Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський університет імені Тараса Шевченка

АВТОРЕФЕРАТ

на здобуття наукового ступеня кандидата бiологiчних наук

Регуляцiя активностi екзопротеїназ молокозсiдальної дії штамiв Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv

Спеціальність: Бiохiмiя

НIКIТIНА ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРIВНА

Київ, 1999 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальнiсть проблеми. Розробка та освоєння нових високоефективних технологiй, якi сприяють комплексному використанню молока, - важливе нородно-господарське завдання. Впровадження до технологiї виробницьтва ферментних препаратiв мiкробного та грибного походження може суттєво впливати на досить довгi пасивнi схеми одержання молочних продуктiв. Ферменти повиннi широко вивчатися та вживатися з метою пiдвищення якостi продукцiї, отриманя принципово нових продуктiв та пiдвищення рентабельностi виробництва.

Сичужний фермент, за традицєю, виробляють iз сичуга ягнят та телят. При цьому отримується не досить активний фермент з великим вмiстом баластових речовин. Розширення виробництва сирiв та iнших молочних виробiв потребують пошуку замiнникiв сичужних ферментiв.

Ферментнi системи вищих базидiальних грибiв зараз вивчаються бiльш широко та планомiрно, але мiцелiальнi гриби у цьому аспектi вивченi ще не досить добре. Важливiсть подiбних дослiджень безперечна, тому що як фiзiологiчнi, так i ферментативнi характеристики чистих мiцелiальних культур, їх первиннi та вториннi процеси метаболiзму та вiдповiднi продукти явно вказують не тiльки на наукове значення напрямку, але i на його перспективнiсть для практичного використання.

Порiвняльна простота культивування грибiв, їх висока фiзiологiчна та генетична пластичнiсть вiдкривають великi можливостi cтосовно промислової ферментологiї та селекцiї штамiв-продуцентiв.

Отримання цiнних грибних метаболiтiв пов'язано з оптимiзацiєю умов для їх бiосинтезу пiд час штучного культивування та є однiєю з основних задач, яка потребує вирiшення. Впровадження до сфери промислового використання як можна бiльшої кiлькостi базидiомiцетiв приведе до збiльшення корисних ресурсiв нашої держави.

Мета i завдання дослiджень. Метою роботи було пiдвищення синтезу протеїназ молокозсiдальної дiї штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 H. laricinus шляхом використання рiзних факторiв.

Для досягнення цiєї мети вирiшувалися такi завдання:

- з'ясування здатностi штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 до синтезу молокозсiдальних протеїназ;

- вивчення впливу та пiдбiр найкращих екологiчних факторiв: способу культивування, температурного, кислотного режимiв росту;та особливостей бiосинтезу дослiджуваних штамiв;

- виявлення специфiки вуглецевого та азотного живлення продуцентiв молокозсiдальних протеїназ;

- встановлення ролi рiзних бiологiчно-активних речовин: ауксину та гiберелiну, екстракту росткiв картоплi, соєвого борошна, якi додавалися до живильного середовища;

- дослiдження можливостi вирощування продуцентiв на дешевих та доступних субстратах;

- виявлення динамiки росту, бiосинтезу i кiнетичних параметрiв при культивуваннi штамiв на рiзноманiтних живильних середовищах.

Наукова новизна роботи. Дослiджено понад 120 середовищ. Отриманi новi вiдомостi про рiвень молокозсiдальної активностi й росту штамiв на цих середовищах. Пiдiбранi оптимальнi показники кислотного та температурного режимiв культивування, умов стерилiзацiї середовищ, спосiб аерацiї. Вперше визначено константи iонiзацiї, якi контролюють активнiсть молокозсiдальних протеїназ у кожного з дослiдженних штамiв i тенденції змiнювання молокозсiдальної активностi та кислотностi середовища у динамицi.

Пiд час вивчення азотного та вуглецевого живлення вперше виявлено двовершинний харктер синтезу ферменту з молокозсiдальними властивостями у H. laricinus на джерелах вуглецю, якi легко засвоюються. Доведено, що тiльки присутнiсть бiлка у середовищi культивування сприяє активному синтезу молокозсiдальних протеїназ. Шляхом пiдбору концентрцiй цукрiв у живильному середовищi досягнуто збiльшення активностi молокозсiдального ферменту та збiльшення його виходу в чистому виглядi в 5 разiв. Середовище з пiдвищеним вмiстом цукрiв запатентовано у Держпатентi України.

