Цитогенетична та морфофункціональна характеристика ооцитів людини у зв’язку з їх заплідненням in vitro (клініко-експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВИЙ ГІГІЄНІЧНИЙ ЦЕНТР

КОВАЛЕНКО Таміла Анатоліївна

УДК 618.177-089.888.11(048.8)

ЦИТОГЕНЕТИЧНА ТА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ООЦИТІВ ЛЮДИНИ У ЗВ'ЯЗКУ З ЇХ ЗАПЛІДНЕННЯМ IN VITRO (КЛІНІКО-ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Українському науковому центрі медичної генетики МОЗ і НАН України

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Стефанович Ганна Володимирівна

Український науковий центр медичної генетики МОЗ і НАН України, завідуюча лабораторією генетики раннього розвитку людини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Демідов Сергій Вікторович

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, завідуючий кафедрою загальної та молекулярної генетики

кандидат біологічних наук,

Зерова-Любимова Тетяна Едуардівна

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, провідний науковий співробітник

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ генетики людини, м. Київ

Захист відбудеться “28” травня 1999 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованної вченної ради Д26.604.01 Українського наукового гігієнічного центру, 253660 м. Київ-94, вул. Попудренка,50

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Українського наукового гієнічного центру, м. Київ, вул. Попудренка,50

Автореферат розісланий “16” квітня

Вчений секретар

спеціалізованої вченної ради _____________________ Селезньов Б.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Метод запліднення in vitro (in vitro fertilization, IVF) - одна з допоміжних репродуктивних технологій - широко впроваджується в медичну практику багатьох країн світу як метод лікування безпліддя. Суть цього методу полягає в отриманні дозрілих ооцитів людини після гормональної стимуляції суперовуляції, заплідненні їх поза організмом та переносі ембріонів в матку жінки, де відбувається їх імплантація і подальший розвиток.

Демографічна та епідеміологічна ситуація в Україні в останні роки характеризується депопуляцією і високим рівнем безпліддя (біля 20% подружніх пар), що має тенденцію до зростання (Грищенко, 1997). Тому набуває великої ваги лікування безпліддя, зокрема за допомогою нових репродуктивних технологій, які дозволяють вирішувати значну кількість проблем, що пов'язані як з жіночим, так і з чоловічим безпліддям. Саме нові репродуктивні технології можуть стати одним із дієвих засобів збереження генофонду України в умовах екологічної кризи, посиленої Чорнобильською катастрофою.

В теперішній час в Україні існує сім лабораторій, що використовують метод IVF для лікування різних форм безпліддя. Незважаючи на те, що вітчизняними вченими та клініцистами використовується досвід провідних лабораторій світу, ефективність методу все ще лишається досить низькою. З літератури відомо, що у значної частини ооцитів, які були отримані в стимульованих циклах, виявляються хромосомні аномалії (Angell et al, 1986; Plachot et al, 1989; Стефанович, Бариляк, 1994). Можливо, невдачі лікування безпліддя за допомогою методу IVF обумовлені певними морфофункціональними характеристиками ооцитів, а також хромосомними аномаліями, що виникають під час гаметогенезу, запліднення і раннього ембріонального розвитку. Дані про хромосомні аномалії в гаметах та доімплантаційних ембріонах людини знаходяться на стадії накопичення.

Причини та механізми таких порушень лишаються мало вивченими. Припускається, що ряд біологічних та клінічних факторів, найголовнішими з яких є вік жінки, показання до IVF процедур та гормональна стимуляція суперовуляції, можуть впливати на кількісні, морфофункціональні та цитогенетичні характеристики отриманих ооцитів і, в цілому, на ефективність процедури запліднення in vitro (Galan et al, 1992; Winston et al, 1993). Морфофункціональне та цитогенетичне дослідження ооцитів людини, що використовуються в IVF програмах, є виключно актуальним і дозволяє виявити порушення в яйцеклітинах жінок та встановити вплив різних чинників на характеристики отриманих ооцитів.

Зв'язок роботи з науковими планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках державної науково-дослідної програми Захист генофонду населення України, шифр 01.01.

Метою роботи було дослідження морфофункціональних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини та впливу на них деяких клінічних та біологічних факторів (віку жінки, гормональної стимуляції та показань до IVF).

Задачі дослідження:

Встановити основні типи та рівень цитологічних і хромосомних аномалій, які зустрічаються в незапліднених ооцитах людини.

Виявити взаємозв'язок між кількісними і морфологічними характеристиками отриманих ооцитів та рівнем їх запліднення і настання вагітності.

Вивчити вплив віку жінки, гормональної стимуляції та показань до застосування IVF на характеристики ооцитів.

Дослідити вплив віку, доз та схем гормональної стимуляції суперовуляції на морфологічні та цитогенетичні характеристики ооцитів мишей лінії СВА та провести порівняльний аналіз з результатами дослідження ооцитів людини.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше проведено комплексну оцінку кількісних, морфофункціональних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини в залежності від різних біологічних та клінічних факторів.

Вперше встановлено взаємозв'язок між морфологічними характеристиками ооцитів, відсотком аномального їх запліднення та рівнем запліднення ооцитів і настання вагітності.

