Особливості метаболізму злаків при дії низьких температур на рослини

Размещено на http://www.allbest.ru

Міністерство освіти України

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. Ю.ФЕДЬКОВИЧА

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Особливості метаболізму злаків при дії низьких температур на рослини

Кравець Володимир Степанович

Чернівці - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Володимир Васильович Моргун

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

директор інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Василь Васильович Грубінко

Тернопільський державний педагогічний

університет ім. В.Гнатюка,

проректор з наукової роботи, завідувач кафедри

доктор біологічних наук, професор

Ольга Іштванівна Терек

Львівський державний університет ім. Івана Франка,

завідувач кафедри.

доктор біологічних наук,

Вікторія Казимирівна Яворська

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

завідувач відділу

Провідна організація: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Захист відбудеться “20” жовтня 1999 р. о 14-00 год

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому державному університеті ім. Ю. Федьковича за адресою:

274012, м. Чернівці, вул. Коцюбинського,2.

З дисертацією можно ознайомитися в бібіліотеці Чернівецького державного університету
ім. Ю. Федьковича

Автореферат розісланий “ 17 ” вересня 1999 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради

Кандидат біологічних наук доцент Г.П. Копильчук

Размещено на http://www.allbest.ru

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Структурні та функціональні особливості живих систем різного рівня організації направлені на забезпечення їх адаптації до умов середовища. Результати досліджень, виконаних в ряді лабораторій, свідчать, що в процесі пристосування до холоду в клітинах рослин відбуваються зміни метаболізму, які забезпечують їх виживання за несприятливих температурних умов [Проценко, Колоша, 1969; Власюк, Остаплюк, 1973; Туманов, 1979; Трунова, 1984; Sutton et al., 1992; Моргун, Логвиненко, 1995]. Адаптація рослин до холоду включає комплекс біохімічних процесів серед яких зміни складу ліпідів, білків та вуглеводів [Хохлова, 1975; Титов та ін., 1982; Новицкая, та ін.,1986; Guy,1990; Войников та ін., 1998]. Спроби, спрямовані на з'ясування молекулярних основ адаптації до холоду, привели до ідентифікації у рослин генів, експресія яких індукується дією холоду [Thomashow, 1993; Моргун, Логвиненко, 1995; Monroy, Dhindsa, 1995; Gana et al.,1997;]. Характерною особливістю протікання адаптаційних реакцій є новоутворення мРНК і накопичення специфічних білків під впливом температур, що спричиняють індукцію їх синтезу [Jaglo-Ottosen et al., 1998; Sabehat et al., 1998; Voinikov et al., 1998]. Ряд авторів ізолювали і охарактеризували гени, чутливі до низьких температур [Takahashi, Shimosaka, 1997; Ouellet et al., 1998], проте функція білків індукованих низькими температурами та їх роль у розвитку стійкості клітин до холоду залишається до кінця не з'ясованою.

Проблема стійкості рослин до дії екстремальних температур має не лише теоретичне, а й практичне значення. Серед зернових культур України як за площею посіву, так і за валовим збором зерна чільне місце займає кукурудза. Врожайність цієї культури в значній мірі визначається впливом кліматичних умов, в тому числі температурних. Кукурудза належить до теплолюбних рослин, проростання насіння та ріст якої пригнічується при низьких температурах. Затримка розвитку кукурудзи навесні призводить до подовження вегетаційного періоду, попадання рослин в період дозрівання зерна в умови понижених температур восени і як наслідок - до зниження урожаю зерна, до того ж фізологічно не дозрівшого і технологічно неякісного.

Як відомо, проростання насiння pослин включає ініціацію низки метаболічних процесів i одним iз найбiльш важливих сеpед них є посилення енергопродукції, яке супроводжується підвищенням активності дихання їх тканин. Пізнання природи цих процесів є важливим, оскільки енеpгетичнi потpеби заpодку pеалiзуються виключно за pахунок мiтохондpiальних систем акумуляцiї i тpансфоpмацiї енеpгiї в клітині [Семихатова, 1990]. Ось чому вивчення функціонування феpментних комплексiв мiтохондpiй насiння теплолюбних pослин, що проростає пpи низьких темпеpатуpах, дозволить не лише сфоpмувати уявлення пpо pегуляцiю енеpгозабезпечення заpодку насiння, а й вiдiбpати критерії оцінки насiння на здатність до проростання в умовах холоду та розробити технологічні прийоми, спрямовані на інтенсифікацію ростових процесів навесні при низьких температурах середовища.

Пошкодження рослин від морозів є основною причиною зрідження, а в окремі роки і повного вимерзання посівів на значних площах. Проблема стійкості рослин є актульною для нашої країни, оскільки більш ніж 70% сільськогосподарських посівів зазнають впливу екстремальних температур. Вимерзання посівів озимих зернових культур в зимовий період приводить до різкого зменшення урожайності цих культур, наносить сільському господарству значний збиток. Він погіршується зниженням урожайності тих рослин, які виживають після дії морозів, але значно знижують свою продуктивність. Щорічно на Україні гине від дії морозів більше 20% посівів озимих зернових культур, а в окремі роки вимерзання відмічається на значних площах. Так лише в зимовий період 1993-1994 рр. на Україні в задовільному стані знаходились лише 30% посівів озимих, зріджених від вимерзання було 38%, пересіяно більш ніж 30% площ озимих злаків. Значних збитків зазнало сільське господарство внаслідок вимерзання посівів озимої пшениці і в 1997 році. Пошкодження і загибель рослин спостерігається також весною внаслідок дії заморозків. Так у травні 1999 року внаслідок заморозку до -6, -8 °С загинули посіви гречки, томатів та ряд інших теплолюбних культур навіть на півдні України. Були пошкоджені посіви озимої пшениці, гібридів кукурудзи, ячменю, цукрового буряку, а також насадження ряду плодових деревних рослин.

Низький рівень стійкості до дії морозів у чутливих рослин може бути зумовлений відсутністю специфічних до холоду генів або ж наявністю дефектів в їх організації та функціонуванні. Встановлено наявність таких генів як у стійких, так і у мало стійких до морозу рослин, але у останніх вони характеризуються низьким рівнем експресії за дії холоду, що може бути спричинене нездатністю клітин цих рослин сприймати сигнал про зміну температури зовнішнього середовища та трансформувати його у відповідні перебудови біохімічних процесів, які зумовлюють адаптацію рослин до дії несприятливих факторів середовища. Мало дослідженими на сьогодні є первинні процеси біохімічної адаптації рослин до низьких температур.

