Вплив потужності дози на вихід пошкоджень ДНК в клітинах рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський університет імені Тараса Шевченка

Ісаєнков Станіслав Валентинович

УДК 577.346

Вплив потужності дози на вихід пошкоджень ДНК в клітинах рослин

03.00.01 - радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Науковий керівник - академік НАН України, доктор біологічних наук, професор

Гродзінський Дмитро Михайлович

Інститут клітинної біології та генетичої інженерії НАН України,

завідувач відділу біофізики та радіобіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент,

Андрійченко Сергій Вадимович

Інститут отоларингології ім. професора О.С. Коломійченка МОЗ України, головний науковий співробітник відділу біофізики

кандидат біологічних наук,

Бездробна Лариса Костянтинівна

Інститут ядерних досліджень НАН України, завідувач лабораторії радіобіології.

Провідна установа - Український науково-дослідний інститут сільськогосподарської радіології Міністерства агропромислового комплексу України.

Захист відбудеться "17" лютого о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 при Київському університеті Тараса Шевченка за адресою: Київ, вул. акад. Глушакова 2, біологічний факультет, ауд.215. Поштова адреса: 01033, Київ - 33, вул. Володимирська 64, наукова частина.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського університету Тараса Шевченка за адресою: Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "27" грудня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми.

Після унікальної по своїй природі аварії на ЧАЕС особливо гостро стало питання про вивчення особливостей впливу малих доз іонізуючої радіації на біологічні об`єкти. Чорнобильска катастрофа призвела до суттєвого збільшення радіаційного фону, внаслідок чого великі за своєю площею території постійно підпадають під дію опромінення низької інтенсивності. Аналіз даних літератури свідчить про суттєве прискорення мутаційного і рекомбінаційного процесів, збільшення генетичного вантажу в популяціях рослин і тварин, що підпали впливу низькодозового опромінення (Шевченко и др., 1992; Бурлакова и др., 1996; Гераськин и др., 1998). Недосконалість екологічних нормативів і досить туманне уявлення про вплив на екосистеми, що веде до дестабілізації останніх та зниження біорізноманіття, робить актуальним аналіз закономірностей формування і розробку кількісних методів оцінки генетичних ефектів, що індуковані низькими дозами іонізуючого випромінювання.

З`являється все більше експериментальних даних, що свідчать про нелінійний характер прояву біологічних ефектів в низькодозовому діапазоні (Шевченко и др., 1992; Бурлакова и др., 1996; Гераськин и др., 1998). Оскільки залежність доза-ефект в діапазоні малих доз має нелінійний характер, коректна оцінка генетичного ризику в цьому випадку може базуватися тільки на чіткому розумінні молекулярних-клітинних механізмів формування реакції клітин на низькодозове опромінення.

Особливо важливе місце в прояві цих ефектів відіграє фактор інтенсивності впливу на біооб`єкти. Ефекти потужності дози опромінення в діапазоні середніх і великих доз вивчені досить детально (Шехтман 1955; Гродзинский 1989). Існує велика низка фактів, яка свідчить на користь того, що прояви радіобіологічних ефектів змінюються відповідно інтенсивності опромінення. В області великих та середніх доз опромінення, як правило, ефекти лінійно залежать від потужності опромінення і в певній мірі пов`язані з репарацією сублетальних пошкоджень. При високих потужностях опромінення сильно послаблюється можливість репарації такого типу пошкоджень, а при малих - напроти, є певна вірогідність репарації сублетальних пошкоджень.

Якісно інша картина спостерігається для ефектів потужності дози в області низьких доз опромінення. При дослідженнях цитогенетичних ефектів в області низькодозового опромінення вивчені залежності від потужності дози, причому форма залежності може змінюватись разом з величиною дози, що свідчить про складність цих явищ (Бурлакова и др., 1996). Існують експериментальні факти, які вказують на зворотну залежність від потужності дози (Шевченко и др., 1992). На жаль, дані про вплив потужності дози в діапазоні низьких доз нечисленні і носять суперечливий характер. Тому вивчення радіобіологічних ефектів, обумовлених опроміненням різної інтенсивності в області малих доз, має важливе значення.