Проведено порівняння впливу віку, доз та схем гормональної стимуляції суперовуляції на морфологічні і цитогенетичні характеристики незапліднених ооцитів людини та ооцитів миші.

Практичне значення дослідження. Отримані результати можуть бути використані в клініках, що застосовують метод IVF.

Дослідження кількісних і морфологічних характеристик ооцитів, отриманих після гормональної стимуляції суперовуляції, дозволяє прогнозувати рівень їх запліднення та настання вагітності.

Дані про вплив біологічних і клінічних факторів на характеристики ооцитів дозволять оцінити для окремої жінки імовірність запліднення та настання вагітності в залежності від її віку та показань до IVF.

Результати дослідження частоти хромосомних аномалій в незапліднених ооцитах для окремої жінки можуть бути підставою для рекомендації використання яйцеклітин донора.

Встановлення спільних закономірностей при дослідженні впливу віку та схем гормональної стимуляції на ооцити людини та миші може підтвердити оптимальність використання мишей лінії СВА як модельної системи для вивчення впливу різних факторів на ефективність IVF процедур.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено прижиттєве дослідження та фіксація незапліднених ооцитів, отриманих в клініці Isida IVF ; цитогенетичне дослідження та каріотипування цитогенетичних препаратів; експерименти по дослідженню впливу віку та гормональної стимуляції на ооцити мишей лінії СВА; розроблено анкету даних про пацієнток, ооцити яких досліджувались в цій роботі. Автором самостійно виконано статистичний аналіз отриманих результатів та підготовано текст дисертації.

Автор висловлює щиру подяку директору Українського наукового центру медичної генетики Бариляку І.Р. за постійну підтримку та допомогу під час виконання роботи, співробітникам клініки Isida IVF та Інституту репродуктивної медицини (ІРМ) за надання матеріалу та даних про пацієнток, м.н.с. Гасенко О.О. за прижиттєву оцінку та фіксацію незапліднених ооцитів, отриманих в ІРМ, ст.н.с. Лакізі О.В. за проведення вазектомії самців мишей лінії СВА.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на науковому симпозіумі Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии (Київ, 1997), на науково-практичній конференції Ефективність пренатальної діагностики у профілактиці вродженої та спадкової патології (Шацьк, 1998), на міжнародному конгресі “The First World Congress of A PART (The International Assosiation of Privat Assisted Reproductive Technology Clinics and Laboratories)” (Venice, 1999).

Публікації. За темою дисертації було опубліковано 9 друкованих робіт, в тому числі 6 статтей.

Обсяг та структура роботи. Дисертаційна робота викладена на 126 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, результатів власних досліджень, обговорення, заключення, висновків, переліку використаних джерел. Текст дисертації ілюстрований 23 таблицями та 16 рисунками. Перелік використаних джерел містить 216 назв.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи

Під час виконання роботи досліджувалися ооцити, отримані від 214 жінок, які проходили курс лікування безпліддя методом запліднення in vitro у клініці “Іsіdа IVF” та в Інституті репродуктивної медицини (ІРМ), м.Київ.

Жінки були поділені на групи в залежності від віку (3 групи: І - до 26 років; ІІ - 26-34 років; ІІІ -понад 34 роки), типу безпліддя (4 групи: І - з трубно-перитонеальним безпліддям; ІІ - з ендокринним безпліддям; ІІІ - з ідіопатичним безпліддям; ІV - з безпліддям, причиною якого був чоловічий фактор), схеми гормональної стимуляції (3 групи: І - без використання агоністів гонадотропін рілізінг гормону (ГнРГа), ІІ - ГнРГа+; ІІІ - ГнРГа+const. схема), рівня запліднення (4 групи: І - з рівнем запліднення 0-25%; ІІ - з рівнем запліднення 26-50%; ІІІ - з рівнем запліднення 51-75%).

Вплив віку та схем гормональної стимуляції суперовуляції на характеристики ооцитів вивчали на модельній системі - мишах лінії СВА.

Для вивчення впливу віку на стан ооцитів було досліджено три групи мишей (по10 тварин в кожній): “молодшого”, “середнього” та “старшого” віку. Для дослідження впливу різних доз введених гормонів були виділені 4 групи мишей віком 8-12 тижнів (по10 тварин в кожній): І група (контроль) - ооцити отримували у природному циклі; ІІ група - тваринам вводили по 5 МО гонадотропінів; ІІІ група - тваринам вводили по 10 МО гонадотропінів; ІV група - тваринам вводили по 15 МО гонадотропінів. Для вивчення впливу різних схем гормональної стимуляції на характеристики ооцитів було досліджено три групи мишей віком 8-12 тижнів: І група (контроль) - ооцити отримували у природному циклі; ІІ група- стимуляцію проводили за схемою гонадотропін сироватки жеребих кобил + хоріонічний гонадотропін людини (ХГЛ); ІІІ група- стимуляцію проводили за схемою менопаузальний гонадотропін людини + ХГЛ.