Клітини реагують на зміну умов, але первині механізми сприйнятя сигналу та трансформації його в конкретну біохімічну реакцію, досі не з'ясовано. Особливе значення в реакції клітин на дію ряду чинників середовища належить первинним реакціям, які відбуваються в рослинах при зміні температури середовища [Яворская, Калинин, 1984; Яворская, 1990]. Дослідження останніх рокiв, проведенi на клiтинах тварин, переконливо показали, що гiдролiз фосфатидилiнозитолу пiд дiєю фосфолiпази C є складовою частиною передачi сигналу через плазматичну мембрану. Показано участь фосфатидилiнозитолу у реакції клітин на дію свiтла та гiпоосмотичного шоку. У той же час не з'ясовано на сьогодні механізми сприйняття та трансдукції сигналів в клітинах рослин при зміні температури середовища.

Автором сформульована концепція розвитку подій в клітинах рослин при дії низьких температур що супроводжуються змінами метаболізму поліфосфатидилінозитолів, формуванням вторинних посередників, які здатні викликати низку адаптаційних змін направленості та інтенсивності метаболізму клітин, включають новоутворення білків, з класу молекулярних шаперонів, синтез ліпідів та активацію десатураз. Вказані зміни спрямовані на підтримання ряду функцій клітини і перш за все систем трансформації та акумуляції енергії.

Мета і задачі дослідження. Головною метою досліджень було з'ясувати особливості метаболізму злаків при дії низьких температур на рослини, встановити природу вторинних посередників, що приймають участь в реакції рослин на зміну температури середовища; з'ясувати первинні реакції метаболізму поліфосфатидилінозитолів на короткочасну дію низьких температур та виявити вторинні посередники, які здатні індукувати процеси адаптації рослин до дії низьких температур середовища; встановити закономірності реакції на зміну температури білок синтезуючої системи зародків рослин в процесі їх розвитку, вивчити новоутворення в клітинах та їх мітохондріях поліпептидів, яким притаманні функції молекулярних шаперонів; дослідити за умов in vivo та in vitro регуляцію транспорту електронів у мітохондріях рослин при дії холоду.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вивчити:

вплив холодового стресу різної тривалості на метаболізм поліфосфатидилінозитолів клітин чутливих до дії холоду рослин, з'ясувати їх участь у формуванні вторинних посередників трансдукції сигналів;

реакцію новоутворення поліпептидів зародків насіння кукурудзи на дію високих та низьких температур в процесі їх розвитку, порівняти вплив високих та низьких температур середовища на новоутворення поліпептидів, яким притаманні функції молекулярних шаперонінів;

склад фосфоліпідів та їх жирних кислот різних тканин гібридів кукурудзи в процесі росту рослин при низькій температурі;

зміни фосфоліпідів мітохондрій злаків в процесі адаптації рослин до низьких температур середовища;

процес формування альтернативного транспорту електронів в процесі росту тканин рослин, встановити вклад альтернативного та цитохромного дихання в загальний енергообмін зародків кукурудзи в процесі їх розвитку при низьких температурах середовища.

Наукова новизна одержаних результатів. Сформовано концепцію послідовності розвитку подій в клітинах рослин при зниженні температури середовища в основу якої покладено вперше отримані факти щодо механізмів формування вторинних посередників в клітинах злаків при дії холоду та їх ролі в індукції адаптаційних змін направленості та інтенсивності метаболізму клітин, що включають новоутворення білків- представників молекулярних шаперонів, синтез ліпідів та активацію десатураз.

Показана роль молекулярних шаперонів у підтриманні функцій клітин в процесі росту і розвитку рослин при низьких температурах, забезпечені стійкості клітин до дії холоду. Результати досліджень дихального енергообміну in vivo та in vitro дозволили виявити механізм регуляції потоку електронів в мітохондріях, забезпечили розвиток уявлення про шляхи формування енергетичного статусу клітин злаків за умов холодового шоку.

Вперше виявлено зміни пулу поліфосфатиділінозитолів під впливом короткочасного охолодження паростків гібридів кукурудзи та озимої пшениці, показано гідроліз фосфатидилінозитол 4,5-біфосфату до інозитол 1,4,5-трифосфату та диацилгліцеролу при дії холодового шоку. З'ясовано характер формування альтернативного шляху транспорту електронів в клітинах меристеми, показано зростання його участі у транспорті електронів до кисню у дозрілих клітинах рослин. Виявлено динаміку змін активності цитохромного та альтернативного дихання в процесі розвитку зародків насіння кукурудзи при низьких температурах середовища. Встановлено активацію альтернативної оксидази в мітохондріях клітин стійких до дії холоду ліній кукурудзи під впливом низьких температур. Отримано результати, які свідчать про активацію альтернативного дихання за рахунок синтезу білку альтернативної оксидази. Виявлено в електрофоретичних спектрах новосинтезованих білків мітохондрій і цитоплазми проростків пшениці та кукурудзи, що зазнали впливу холоду, білки, що відповідають молекулярним масам 90 і 70 кД з функціями молекулярних шаперонів, а також поліпептиди в ділянці 17-38 кД. Вперше встановлено новоутворення специфічного для низької температури поліпептиду з молекулярною масою близько 120 кД в тканинах проростків морозостійких сортів озимої пшениці, синтез якого був слабо виражений у сортів з низьким рівнем морозостійкості. Збільшення інтенсивності фосфорилювання у фракції як мітохондріального, так і загального білка проростків кукурудзи відмічено перш за все на ділянці 90 кД, що може відповідати родині шаперонів cpn90.

Практичне значення отриманих результатів. Виявлені особливості реакції рослин на зміну температури середовища формуванням вторинних посередників, новоутворенням білків, представників молекулярних шаперонів, регуляцією функцій мітохондрій, як і з'ясування відповіді на екстремальні температурні умови зародків рослин поглиблюють уявлення про природу морозостійкості, накреслюють шляхи керування холодо- та морозостійкістю за допомогою молекулярно-генетичних підходів із позицій регуляції активності альтернативного дихання та синтезу холодо-чутливих білків. Запропоновано критерії відбору стійких до холоду гібридів кукурудзи. холодовий температура рослина метаболізм

Отримані результати можуть бути використанні в курсах лекцій з біохімії, біоенергетики, фізіології та селекції рослин в ВУЗах України.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто розробив робочі гіпотези, спланував та провів експериментальні дослідження. Здійснив аналіз, інтерпретацію і узагальнення одержаних результатів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетних тем відділу фізіології стійкості рослин ІФРГ НАН України “Вивчення ролі білків шаперонів та фосфатидилінозитолу у стійкості злаків до екстремальних температур; дослідження еколого-фізіологічних особливостей морозостійкості різних за генотипами сортів озимих злаків” (0198U009039), "Регуляція дихання теплолюбивих рослин в процесі проростання при низьких температурах” 0199U000020, “Дослідити синтез білків та роль ліпідів як месенджерів у зв`язку із фізіологією холодо- та морозостійкості злаків в процесі онтогенезу рослин” (0198U007708), та проектів Фонду фундаментальних досліджень України: “Дослідження ролі білків-шаперонів мітохондрій зародків кукурудзи при їх розвитку в умовах дії високих та низьких температур"(5.4/336).