За нашим припущенням причиною нелінійності прояву біологічних ефектів в області малих доз опромінення може виступати розрив між дозами, що спричиняють активацію індуцибельних систем репарації, і дозами, що не активують додаткові репаративні системи, а ємності конститутивних систем відновлення не вистачає, щоб повністю елімінувати всі пошкодження, спричинені опроміненням низької інтенсивності. Таким чином, має підставу припущення, що для індукції додаткових репаративних систем потрібне певне порогове значення пошкоджень геному за одиницю часу. Якщо інтенсивність навантаження менша за порогову величину, то можлива ситуація, коли конститутивні системи репарації вже не спроможні відновити всі пошкодження, що були спричинені опроміненням, а активації додаткових систем репарації ще не відбувається.

Подібне вивчення реакцій клітин рослин на дію іонізуючих випромінювань виступає як метод розкриття загальнобіологічних закономірностей. Важливість та актуальність таких пошуків безперечна, оскільки екстраполяція ефектів з області середніх та високих доз в область низьких доз не зовсім коректна.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у відділі біофізики та радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії згідно з планом науково-дослідних робіт інституту за темами: "Корекція кумулятивних ефектів хронічного опромінення рослин іонізуючою радіацією" та "Хронічне опромінення рослин як фактор формування нестабільності геному". Робота виконувалась за підтримки грантами Міністерства України в справах науки і технологій (проект: 5.4/389 "Дослідити молекулярно-біологічну природу процесів, що індуковані хронічним опроміненням рослин")

Мета роботи і задачі дослідження.

Головна мета роботи полягала у вивченні змін в ДНК клітин рослин під впливом іонізуючого опромінення різної інтенсивності в низьких дозах. Відповідно до цього були поставлені слідуючи завдання:

- дати порівняльну оцінку виходу пошкоджень ДНК у рослинних клітин, що були опроміненні в низькодозовому діапазоні з різною потужністю, для різних рослинних систем (насіння, протопласти та проростки) та різних видів рослин (тютюн та сосна);

- вивчити закономірності формування пошкоджень ДНК у насінні сосни, що обумовлені хронічним опроміненням в малих дозах;

- виявити режими опромінення, в якому спостерігається підвищений вихід пошкоджень ДНК для цих систем, та пояснити це явище.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше показано, що вихід пошкоджень ДНК для таких рослинних об'єктів, як сосна та тютюн, при дії опромінення різної інтенсивності в низьких дозах має складну залежність, як від значення дози, так і від її потужності. Показано, що фактор потужності дози є важливим чинником у формуванні відповіді рослинної клітини на низькодозове опромінення. Отримані результати свідчать про недостатню обгрунтованість застосування пануючої в теперішній час лінійно- безпорогової концепції для оцінки ризику низькодозового опромінення. Встановлено факт реалізації “прихованих” пошкоджень ДНК, що сформувались у опроміненого насіння. Знайдено режим низькодозового опромінення, при якому спостерігається підвищений вихід пошкоджень ДНК порівняно з очікуваним.

Практичне значення одержаних результатів.

Встановлені факти можуть бути корисними для відновлення лісового господарства в районах, що постраждали внаслідок радіоактивного забруднення. Було встановлено, що насіння сосни звичайної, яке отримало за два роки свого формування дозу хронічного опромінення 3 Гр, має ряд переваг по критеріям життєздатності порівняно з контрольним та більш сильні можливості відновлення ДНК за умови впливу тестуючого гострого гамма-випромінювання.

Особистий внесок здобувача.

Основні ідеї, наукові положення і висновки розроблені дисертантом самостійно. Дисертантом безпосередньо проводилось опромінення об`єктів дослідження. Він був задіяний на всіх етапах виділення ДНК, а також аналізу ступені ушкодженності цієї біомакромолекули. Дисертантом самостійно проведений аналіз ДНК методом лужного електрофорезу. В процесі виконання дисертації автор особисто відібрав та критично проаналізував доступну літературу, яка має відношення до теми дослідження.

Апробація результатів дисертації.