Ооцити жінок отримували в клініках шляхом трансвагінальної пункції та аспірації преовуляторних фолікулів під контролем ультрасонографії після гормональної стимуляції суперовуляції. Враховували такий показник, як кількість отриманих ооцитів в розрахунку на одну жінку, а також результати їх прижиттєвого морфологічного аналізу: кількість дозрілих/недозрілих ооцитів та яйцеклітин з ознаками дегенерації. Незапліднені ооцити доставляли у лабораторію для прижиттєвого дослідження та фіксації.

Овуляторні ооцити мишей одержували шляхом гормональної стимуляції суперовуляції, яку проводили за стандартною методикою (Aogan et al, 1986).

Незапліднені ооцити людини та отримані ооцити мишей піддавали прижиттєвій морфологічній оцінці (враховували стан цитоплазми: ступінь гранульованості, щільність; перивітелінового простору; наявність 1-го полярного тільця; фрагментації; ознак дегенерації), за результатами якої виділяли ооцити задовільної та низької якості.

Фіксація ооцитів проводилася за методами Almeida, 1993; Micamo et al, 1983; Wramsby, 1985.

Для об'єктивізації та прискорення хромосомного аналізу використовували автоматизовану оптико-електронну систему “Метаскан-2” (спільного виробництва фірми “Оптрон” та Українського наукового центру медичної генетики, м. Київ).

Усі статистичні розрахунки виконували за допомогою спеціальних програм на мікрокалькуляторі “Електроніка МК 61”.

Результати дослідження та їх обговорення

Дослідження функціональних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини

Проведене дослідження дало змогу порівняти функціональні та цитогенетичні характеристики ооцитів людини, отриманих в різних центрах лікування безпліддя: клініці ”Isida IVF” та Інституті репродуктивної медицини (ІРМ). В кожній з клінік ооцити були отримані від 107 жінок віком від 19 до 42 років, середній вік 30,6 4,5 років (ІРМ) та віком від 19 до 44 років, середній вік 31,2 5,1 років (”Isida IVF”). Середня кількість ооцитів на жінку становила 10,6 0,7, розбіг 1-33 (ІРМ) та 10,5 0,6, розбіг 3-28 (”Isida IVF”). Кількість запліднених та незапліднених ооцитів на жінку в обох центрах лікування безпліддя достовірно не відрізнялась (5,7 0,5 та 4,8 0,4 відповідно, “Isida IVF” і 5,1 0,7 та 5,5 0,7 відповідно, ІРМ), що дозволяє говорити про майже ідентичні функціональні характеристики ооцитів, отриманих в різних клініках. Отримані нами результати знаходяться в межах показників аналогічних досліджень, проведених в різних IVF центрах. Рівень запліднення в обох випадках становить ~50%, що узгоджується з даними інших дослідників (Winston et al, 1993) та вважається нормальним загальноприйнятим рівнем запліднення при IVF процедурах.

Цитогенетичному аналізу підлягали 288 незапліднених ооцитів з ІРМ та 204 - з клініки ”Isida IVF”. Результати дослідження показали, що майже усі характеристики їх знаходяться в межах результатів аналогічних досліджень. Так, основна кількість яйцеклітин знаходилася на стадії М ІІ мейозу (61,1% ІРМ та 57,8% ”Isida IVF”), що узгоджується з даними, наведеними в інших роботах (Стефанович и др., 1995). Рівень диплоїдії, аномалії, яка виникає внаслідок порушення виділення полярного тільця під час першого поділу дозрівання, становив 5,3% (ІРМ) та 6,9% (”Isida IVF”), що ближче до нижньої межі цього показника (Angell et al, 1986). Поліплоїдія (кількість хромосом приблизно дорівнювала тетраплоїдному набору хромосом) зустрічалася в 1,0% (ІРМ) та 0,5% (”Isida IVF”) яйцеклітин. Рівень дегенерації хромосомного матеріалу- 20,1% (ІРМ) та 24,0% (”Isida IVF). Незначна кількість ооцитів - 1,4% (ІРМ) та 0,5% (”Isida IVF”) були недозрілими і знаходилися на стадії телофази І мейозу. Вважається, що яйцеклітини з передчасною конденсацією хромосом (ПКХ) сперматозоїдів також недозрілі, тому що ця аномалія виникає через надлишкову присутність фактору промоції мейозу (Tejada et al, 1992). В нашому дослідженні в 12,7% (ІРМ) та 13,7% (”Isida IVF”) ооцитів, поряд з метафазною пластинкою хромосом ооциту спостерігалася ПКХ сперматозоїда. Тому можна вважати, що загальна кількість недозрілих ооцитів становить 13,4%. В той же час ооцити, в яких спостерігається ПКХ сперматозоїдів, належать до аномально запліднених яйцеклітин (Edwards et al, 1984), як і поліспермно запліднені ооцити (Woll, 1988), частота яких складає, за нашими даними, 3,5% (ІРМ) та 1,5% (”Isida IVF”). Цитогенетичний аналіз також виявив 7,6% в ІРМ та 5,9% у клініці ”Isida IVF”ембріонів, які зупинилися на ранніх стадіях дроблення. Таким чином, в 21,9% ооцитів, які вважалися незаплідненими, відбулося запліднення, причому в 6,9% це було нормальне запліднення, але через невстановлені причини дроблення ембріонів припинилося на початкових стадіях, а у 15% - відбулося аномальне запліднення. Рівень спонтанної партеногенетичної активації в нашому дослідженні становив 3,8% (ІРМ) та 2,9% (”Isida IVF”). Ці цифри близькі до результатів Wojcik et al, 1995 (2,7%). З таких ооцитів можуть розвиватися гаплоїдні ембріони, частина яких гине під час дроблення, перед або відразу після імплантації, а деякі - на початку органогенезу (De Sutter, 1992).