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були представлені на ХХV Ювілейній Міжнародній нараді і симпозіумі на тему:"Дослідження біогенезу, структури та функцій фотосинтетичного апарату у зв'зку з перетворенням сонячної енергії (Болгарія, Толбухін, 1988), Міжнародній конференції " Досягнення та перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини" (Харків, 1988), II з'їзді Всесоюзного товариства фізіологів рослин (Мінськ, 1990), Всесоюзній конференції "Генетичні механізми стійкості рослин до несприятливих факторів середовища " (Іркутськ, 1991 р.), II з'їзді Укр. Товариства фізіологів рослин (Київ, 1993), III з'їзді Всеросійського товариства фізіологів рослин (Санкт-Петербург, 1993), Міжнародній нараді "Актуальні питання фізіології рослин в аспекті екологічних проблем України" (Чернівці, 1995 р.), I з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995 р.), Міжнародному симпозіумі "Дихання рослин: фізіологічні та екологічні аспекти (Сиктивкар, 1995), Міжнародному симпозіумі "Стрес і асиміляція неорганічного азоту" (Москва, 1996 р.), 8-му (Бельгія, 1992р.), 10-му (Італія, 1996 р.) та 11-му (Болгарія, 1998 р.) конгресах Федерації Європейських товариств фізіологів рослин, Міжнародній конференції "Вплив стресів середовища на молекулярну біологію рослин” (Польща, 1997 р.), Міжнародному семінарі "Охорона довкілля: сучасні дослідження в екології і мікробіології” (Ужгород, 1997), XVIII Конгресі товариства фізіологів рослин Скандинавії (Швеція,1997), IV Міжнародному симпозіумі “Реакція метаболізму рослин на забруднення повітря і глобальні зміни” (Нідерланди, 1997), науковому семінарі Університету штату Південа Дакота (США, 1999).

Публікації. Наукові результати по темі дисертації опубліковано в 37 друкованих роботах, що включає 19 статей, в тому числі 7 - без співавторів, опублікованих в провідних наукових виданнях.

Об'єм та структура роботи. Дисертація, викладена на 291 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, 5 глав, висновків, списку використаної літератури. Робота містить 25 малюнків і 20 таблиць. Бібліографічний список складає 665 літературних джерел, із них 614 на іноземних мовах.

Основні положення, які виносяться на захист.

Метаболізм поліфосфатиділінозитолів реагує на дію низьких температур формуванням вторинних посередників трансдукції сигналів у клітинах рослин.

На ранніх етапах розвитку зародки рослин клітини реалізують програму експресії геному і не змінюють синтез білків під впливом високих і низьких температур.

Низькі температури індукують новоутворення поліпептидів із родин БТШ70, БТШ90 і низькомолекулярних білків (17-35 кД) у клітинах злаків і специфічного до дії низьких температур білка із молекулярною масою 120 кД лише у клітинах озимої пшениці.

Підтримання енергетичного гомеостазу клітин рослин за умов низьких температурах відбувається шляхом активації транспорту електронів через альтернативний шлях їх мітохондрій.

Матеріали та методи

Об'єкти дослідження. У дослідженнях були використані зародки, колеоптилі і листки етіольованих проростків ліній і гібридів кукурудзи та озимої пшениці, які вирощували в термостаті при 25 °С. Адаптаційні зміни метаболізму озимої пшениці вивчали при витримуванні в низькотемпературній камері при температурі +3 °С, кукурудзи - при +12- +14оС ттривалістю до трьох тижнів. Короткочасну дію холоду на тканини кукурудзи (+10 °С ) та озимої пшениці (+3 °С) створювали у трис-НСl (10 мМ, pH 7,2) буфері протягом 5 - 60 хвилин.

Методи дослідження складу ліпідів рослин. [32P]-ортофосфат вводили в тканини колеоптилів і листків кукурудзи та озимої пшениці шляхом iнкубацiї у розчині з активнiстю 6,6 МБк на 1 г тканин протягом 18 годин при +25 °С. Радіоактивний фосфор вводилася шляхом вакуумної iнфiльтрацiї протягом 5 хвилин для бiльш швидкого проникнення у тканини [Raison et al., 1980]. Перед охолодженням рослини витримували на світлі протягом 30 хвилин при +25°С для запобiгання побiчного впливу світла. Фiксацiю матерiалу здiйснювали рiдким азотом.

Видiлення загальних лiпiдiв проводили за методом Фолча (1957). Екстракцiю проводили сумiшшю хлороформ-метанол (2:1 за об'ємом ) з розрахунку 21 мл сумiшi на 1 г тканин. Хлороформну фракцiю лiпiдiв упарювали у струмi азоту та розчиняли у сумiшi хлороформ-метанол (2:1).

Екстракція поліфосфатидилінозитолів. Для виділення полiфосфатидилiнозитолiв нами була модифікована методика Чо та Чен [Crookston et al., 1974]. Осад тканин, який залишився на фiльтрi пiсля екстракцiї загальних лiпiдiв, обробляли 0,05 М ЕДТА протягом 20 хв. та переносили осад з фільтру у розчин хлороформ-метанол-кHCl (200:100:1) і проводили екстракцiю при 37 °С протягом 1 години з перiодичним помішуванням. Очистку вiд водорозчинних компонентiв здiйснювали шляхом додавання 0,2 об'єму 1н HCl з подальшим центрифугуванням 10 хвилин при 3000 g. Поверхневий шар промивали тричі розчином метанол-1нHCl (1:1), кожного разу центрифугуючи зразки 10 хвилин при 3000 g. Хлороформний екстракт упарювали у струмi азоту та розчиняли у сумiшi хлороформ-метанол (2:1).