Матеріали роботи були представлені на III з'їзді по радіаційним дослідженням, Москва, 1997; International Conference on Plant Ontogenesis in Natural and Transformed environments, Lviv, Ukraine, July 1-4, 1998; XIth International Congress on Photosyntesis, Budapest, Hungary, August 17-22, 1998; International Conference “Diagnosis and Treatment of Radiation injury”, Rotterdam, the Nethelands, 30 August - 3 September, 1998; Наукова-практична конференція молодих вчених “Інтегративність функцій рослинного організму” Вересень 3 - 4, Київ, Україна, 1998; II International Symposium on Plant Biotechnology, October 4-8, Kyiv, Ukraine, 1998.

Структура дисертації.

Дисертація викладена на 155 сторінках, включає 26 ілюстрацій, містить вступ, три розділи, аналіз та узагальнення результатів, висновки та список використаних літературних джерел (138 найменувань).

ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1 .Огляд літератури.

Матеріал розділу відображає сучасний стан знань про біологічні ефекти пов`язані з дією іонізуючої радіації низьких рівнів та різних потужностей опромінення. Охарактеризовані типи радіаційно-індукованих пошкоджень ДНК. Розглянуті типи репараційних систем клітини.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень.

Насіння сосни (Pinus silvestris) було отримане від співробітників Старопетрівськоі лісної дослідної станції (Київська область). Для окремих експериментів використовували насіння сосни з різних ділянок Зони відчуження ЧАЕС. За даними ТЛД-дозиметрії, що була проведена робітниками Старопетрівської лісової дослідної станції, поглинена рослинами доза іонізуючого опромінення за 2 роки формування цього насіння по зовнішньому гамма-опроміненню складала: 0,03 Гр (район села Дитятки), 3 Гр (район села Копачі) та 6 Гр (район села Чистогалівка). Пророщували його у темряві на зволоженому фільтрувальному папері на протязі 10 діб при температурі 25oС. Перед термостатуванням замочене насіння сосни витримували 2 доби при температурі 40С в темряві для стратифікації. Для дослідів відбирали проростки довжиною 50-60 мм, з яких отримували також протопласти, та насіння.

Рослини тютюну (Nicotiana tabacum) були отримані з стерилізованого насіння, що пророщували на твердому агаризованому середовищі MS (Murasige, Skoog, 1962) в контрольованих умовах: 250C, 25 W/м2, фотоперіод складав 16 годин на протязі 5 неділь. Для експериментів відбиралися молоді листки. В частині експериментів з молодих листків тютюну отримували протопласти.

В експериментах опромінювали проростки сосни, молоді листки тютюну, насіння сосни та протопласти цих рослин. Для деяких варіантів дослідів протопласти та насіння сосни опромінювали гамма-променями за допомогою кобальтового гамма-приладу "Исследователь" (Росія) з потужністю дози 0,063 Гр/с. Протопласти сосни опромінювались в дозах 20, 40 та 50 Гр. Крім того, протопласти тютюну та сосни, проростки сосни та молоді листки тютюну, насіння сосни опромінювали рентгенівськими променями за допомогою приладу РУМ-17 (Росія). Ці об`єкти опромінювали з потужностями опромінення: 4 сГр/хв, 8 сГр/хв, 25 сГр/хв, 46 сГр/хв, 84 сГр/хв та 118 сГр/хв в дозах: 9,6 сГр, 24 сГр та 48 сГр.

Одним з показників променевого ураження насіння сосни було проростання насіння, що визначалось за формулою: Пн=ntх100\ n0, де:

Пн - процент проростання насіння;

n0 - загальна кількість насіння, що було поставлено на проростання;

nt - кількість насінин, що проросли на 10 день після замочування.