Загальне порівняння результатів цитогенетичного аналізу ооцитів, отриманих в двох центрах лікування безпліддя, не виявило достовірних відмінностей у цитогенетичних характеристиках незапліднених ооцитів. Тому ми вважаємо, що можна говорити про загальну сукупність ооцитів, що були отримані під час IVF процедур у клініках міста Києва. Крім того, отримані нами дані про функціональні та цитогенетичні характеристики незапліднених ооцитів є цілком порівнянними з результатами інших дослідників. Але, в той же час, існують суттєві розбіжності даних в межах кожної групи ооцитів. Тому можна говорити, що на розподіл незапліднених ооцитів за їх характеристиками можуть впливати різні фактори (клінічні, біологічні та ін.), мова про які піде нижче.

Дослідження морфологічних характеристик ооцитів людини

Нами було встановлено, що більшість незапліднених ооцитів людини на стадії метафази ІІ (МІІ) мейозу мали задовільні морфологічні характеристики (табл. 1). Вплив морфологічних характеристик на рівень запліднення був описаний рядом дослідників (Zenzes et al, 1997, Zhen et al, 1992). В нашому дослідженні було показано, що морфологічні характеристики пов'язані з рівнем запліднення, як нормального, так і аномaльного, та не впливають на рівень спонтанної активації (табл. 2).

Табл. 1.

Зв'язок між морфологічними та цитогенетичними характеристиками ооцитів

*р0,05 При порівнянні ооцитів нормальної та низької якості

Табл. 2.

Зв'язок між морфологічними характеристиками ооцитів та рівнем запліднення і партеногенетичної активації

*р0,05 При порівнянні ооцитів нормальної та низької якості

Хромосомний аналіз незапліднених ооцитів людини

Хромосомний аналіз незапліднених ооцитів людини на стадії МІІ мейозу показав, що лише 47,0% яйцеклітин мали нормальний набір хромосом (рис. 1). Основною хромосомною аномалією в незапліднених ооцитах людини була анеуплоїдія, причому частота гіпогаплоїдії складала 39,0%, а гіпергаплоїдії - 11,0%. В досліджуваних ооцитах анеуплоїдія частіше була пов'язана з надлишком або недостачею цілих хромосом (78,0%), ніж хроматид (18,0%). Було також з'ясовано, що найчастіше анеуплоїдія виникає внаслідок нерозходження хромосом груп Е та G, а частота нерозходження хромосом групи А достовірно нижча очікуваної. Частота поліплоїдії в ооцитах, що були відібрані для хромосомного аналізу, складала 2,0%. Структурні аномалії були виявлені в 1,0% яйцеклітин.

Вплив біологічних та клінічних факторів на характеристики ооцитів

Дослідження впливу віку жінки на морфофункціональні та цитогенетичні характеристики ооцитів. В нашій роботі ми вивчали як морфофункціональні, так і цитогенетичні характеристики ооцитів людини. Встановлено поступове зниження кількості ооцитів на жінку з віком (13,31,1 проти 10,60,7 та 8,80,6 вІ, ІІ і ІІІ групах відповідно, р < 0,05 ), збільшення кількості недозрілих ооцитів у жінок старшого віку (17,91,6% у ІІІ групі проти 13,31,0% та 12,81,4% в ІІ і І групах відповідно, p < 0,05). Кількість диплоїдних ооцитів у жінок різних вікових груп в нашому дослідженні була майже незмінною (4,91,9%; 5,51,5%; 5,32,0% у І, ІІ і ІІІ групах відповідно), крім того, всупереч даним Yie, 1996, нами було показано достовірне збільшення кількості поліспермно запліднених ооцитів з зростанням віку жінки (0% у І групі проти 2,10,9% та 6,12,1% у ІІ та ІІІ групах, р<0,05) .

Серед незапліднених яйцеклітин у жінок старшого віку достовірно збільшувалася кількість ооцитів низької якості (35,14,2% у ІІІ групі та 32,43,0% у ІІ групі проти 15,43,3% в І групі, p<0,05). Ми встановили пропорційне зниження рівня настання вагітності з віком пацієнток, але різниця між цими показниками в різних вікових групах не була достовірною (18,65,9%; 15,63,5%; 12,94,3% в І, ІІ та ІІІ групах відповідно).

