА-рецепторів (Hollmann, 1991; Hume, 1991; Burnashev, 1992). Як показано в таблиці 1, з 9 досліджених пірамідних клітин СА1-регіону гіпокампу всі експресували GluRA- і GluRB-субодиниці і всі, за винятком однієї клітини, експресували GluRC-субодиницю. Присутність GluRD-субодиниці було виявлено лише в одному нейроні.

Подібні дані було отримано також в дослідах з клітинами Пуркіньє мозочку, де фрагменти комплементарної ДНК, що відповідають GluRA-C-субодиницям, було виявлено в усіх нейронах обох досліджених вікових груп (Р5-7, n=8 клітин та Р14-17, n=6 клітин). В той же час GluRD-субодиницю було виявлено лише у двох клітинах молодшої вікової групи.

Таким чином, отримані молекулярно-біологічні дані узгоджуються з результатами вимірювання Ca2+-проникності і приводять до висновку, що низька Ca2+-проникність нативних рецепторів не-NMDA-типу зумовлюється присутністю в їх складі GluRВ-субодиниці.

Завдяки вивченню рекомбінантних глутаматних рецепторів за останній час було накопичено досить докладні дані про функціональні властивості деяких типів гомо та гетеромерних рецепторів (Sommer, 1991; Burnashev, 1992; Monyer, 1992; Burnashev, 1995; Koh, 1995). Однак, як показано в цьому (див. табл. 1) та інших (Lambolez, 1992; Bochet, 1994; Monyer, 1994; Burnashev, 1995) дослідженнях, ці результати не можна безпосередньо застосувати для з`ясування властивостей нативних глутаматних рецепторів в нейронах ЦНС, оскільки ці нейрони містять велику кількість різних субодиниць глутаматних рецепторів. В нашому дослідженні ми вперше поєднали вимірювання Ca2+-потоків через нативні глутамат-активовані рецептор-канали на мембрані нейронів ЦНС та аналіз вмісту мРНК, які кодують ці рецептор-канали. Це дозволило співвіднести дані про Ca2+-проникність глутаматних рецептор-каналів NMDA- та не-NMDA-типу з їх молекулярною будовою. На основі порівняння молекулярної будови та функціональних властивостей глутаматних рецептор-каналів, виявлених в різних типах нейронів ЦНС, ми прийшли до висновку, що функціональні властивості, і в першу чергу Ca2+-проникність, рецептор-каналів NMDA-типу зумовлюються домінантною NR2В-субодиницею. Аналогічно, наші дослідження підтвердили виявлену при вивченні рекомбінантних не-NMDA-рецепторів визначальну роль GluR-В-субодиниці у детермінації властивостей гетеромерних не-NMDA-рецепторів. Таким чином, отримані нами дані дають змогу прогнозувати властивості нативних глутамат-активованих рецептор-каналів не-NMDA- та NMDA-типів спираючись на дані про їх молекулярну будову. Віриться, що отримані результати сприятимуть глибшому розумінню функції нативних глутаматних рецептор-каналів в різних відділах мозку та створенню ліків, здатних селективно впливати на певні види рецепторних комплексів.

Викид та запасання йонів кальцію рианодин-чутливими Ca2+-депо в сомі і дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу

Викид Ca2+ в цитоплазму клітини з внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо може потенційно активуватися як специфічними агоністами рианодинових рецепторів (кофеїн, циклічна АДФ-рибоза), так і йонами Ca2+, що потрапляють в цитоплазму через мембрану клітини (так званий Ca2+-індукований викид Ca2+, СICR) (Nabauer, 1989). В переважній більшості наведених нижче експериментів для активації викиду Ca2+ з цих депо ми використовували специфічний агоніст кофеїн, який локально аплікували з тонкої скляної піпетки за допомогою тиску.

Амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в 105 пірамідних клітинах, розташованих безпосередньо поблизу піпетки, набувала значень від 50 до 600 нМ (в середньому 253±269 нМ, n=105 клітин з 85 зрізів гіпокампу).