Виділення протопластів. Протопласти виділяли з проростків сосни та молодих листків тютюну за стандартною методикою (Драйпер и др., 1991). Ферментний розчин містив: 1 % Onozuka R 10 (Yakult Biochemicals, Японія), 0,75 % Macerozyme R 10 (Yacult Biochemicals, Японія) 0,75 % Cellulase (Ferak, Німеччина), 0,75 % Pectinase ( Ferak, Німеччина), 0,5 М цукрозу, 50 мМ СаСl2, (pH 5,5). Протопласти інкубували в 1 мл середовища В-5 (Gamborg et. al. 1968). Час інкубування протопластів після опромінення в деяких варіантах дослідів сягав 6 годин. Для деяких експериментів до середовища В-5 з протопластами сосни додавали інгібітор полімераз ? та ? - афідіколін (Sigma, США) в концентрації 50 мг/мл (With et. al., 1995). При використанні протопластів для аналізу ДНК методом пульс-електрофорезу протопласти сосни (0,2 мл) ресуспендували в рівному об`ємі 1 % - низькоплавкої агарози (Biorad, США), збалансованої на середовищі W-5 при 37оС та давали застигнути, після чого додавали ще 0,2 мл середовища В-5.

Життєздатність протопластів визначали за стандартною методикою (Штругер 1976).

Аналіз ДНК протопластів проводили методом пульс-електрофорезу (ПЕФ) в агарозних гелях. Після опромінення протопластів в агарозних блоках їх лізували, варіюючи при цьому тривалість проміжку часу між опроміненням та подальшим лізисом. Препарати протопластів лізували 200 мкл розчину: 2,5 М NaCl, 1 % Тriton X-100 (Ferak, Німеччина) (pH 9,0). Витримували протягом 1,5 години при 4оС, після чого розчин зливали, додавали 200 мкл середовища ESP (Дейвис и др., 1990) та інкубували 16 годин при 37оС. Для підвищення чутливості методу ПЕФ, препарати ДНК піддавали обробці S1-нуклеазою 100 МЕ (Amersham, Великобританія) (Maniatis 1982). Для цього агарозні вставки відмивали протягом 30 хв, додаючи 1 мл розчину ТЕ (Maniatis 1982), після чого до вставок додавали ТЕ - буфер, який містив 0,5 мМ фенілметилсульфонілфториду (ФМСФ, Serva, Німеччина), і інкубували в термостаті при 37оС 40 хв. На наступному етапі вставки відмивали в 1 мл ТЕ - буферу протягом 30 хв (Maniatis 1982). Після цього зразки розміщували у 150 мкл буфері для S1- нуклеази (Maniatis 1982) і інкубували при 37оС протягом 3 годин. Реакційну суміш охолоджували до 0оС, зливали, агарозні зразки відмивали в ТЕ-буфері. Після цього ДНК зразків розділяли за допомогою ПЕФ. На кожну доріжку в гелі наносили приблизно 1-3 мкг ДНК. Електрофоретичне розділення ДНК здійснювали за допомогою приладу "Диапульс" (Росія) згідно методики (Elia et. al., 1993) Умови проведення: напруга 85 В, 199 мА, час пульсу 45 хв протягом 14 годин. Потім протягом 7 годин час пульсу складав 20 хв. На наступному етапі протягом 3 годин час пульсу складав 30 с. Після проведення електрофорезу гель фарбували протягом 10 хв розчином бромистого етидію (Sigma, США) в концентрації 20 мкг/мл та фотографували (Maniatis 1982).

ДНК виділяли з проростків сосни та насіння сосни, а також з молодих листків тютюну, що були занурені у рідкий азот в різний час після опромінення. Виділення проводили в пробірках типу Eppendorf 1,5мл за допомогою ДСН та протеїнази К згідно стандартної методики (Драйпер и др., 1991).

Аналіз загальної ДНК рослинних тканин проводили методом лужного електрофорезу в агарозних гелях. Електрофорез проводили за методикою (Maniatis 1982). Умови електрофорезу були такі: 28 В, 30 мА на протязі 18 годин при температурі 4 оС. Після електрофорезу агарозний гель нейтралізували на протязі 45 хв в буфері: 1М Tris-НCl (pH 7,6), 1,5M NaCl. Після цієї процедури гель занурювали в розчин бромистого етидію (Sigma, США) з концентрацією 20 мкг/мл. Після проведення електрофорезу гель фарбували протягом 10 хв розчином бромистого етидію (Sigma, США) в концентрації 20 мкг/мл та фотографували (Maniatis 1982).