Тонкошарова хроматографія ліпідів. Розподiл лiпiдiв проводили на силiкагелевих пластинах "Sorbfil" ПЕТФ СТХ-1А (АО "Сорбполiмер") методом двомірної хроматографії: 1 напрямок хлороформ-метанол-7н амiак (60:30:4), 2 напрямок хлороформ-метанол-оцтова кислота-вода (170:25:25:6) , фосфолiпiди- у системах розчинникiв: 1) ацетон-оцтова кислота-вода (100:2:1); 2) хлороформ-метанол-вода (65:25:4) [Roughan, Slack, 1982].

Аналiз полiфосфатидилiнозитолiв проводили на iмпрегнованих 1% оксалатом калiю (75 с) силiкагелевих пластинках "Sorbfil" ПЕТФ СТХ-1А . Для роздiлення була обрана система розчинникiв хлороформ-метанол-4н амiак (9:7:2) [Зауралов и др., 1990].

Авторадіографія та сцинтиляційний рахунок. Пiсля роздiлення у наведених вище системах розчинникiв пластинки з [32Р]-мiченими фосфолiпiдами та фосфатидилiнозитольною фракцiєю аналiзували методом авторадiографiї на рентгенiвський плiвцi. Кiлькiсну активнiсть зразків визначали методом сцинтиляційного рахунку на рідинному сцинтиляторi Rac-Beta (Фiнляндiя) з сцинтиляцiйною рiдиною ЖС-7.

Кількісне визначення загальних фосфоліпідів. Кiлькiсть загальних фосфолiпiдiв та їх окремих класiв визначали по неорганiчному фосфору за методом Боєр i Кiнг [Bowyer,King,1977].

Газорідинна хроматографія жирних кислот. Метод оснований на переведеннi жирних кислот у легкi метиловi ефіри з подальшим визначенням їх кількості газорідинною хроматографією [Синяк и др.,1976]. Кількість жирних кислот визначали методом внутрішньої нормалізації [Гольберт, Вигдергауз,1990]. Якісну ідентифікацію хроматограм проводили за стандартним розчинами метилових ефірів жирних кислот та за часом утримання [Мак-Нейр, Бонеллi,1970].

Кількісне визначення індивідуальних iнозитол-фосфатiв. Фракціонування фосфоiнозитолiв здійснювали методом рідинної іонообмінної хроматографії [Bartlet 1982]. Зміни вмісту інозитолфосфатів визначалися за рівнем неорганiчного фосфору у відповідній пробі елюенту після іонообмінної хроматографії.

Дослідження новоутворення поліпептидів. Дослідні і контрольні проростки подрібнювали на шматочки довжиною 4-5 мм та інкубували у розчині 35S-метіоніну (питома активність 80-100 мкКі/мл) або суміші 14C-амінокислот (питома активність 20-60 мкКі/мл) протягом 3-5 год. при 24°C. У інших серіях експериментів включення мітки проводили при температурі +3°C протягом останньої доби дії холоду. Мічення 32P-ортофосфатом (питома радіоактивність близько 200 мкКі/мл) проводили в умовах дії температурного чинника. Перед подальшими операціями рослинний матеріал відмивали від радіоактивної мітки. Частина матеріалу була використана для одержання сумарної фракції поліпептидів проростків, з решти отримували фракцію Мх. Загальний білок екстрагували подвійним буфером Леммлі, отримані зразки (після 1-хвилинного прогрівання на водяній бані при 100 oС) розділяли методом диск електрофорезу у поліакриламідному гелі з аспаргіновим буфером у присутності SDS. Автографи отримували на рентгенівській плівці типу РМ-В з висушених гелей після фарбування їх колоїдним розчином кумасі R250 (Reanal, Угорщина). Як молекулярні маркери використовували набір "Rainbow" (Amersham, Великобританія) із 7 білків з молекулярними масами від 14,3 до 200 кД.

Дихальний енергообмін рослин. Для дослідження газообміну тканин кукурудзи використовували полярограф ОН-105 (Угорщина) та закритий платиновий електрод типу Кларка. Вимірювання проводили у середовищі, яке містить СаСl2 (0,2%) та трис-НСl буфер (10мМ). Температура комірки підтримувалася за допомогою ультратермостату, з холодильним агрегатом, що забезпечував температуру від 0 до 30оС. Рослини перед вимірами розрізали за допомогою леза на ділянки завширшки 2 мм та довжиною 3-4 мм. Перед вимірюванням газообміну тканини витримували у розчині інкубації, або ж в аерірованих розчинах відповідних інгібіторів протягом 20 хвилин. Для блокування транспорту електронів через цитохромний ланцюг використовували азид натрію (5 мМ), альтернативну оксидазу блокували розчином бензгідроксамової кислоти (10 мМ). Вклад оксидаз немітохондріального походження в загальне поглинання кисню визначали як залишкове дихання після сумісного введення в тканини коренів кукурудзи азиду натрію та бензгідроксамової кислоти [Azcon-Bieto et. al, 1983]. Активність цитохромного шляху мітохондрій клітин кореня визначали, як різницю між інтенсивностями поглинання кисню тканинами в присутності бензгідроксамової кислоти та залишкового дихання. Потенціальну активність альтернативного шляху розглядали як інтенсивність дихання в присутності азиду натрію після відрахування залишкового дихання. Зайнятість альтернативного шляху розраховували за відношенням ступені інгібування дихання бензгідроксамовою кислотою до ступені стійкості дихання в присутності азиду натрію (Lambers et.al.,1983). Мітохондрії отримували за допомогою методу диференціального центрифугування за описаною методикою (Кравец, Войников, 1984).

РЕАКЦІЯ МЕТАБОЛІЗМУ ПОЛІФОСФАТИДИЛІНОЗИТОЛІВ НА
ДІЮ ХОЛОДОВОГО СТРЕСУ

Для дослідження дії холодового шоку на метаболізм поліфосфатидилінозитолів була обрана температура +10°С на тій підставі, що ця температура не викликає пошкодження тканин рослин кукурудзи і є зоною температурного діапазону, в якому дана культура здатна підвищувати стійкість до дії низьких температур. Саме при цій температурі в клітинах починаються процеси, які характеризуються терміном "адаптація до холоду". В процесі росту при цих температурах в клітинах рослин відбуваються адаптивні зміни метаболізму.

Було досліджено вплив холодового шоку (5 - 20 хв.) на метаболізм ліпідів колеоптилів 4-добових етіольованих паростків кукурудзи. Тканини колеоптилів є однорідними, завершили ростові процеси і в природних умовах зазнають впливу холодового стресу у першу чергу.