В, кофеїн-активовані Ca2+-відповіді 4-х нейронів, позначених в Б, що знаходились в безпосередній близькості до мікропіпетки. Позначені літерами стрілки відмічають моменти часу, що відповідають аналогічно позначеним псевдокольоровим зображенням в Г. Г, псевдокольорові зображення, що ілюструють значення [Ca2+]i отримані в контролі (а), під час аплікації кофеїну (b) та після повернення [Ca2+]i до контрольного рівня (с).

Кофеїн-активовані Ca2+-сигнали спостерігались в переважній більшості (123 з 133) досліджених пірамідних нейронів і не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 10, 11; Vh=-60 мВ). На відміну від Ca2+-сигналів, викликаних активацією потенціал-залежних Ca2+-каналів, кофеїн-активовані Ca2+-сигнали зберігались за відсутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині і селективно блокувались специфічним блокатором рианодинових рецепторів рианодином (n=21; мал. 10).

Зауважте, що рианодин селективно блокує кофеїн-активовані Ca2+-сигнали, не впливаючи на амплітуду трансмембранних струмів та асоційованих Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією нейрону (вертикальні стрілки).

За умови присутності у внутрішньоклітинному розчині К+ як основного катіону кофеїн-активовані Ca2+-сигнали супроводжувались вихідним струмом (n= 4), котрий повністю блокувався при заміні К+ на Cs+ (мал. 10). Отже, викид Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо відбувається в безпосередній близькості від клітинної мембрани, так, що викликаний зріст [Ca2+]i є достатнім для активації Ca2+-активованих К+-каналів.

Щоб дослідити просторове розташування функціональних рианодин-чутливих Ca2+-депо, ми локально аплікували кофеїн до соми та дендритів одних і тих же пірамідних нейронів. Аплікація кофеїну як до соми, так і до дендритів приводила до реєстрації локального Ca2+-сигналу (мал. 11). Ca2+-сигнали, викликані в дендритах, не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (мал. 11Б) і, загалом, були подібними до сигналів, зареєстрованих в сомі (n=9 експериментів, 6 нейронів).

Отже, функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо знаходяться не лише в сомі, а також і в апікальних дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону, і можуть активуватись незалежно від соматичних Ca2+-депо.

Коли кофеїн аплікували декілька разів підряд, амплітуда Ca2+-сигналу, викликаного другою і наступними аплікаціями, завжди була меншою за амплітуду першого Ca2+-сигналу (мал. 12). Відновлення амплітуди кофеїн-активованого Ca2+-сигналу відбувалось спонтанно і поступово, протягом 2 хв. після останньої аплікації.

Суцільна лінія ілюструє наближення отриманих даних експоненційною функцією, отримане за методом найменших квадратів. Пунктирна лінія ілюструє апроксимацію отриманої функції до початку координат.

Часова константа спонтанного відновлення Ca2+-вмісту всередині Ca2+-депо становила 59 с. Активація потенціал-залежних Ca2+-каналів одразу після повного спустошення рианодин-чутливих Ca2+-депо 6-ма послідовними аплікаціями кофеїну приводила до підвищення [Ca2+]i і швидкого відновлення вмісту Ca2+ всередині депо, свідчачи, що в описаних дослідах йдеться саме про спустошення Ca2+-депо, а не, скажімо, про тимчасову десенситизацію рианодинових рецепторів в присутності кофеїну. Відновлення вмісту Ca2+-депо, викликане підвищенням [Ca2+]i, було значно швидшим за спонтанне відновлення.