Використаня методiв математичного планування дозволило докладно вивчити характер залежностi молокозсiдальної активностi й росту H. laricinus вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла. Вирахованi функції дають можливiсть прогнозувати поведiнку продуценту у будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв. Завдяки цьому було пiдiбрано найкраще середовище культивування, яке мiстить молочну сироватку та пивне сусло. На це середовище отримано рiшення про видачу патенту на винахiд.

З'ясовано, що усi дослiджуванi штами H. laricinus мають здатнiсть утворювати позаклiтиннi протеїнази з високою молокозсiдальною активнiстю. Доведена висока пластичнiсть штамiв. Культура штама А-032 H. laricinus запатентована у Держпатентi України, як активний продуцент протеїназ молокозсiдальної дії. Усi дослiдженi штами не виявили плодоношення у культурi.

Практична цiннiсть роботи. Штами H. laricinus можна використовувати як продуценти молокозсiдальних ферментiв, що можуть знайти застосування у виробництвi сирiв.

Можливiсть культивування H. laricinus на дешевих субстратах дозволяє зробити процес виробництва молокозсiдального ферменту бiльш дешевшим, тому що молочна сироватка, яка є вiдходом виробництва молочних продуктiв, зокрема сиру, може вiдразу використовуватись для отримання молокозсiдального ферменту. Вiдсутнiсть плодоношення у культурi та висока фiзiологiчна пластичнiсть продуцентiв характеризує їх як важливi об'єкти бiотехнології, враховуючи те, що кислi та слабокислi протеолiтичнi препарати у нас взагалi не виробляються.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Представленi дослiдження - це частина роботи, що проводиться на кафедрi фiзiології рослин Донецького державного унiверситету в рамках держбюджетної теми №97-1вв/16 “Одержати i апробувати новi високоактивнi штами базидiальних грибiв i розробити на їх основi технологiю виробництва цiнних бiопрепаратiв i харчових продуктiв”, яка координується планом науково-дослiдних тем Мiнiстерства освiти Украпни.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана особисто автором пiд керiвництвом док. бiол. наук, професора, С.Ф. Негруцького i док. бiол. наук, доцента М.I. Бойко. Особиста участь дисертанта полягала у плануваннi та проведеннi лабораторних дослiджень, аналiзi, узагальненнi одержанних експериментальних даних, спiвставленнi пх з лiтературними матерiалами. Автор приносить щиру вдячнiсть всiм спiвробiтникам кафедри фiзiологiп рослин Донецького державного унiверситету.

Апробацiя роботи. Про основнi положення дисертації доповiдалося на мiжнароднiй конференції, присвяченiй проблемам кореневих та комлевих гнилей (Францiя, 1997), мiжнароднiй конференції “Методологические основы познания особенностей грибов - продуцентов физиологически активных веществ и пищевых продуктов” (Донецьк, 1997), конференції молодих вчених “Актуальнi проблеми фiзiології рослин та генетики” (Київ, 1996), Х з'їздi Украiнського ботанiчного товариства (Полтава, 1997), на наукових конференцiях Дон ДУ (Донецьк, 1994-1997), Всеукраiнських студентських конференцiях (Донецьк, 1992-1997).

У завершеному варiантi дисертацiя доповiдалась на засiданнях кафедри фiзiології рослин Дон ДУ.

Публiкації. За матерiалами дисертації опублiковано 11 наукових праць: 4 статтi в наукових журналах, 2 патенти i 5 тез конференції.

Структура та обсяг роботи. Дисертацiя викладена в 150 сторiнках та складається з вступу, 7 роздiлiв, висновкiв, рекомендацiй, списку лiтератури (198 джерел). Праця iлюстрована 28 таблицями та 54 малюнками, має 5 додаткiв.

2. ЗМIСТ РОБОТИ

Огляд лiтератури складається iз 3 роздiлiв, в яких висвiтленi питання регуляцiп синтезу позаклiтинних ферментiв мiкроорганизмiв, подана класифiкацiя протепназ та принципи застосування пх у промисловостi, а також охарактеризовано процес ферментної коагуляцiї молока.

Об'єкти i методи дослiджень.

Об'єктами наших дослiджень були штами H. laricinus М-81, А-031, А-032 i Р-323.