Дослідження отриманих хроматограм виявило високий рівень включення фосфору у фосфатидилетаноламін (ФЕА) та фосфатидилхолін (ФХ). Дещо нижчий рівень включення фосфору було відмічено у фракції фосфатидилгліцеролу (ФГ) порівняно з ФЕА та ФХ. Досить помітний рівень радіоактивності зареєстровано у фракціях фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилінозитолу (ФІ) та фосфатидної кислоти (ФК). Серед фракції поліфосфатидилінозитолів виявлено включення мітки до фосфатидилінозитолфосфату (ФІФ) та фосфатидилінозитолбіфосфату (ФІФ2).

Різке охолодження колеоптилів кукурудзи протягом 5 - 20 хвилин при +10°С не викликало достовірної зміни активностей у фракціях загальних фосфоліпідів (рис. 1), в той час як серед поліфосфатидилінозитолів відмічено різке зниження активності ФІФ та ФІФ2 через 10 хвилин дії низької температури (рис. 2), яке супроводжувалось зростанням рівня інозитол 1,4,5-трифосфату (Інз(1,4,5)Ф3) (рис. 3). Подальше витримування тканин рослин при температурі +10°С протягом 20 хвилин обумовило зростання кількості включення мітки у ФІФ та ФІФ2, що було підтверджено даними сцинтиляційного рахунку (рис. 2). У подальших дослідженнях дії низькотемпературного стресу на метаболізм фосфоліпідів та поліфосфатидилінозитолів у листках та колеоптилях 4-добових етіольованих паростків кукурудзи тканини рослин охолоджували протягом 10 хвилин при температурі +10°С. Аналіз отриманих хроматограм показав, що і в листках і в колеоптилях досліджених тканин відбувалося різке зниження кількості ФІФ та ФІФ2 при дії холоду +10°С протягом 10 хвилин.

Кількість загальних фосфоліпідів залишалась у межах контрольних значень .

В дослідженнях реакції метаболізму поліфосфатидилінозитолів на дію холодового стресу було використано тканини паростків озимої пшениці. У якості стресового чинника у даному випадку була вибрана температура +5°С (температура, яка не викликає пошкоджень, але індукує адаптивні перебудови у клітинах рослин пшениці). Отримані результати свідчать, що вже через 5 хвилин дії низькотемпературного стресу спостерігається зменшення кількості ФІФ та ФІФ2 у тканинах трьох добових етіольованих колеоптилів паростків пшениці (рис. 4). Десяти хвилинна експозиція призводила до подальшого розпаду окремих компонентів поліфосфатидилінозитолів, на низьким був рівень цих сполук і через 20 хвилин дії холоду. Кількість загальних фосфоліпідів тканин паростків озимої пшениці достовірно не змінювалась на протязі всього експерименту.

Отримані результати свідчать про чутливість метаболізму ФІФ та ФІФ2 до короткочасного охолодження тканин рослин на відміну від метаболізму основних фосфоліпідів. Відомо, що ФІФ2 у клітинах рослин гідролізується під дією фосфоліпази С (фосфоінозитидази) до Інз(1,4,5)Ф3 та ДАГ. Отримані результати вказують на те, що при дії холодового стресу відбувається активація ФІФ2-специфічної фосфоліпази С.

На прикладі дії ряду чинників (освітлення, зміна осмотичного тиску, дія патогенних елісіторів та супресорів) з'ясовано, що Інз(1,4,5)Ф3 впливає на перерозподіл вмісту іонів Са2+ у компартментах клітини, зокрема, обумовлює вихід Са2+ з вакуолі. Відомо, що Са2+ є вторинним месенджером, який безпосередньо залучається до багатьох сигнальних процесів [Bush, 1995]. Показано, що підвищення рівня кальцію у відповідь на дію холоду відбувається за рахунок як зовнішньо клітинного Са2+, так і Інз(1,4,5)Ф3-індукованого звільнення кальцію із вакуолі [Knight et al., 1996]. Наведені дані разом із результатами проведених досліджень свідчать про можливу участь фосфатидилінозитольної системи у сприйнятті низькотемпературного впливу та запуску реакцій клітинного відгуку на дію холоду. Підвищення активностей ФІФ і ФІФ2 в процесі подальшого витримування тканин кукурудзи на холоді може свідчити про активацію ФІ4- і ФІФ5-кіназ, які формують ФІФ та ФІФ2 і локалізовані у цитоскелетній фракції плазматичної мембрани [Tan, Boss, 1992].

РОЛЬ ЛІПІДІВ В АДАПТАЦІЇ КЛІТИН РОСЛИН ДО НЕСПРИЯТЛИВИХ УМОВ СЕРЕДОВИЩА.

Зміни складу фосфоліпідів клітин рослин при зниженні температури середовища

Адаптація паростків кукурудзи до дії низької температури супроводжувалась збільшенням загальної кількості фосфоліпідів у всіх досліджених органах рослин. У листках сума фосфоліпідів зросла у 2,5 рази, тоді як у колеоптилях та мезокотилях - у 1,5 та 1,2 рази, відповідно. Розвиток холодових пошкоджень спостерігався здебільшого на мезокотилях паростків та деякою мірою - на колеоптилях. Листки як загартованих, так і незагартованих рослин за даних умов охолодження були стійкішими до дії холоду. Таким чином, інтенсивність накопичення фосфоліпідів в окремих органах рослин відповідала ступеню їх стійкості до дії низької температури, що свідчить про участь цих сполук у розвитку стійкості до охолодження.

Динаміка складу ліпідів в процесі адаптації паростків злаків до низької температури середовища. Основними компонентами фосфоліпідів мітохондріальних мембран озимої пшениці є ФХ,ФЕА, ФГ і кардіоліпін (КЛ). Ідентифіковано також ФІ, і ФК (табл.1). Адаптація рослин до низьких температур супроводжується накопиченням ФХ. ФЕА і ФГ у мітохондріях пагонів озимої пшениці, так в процесі росту на протязі перших 7 діб при 5 °C кількість ФХ збільшується на 28%, ФЕА на 22% і ФГ на 17% порівняно із контролем.

Таблиця 1

Динаміка накопичення фосфоліпідів мітохондрій паростків озимої пшениці сорту Миронівська 808 в процесі адаптації рослин до низьких
температур середовища (фосфоліпіди в нМ на мг білку )

Подальший ріст рослин при 2 °C обумовлює зростання вказаних ліпідних компонентів порівняно з контролем на 39, 34 і 22% відповідно. Не відмічено достовірних змін вмісту КЛ і ФК на протязі всього періоду росту рослин при низьких температурах (табл.1). Проведені нами дослідження свідчать про зростання вмісту фосфоліпідів у мітохондріях озимої пшениці Миронівська 808 в процесі адаптації до низьких температур. Ці зміни забезпечують більш високий рівень енергопродукції в органелах морозостійкого сорту при низьких температурах, підтримуючи необхідний рівень витрат на підтримання структур клітин за несприятливих температурних умов.