Цікаво, що навіть за відсутності попереднього спустошення Ca2+-депо, присутність СРА у зовнішньоклітинному розчині на протязі 7 хв. приводила до зникнення кофеїн-активованих Ca2+-сигналів (6 з 6-ти клітин). Наведені дані свідчать, що рианодин-чутливі Ca2+-депо не є щільними і безперервно втрачають певну частину запасу Ca2+. В контролі цей спонтанний витік Ca2+ з депо урівноважується активним транспортом Ca2+ в протилежному напрямку, опосередкованим ендоплазматичними Ca2+-насосами.

Для подальшого з`ясування механізму спонтанного відновлення вмісту Ca2+ всередині депо ми дослідили, чи залежить це відновлення від присутності Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині. Як показано на мал. 13, у безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині зменшення амплітуди кофеїн-активованих Ca2+-сигналів відбувалося значно швидше, що свідчить про прискорене спустошення внутрішньоклітинних депо за цих умов. Більше того, відсутність Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині перешкоджала відновленню Ca2+-сигналів (n=6). Це вказує на необхідність трансмембранного входу Ca2+ для спонтанного відновлення його вмісту всередині депо (мал. 13).

Процес трансмембранного входу Ca2+, необхідного для відновлення його вмісту всередині депо, блокувався такими неспецифічними блокаторами Ca2+-каналів, як 2 мМ Ni2+ (n=4) і 0.5 мМ D600 (n=9). Цей процес, однак, не блокувався селективним блокатором потенціал-залежних Ca2+-каналів L-типу нітрендипіном (10 мМ, n=5).

У підсумку, наведені дані свідчать, що спонтанне відновлення вмісту Ca2+ всередині внутрішньоклітинних Ca2+-депо критично залежить від його трансмембранного входу через Ni2+- та D600-чутливі, дигідропіридин-нечутливі Ca2+-канали, що здатні відкриватися при потенціалі спокою.

Ступінь заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо йонами кальцію залежить від рівня [Ca2+]i

Як показано на мал. 14, зміни [Ca2+]i можуть впливати на амплітуду кофеїн-активованих Ca2+-сигналів. В усіх проведених експериментах (n=26) спостерігалась прямопропорційна залежність між амплітудою кофеїн-активованих Ca2+-сигналів та рівнем [Ca2+]i. Ця залежність віддзеркалює присутність більшої кількості Ca2+ у внутрішньоклітинних депо протягом (мал. 14) та одразу після (мал. 15) підвищення [Ca2+]i. Надлишок Ca2+, акумульований в депо під час підвищення [Ca2+]i, повільно витікає з депо так, що амплітуда кофеїн-активованих Ca2+-сигналів досягає контрольного рівня через 6-9 хв. після відновлення контрольного рівня [Ca2+]i (мал. 15).

Нормалізоване значення амплітуди тестового кофеїн-активованого Ca2+-сигналу відкладено як функцію часового інтервалу Dt. Для зручності інтервал Dt вимірювали від піку зросту [Ca2+]i, викликаного аплікацією КСl, до піку тестової аплікації кофеїну.

Ці результати свідчать, що рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу мають високу ємність і можуть запасати значно більше йонів Ca2+, ніж їх там знаходиться в стані спокою. Таким чином, перехідне чи довготривале підвищення [Ca2+]i приводить до пропорційного збільшення запасів Ca2+ всередині депо.

Роль рианодин-чутливих Ca2+-депо в процесі Ca2+-активованого викиду Ca2+

Усі отримані до цього часу дані свідчать про те, що рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу виступають в ролі регульованого Ca2+-буферу. Однак в м`язах, як і у деяких типах нейронів (Friel, 1992; Hua, 1993; Llano, 1994), ці депо беруть безпосередню участь в процесі Ca2+-активованого викиду Ca2+ (CICR) в цитоплазму нейронів. Для з`ясування ролі цих депо в процесі CICR в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу ми порівняли амплітуду Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани, в контролі та після спустошення внутрішньоклітинних Ca2+-депо (мал. 16).