На жаль, більшість досліджень морфологічних та цитогенетичних характеристик проводилося на ооцитах людини, які залишилися незаплідненими, тому виникало питання, чи можна екстраполювати виявлені закономірності на всю сукупність отриманих ооцитів. Для вирішення цієї проблеми проводилися експерименти на тваринах, найчастіше на мишах. Більшість дослідників приділяли увагу змінам у хромосомному стані ооцитів. В одній з робіт описано зниження рівня спонтанної овуляції у мишей віком понад 300 днів (Hartshorne, 1994). Рівень анеуплоїдії також зростав з віком миші (Brovk, 1984).

В нашому дослідженні вивчався вплив віку як на морфологічні, так і на цитогенетичні характеристики ооцитів миші. Було показано значне погіршення зазначених характеристик з зростанням віку тварини. Крім того, було проведено порівняння отриманих результатів для ооцитів людини та миші (табл. 3). Незначні розбіжності у впливі віку на деякі цитогенетичні характеристики ооцитів миші та людини можна пояснити тим, що в яйцеклітинах людини, які залишилися незаплідненими, відбуваються дещо інші хромосомні зміни. Але загальне погіршення характеристик, що досліджувалися, притаманне ооцитам як людини, так і миші. Тому можна вважати, що збільшення віку жінки - це фактор, який негативно впливає на морфологічні та цитогенетичні характеристики всієї сукупності отриманих ооцитів, а, таким чином, і на рівень заплідненості та настання вагітності; на цій підставі його можна вважати фактором, який лімітує успішне проведення IVF програм.

Вивчення впливу різних форм безпліддя на характеристики отриманих ооцитів До нашого часу не існує одностайної думки про вплив показань до IVF на морфофункціональні та цитогенетичні характеристики ооцитів. У хворих з ідіопатичною формою безпліддя частіше спостерігалися партеногенетично активовані ооцити, порівняно з жінками з трубно-перитонеальним безпліддям (Plachot, 1988). Наші дослідження також виявили таку закономірність, але різниця не була достовірною (6,73,2% у жінок з ідіопатичною формою безпліддя проти 3,21,2% з трубно-перитонеальним безпліддям).

Табл. 3.

Порівняння морфологічних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини та миші в залежності від віку, (M+m)

*p < 0,05 - достовірність відмінностей в порівнянні з першою групою.

За даними деяких дослідників, ефективність IVF процедур найвища у випадку трубно-перитонеального безпліддя (Ramesh, 1996) і найменша - у випадку чоловічого безпліддя (Plachot, 1988). У випадку з ідіопатичною формою безпліддя рівень запліднення нижчий, ніж у пацієнтів з трубним фактором, в той же час рівень імплантації та настання вагітності в цих випадках однаковий (Mahadevan, 1983).

За нашими даними, найменша кількість недозрілих ооцитів спостерігалася у пацієнток з трубно-перитонеальним безпліддям (9,10,9% проти 18,91,6% з ендокринним безпліддям та 19,92,1% у випадку, коли причиною безпліддя був чоловічий фактор, p<0,05). Кількість дозрілих яйцеклітин була найнижчою у разі ендокринного безпліддя (74,01,8%) та у випадку, коли причиною безпліддя був чоловічий фактор (73,52,3% проти 82,41,2% з трубно-перитонеальним та 79,42,2% з ідіопатичним безпліддям, p<0,05). Найвищий рівень запліднення спостерігався у жінок з ідіопатичною формою безпліддя (70,52,7% проти 50,92,2% з ендокринним безпліддям, 49,22,0% з трубно-перитонеальним безпліддям та 43,32,6% у випадку, коли причиною безпліддя був чоловічий фактор, p<0,05), ці дані суперечать результатам, наведеним вище (Mahadevan, 1983). Достовірно більша кількість ооцитів нормальної якості спостерігалась у пацієнтів, причиною безпліддя у яких був чоловічий фактор (79,04,5%, р<0,05). Крім того, у цих пацієнтів був найнижчий рівень аномального запліднення (ПКХ - 4,02,3% та поліспермії - 0%, p<0,05), що добре узгоджується з результатами інших досліджень (Plachot, 1988).

При вивченні характеристик ооцитів в залежності від показань до IVF було виявлено, що достовірні зміни відбуваються скоріше в морфофункціональних, ніж цитогенетичних характеристиках ооцитів. Найнижчий рівень аномального запліднення був у пацієнтів, причиною безпліддя у яких був чоловічий фактор. Таким чином, у таких пацієнтів найменша імовірність запліднення як нормального, так і аномального типу, оскільки рівень аномального запліднення, зокрема поліспермії, корелює з рівнем нормального запліднення і настання вагітності.

Дослідження впливу різних схем гормональної стимуляції на характеристики ооцитів Вплив різних схем гормональної стимуляції суперовуляції на характеристики ооцитів почав ретельно досліджуватись в зв'язку з використанням ГнРГа. Достовірне збільшення рівня запліднення ооцитів було показано для яйцеклітин, отриманих за допомогою ГнРГа, тоді як різниця між якістю отриманих ембріонів не простежувалася (De Sutter et al, 1991). Рівень анеуплоїдії був вищим в ооцитах, що були отримані після стимуляції ГнРГа (Plachot, 1988).