Роль жирнокислотного складу мембран рослин в підтриманні функцій клітин при екстремальних температурах середовища

Вивчення відносного складу жирних кислот фосфоліпідної фракції листків, колеоптилів та мезокотилів 4 добових етіольованих паростків кукурудзи показало, що насичені жирні кислоти, переважно, представлені пальмітиновою (С16:0) та стеариновою (С18:0), а ненасичені - олеїновою (С18:1), лінолевою (С18:2) та ліноленовою (С18:3) кислотами. Серед насичених жирних кислот у органах рослин, які ми вивчали переважає пальмітинова (С16:0), тоді як серед ненасичених - лінолева (С18:2). При вирощуванні рослин за умов низької температури (+10°С) спостерігалися зміни відносного вмісту жирних кислот у всіх досліджених органах рослин. Аналіз окремих груп жирних кислот виявив зменшення кількості насичених пальмітинової (С16:0) та стеаринової (С18:0) кислот у всіх органах рослин, яке відповідало тривалості дії низькотемпературного фактора. Слід відзначити, що у випадку мезокотилів ці зміни відбуваються лише при 10 добовій експозиції в умовах загартовуючої температури, тоді як при 4 добовій їх рівень залишається у межах контролю. У листках та колеоптилях кількість насичених пальмітинової та стеаринової кислот суттєво знижувалась вже при 4 добах загартування, та зберігалась на тому ж рівні і при 10 добах дії холоду. При експозиції протягом 21 доби у листках та колеоптилях знов спостерігалося наступне суттєве зниження відносного вмісту цих жирних кислот.

Аналіз отриманих результатів показав, що в процесі низькотемпературного загартування відбувається збільшення кількості ненасичених жирних кислот фосфоліпідів у всіх органах етіольованих паростків кукурудзи, які ми вивчали. Отримані експериментальні дані свідчать про те, що це є наслідком зростання відносного вмісту лінолевого (С18:2) та ліноленового (С18:3) жирнокислотних ланцюгів у складі фосфоліпідів.

Синтез білків в клітинах злаків та їх мітохондріях за умов низьких температур середовища.

Дослідження впливу різних умов дії холоду на склад та синтез білків мітохондрій злаків. В процесі дослідження впливу низьких температур на новоутворення поліпептидів в клітинах кукурудзи встановлено, що зміна синтезу загального білка є більш чутливою до дії температурного чинника і відбувається раніше, ніж перебудови, що спостерігаються у спектрі новосинтезованих мітохондріальних білків.

Хорошо дослідженими є зміни синтезу представників родин БТШ, що виникають в умовах впливу високих температур [Vierling, 1991]. Це дозволяє використовувати варіант теплового шоку в якості другого контролю при дослідженні впливу холоду на новоутворення мiтохондрiальних бiлкiв. Дія зниженої температури на проростки кукурудзи віку 4-5 діб призводить до змін спектра новосинтезованих білків (рис. 5) Перш за все, це стосується шаперонних ділянок, - 70 і 90 кД. Крім того, можна виділити ще деякі характерні поліпептиди, питомий синтез яких суттєво посилюється внаслідок холодового впливу, це білки з молекулярними масами близько 23, 32 та 58 кД. Подальша логіка досліджень привела до необхідності розділення ефекту дії холодового чинника для різних типів тканин. У зв'язку з цим порівнювали вплив холоду на апікальну та базальну частину рослин кукурудзи. Отримано результати, які свідчать, що меристематична тканина не розвиває відзначену реакцію (посилення інтенсивностей синтезу поліпептидів у шаперонних ділянках 70 і 90 кД), на тепловий шок включно. Характерна відповідь є невід'ємною рисою базальних тканин, клітини яких припинили поділ . Температура +10 °C викликає зміни синтезу білка, що детектуються вже після 10 год., однак оптимальна тривалість для прояву реакції до дії холоду на рівні новоутворення Мх білків складає не менше 20 год .

Вплив низьких температур на синтез білків етіольованих проростків озимої пшениці В дослідженнях були використані проростки сорти озимої пшениці, що відрізняються за морозостійкістю: Лютесценс 7 (Л7), Миронівська 808 (М808) - морозостійкі, Миронівська 40 (М40) - середня морозостійкість, Миронівська 29 (М29) - морозостійкість нижча за середню. При дії високої температури (+41°C) у спектрах новосинтезованих загальних та мітохондріальних білків спостерігаються характерні смуги БТШ, що відповідають молекулярним масам (ММ) 73, 82 і 98 кД, а також в ділянці 16-34 кД. Витримування рослин пшениці за умов низьких додатніх температур призводить до підвищення інтенсивності новоутворення поліпептидів у ділянках 70 та 90 кД (рис. 6, треки 4 і 9). Відзначені зміни схожі на ті, що спостерігається для варіанта теплового шоку, але виявляться у меншій мірі.

Для проростків пшениці виявлено специфічну ділянку прояву ефекту холоду у високомолекулярній частині спектрального складу новосинтезованих поліпептидів - близько 120 кД. Зростання інтенсивності синтезу вказаних білків відзначається після тривалості дії холоду не менше 10-12 год. та за умов імпульсного радіоактивного мічення при низькій температурі. Зміни у високомолекулярній ділянці майже не відмічено у зразках, радіоактивне мічення яких відбувалось при нормальній (+24°C) температурі після холодового впливу (рис. 6, треки 5 і 10), що пояснюються, можливо, швидким припиненням синтезу поліпептидів вказаних молекулярних мас після перенесення проростків у нормальні температурні умови.

Можна виділити ще деякі характерні поліпептиди, питомий синтез яких суттєво посилюється внаслідок холодового впливу - це поліпептиди з ММ близько 16, 22, 24, 35, 38 і 54кД . Для зразків білка Мх основні зміни інтенсивності смуг новосинтезованих поліпептидів при дії низької температури детектуються у ділянках 70 кД, 38 кД, 35 кД та 16кД. Подібна мінливість у вказаних ділянках є спільною для зразків мітохондріального та загального білка. Дослідженню особливостей мінливості синтезу поліпептидів у шаперонних ділянках було приділено особливу увагу (табл. 2).

Таблиця 2

Питома інтенсивність синтезу білків проростків пшениці в умовах холоду у шаперонних ділянках (за включенням радіоактивної мітки), % до контролю

Примітка. “-” - даних немає.