Згрупувавши результати дослідів відповідно до амплітуди викликаного деполяризацією Ca2+-сигналу в контролі, ми виявили достовірне (p<0.001, t тест Стьюдента) зменшення амплітуди тестового сигналу (0.89 ± 0.10, n=16) для групи, де амплітуди в контролі перевищували 200 нМ. Жодного зменшення амплітуди тестового сигналу не було отримано для групи, де амплітуди в контролі не перевищували 200 нМ (1.05 ± 0.16, n=41). Наведені дані свідчать, що Ca2+-активований викид Ca2+ не відіграє суттєвої ролі для Ca2+-сигналів незначної амплітуди (< 200 нМ), в той же час цей процес може значно підсилювати амплітуду Ca2+-сигналів більшої амплітуди (> 200 нМ).

Кофеїн-активований викид Ca2+ з рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо в сомі та дендритах клітин Пуркіньє

Подібно до пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу в клітинах Пуркіньє кофеїн теж здатний викликати викид Ca2+ з рианодин-чутливих внутрішньоклітинних Ca2+-депо. При потенціалі на мембрані -60 мВ кофеїн-активовані Ca2+-сигнали не супроводжувались вхідним трансмембранним струмом (n=5), не залежали від присутності Ca2+ в зовнішньоклітинному розчині (n=5) і блокувались селективними блокаторами рианодинових рецепторів рианодином (n=22) та рутенієм червоним (n=5). Присутність кофеїну у зовнішньоклітинному розчині приводила до кофеїн-активованого зросту [Ca2+]i в сомі та в усіх видимих дендритах нейронів. Подібно до кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в пірамідних нейронах амплітуда соматичних кофеїн-активованих Ca2+-сигналів в клітинах Пуркіньє зростала з підвищенням [Ca2+]i (мал. 17А). Цікаво, що подібна залежність спостерігалась також і для дендритних кофеїн-активованих Ca2+-сигналів (мал. 17Б), свідчачи про подібні функціональні властивості соматичних та дендритних Ca2+-депо.

Кофеїн подовжує тривалість Ca2+-сигналів, викликаних деполяризацією клітинної мембрани та синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон.

Ca2+-сигнали, викликані деполяризацією клітинної мембрани в сомі клітини Пуркіньє, в основному та другорядному апікальних дендритах, тривали значно довше в присутності 20 мМ кофеїну в зовнішньоклітинному розчині. Так, час від ініціації Ca2+-сигналу до моменту його спаду до 1/ 2 максимальної амплітуди (t1/2 ) збільшувався в 2.3 ± 0.8 рази в сомі, в 2.7 ± 1.2 рази в основному та в 3.2 ± 1.5 рази в другорядних апікальних дендритах (n=37). Цей викликаний кофеїном ефект спостерігався також протягом 4-х хвилин після його вилучення із зовнішньоклітинного розчину (n=9). Це збільшення тривалості Ca2+-сигналу не було пов'язаним з кофеїн-активованим збільшенням входу Ca2+ через клітинну мембрану, оскільки відповідні потенціал-залежні Ca2+-струми відрізнялися меншою амплітудою і прискореною інактивацією.

Щоб з'ясувати, чи має викликане кофеїном збільшення тривалості потенціал-активованих Ca2+-сигналів пряме фізіологічне значення, ми розглянули вплив кофеїну на Ca2+-сигнали, викликані синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон. Оскільки амплітуда ГАМК- та глутамат-активованих синаптичних струмів зменшується в присутності 20 мМ кофеїну в зовнішньоклітинному розчині, подальші експерименти було проведено одразу після відмивки кофеїну, використовуючи той факт, що ефект кофеїну зберігається протягом наступних кількох хвилин. Під впливом кофеїну значення t1/2 синаптичних Ca2+-сигналів зростало від 2.9 ± 0.7 с до 10.8 ± 2.7 с в головному та від 3.9 ±0.9 с до 14.6 ± 3.1 с в другорядних дендритах. Таким чином, викликаючи збільшення тривалості Ca2+-сигналів, викликаних синаптичною стимуляцією ліаноподібних волокон, кофеїн є потенційно здатним впливати на ефективність синаптичної передачі в цих синапсах.