Використовувались чистi культури, видiленi з плодових тiл на кафедрi фiзiології рослин ДонДУ. Штам А-032 та М-81 задепоновано у колекцiю Iнституту Ботанiки iм. М.Г. Холодного НАН Украiни. На штам М-81 H. laricinus спiвробiтниками кафедри отримано патент Украiни (Бойко, Негруцкий, Мирошниченко та iн., 1994).

Гриби вирощували на рiдких живильних середовищах при температурi 30⁰С (Бойко,1996). Основним середовищем було глюкозо-пептонне з додатком мiнеральних речовин (Федорова, Шиврина, 1974). Iнокулювали середовища 7-ми добовим мiцелiєм, який зростав на сусло-агарi.

Молокозсiдальну активнiсть (МЗА) визначали за методом Кавап та Мукап (Kawai, Mukai, 1970). Розрахунок МЗА проводили згiдно з формулою:

Де:

К - коефiцiєнт разведення культурального фiльтрату;

П - час, за який зi 10 мл. молока при додаваннi 1 мл. культурального фiльтрата утворюється щiльний сгусток, у хвилинах;

40 - середнiй час зсiдання молока при виробництвi сирiв, у хвилинах.

Кислотнiсть середовища реєстрували потенцiометричним методом, накопичення бiомаси - ваговим (Петербургский, 1966). Залишкову кiлькiсть цукрiв визначали за методом Швецова та Лук'яненко (Ермаков, 1987), а кiлькiсть амiнокислот - фотометричним методом за визначенням амiнного азоту (Ермаков, 1987). Вмiст бiлку визначали за методом Бредфорда (Bredford, 1976).

Одержання ферментного препарату сичужної дії здiйснювали шляхом додавання у культуральну рiдину сiрчанокислого амонiю у кiлькостi, яка вiдповiдає 80% насичення (Бойко, 1996).

Статистичну обробку результатiв здiйснювали за допомогою однофакторного дисперсiйного аналiзу порiвняння середнїх арифметичних величин методом множинних порiвнянь за критерiями Дункана та Тьюки, та критерiю Стьюдента (Лакин, 1980, Негруцкий, Фильчаков, 1984).

Оптимiзацiю середовища з пивним суслом та молочною сироваткою здiйснювали за допомогою повного факторного екcперименту ПФЕ - 5² (Максимов, Пименова, Гречушкина, 1976). Аналiз даних проводили згiдно з алгоритмом Йєйтса. За допомогою комп'ютерних програм здiйснювали побудову поверхней вiдгуку.

Усi эксперименти виконувалися неменш нiж у 3-х повторностях.

Результати дослiджень та їх обговорення.

Фiзико-хiмiчнi умови культивуваня Hirschioporus laricinus.

В роботi було проведено вивчення впливу температури зовнiшнього середовища, рН, аерації, а також режимiв cтерилiзації середовища на рiвень МЗА та накопичення бiомаси штамами H. laricinus. Встановлено, що змiна температури в межах 28⁰С-32⁰С не вiдбивається на характерi синтезу молокозсiдального фермента у дослiджуваний перiод (30 дiб) (рис. 1), а також на накопиченнi бiомаси. Для культивування H. laricinus можна використовувати температуру 28⁰С-32⁰С.

Рис. 1. - Показники МЗА штаму М-81 H. laricinus пiд час культивування в рiзних температурних режимах:

Зроблено припущення, що короткочасова дiя пiдвищених та знижених температур на мiцелiй H. laricinus перед реєстрацiєю показникiв МЗА та бiомаси буде викликати порушення напiвпроникностi мембран та обмiнних процесiв у клiтинах, що приведе до збiльшення виходу ферменту в культуральну рiдину.

Вперше встановлено, що дiя температур 40⁰С i 45⁰С протягом двох годин викликає пiдвищення активностi ферменту. Температура 45⁰С збiльшує МЗА в 3,5 разiв, а температура 40⁰С - у 1,9 разiв. Дiя температури 55⁰С пртягом двох годин знижує активнiсть ферменту. Iмовiрно, молокозсiдальна протеiнза H. laricinus не термостабiльна, як бiльшiсть грибних протеїназ. Вплив зниженних температур також пiдвищує МЗА.

Порiвняльне вивчення ферментативнiй активностi H. laricinus в умовах глибинного i поверхневого культивування вказує, що у рiзнi сроки культивування перемiшування по-рiзному вiдбивається на МЗА (рис. 2).