У проростках сортів, більш чутливих до дії низьких температур, індукція синтезу білків у ділянках БТШ70 і БТШ90 виражена слабкіше, ніж у більш стійких сортів.

У проведених дослідженнях було виявлено, що тепловий шок викликає посилений синтез БТШ70 з ММ 73 кД , тоді як при холодовій адаптації збільшується рівень новоутворення БТШ з ММ 71 кД. Вірогідно, це пов'язано з різними функціями цих БТШ: можна думати, що перший з них має справу з денатурованими внаслідок стресів білками, інший необхідний для процесів транспортування або складання новосинтезованих білків при зниженій температурі.

Поліпептид з ММ 35 кД (посилений синтез якого спостерігається) може являти собою мономер альтернативної оксидази, адже активація цього шляху дозволяє захистити клітину від вільно радикального пошкодження в умовах абіотичних стресів [Purvis, Shewfelt, 1993]. Прояв мінливості синтезу у нижній частині спектру (16-18 кД) пов'язаний, найвірогідніше, із інтенсифікацією новоутворення низькомолекулярних БТШ [Sabehat et al., 1998].

Синтез білків мітохондрій зародків кукурудзи при їх розвитку в умовах дії високих та низьких температур. Ряд генів теплового шоку експресуються на протязі ранніх етапів розвитку ембріональних тканих евкаріот, але специфічна роль БТШ в ембріогенезі з'ясована слабо. Дослідження дії таких типово стресових факторів, як підвищена чи низька температура, на ранніх етапах розвитку рослин представляє значний інтерес як з точки зору фундаментальної науки, так і з практичних міркувань. Важлива роль системи енергозабезпечення у реалізації стрес-реакції клітин до несприятливих умов зумовлює підвищену увагу до білків мітохондріому [Martinus et al., 1996].

Довготривалий вплив холоду на зародки гібриду кукурудзи Колективний 100 СВ досліджували в серії експериментів, у яких вирощування дослідних рослин відбувалось при зниженій (+14 °С) температурі. В іншій серії дослідів після пророщування насіння у нормальних температурних умовах (+24 °С) частину зародків витримували протягом 24 год. при +10 °С (холод) або 2 год. при +42 °С (тепловий шок). Ізольовані із насіння зародки інкубували у розчині 35S-метионіну. Аналіз розподілу білкових смуг на радіоавтографах виявив, що основні опорні смуги, а саме, з молекулярними масами 10, 60, 70 і 90 кД, які відповідають білкам із родини шаперонів, наявні практично у всіх досліджених варіантах . Виключення складють сухі зародки, де не спостерігається взагалі ніякого помітного рівня синтезу білка de novo. У треках, що відповідають 6 год. розвитку зародків при температурі +24 °С та 12 год. - при температурі +14 °С, інтенсивність включення радіоактивної мітки приблизно однакова і знаходиться ще на досить низькому рівні. Це свідчить про те, що у вказаних умовах синтез білка Мх тільки починається. Подібний паралелізм між варіантами різних температурних умов розвитку спостерігається при аналізі інтенсивностей смуг, що відповідають основним білкам-шаперонам: ділянка 70 кД- початок синтезу між 12 і 24 год. при температурі +24 °С та приблизно 48 год. - при +14 °С; ділянка 60 кД - поява, а потім поступове зникнення смуги з молекулярною масою приблизно 65 кД і далі поява смуги з нижчою молекулярною масою (приблизно 62,5 кД) як у дослідних, так і в контрольних зразках практично з тим самим (у 2-2,5 рази) зсувом у часі. Аналогічний характер мінливості спостерігається і в ділянці 90 кД. Результати дослідження новоутворення поліпептидів в зародках кукурудзи дають підставу для припущення про те, що досліджуваний низькотемпературний вплив (+14 °С) при розвитку зародків даного гібриду кукурудзи не спричиняє специфічної активації синтезу шокових білків, серед яких звичайно спостерігається посилення новоутворення білків-шаперонів, яким відповідають чотири ділянки з молекулярними масами близько 70, 60, 10 і 90 кД. У даній серії експериментів відбувається зростання їх синтезу, але, ймовірно, не внаслідок впливу низької температури, а в результаті реалізації програми розвитку зародків. Важливо відмітити, що синтез в клітинах зародків кукурудзи поліпептидів, що відносяться до типово "шокових" ділянок білкового спектру, спостерігається на певних стадіях розвитку. Відомо, що, наприклад, представники родини БТШ 90 здатні змінювати у просторі і часі про цеси ембріогенезу різних систем тваринного походження [Csermely et al., 1998]. Аналіз результатів, отриманих у наступній серії експериментів, дозволяє зробити такі висновки. Поліпептид з молекулярною масою 70 кД синтезується вже на самих ранніх досліджуваних стадіях розвитку зародків - починаючи з 12 год. після початку замочування. На цій стадії вплив тепла чи холоду практично не спричиняє змін інтенсивності його синтезу. Подібне спостерігається також і після 24 год. тривалості розвитку, однак для варіанту теплового шоку є помітним також синтез і нижньої складової із меншою молекулярною масою (приблизно 68 кД), що, скоріш за все, пояснюється звичайним прискоренням перетворень при підвищенні температури або більш сильною напруженістю стресового фактора порівняно до низької температури.

Далі, при переході до 48 год. тривалості розвитку характер мінливості у цій ділянці для всіх трьох варіантів - контроль, тепловий шок та холод - практично однаковий, за виключенням компоненти білкового спектру з родини 70 кД: спостерігається синтез у варіанті теплового шоку, відзначається для варіанту холодового впливу і практично відсутній у контролі. Для інших опорних ділянок спектру білків зародків кукурудзи - 90, 60 і 10 кД спостерігається подібна тенденція, як і у БТШ70. Показано, що, наприклад, ембріони риб набувають здатності до акумуляції mRHK БТШ 47, БТШ 70 і БТШ 90 при дії теплового шоку лише після проходження стадії бластули [Lele et.al., 1997]. При досягненні стадії досить сформованих проростків кукурудзи(48 год.) ступінь резистенції знижується і вплив стресових температур призводить до специфічних змін рівня синтезу поліпептидів з молекулярними масами 70-72 кД. В умовах дії холоду реакція проростків після 2 діб розвитку подібна до такої, що спостерігається для варіанту теплового шоку . Отримані результати свідчать, на ранніх стадіях розвитку зародків кукурудзи синтез поліпептидів у типових шаперонних ділянках білкового спектру визначається самою стадією розвитку зародків і мало залежить від зовнішніх температурних умов.