Для кількісної оцінки ступеня ушкодженості ДНК використовували метод лужної денатурації з подальшим розділенням фракції однониткової та двониткової ДНК на колонці з гідроксилапатитом за методикою, що описана (Решетников и др., 1996). В обох фракціях кількість ДНК визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-2У (Росія). Частка однониткової ДНК в загальному вмісті біополімеру відображала ступінь ушкодженості і була виражена у відносних одиницях: N=M/Mk де M - відношення кількості однониткової ДНК до загальної кількості ДНК зразку, Mk - відношення кількості однониткової ДНК в контролі до загальної кількості ДНК в контролі.

Для перевірки даних досліди повторювали три рази. Статистично обробку експериментальних даних проводили за допомогою комп'ютерної програми MicroCal Origin 3.1, при цьому для оцінки достовірності даних використовували T - тест (аналіз двох популяцій), також вираховували стандартну помилку.

Розділ 3. Особливості змін в ДНК насіння сосни звичайної, що було опромінене з різною потужністю низькодозовим опроміненням.

Результати вивчення проростання насіння сосни звичайної, що отримали за 2 роки свого формування різну дозу хронічного опромінення, та оцінка життєздатності протопластів, які отримані з проростків цього насіння, та були додатково опроміненні гостро гамма-променями в дозах 20 та 40 Гр, свідчать про те, що для цих показників спостерігається складна залежність від дози. Встановлена більша радіочутливість протопластів та насіння, що за два роки свого формування отримало дозу 0,03 Гр, ніж протопластів та насіння, що за той же період отримало 3 Гр та 6 Гр, причому показники життєздатності при поглиненій дозі хронічного опромінення в 3 Гр майже не відрізняється від контролю. Нелінійна залежність ефекту від дози може бути обумовлена тим, що під час свого формування в насінні сосни міг накопичитись певний рівень прихованих пошкоджень, які могли реалізуватися в подальшому.

Для якісного аналізу характеру змін в ДНК протопластів сосни з різних ділянок 30-км зони ЧАЕС використовували метод пульс-електрофорезу ДНК в агарозних гелях. Для перевірки ефективності роботи систем репарації ДНК, а також вивчення кінетики деградації ДНК, протопласти з різною кумулятивною дозою опромінення додатково опромінювали гостро гамма-променями в дозах 20 і 50 Гр. При гострому опроміненні протопластів в дозі 20 Гр, для всіх варіантів, де лізис відбувався безпосередньо після опромінення, властива наявність треку фрагментованої ДНК, що вказує на протікання процесів деградації ДНК. В зразках, які були інкубовані протягом 4 годин після опромінення в дозі 20 Гр, треки фрагментованої ДНК були майже непомітні, але цей феномен стосується лише тих протопластів, які зазнали впливу хронічного опромінення. Якщо насіння не зазнавало такого впливу (контроль), характер треку фрагментованої ДНК після 4 годин інкубації не відрізнявся за характером в зразках без додаткової інкубації. ДНК зразків, що отримали дозу хронічного опромінення 0,03 Гр, при додатковому опроміненні в дозі 50 Гр ДНК дуже сильно деградує. У випадку контрольних зразків та зразків, що отримали дозу хронічного опромінення 6 Гр, певний рівень деградації спостерігається на 4 годині після додаткового опромінення. ДНК з протопластів, що отримало за 2 роки дозу 3 Гр, практично не має тенденції до деградації. Таким чином можна припустити, що насіння, яке за час свого формування отримало дозу 3 Гр, має більш високі репараційні здатності, порівняно з іншими зразками.

При аналізі ДНК хроматографічно були виявлені "приховані" пошкодження ДНК в протопластах, що досліджувались без додаткового опромінення. Аналіз дозової залежності відносної кількості однониткової ДНК в протопластах продемонстрував (рис. 1), що при дозі додаткового гострого опромінення в 20 Гр кількість однониткової ДНК зменшується порівняно з цим показником при дозі в 40 Гр. При додатковому гострому опроміненні в дозі 20 Гр протопластів з насіння, що отримали дози хронічного опромінення 3 Гр та 6 Гр, показник кількості однониткової ДНК майже не відрізнявся від контролю вже через 30 хвилин після гострого опромінення. Цікаво те, що при інкубації клітин протягом 4 годин рівень однониткової ДНК реєструвався нижчим, ніж значення цього показника для неопромінених додатково зразків. Аналогічні залежності спостерігаються і при опроміненні цих протопластів в дозі 40 Гр. Таким чином, процес елімінації більш інтенсивно відбувається у протопластів, насіння яких отримало кумулятивну дозу 3 Гр.