З'ясовано, що при кiмнатнiй температурi краще здiйснювати культивування глибинним способом.

Рис. 2. - Молокозсiдальна активнiсть H. laricinus пiд час вирощування поверхневим та глибинним способом:

Дослiдження кислотного режиму культивування продуцента у динамицi дозволили з'ясувати, що всi дослiджуванi штами прявляють здатнiсть до регулювання кислотностi середовища. Пiд час вирощування продуцентiв на середовищi з рН 2,5 молокозсiдальної активностi невстановлено.

Характерно те, що оптимальнi значення рН для накопичення бiомаси та синтезу молокозсiдального ферменту не збiгаються, що свiдчить про доцiльнiсть використання комбiнованного кислотного режиму:

- спочатку пiдтримувати кислотнiсть, яка сприяє росту грибів;

- потiм - ферментації.

Оптимальною кислотнiстю середовища для росту штамiв М-81, А-031, А-032 i Р-323 є значення рН 5,0 i вище.

Для бiосинтезу молокозсiдальних ферментiв вихiдне значення кислотностi повинно складати рН 3,5.

Концентрацiя iонiв водню може регулювати iонний стан субстрату. Змiна кислотної рiвноваги до значень, якi виходять за межi значення рК_а, викликає змiну концентрації субстрату i швидкiсть синтезу ферменту.

Спосiб подання експериментальних даних у логарифмiчних координатах дає змогу визначити рК_а. На рис. 3 у логарифмiчних координатах подано кiнетику синтезу молокозсiдального фермента штамом М-81 H. laricinus у залежностi вiд рН культивування.

Згiдно з теорiєю дії ферментiв - приєднання одного протону до активного центру вiдображається у рН залежностi швидкоcтi у логарифмiчних координатах змiною тангенсу кута нахилу дотичної до вiток сигмоід на одиницю. Оскiльки перехiд тангенсу кута нахилу на рис. 3 вiд (1,38) до 0, то синтез молокозсiдальної протеїнази, за нашими даними, контролюється однiєю iоногенною групою з рК_а менше нiж 3,5 та iншою з рК_b близько 3,85. Концентрацiя iонiв водню у зовнiшньому середовищi й усерединi компартменту, де синтезується фермент, пов'язанi лiнiйним спiввiдношенням:

Де:

i - кiнетичнi коефiцiєнти (Варфоломеев, Калюжный, 1990).

Рис. 3. - Теоретична залежнiсть логарифма ^уяв вiд рН, штама М-81 H. laricinus:

Звiдси, коли (рис. 3), то можна з увпевненiстю стверджувати, що у клiтинах штаму M-81 H. laricinus пiдтримується бiльш кисле середовище. Теж саме стосується й iнших штамiв.

Таким чином активнiсть молокозсiдальної протеїнази пiд час культивування на глюкозо-пептонному середовищi для усїх штамiв контролюється однаково - двома iоногенними групами. Взагалi рН зовнiшнього середовища 3,5 одиниць входить в усi плато логарифмiчного профiлю утворення молокозсiдального ферменту штамiв Н. laricinus i може бути визначена, як оптимальна концентрацiя iонiв водню для синтезу молокозсiдальної протеїнази.

Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з вуглеводами.

Пiд час культивування штаму А-032 на середовищах з рiзними цукрами виявлено двовершинний характер синтезу молокозсiдальних протеаз на середовищах з глюкозою (рис. 4), крохмалем та iнулiном, якi легко споживаються продуцентом.

У динамiцi накопичення бiомаси на середовищах з цими цукрами вiдмiчається дiауксичний характер росту (рис. 5). Схожа картина росту i синтезу ферменту спостерiгається також при культивуваннi штаму Р-323 на сахарозi та мальтозi.

Рис. 4. - Динамiка молокозсiдальної активностi штамiв Н. laricinus на середовищi з глюкозою:

Рис. 5. - Динамiка накопичення бiомаси штамами H. laricinus на средовищi з глюкозою:

У цих випадках має мiсце катаболiтна репресiя, коли висока концентрацiя цукрiв на початковому етапi культивування стримує синтез ферментiв, якi асимiлюють iнше джерело живлення. Зменшення кiлькоcтi цукру дозволяє органiзму продукувати нову ферментну систему, що атакує другий субстрат, можливо продукти власного метаболiзму, або джерела азотного живлення.