Інтенсивність дихання тканин рослин у процесі їх росту.

Формування альтернативного шляху транспорту електронів в мітохондріях коренів кукурудзи. Вивчали інтенсивність поглинання кисню коренями гібриду кукурудзи Колективний 100 СВ зони меристеми (ділянка 0-2 мм від початку кореня), зони розтягування (ділянка 2-4 мм) та зони дозрілих клітин (10-20 мм). В процесі росту коренів кукурудзи інтенсивність дихання їх клітин, в перерахунку на суху речовину, знижується від 450,9 мкМ О2 (г сух.речов.)-1год-1 в клітинах зони меристеми до 249,2 мкМ О2 (г сух.речов.)-1год-1 в дозрілих клітинах коренів. Показник інтенсивності дихання клітин зони розтягнення займає проміжне положення між клітинами меристеми та дозрілими клітинами коренів (табл. 3, контроль). Введення в тканини меристеми інгібітора цитохромного шляху транспорту електронів (азиду натрію) знижувало на 56% інтенсивність дихання клітин в період їх поділу. Разом з тим, клітини меристеми слабо реагували на дію інгібітора альтернатівного шляху транспорту електронів - бензгідроксамової кислоти. Тканини зони початку розтягування клітин коренів кукурудзи були більш стійкі до дії азиду натрію і достовірно не відрізнялися за чутливістю до дії бензгідроксамової кислоти, порівняно з тканинами меристеми (табл. 3, контроль). Дозрілі клітини коренів кукурудзи (зона 10-20 мм від початку кореня) були майже вдвічі чутливішими до дії інгібітора альтернативного шляху транспорту електронів порівняно до клітин меристеми. Так ступінь інгібування інтенсивності поглинання кисню в присутності бензгідроксамової кислоти склала 16,4% від контролю.Сумісне введення в тканини коренів гібридів кукурудзи азиду натрію та бензгідроксамової кислоти пригнічувало дихання до 90%, що свідчить про домінуючу роль мітохондріальних ферментів у поглинанні кисню. Як свідчать результати проведених досліджень, в процесі росту клітин коренів спостерігається зниження інтенсивності поглинання кисню (табл.3), що узгоджується із результатами дослідження дихання протопластів ячменю, отримах із сегментів, розташованих вище та нижче интеркалярної меристеми проростків ячменю [Owen et al.,1986]. Зміни в інтенсивності поглинання кисню клітинами меристеми коренів кукурудзи при блокуванні транспорту електронів по цитохромному ланцюгу мітохондрій є подібні до ступеню стійкості клітин інтеркалярної меристеми листків ячменю до дії аналогічного інгібітора [Owen et al.,1986].

Отримані результати досліджень енергообміну злаків свідчать про те, що формування альтернативного шляху транспорту електронів в мітохондріях відбувається під час поділу клітин кукурудзи. Органели клітин меристеми здатні транспортувати електрони по альтернативному шляху, але цей шлях в клітинах меристеми функціонує слабо. Зайнятість ціанідрезистентного шляху транспорту електронів дещо збільшується в зоні початку розтяжіння клітин корнів кукурудзи . Найбільшу активність альтернативного шляху транспорту електронів проявляють дозрілі корені кукурудзи. Таким чином показано, що альтернативний шлях транспорту електронів в мітохондріях формується, як і цитохромний, на ранніх етапах росту клітин, але найбільш висока активність ціанідрезистентного дихання спостерігається у дозрілих клітинах злаків.

Вплив холодового шоку на активність цитохромного та альтернативного шляхів транспорту електронів в клітинах меристеми, дозрілих клітин коренів та листків кукурудзи. Вивчення впливу холодового шоку на інтенсивність поглинання кисню клілинами злаків було розпочато з визначення чутливості дихального енергообміну до пониження температури середовища клітин рослин, що знаходяться на різних етапах росту. Як об'єкт досліджень були використані корені гібридів кукурудзи Колективний 100 СВ. Полярографічний аналіз поглинання кисню коренями різних ділянок коренів гібридів кукурудзи виявив різну реакцію на холодовий стрес клітин коренів кукурудзи в процесі їх росту. Так, не виявлено достовірних змін інтенсивності дихання клітин меристеми під впливом дії холоду (табл.3), в той час як клітини зони початку розтяжінння (2-4 мм від кінчика кореня) реагують незначним підвищенням інтенсивності поглинання кисню після дії холодового стресу. Найбільш виражена реакція на холодовий шок у клітин коренів гібридів кукурудзи, що завершили ріст (ділянка 10-20 мм), де відмічено значне підвищення дихальної активності (табл.3). Охолодження рослин практично не змінює чутливість всіх досліджуваних зон коренів до інгібітора цитохромного шляху транспорту електронів в мітохондріях - азиду натрію. Разом з тим, у всіх досліджуваних зон росту коренів холодовий стрес змінює реакцію дихання на введення в середовище інкубації інгібітора альтернативного шляху транспорту електронів в мітохондріях бензгідроксамової кислоти. Спостерігається збільшення ступеню інгібування дихання бензгідроксамовою кислотою 9,6 до 11,5% в клітинах меристеми; з 11,5 до 17,0% в зоні початку розтягування клітин; з 16,4 до 24,3% в зоні дозрілих клітин коренів гібридів кукурудзи, відповідно до та після холодового шоку.

Таблиця 3

Вплив низьких температур на активність цитохромного і альтернативного шляхів транспорту електронів мітохондрій клітин коріння гібриду кукурудзи Колективний 100 СВ при 25°C у{мкM O2(г сух.речов.)-1 год-1}

Отримані результати свідчать про активацію альтернативного шляху при низьких температурах в клітинах, що завершили ріст. Збільшення активності альтернативного шляху транспорту електронів при пониженні температури середовища може бути обумовлено новоутворенням білка [Vanlerberghe and McIntosh, 1992], внаслідок активації експресії генів, як це було показано не так давно для рису (Ito et al., 1997).

Регуляція активності цитохромного та альтернативного дихання в процесі розвитку зародків кукурудзи при проростанні насіння. Зміни в інтенсивності поглинання кисню тканинами рослин відображують зміни в активності метаболізму клітин, який тісно пов'язаний з фазою їх розвитку. Проростання насіння кукурудзи супроводжується різким підвищенням інтенсивності дихання (табл.4). Стійке до дії азиду дихання тканин ембріонів спостерігається на всіх стадіях проростання насіння. Разом з тим чутливість тканин рослин до дії SHAM різко зростає на протязі 24 - 120 годин проростання насіння кукурудзи при низьких температурах.