На основі наведених вище даних можна припустити, що викликане кофеїном збільшення тривалості потенціал-активованих Ca2+-сигналів віддзеркалює процес Ca2+-активованого викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних Ca2+-депо. Дійсно, ефект кофеїну повністю блокувався антагоністом рианодинових рецепторів рутенієм червоним, оскільки нам не вдалося виявити викликаного кофеїном збільшення тривалості як потенціал-активованих, так і викликаних синаптичною стимуляцією (мал. 18) Ca2+ -сигналів в сомі та дендритах клітин Пуркіньє за умови присутності 10 µМ рутенію червоного у внутрішньоклітинному розчині.

Наведені дані дають підставу вважати, що в основі викликаного кофеїном збільшення тривалості Ca2+-сигналів в сомі та дендритах лежить процес CICR з внутрішньоклітинних Ca2+-депо.

Таким чином, дана робота є ґрунтовним дослідженням властивостей рианодин-чутливих Ca2+-депо в принципових збуджуючих та гальмівних нейронах ЦНС. Отримані дані свідчать, що функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо знаходяться не тільки в сомі, а і в дендритах даних нейронів, а також, що соматичні і дендритні Ca2+-депо є функціонально незалежними і, отже, здатні брати участь у локальних субклітинних процесах. В стані спокою ці депо відіграють роль буферу, ефективно нейтралізуючи надлишок йонів Ca2+, що потрапляють в клітину в результаті активації різноманітних трансмембранних процесів. Внутрішньоклітинні Ca2+-депо мають велику буферну ємність і є частково заповненими в стані спокою (мал.19).

В пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу активація викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо не вимагала попереднього їх заповнення шляхом активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Ці дані узгоджуються з даними інших авторів (Seymour-Laurent, 1995), отриманими внаслідок аплікації кофеїну до нейронів гіпокампу мишей в культурі. Отже, рианодин-чутливі Ca2+-депо в пірамідних нейронах СА1-регіону гіпокампу завжди зберігають здатність відповідати викидом Ca2+ на активацію рианодинових рецепторів. В протилежність цьому, рианодин-чутливі Ca2+-депо в клітинах Пуркіньє мозочку є переважно порожніми в стані спокою, і тому активація викиду Ca2+ в цих клітинах відбувається лише після попереднього їх заповнення. Найбільш ймовірно, що причиною цієї розбіжності є відсутність в клітинах Пуркіньє механізмів спонтанного заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо (Garaschuk, 1997).

Функціональні рианодин-чутливі Ca2+-депо було виявлено нами не тільки в сомі, але і в дендритах пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу та нейронів Пуркіньє мозочку щурів. В обох типах нейронів властивості соматичних та дендритних Ca2+-депо були схожими. Так, наприклад, в клітинах Пуркіньє мозочку щурів дендритні рианодин-чутливі Ca2+-депо демонстрували фармакологічні властивості та залежність вмісту від рівня [Ca2+]i дуже подібні до відповідних властивостей соматичних Ca2+-депо. Однак, за допомогою локальної аплікації кофеїну до соми та дендритів пірамідних нейронів СА1-регіону гіпокампу вдалося показати, що за умов викиду Ca2+ та асоційованого з ним спустошення соматичних Ca2+-депо дендритні Ca2+-депо зберігали властивість відповідати на аплікацію агоністу викидом Ca2+. Ці досліди демонструють функціональну відособленість дендритних Ca2+-депо, що дає їм змогу приймати участь в локальних дендритних процесах інтеграції інформації.