Щодо штаму А-031, можна довести, що пiсля досягнення високих значень МЗА у 10-ти добовому вiцi вона мало змiнюється до кiнця перiоду культивування.

Таким чином, можна сказати, що всi вивченi цукри, крiм арабiнози, добре використовуються штамами H. laricinus для синтезу молокозсiдальних протеїназ.

Кiнетичнi показники росту та МЗА рiзняться (табл. 1). Як правило, для штамiв А-031 и А-032 максимальна швидкicть пiдвищення МЗА вища, нiж швидкiсть збiльшення сухої речовини.

Для штаму Р-323 - навпаки. Час подвоєння показникiв бiомаси перевищує час подвоєння показникiв МЗА. Iндивiдуальним для кожного середовища та цукру є час найвищого економiчного коефiцiєнту культури. На середовищi з арабiнозою економiчнi коефiцiєнти усїх грибiв вищi, нiж на середовищах з iншими цукрами.

Таблиця 1. - Кiнетичнi показники росту i бiосинтезу молокозсiдального ферменту пiд час культивування штамiв H. laricinus на середовищi з глюкозою:

Дослiдження показали, що пiдбором джерел вуглецевого живлення можна регулювати вiдповiднiсть процесiв росту та змiни МЗА як у бiк прискорення синтезу молокозсiдального ферменту, так i в бiк збiльшення швiдкоcтi росту. Максимальнi швидкоcтi росту та МЗА виявляються на раннїх стадiях розвитку культури.

У випадку пiдвищення концентрації цукрiв у два рази в порiвняннi з стандартним середовищем вiдбувається збiльшення МЗА на усїх середовищах з протягом 30-добового культивування. Пiдвищення концентрації глюкози, мальтози i крохмалю викликає зниження значень бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Це, мабуть, пов'язано зi здатнiстю цих цукрiв у зазначенiй концентрації стимулювати синтез ферментiв, що викликають руйнування клiтинних оболонок мiцелiю H. laricinus.

Пiдвищення вмiсту цукрiв у середовищi культивування у 2 рази доцiльно, тому що це збiльшує вихiд молокозсiдального ферменту у 5 разiв i пiдвищує його активнiсть.

Роль джерел азоту для культивування штамiв Hirschioporus laricinus.

Пiд час дослiдження джерел азотного живлення (NH₄NO₃, (NH₂)₂CO, (NH₄)₂SO₄, CH₃COONH₄, NaNO₃, KNO₃ та пептон) рiст продуцентiв виявлено на всїх речовинах, що мiстять азот (рис. 6). Добре використовуються для накопичення бiомаси H. laricinus сечовина й сiрчанокислий амонiй, але показники бiомаси в обох випадках нижчi, нiж на середовищi, яке мiстить пептон.

Рис. 6. - Накопичення бiомаси штамом А-031 пiд час вирощування на рiзних джерелах азоту:

Стосовно МЗА можна вiдзначити, що нiтрат натрiю та калiю, а також ацетат амонiю цiлком iнгiбують синтез молокозсiдального ферменту. На рештi джерел рiвень МЗА нижчий, нiж на середовищi з пептоном в 5-27 разiв. Таким чином, штами H. laricinus для росту та синтезу молокозсiдального ферменту краще використовують азот пептону. Нiтрат- iон непридатний до культивування штамiв H. laricinus.

Вивчення впливу амiнокислот: DL-триптофан, DL-фенiлаланiн, DL-лiзинмоногiдрохлорид, DL-лейцин, DL-метiонiн, L-iзолейцин, L-гiстидингiдрохлорид, DL-валiн, L-аргiнiнгiдрохлорид, DL-треонiн, проводили шляхом додавання їх у середовище у кiлькостi, еквiвалентнiй 3 г пептону по амонiйному азоту.

На середовищах з триптофаном, лiзинмоногiдрохлоридом, валiном та треонiном МЗА не виявлена. На середовищах, де була МЗА, рiвень ії складав близько 2500 од/мл.

Для росту H. laricinus краще використовувати лiзинмоногiдрохлорид. Використання амiнокислот штамами проходить неоднаково.

Краще з усїх амiнокислот використовуються триптофан та аргiнiн, слабко - метiонiн та валiн.

