Молекулярная биология: исторические вехи и перспективы развития в XXI веке

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования Российской Федерации

Центр “Биоинженерия” Российской Академии Наук

Лаборатория готовых лекарственных форм

Институт философии Российской Академии Наук

Кафедра философии

«Молекулярная биология: исторические вехи и перспективы развития в XXI веке»

Щукин Александр Владимирович

Научный руководитель:

академик РАСХН, профессор

Константин Георгиевич Скрябин

Москва, 2007 г.

Введение

Молекулярная биология - наука, изучающая живые системы на молекулярном уровне. Перекрываясь с другими смежными областями биологии и химии, а именно с генетикой и биохимией, молекулярная биология изучает взаимодействия между различными системами живой клетки, включая процессы синтеза таких жизненно-важных биополимеров, как ДНК, РНК, и белков, а также взаимодействия, регулирующие эти процессы.

Молекулярная биология исторически появилась в 30-е годы XX века как раздел биохимии. Впервые термин «молекулярная биология» ввел Варен Вивер (Warren Weaver) в 1938 году. Варен был в то время директором фонда Рокфеллера и искренне верил в то, что в биологии грядут большие перемены, подстегиваемые недавними успехами в области рентгеноструктурного анализа. Поэтому сам он направлял значительные финансовые средства института Рокфеллера на исследования в этой области.

Исследователи, работающие в области молекулярной биологии, используют методы, как присущие только молекулярной биологии, так и биохимические и генетические методы. Нет четкой грани между этими разделами биологии. На рисунке 1 схематично показано

Датой рождения молекулярной биологии принято считать апрель 1953 г., когда в английском журнале «Нейчер» появилась статья Джеймса Д. Уотсона и Фрэнсиса Крика с предложением пространственной модели молекулы ДНК. Основанием для построения этой модели послужили работы по рентгеноструктурному анализу, в которых участвовали также Морис Х. Ф. Уилкинсон и Розалинда Франклин.

1. История

молекулярный биология полимеразный

История молекулярной биологии начинается в 1930-е годы, когда сошлись пути ранее независимых дисциплин: биохимии, генетики, микробиологии и вирусологии. С надеждой на то, что эта наука объяснит живые процессы на самом фундаментальном уровне, многие физики и химики примкнули к зарождающейся области исследования, котороая впоследствии превратится в молекулярную биологию.

В том виде, в котором она существует сейчас, молекулярная биология пытается объяснить феномены процессов, протекающих в живых клетках, опираясь на макромолекулярные свойства молекул, которые образуют эти феномены. В частности, две категории макромолекул являются основными объектами молекулярных биологов: 1) нуклеиновые кислоты, среди которых наиболее известна дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), составная часть генов, и 2) белки, активные компоненты живых организмов. Одно из определений основной задачи молекулярной биологии звучит так: охарактеризовать структуру, функцию данных макромолекул, а также связь между ними. Такое относительно ограниченное определение будет для нас достаточно, чтобы мы смогли установить даты так называемых «молекулярных революций» или, по крайней мере, хронологию наиболее важных фундаментальных открытий.

На ранних стадиях своего существования, молекулярная биология (этот термин был введен в употребление Вареном Вивером из Института Рокфеллера) являлась скорее идеальным вариантом для объяснения жизни с физико-химической точки зрения, чем логически последовательной дисциплиной. Вслед за открытием законов наследования Менделя в 1910-е, а так же появлением теории атома и квантовой механики в 1920-е эти объяснения казались весьма богатыми и многообещающими. Вивер и другие вкладывали средства и вдохновляли исследования к пересечению биологии, физики и химии. Тогда как выдающиеся физики того времени, как например, Нильс Бор и Эрвин Шредингер, всецело погрузились в биологические рассуждения. Однако в 30-40-е годы не было понятно, какое исследование на стыке наук (если оно вообще есть) принесет плоды; работы в области коллоидной химии, биофизики, также как и в радиационной биологии, кристаллографии и других областях казались многообещающими.