В даній роботі ми вперше описали процес спонтанного відновлення вмісту спустошених Ca2+-депо в нейронах ЦНС ссавців. Спонтанне відновлення вмісту Ca2+-депо не відбувалося в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині та за умови присутності у ньому неспецифічних блокаторів Ca2+-каналів Ni2+ та D600 як у дослідах з інтактними клітинами в присутності ТТХ, так і в перфузованих клітинах при фіксованому потенціалі на мембрані -60 мВ. Таким чином, механізм трансмембранного входу Ca2+, що відповідає за спонтанне відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо, здатен діяти при потенціалі спокою. Для пояснення даного механізму доводиться припустити присутність в клітинній мембрані певного класу Ca2+-каналів, що активуються внаслідок спустошення внутрішньоклітинних Ca2+-депо. В цьому випадку даний трансмембранний механізм нагадує добре відомий для незбудливих клітин механізм "ємнісного" ('capacitative') входу Ca2+, що активується внаслідок опосередкованого гормонами та нейротрансмітерами викиду Ca2+ з внутрішньоклітинних IP3-чутливих Ca2+-депо (Tsien, 1990; Putney, 1993). Цікаво, що йони Ni2+ (2 mM), які успішно блокували спонтанне відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо в наших дослідах, є відомими блокаторами "ємнісного" входу Ca2+ в незбудливих клітинах (Tsien, 1990; Hoth, 1993).

На додачу до "ємнісного" входу Ca2+, що діє при потенціалі спокою, як пірамідні нейрони СА1-регіону гіпокампу, так і клітини Пуркіньє мозочку володіють потужним механізмом заповнення внутрішньоклітинних Ca2+-депо внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Дійсно, в нейронах обох типів вміст рианодин-чутливих Ca2+-депо швидко відновлювався внаслідок активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. Це активність-залежне заповнення рианодин-чутливих Ca2+-депо спостерігається в багатьох типах нейронів (Brorson, 1991; Shmigol, 1994), і до цього часу вважалось універсальним і єдиним механізмом відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо в збудливих клітинах.

Таким чином, трансмембранний вхід Ca2+ є необхідною умовою відновлення вмісту внутрішньоклітинних рианодин-чутливих Ca2+-депо в нейронах ЦНС. Для цього нейрони ЦНС володіють двома відмінними механізмами: (і) вперше описаним в даній роботі механізмом "ємнісного" входу Ca2+, що діє при потенціалі спокою, та (іі) механізмом активність-залежного входу Ca2+, що критично залежить від активації потенціал-залежних Ca2+-каналів. В той час, як механізм активність-залежного відновлення вмісту внутрішньоклітинних Ca2+-депо притаманний всім дослідженим на сьогодні типам нейронів ЦНС (Simpson, 1995), проведені нами дослідження свідчать, що механізм "ємнісного" входу Ca2+ є більш чи менш чітко вираженим, а то і майже відсутнім, в різних типах нейронів ЦНС, визначаючи їхню здатність до агоніст-активованого викиду Ca2+ за умови довготривалого перебування нейрону в стані спокою.

Згідно до отриманих нами даних, рианодин-чутливі Ca2+-депо мають здатність активно регулювати амплітуду та тривалість фізіологічних Ca2+-сигналів. В стані спокою рианодин-чутливі Ca2+-депо виступають ефективним буфером Ca2+, що потрапляє в цитоплазму внаслідок активації потенціал- та агоніст-активованих каналів. На відміну від цього, під час епізодів посиленої клітинної активності, коли вміст Ca2+ всередині депо значно збільшується, підвищення [Ca2+]i відповідної амплітуди здатне викликати Ca2+-активований викид Ca2+ в цитоплазму нейрону. Нещодавно було показано (Shmigol, 1996), що підвищення концентрації Ca2+ всередині депо приводить до значного зниження порогу ініціації CICR. Ці дані дають підставу вважати, що рианодин-чутливі внутрішньоклітинні Ca2+-депо здатні відігравати роль "детектора співпадіння", вагомо підсилюючи лише ті фізіологічні Ca2+-сигнали, що виникають в період посиленої нейрональної активності.