Значення МЗА на середовищах з амiнокислотами на порядок нижче, нiж на середовищi з пептоном, але значення бiомаси на цих середовищах незначно поступаються значенням бiомаси на глюкозо-пептонному середовищi. Це свiдчить, що амiнокислоти використовуються продуцентом переважно для росту органiзму.

Таким чином, для синтезу молокозсiдального ферменту штамами H. laricinus необхiдна наявнiсть у середовищi культивування бiлкового азоту, який серед усїх вивчених джерел азотного живленя є тiльки у пептонi.

Культивування Hirschioporus laricinus на середовищах з молочною сироваткою.

Додавання молочної сироватки у середовище культивування викликає збiльшення швидкостi росту та продукування молокозсiдального ферменту (_max), до того ж, чим бiльше сироватки у середовищi, тим вище _max, отже скорочується час подвоєння показникiв (табл. 2).

Таблиця 2. - Параметри, що характеризують динамiку змiни бiомаси та МЗА Н. laricinus пiд час культивування на середовищах з молочною сироваткою:

Звертає на себе увагу i те, що додавання сироватки збiльшує тривалiсть експоненцiйної фази росту та бiосинтезу ферменту до 10-ти дiб, коли при ії вiдсутностi експоненцiйна фаза складає 5 дiб. Слiд вiдзначити, що пiд час додавання максимальної концентрації молочної сироватки у випадку з МЗА вiдбувається подовження лаг-перiоду.

Таким чином, змiнюючи кiлькiсть молочної сироватки у середовищi можна досягти прискорення як процесiв росту, так i продукування молокозсiдальних протеаз у H. laricinus та регулювати швидкiсть цих процесiв за власним бажанням.

З метою оптимiзації живильного середовища культивування H. laricinus, яке мiстить молочну сироватку i пмвне сусло, було проведено серiю модельних експериментiв згiдно з повним факторним експериментом 5² (ПФЕ 5²). Для кожного експерименту на 5-ту та 10-ту добу культивування складалися рiвняння регресії, вiдповiдно яким за допомогою комп'ютерних програм будувалися поверхнi вiдгуку бiомаси та МЗА. ПФЕ 5² дозволив нам докладно дослiдити характер залежностi, визначити значення функції в будь-якiй точцi простору, обмеженого рiвнями факторiв.

Що стосується вдосконалення середовища, то для виключення ефектiв високого порядку та узагальнення отриманих даних нами було зменшено кiлькiсть рiвнiв факторiв вiдповiдно ПФЕ 3². В результатi експерименту отриманi данi, якi описуються рiвняннями регресії (1) i (2).

Рiвняння (1) описує данi з МЗА, рiвняння (2) - данi з бiомаси, де х₁ - кодованi значення концентрації пивного сусла, а х₂ - кодованi значення концентрації молочної сироватки.

Характер залежностi МЗА i бiомаси вiд дослiджуванних факторiв подiбний. Мiнiмальнi значення функції зсунутi до краю, а плато оптимальних значень знаходиться у центрi поверхнi вiдгуку. Високi значення МЗА знаходяться в iнтервалi, де х₁ (-0,2, 0,5), а х₂ (-0,4, 0,5). Що стосується бiомаси, то плато оптимуму обмежується значеннями х₁ (-0,2, 0,4) та x₂ (-0,3, 0,5). Таким чином, високi значення МЗА i бiомаси були одержанi на середовищах, у яких спiввiдношення молочної сироватки i пивного сусла складає 1:1, до того ж кiлькiсть води, яка додається у середовище, також є важливою, тому що у випадку високих концентрацiй дослiджуваних факторiв значення МЗА та бiомаси зменшуються. Частка води повинна складати третю частину субстрату, отож, удосконалене середовище включає молочну сироватку, пивне сусло та воду в спiввiдношеннi 1:1:1. За результатами цих дослiджень Держпатентом Украiни прийнято рiшення про видачу патенту.

Введення у середовище культивування Hirschioporus laricinus бiологiчних додаткiв.

Введення високих концентрацiй екстрактiв росткiв картоплi скорочує стацiонарну фазу росту, про що свiдчить зниження бiомаси наприкiнцi перiоду культивування. Екстракт росткiв картоплi пiдвищує МЗА тiльки в експоненцiйнiй фазi росту, при подальшому культивуваннi на всїх середовищах рiвень активностi ферменту не вiдрiзняється вiд рiвня МЗА контрольного глюкозо-пептонного середовища, але при максимальнiй концентрації экстракту значення МЗА нижче, нiж у контролi.