Наше дослідження показало достовірні відмінності в морфофункціональних характеристиках незапліднених ооцитів (відсотку недозрілих ооцитів; ооцитів, які дегенерували; яйцеклітин, що залишилися незаплідненими) при використанні різних схем гормональної стимуляції суперовуляції. В той же час лише рівень запліднення ооцитів був достовірно вищим при використанні ГнРГа (54,32,2% у групі ГнРГа+ та 54,21,5% в групі ГнРГа+const. схема, проти 30,43,4% в групі ГнРГа-, p<0,05), всі інші зміни відбувалися як між схемами з використанням ГнРГа та без них, так і між різними схемами з використанням ГнРГа. Аналогічні висновки можна було зробити і виходячи із даних про вплив різних схем гормональної стимуляції на морфологічні характеристики ооцитів миші.

Дослідження, що були проведені на мишах, дозволили не тільки вивчити вплив різних схем гормональної стимуляції на характеристики ооцитів, але й дослідити вплив різних доз гормонів, що використовувалися для стимуляції суперовуляції, на морфологічні та цитогенетичні параметри яйцеклітин.

Наше дослідження встановило, що використання різних доз гонадотропінів більше позначається на морфологічних та цитогенетичних характеристиках отриманих ооцитів, ніж застосування різних схем гормональної стимуляції. Існує оптимальна доза гонадотропінів (в нашому випадку 5 МО), використання якої дозволяє отримувати значну кількість ооцитів, морфологічні та цитогенетичні характеристики яких не відрізняються від параметрів яйцеклітин, отриманих в природному циклі. Подальше збільшення дози приводить до погіршення морфологічних та цитогенетичних характеристик ооцитів.

При оцінці впливу гормональної стимуляції на отримані ооцити можна сказати, що використання ГнРГа підвищує рівень запліднення ооцитів; вживання різних схем гормональної стимуляції суперовуляції суттєво не впливає на функціональні характеристики ооцитів, причому зміни в морфологічних характеристиках, що досліджувалися в нашій роботі, не були встановлені, а з цитогенетичних характеристик змінювався лише відсоток яйцеклітин з дегенерацією ядерного матеріалу. Дослідження, проведені на ооцитах мишей, показали, що зміни доз гонадоторопінів більше, ніж різні схеми гормональної стимуляції суперовуляції, впливають на морфологічні та цитогенетичні характеристики ооцитів.

Дослідження морфологічних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини з різним рівнем запліднення Дослідження характеристик яйцеклітин в залежності від рівня їх запліднення проводилося лише в одній роботі (Воробьева и др., 1997). Але, на жаль, в ній порівнювся лише рівень анеуплоїдії. Проведені нами дослідження показали, що морфологічні характеристики ооцитів в значній мірі обумовлюють рівень їх запліднення. Так, найменша кількість недозрілих ооцитів була в групі з рівнем запліднення (РЗ) 51-75% (6,70,9%, р<0,05), найбільша кількість дозрілих ооцитів спостерігалася в групі з РЗ 76-100% (82,32,2%, p<0,05). В свою чергу, рівень запліднення ооцитів корелює з відсотком ПКХ (6,22,4% в групі з РЗ 0-25%, 8,32,6% -з РЗ 26-50%, 17,53,7% - з РЗ 51-75% та 34,68,6% в групі з РЗ 76-100%), а з рівнем поліспермного запліднення така закономірність не простежується. В той же час в групах жінок з достовірно вищим рівнем настання вагітності спостерігався вищий рівень поліспермного запліднення (22,96,1% та 4,11,8% відповідно в групі з РЗ 26-50% і 21,05,2% та 3,41,7% відповідно в групі з РЗ 51-75%).

Таким чином, можна сказати, що морфологічні характеристики отриманих ооцитів людини в значній мірі обумовлюють рівень їх запліднення. Цитогенетичні характеристики незапліднених ооцитів залишаються незмінними в групах з різним рівнем запліднення. Найвищий рівень настання вагітності спостерігався у жінок з рівнем запліднення ооцитів 26-75%.

Висновки

Сукупність ооцитів, що не запліднилися під час IVF процедур, гетерогенна за своїми морфологічними ознаками та цитогенетичними характеристиками. Переважна більшість яйцеклітин, які знаходилися на стадії МІІ мейозу та містили гаплоїдний набір хромосом, мали нормальну морфологію.

Хромосомний аналіз незапліднених ооцитів людини, що знаходилися на стадії МІІ мейозу, встановив, що 53,0% цих клітин містили хромосомні аномалії, серед яких найчастіше зустрічалася анеуплоїдія хромосом груп E та G.

Зменшення кількості ооцитів, отриманих від однієї жінки, та погіршення їх морфологічних характеристик призводить до зниження здатності їх до запліднення. Найбільша кількість яйцеклітин з ознаками дегенерації спостерігалась в групі ооцитів з рівнем запліднення 0-50%.

Зростання віку жінки, починаючи з 26 років, негативно впливає на морфофункціональні та цитогенетичні характеристики ооцитів, отриманих під час IVF програм.