В 1940 году Джордж Бидл (George Beadle) и Эдвард Татум (Edward Tatum) показали, что существует четкая связь между генами и белками. В ходе своих экспериментов, соединяющих генетику и биохимиию, они перешли от широко используемого в генетике организма Drosophila к более подходящему модельному организму гриба Neurospora. Конструирование и использование новых модельных организмов все чаще стало входить в практику молекулярных биологов. В 1944 году Освальд Авери (Oswald Avery), работающий в институте Рокфеллера в Нью-Йорке, показал, что гены состоят из ДНК. В 1952 году Альфред Херши (Alfred Hershey) и Марта Чейз (Martha Chase) своими работами подтвердили, что генетический материал бактериофага (вируса, заражающего бактерии) составлен из молекул ДНК. В 1953 году Джеймс Уотсон (James Watson) и Фрэнсис Крик (Francis Crick) открыли двуспиральную структуру молекулы ДНК. В 1961 году Франсуа Якоб и Жак Моно предположили существование молекулы-посредника между ДНК и ее белковыми продуктами, которую они назвали информационной РНК (рибонуклеиновая кислота). В период с 1961 по 1965 годы была установлена связь между информацией, содержащейся в ДНК и структурой белка: существует генетический код, который устанавливает соответствие между последовательностью нуклеотидов в цепи ДНК и последовательностью аминокислот в белке. В начале 1960-х Якоб и Моно также показали, каким образом специальные белки, называемые регуляторным, связываются с ДНК на границах генов и, тем самым, контролируют транскрипцию этих генов. Говорят, что данные белки направляют «экспрессию» генов.

Таким образом, основные открытия в молекулярной биологии произошли в течение 25 лет. Еше 15 лет понадобилось для того, чтобы появились более сложные, новые методы, известные сегодня под названием генетической инженерии. Она позволила выделять и характеризовать гены сложных организмов.

Если рассматривать молекулярную революцию в рамках биологической истории, мы заметим, что она явилась кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений в микроскоп в 18 веке. Перед исследователями того времени стояла задача понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне. C конца 18 века уделялось все большее внимание установлению свойств химических молекул, составляющих живые организмы, параллельно с зарождением в 19 веке физиологической химии, основателем которой считается немецкий химик Юстус вон Либиг (Justus von Liebig), и последующим рождением в начале 20 века биохимии, благодаря еще одному немецкому исследователю, Эдуарду Бухнеру (Eduard Buchner). Между молекулами, изучаемыми химиками, и крошечными структурами, наблюдаемыми в микроскоп, такими как клеточное ядро или хромосомы, существовала область неизведанного. Немецкий физхимик Вольфганг Оствальд (Wolfgang Ostwald) назвал эту область “миром скрытых измерений”. Этот мир населяли коллойды, химические соединения, структура и свойства которых еще не были известны в то время.

Успехи в молекулярной биологии в исследовании этого неизвестного мира связаны с использованием новых методов, созданных химиками и физиками, такие как: дифракция рентгеновских лучей, ультрацентрифугирование и гель-электрофорез. Эти исследования позволили установить стурктуру и функции некоторых макромолекул.

Важной вехой в процессе познания неизведанного стала работа доктора Лайнуса Поллинга (Dr. Linus Pauling), который связал конкретную генетическую мутацию у пациентов с серповидно-клеточной анемией с найденными изменениями в структуре конкретного белка, гемоглобина.

2. Столкновение биохимии и генетики

Толчком к развитию молекулярной биологии послужило столкновение двух дисциплин, которые значительно продвинулись в течение первых 30 лет двадцатого столетия: это биохимия и генетика. Первая изучает структуру и функцию молекул, которые составляют живые организмы. В период с 1900 по 1940 года были описаны основные процессы метаболизма: процессы расщепления и утилизации питательных элементов, получаемых с пищей, таких как например сахара. Каждый из этих процессов катализируется специальными ферментами. Ферменты, по своей структуре, являются белками, также как и антитела, присутствующие в крови. Следовательно, основной целью биохимиков стало изучение структуры и функции белковых молекул.

Вторая дисциплина, появившаяся в начале 20 века - генетика.

3. Полимеразная цепная реакция

В 1985 г. американский биохимик Кари Банкс Мюллис (Kary Banks Mullis) c коллегами опубликовали и запатентовали метод полимеразной цепной реакции (или сокращенно ПЦР), которому суждено было оказать глубочайшее влияние на все области исследования и прикладного использования нуклеиновых кислот. Значение этого метода для молекулярной биологии и генетики оказалось столь велико и очевидно, что уже через восемь лет (в 1993 году) автору была присуждена Нобелевская премия по химии.