Додавання у середовище культивування соєвого брошна у концентрації 0,5% i 1,0% стимулює, як накопичення бiомаси, так i бiосинтез молокозсiдального ферменту. Введення гiберелiну у середовище стимулює МЗА. При концентрації 4 мг/л активнiсть вища, нiж при 2,5 мг/л. Така ж залежнiсть спостерiгається i стосовно бiомаси. Додавання ауксину на раннїх стадiях культивування знижує МЗА, одночасно вiдбувається пригнiчення росту, але пiзнiше активнiсть ферменту рiзко збiльшується та досягає рiвня контрольного глюкозо-пептонного середовища, а значення бiомаси навiть перевищують значення iнших середовищ. Таким чином, для пiдтримування високих значень МЗА H. laricinus виправдано введення у середовище культивування гiберелiна у кiлькостi 4 мг/л, яка збiльшує МЗА в 2-2,5 разiв. Ауксин краще використовувати у концентрації 4 мг/л з метою збiльшення бiомаси пiд час тривалого культивування.

ВИСНОВКИ

На пiдставi дослiджень регуляції молокозсiдальних протеїназ штамiв Hirschioporus laricinus (Karst) Ryv. можна зробити такi висновки:

1. Усi вивченi штами М-81, А-031, А-032 i Р-323 H. laricinus мають здатнiсть продукувати позаклiтиннi кислi протеїнази з високою молокозсiдальною активнiстю. Найбiльш активним є штам А-032. Шляхом використання рiзних фiзiологiчних факторiв можливе змiнювання значень молокозсiдальної активностi та досягнення ії високого рiвня у будь-якого iз штамiв H. laricinus;

2. Змiнювання температурного режиму культивування у межах вiд 280С до 320С не вiдбивається на характерi синтезу молокозсiдальних протеїназ та ростi H. laricinus. Цей температурний режим є оптимальним для культивування продуценту. З метою збiльшення виходу фермента доцiльно перед його видiленням пiддавати охолодженню до низьких плюсових температур (2-50С) протягом двох годин, а також нагрiвання у межах 40-45 0С пртягом двох годин, до того ж нагрiвання має перевагу;

3. Штами H. laricinus здатнi регулювати рН середовища, пiд час їх вирощування на середовищах з цукрами. Активнiсть молокозсiдальної протеїнази пiд час культивування H. laricinus на глюкозо-пептонному середовищi контролюється двома iоногенними групами. рН 3,5 одиниць є оптимальною для утворення молокозсiдальних ферментiв штамами H. laricinus. Для цих штамiв оптимальнi значення кислотностi для накопичення бiомаси (рН 5,0) та синтезу фермента (рН 3,5) не збiгаються, що свiдчить про можливiсть використання комбiнованого режиму культивування: спочатку пiдтримувати кислотнiсть, яка сприяє росту грибiв, а пiсля цього ферментації;

4. Пiдбором джерел вуглецевого живлення можна регулювати спiввiдношення процесiв росту та змiни молокозсiдальної активностi штамiв H. laricinus як у бiк прискорення синтезу молокозсiдального ферменту, так i у бiк швидкостi росту. Використовуючи середовища з комбiнованим джерелом вуглецю, можна, коли необхiдно, синхронiзувати процеси росту i бiосинтезу. Максимальнi швидкостi росту та бiосинтезу виявляються на перших стадiях розвитку культур. Глюкоза, крохмаль, iнулiн, сахароза та мальтоза добре використуються штамами для синтезу молокозсiдального фермента. Доцiльно використовувати пiдвищення концентрації цукрiв у 2 рази у порiвняннi зi стандартним глюкозо-пептонним середовищем, що збiльшує вихiд молокозсiдального ферменту в 5 разiв та пiдвищує його активнiсть;

5. H. laricinus здатний використовувати для росту мiцелiю усi дослiдженнi джерела азоту, але нiтрат калiю та натрiю, а також ацетат амонiю цiлком iнгiбують синтез молокозсiдального фермента. На середовищах з амiнокислотами, NH4NO3, CH4NO2, (NH4)2SO4 рiвень МЗА нижчий, нiж на середовищi з пептоном у 5-27 разiв. Для активного синтезу молокозсiдальних протеїназ H. laricinus необхiдна наявнiсть у середовищi культивування бiлкового азоту;