У пацієнтів з різними формами безпліддя отримані ооцити суттєво відрізняються за своїми морфофункціональними показниками та здатністю до запліднення. Найвищий рівень запліднення яйцеклітин in vitro спостерігався у жінок з ідіопатичним безпліддям (70,5%), найнижчий - у пацієнтів, причиною безпліддя у яких був чоловічий фактор (43,3%).

Результати дослідження впливу віку та схем гормональної стимуляції суперовуляції на характеристики ооцитів мишей лінії СВА співпадають з аналогічними даними в незапліднених ооцитах людини: з зростанням віку спостерігалось погіршення морфологічних та цитогенетичних характеристик ооцитів. В той же час зміни у схемі гормональної стимуляції суперовуляції суттєво не позначаються на морфологічних та цитогенетичних характристиках ооцитів людини та миші.

Список опублікованих наукових робіт, які відображають основні положення дисертації

1. Горопашна Т.А., Стефанович Г.В., Бариляк І.Р.Цитогенетичні аномалії в незапліднених ооцитах людини // Український медичний альманах.-1998.-№4.-С.9-13.

2. Коваленко Т.А., Лакіза О.В., Стефанович Г.В., Бариляк І.Р. Вплив різних доз гонадотропінів на кількісні морфологічні та цитогенетичні характеристики ооцитів мишей лінії СВА // Цитология и генетика.-1999.-Т.33, №1.-С.49-53.

3. Коваленко Т.А., Стефанович Г.В., Бариляк І.Р., Дахно Ф.В., Гасенко О.О., Зінченко В.М. Дослідження морфологічних та цитогенетичних характеристик ооцитів людини з різним рівнем запліднення // Вісник проблем біології і медицини.-1999.-№2.-С.26-29.

4. Коваленко Т.А., Стефанович Г.В., Бариляк І.Р. Використання лабораторних тварин для вивчення факторів, що впливають на запліднення in vitro // Вісник проблем біології і медицини.-1999.-№3.-С.6-9.

5. Коваленко Т.А., Стефанович Г.В., Бариляк І.Р., Дахно Ф.В., Гасенко О.О., Зінченко В.М. Дослідження впливу різних схем гормональної стимуляції на характеристики ооцитів, отриманих під час IVF процедур // Вісник проблем біології і медицини.-1999.-№4.-С.22-26.

6. Бариляк І.Р., Горопашна Т.А., Стефанович Г.В., Лакіза О.В., Ісаєва Г.В., Зукін В.Д., Зінченко В.М. Морфологічні та цитогенетичні характеристики ооцитів жінок різних вікових груп // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології.- Київ - Луганськ: ВАТ “ЛОД”,-1998.-С.211-213.

7. Горопашная Т.А., Стефанович А.В., Зинченко В.М. Цитогенетический и морфологический анализ неоплодотворившихся ооцитов человека // Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии; Сборник научных трудов симпозиума с международным участием.-Киев.-1997.- С.142.

8. Goropashnaya T., Lakiza O.V., Stefanovich A., Barilyak I. The effect of different doses of gonadotropins on number, quality and cytogenetics of mouse oocytes // J. of Assisted Reproduction and Genetics.-1999.-V.16,№3.-P.156.

9. Kovalenko T.A., Stefanovich A.V., Barilyak I.R., Dakhno F.V., Sirenko V.Y., Gasenko E.A., Zinchenko V.M. Effects of hormonal stimulation on parameters of human oocytes // J. of Assisted Reproduction and Genetics.-1999.-V.16,№3.-P.157.

хромосомний ооцит цитогенетичний мейоз

Анотації

Коваленко Т.А. Цитогенетична та морфофункціональна характеристика ооцитів людини у зв'язку з їх заплідненням in vitro (клініко-експериментальне дослідження).

Рукопис дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук по спеціальності 03.00.15 - генетика (біологічні науки). Український науковий гігієнічний центр. Київ, 1999.

Встановлено, що ооцити нормальної морфології переважно знаходяться на стадії МІІ мейозу та мають більшу імовірність запліднення, як нормального, так і аномaльного. Хромосомний аналіз ооцитів людини, які залишилися незаплідненими після IVF та знаходилися на стадії МІІ мейозу, встановив, що 53,0% цих клітин містили хромосомні аномалії. Крім того, було показано, що погіршення кількісних та морфологічних характеристик отриманих ооцитів призводить до зниження рівня їх запліднення. Збільшення віку жінки негативно впливає на морфофункціональні та цитогенетичні характеристики ооцитів, отриманих під час IVF програм. У пацієнтів з різними формами безпліддя отримані ооцити суттєво відрізняються за своїми морфофункціональними показниками та здатністю до запліднення. Результати дослідження впливу віку та схем гормональної стимуляції суперовуляції на характеристики ооцитів мишей лінії СВА співпадають з аналогічними даними про незапліднені ооцити людини.

З теми дисертації опубліковано 9 наукових робіт.

Ключові слова: незапліднені ооцити, цитогенетичні характеристики, морфологічні характеристики ооцитів, метафаза ІІ мейозу, гормональна стимуляція, вік жінки, запліднення in vitro.

Коваленко Т.А. Цитогенетическаия и морфофункциональная характеристика ооцитов человека в связи с их оплодотворением іn vitro (клинико-экспериментальное исследование).