ПЦР - это экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Для осуществления реакции ПЦР в пробирке смешиваются: ДНК-матрица - образец, содержащий ДНК, участок которой нужно “размножить”; пара праймеров - коротких последовательностей ДНК, комплементарных ДНК-матрице, и обозначающих “начало” и “конец” участка ДНК, который подлежит амплификации; набор дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - “составных частей” молекулы ДНК; специальный фермент - ДНК-полимераза, осуществляющий синтез новой цепи ДНК по уже имеющейся цепи; а также солевой буфер для эффективной работы фермента. Реакция проводится в специальном приборе, ПЦР-амплификаторе, позволяющим выдерживать циклы с заданной температурой и длительностью цикла.

Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих ее направлений.

В настоящее время разработано масса модификаций классической ПЦР: множественная, ассиметричная, гнездовая, с “горячим стартом”, аллель-специфичная, ПЦР в реальном времени и т.д.

4. Гель-электрофорез

Гель-электрофорез - это метод, позволяющий разделять молекулы ДНК, РНК и белков в полимерной матрице под действием электрического поля. Обычно используется как аналитический метод, но так же может быть использован и в препаративных целях, например, для частичной очистки перед использованием других методов (масс-спектрометрия, ПЦР, клонирование).

Слово “гель” в названии метода обозначает полимерно-сшитую матрицу, в которой происходит разделение. Для разделения белков и малых фрагментов ДНК (до 100 пар оснований) обычно используют гель с различными концентрациями акриламида и сшивателя (бис-акриламида). При разделении больших фрагментов ДНК и РНК используют матрицы из очищенной агарозы, компонента агара - экстракта красной морской водоросли. Слово “электрофорез” в названии относится к электродвижущей силе, которая заставляет заряженные молекулы двигаться в полимерной матрице.

По окончании электрофореза (обычно 1-2 часа), разделяемые молекулы располагаются в разных местах геля, в зависимости от их размера, и, как следствие, их электрофоретической подвижности. Гели с белковыми молекулами визуализируются при помощи специальных красителей (Кумасси, нитрат серебра), а агарозные гели с нуклеиновыми кислотами обычно окрашиваются флуоресцентным красителем - этидиум бромидом, и просматриваются в ультрафиолетовом свете.

Изобретателем данного метода считается английский ученый Оливер Смитис (Oliver Smithies), а датой изобретения 1950 г., хотя первые разделения в сахарозных гелях были проведены еще в 1930-х гг. Полиакриламидные гели впервые вошли в практику молекулярных биологов в 1959 г., благодаря работам Самюэля Раймонда (Samuel Raymond) и Льюиса Вайнтрауба (Lewis Weintraub), а агарозные - в конце 1970-х.

В 1969 г. впервые в качестве денатурирующего агента в гель-электрофорезе белков был использован додецилсульфат натрия (ДСН). А в 1970 г. Ульрих К. Лэммли (Ulrich K. Laemmli), используя ДСН, разделил 28 белковых компонентов бактериофага Т4 в полиакриламидном геле (сокращенно ДСН-ПААГ). С тех пор фамилия швейцарского ученого стала именем нарицательным, а метод разделения, использованный в его работе стали называть “гель-электрофорезом по Лэммли”. Существуют также и другие методики ДСН-ПААГ, например гель-электрофорез в Трис-трициновой системе, впервые использованный в работе [].

В 1983 г. появились модификации метода: гель-электрофорез в импульсном электрическом поле, для разделения больших фрагментов ДНК, а также достаточно дорогостоящая методика капиллярного элеткрофореза.

5. Саузерн-блот (Southern-blot)

Саузерн-блот - это метод, используемый в молекулярный биологии, для анализа наличия ДНК-последовательности в ДНК-образце. Саузерн-блот включает в себя электрофоретическое разделение ДНК и методы переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на мембрану под действием электрического поля для дальнейшего анализа с помощью ДНК-гибридизации.

Метод назван в честь своего изобретателя - сэра Эдвина Саузерна (Sir Edwin Southern), британского исследователя, ныне профессора Оксфордского Университета. В своей работе, опубликованной в 1975 г.[], он описал новую в то время методику переноса фрагментов ДНК из агарозного геля на нитратные фильтры. Далее фильтры инкубируются (гибридизуются) с радиоактивно меченным ДНК-зондом и затем ДНК-гибриды могут быть визуализированы авторадиографией.

Размещено на Allbest.ru