6. Пiдвищена кiлькiсть екстракту росткiв картоплi у живильному середовищi iнгiбує як ростовi процеси, так i синтез фермента. Екстракт росткiв картоплi стимулює МЗА тiльки на перших eтапах росту культури.Соєве борошно у концентрації 0,5-1,0% прискорює рiст та збiльшує МЗА H. laricinus. Додавання гiберелiну у середовище у кiлькостi 4 мг/л збiльшує активнiсть молокозсiдального фермента в 2-2,5 разiв. Внесення ауксину в середовище культивування у кiлькостi 4 мг/л дозволяє отримати бiльш високий вихiд бiомаси продуценту;

7. Введення молочної сироватки у середовище культивування викликає пiдвищення швидкостi росту та продукування молокозсiдального ферменту, а також збiльшення тривалостi експоненцiйної фази росту продуценту;

8. Використання методiв математичного планування дозволило докладно вивчити характер залежностi МЗА i росту Н. Laricinus вiд концентрації молочної сироватки та пивного сусла. Розрахованi функції дають змогу прогнозувати поведiнку продуценту в будь-якiй точцi простору, який обмежений рiвнями факторiв;

9. Вiк посiвного мiцелiю не вiдбивається на рiвнi МЗА Н. laricinus.

ПУБЛІКАЦІЇ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Никитина О.А. Влияние рН среды на накопление молокосвертывающего фермента штаммами Hirschioporus laricinus // Мiкробiологiчний журнал. - 1998. - №4. - С. 43-48. штам культивування бiосинтез

2. Никитина О.А. Влияние фитогормонов на молокосвертывающую активность и рост Hirschioporus laricinus. // Весник Донецкого университета. - 1998. - №1. - С. 141-144.

3. Никитина О.А. Влияние рН на кинетику синтеза молокосвертывающих ферментов штаммов Hirschioporus laricinus // Вестник проблем биологии и медицины. - Полтава-Харьков, 1998. - №11. - С. 18-25.

4. Никитина О.А., Бойко М.И., Негруцкий С.Ф. Роль источников азота для культивирования штамма А-031 Hirschioporus laricinus // Вестник проблем биологии и медицины. - Полтава-Харьков, 1998. - №11. - С. 26-33.

5. Пат. 96031179. Україна. МПК 5 С 12 №1/38. Живильне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуценту молокозвертаючого ферменту / Бойко М.I., Негруцький С.Ф., Федотов О.В., Нiкiтiна О.О. (Україна). - 1 с. Заявл. 27.03.96, опубл. 06.02.97. - 2 с.

6. Пат. 97073489. Україна. МПК С 12 №1/38, 9/14. Живильне середовище для росту штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуценту молокозсiдального ферменту / Нiкiтiна О.О., Бойко М.I., Негруцький С.Ф. (Україна). - 1 с. Заявл. 2.07.97, опубл. 10.06.98. - 2 с.

7. Борисенко О.А. (Никитина), Негруцкий С.Ф., Бойко М.И. Влияние различных доз молочной сыворотки на рост и продуцирование молокосвертывающего фермента Hirschioporus laricinus // Устойчивость растений к стрессовым явлениям. ДонДУ, Донецк, 1995. - С. 168-173.

8. Никитина О.А. Динамика, кинетика роста и синтеза молокосвертывающего фермента Hirschioporus laricinus // Мат. I Международной конференции: Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологочески активных соединений и пищевых продуктов. - Донецк, 1997. - С. 34-37.

9. Никитина О.А. Влияние режимов стерилизации на молокосвертывающую активность Hirschioporus laricinus // Мат. Х съезда Украинского ботанического общества. - Полтава,1997. - С. 98.

10. Никитина О.А. Аминокислоты, как источник азота для культвирования Hirschioporus laricinus - продуцента молокосвертывающего фермента // Мат. вуз. научн. конф. профессорско-преподавательского состава по итогам научноисследовательской работы. - Донецк: ДонГУ, 1997. - С. 79-82.

11. Никитина О.А. Влияние критических температур на выход молокосвертывающего фермента у Hirschioporus laricinus // Тез. докл VI Конф. молодых ученых: Актуальние проблемы физиологии растенийи генетики. - Киев, 1996. - С. 122-124.

Размещено на Allbest.ru