Рукопись диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). Украинский научный гигиенический центр. Киев, 1999.

Метод оплодотворения in vitro (in vitro fertilization, IVF) широко внедряется в медицинскую практику большинства стран мира, как метод лечения многих форм бесплодия, не поддающихся лечению другими методами. Спектр его применения постоянно расширяется, включая самые тяжелые формы бесплодия, в частности мужского. Суть метода заключается в получении зрелых ооцитов человека после гормональной стимуляции суперовуляции, оплодотворении их вне организма и переносе полученных эмбрионов в матку женщины, где происходит их имплантация и дальнейшее развитие.

Его применение в Украине особенно актуально, поскольку демографическая и эпидемиологическая ситуация в последние годы характеризуется депопуляцией и высоким уровнем бесплодия (около 20% супружеских пар). Использование новых репродуткивных технологий и метода IVF в частности позволяет решать значительное количество проблем, связанных как с женским, так и с мужским бесплодием. Именно новые репродуктивные технологии могут стать одним из действенных средств сохранения генофонда Украины в условиях экологического кризиса, усиленного Чернобыльской катастрофой.

В настоящее время в Украине созданo 7 лабораторий, которые используют метод IVF для лечения разных форм бесплодия. Несмотря на то, что отечественными учеными и клиницистами учитывается опыт ведущих лабораторий мира, эффективность метода до сих пор остается достаточно низкой. Предполагается, что неудачи лечения бесплодия методом IVF обусловлены определенными морфофункциональными характеристиками ооцитов и хромосомными аномалиями, которые возникают во время гаметогенеза, оплодотворения и раннего эмбрионального развития. Кроме того, ряд биологических и клинических факторов, в первую очередь таких как, возраст женщины, показания к IVF и горманальная стимуляция суперовуляции могут негативно влиять на количественные, морфофункциональные и цитогенетические характеристики полученных ооцитов, и, таким образом, на эффективность оплодотворения in vitro.

Целью работы было исследование морфофункциональных и цитогенетических характеристик ооцитов человека и влияния на них некоторых клинических и биологических факторов (возраста женщины, гормональной стимуляции и показаний к IVF).

Было исследовано 492 неоплодотворившихся ооцита, полученных от 214 женщин, проходивших курс лечения бесплодия методом IVF в клиниках г. Киева. Для того, чтобы определить, можно ли экстраполировать закономерности, установленные при исследовании неоплодотворившихся ооцитов, на всю совокупность яйцеклеток, полученных в ходе IVF программ, было проведено дополнительное исследование на 988 ооцитах мышей линии СВА. В результате проведенного исследования было установлено, что ооциты с нормальной морфологией в основном находятся на стадии МІІ мейоза и имеют большую вероятность оплодотворения как нормального, так и аномaльного. Хромосомный анализ ооцитов человека, которые остались неоплодотворенными после IVF и находились на стадии МІІ мейоза, показал, что 53,0% из них несли хромосомные аномалии. Кроме того, было установлено, что ухудшение количественных и морфологических характеристик полученных ооцитов приводит к снижению уровня их оплодотворения. Увеличение возраста женщины негативно влияет на морфофункциональные и цитогенетические характеристики ооцитов, полученных при проведении IVF программ. У пациентов с разными формами бесплодия полученные ооциты значительно отличаются по своим морфофункциональным показателям и по способности к оплодотворению. Результаты исследования влияния возраста и схем гормональной стимуляции суперовуляции на характеристики ооцитов мышей линии СВА совпадают с аналогичными данными о неоплодотворившихся ооцитах человека.

По теме диссертации было опубликовано 9 научных работ.

Ключевые слова: неоплодотворившиеся ооциты, цитогенетические характеристики, морфологические характеристики ооцитов, гормональная стимуляция, метафаза ІІ мейоза, возраст женщины, оплодотворение in vitro.

Kovalenko T.A. Cytogenetical and morphological oocytes charaсteristics associated with in vitro fertilization (сliniсs and eхperimental investigation).

The manuscript of dissertation for a Candidate's degree in Biology, Speciality 03.00.15-genetics (biological science). Ukrainian Scientific Centre of Hygiene. Kуіv, 1999.

Correlation between oocytes with normal morphology and Metaphase II stage, level of fertilization (bofh normal and abnormal) was estimated. The level of chromosome anomalies in oocytes of second meiotic metaphase comprised 53,0%. The decreasing of number and aggravation of morphological oocyte parameters corelates with decreasing of their fertilization rate. Decreasing of woman age influences on morphological and cytogenetics oocyte parameters in negative way. In groups of patients with different causes of infertility recovering oocytes distinguish by their morphological, functional parameters and fertilization potential. Results of age and different schemes of gormonal stimulation influence on unfertilized human oocyte parameters and oocytes from CBA mice where compared. 9 scientific papers within the context of dissertation had been published.

Key words: unfertilized oocytes, cytogenetical parametres, morphological oocytes characteristics, meiotic II metaphase, hormonal stimulation, women's age, in vitro fertilization.

Размещено на Allbest.ru