При хроматографічному аналізі ДНК насіння сосни звичайної опроміненого рентгенівськими променями в дозах 48 сГр та 24 сГр з різними потужностями дози виявлено, що відносна кількість однониткової ДНК при опроміненні значно вища за контрольний рівень (рис. 2). Але цей показник не є постійною величиною для певної дози, і характеризується відсутністю прямої залежності від потужності дози. Винятком при цьому виступає рівень однониткової ДНК для зразків, що були опромінені в дозі 48 сГр і потужності 84 сГр/хв, у цьому випадку ця характеристика практично не відрізнялась від контрольного рівню.

При опроміненні насіння сосни в дозі 24 сГр показник кількості однониткової ДНК в проростках цього насіння був вищий за контрольний для малих потужностей доз: 4 сГр/хв, 8 сГр/хв, 25 сГр/хв, а для інших потужностей доз рівень однониткової ДНК був незначно нижчий за контрольний (рис. 3). Рівень однониткової ДНК в проростках з насіння, що було опромінене в дозі 48 сГр, коливається хвилеподібно і має три максимуми для потужностей опромінення 8 сГр/хв, 46 сГр/хв та 118 сГр/хв та два мінімуми для потужностей 25 сГр/хв та 84 сГр/хв. Для режимів опромінення з потужностями 25 сГр/хв та 84 сГр/хв відносна кількість однониткової ДНК практично не відрізняється від контролю див.рис. 3.

Таким чином, в протопластах сосни, що отримали дози хронічного опромінення 3 Гр та 6 Гр при додатковому опроміненні в дозах 20 Гр та 40 Гр, можуть ініціюватися потужні індуцибельні системи відновлення, що відрепаровують наслідки гострого опромінення. Ці системи не індукуються, якщо доза хронічного опромінення складала 0,03 Гр. Проведені досліди показують, що довготривале опромінення низької інтенсивності насіння, що формується, в певних дозових діапазонах, може збільшити здатність відновлювати ДНК в клітинах дорослого організму при дії гострого опромінення в досить високих дозах та модифікувати деякі показники життєздатності насіння. З вищезазначеного матеріалу видно, що навіть відносно короткочасне опромінення насіння низькодозовим опроміненням в деяких випадках може призводити до збільшення рівню пошкоджень ДНК в подальших поколіннях клітин, що обумовлене реалізацією частини "прихованих" пошкоджень ДНК.

Розділ 4. Вплив низькодозового рентгенівського опромінення різної інтенсивності на вихід пошкоджень ДНК у рослинних протопластів.

При опроміненні протопластів сосни з потужністю дози 4 сГр/хв в дозі 9,6 сГр рівень однониткової ДНК був нижчий за контрольний весь час після опромінення (рис. 4). Якщо доза опромінення складала 24 сГр, то в перші хвилини післяопромінення рівень однониткової ДНК був вищий за контроль, а при подальшій інкубації протопластів після опромінення він знижувався і коливався в межах контрольного рівню. При опроміненні в дозі 48 сГр, в перші хвилини після опромінення спостерігався підвищений вихід пошкоджень ДНК, але з часом рівень ушкодженості ДНК знижувався, і на 6 годині після опромінення він був менший за контрольний. Можна припустити, що тільки при опроміненні в дозі 48 сГр починають діяти окремі ланки індуцибельних репаративних процесів, бо рівень однониткової ДНК суттєво нижчий контрольного на 6 годині інкубації після опромінення.

При опроміненні протопластів сосни з потужністю дози 8 сГр/хв, для дози опромінення 9,6 сГр відмічений рівень однониткової ДНК, що нижчий за контроль. При опроміненні в дозі 24 сГр, показник кількості однониткової ДНК на 6 годині після опромінення стає нижчим за контрольний. Напевно, при такій потужності опромінення відбувається активація окремих ланок адаптивної відповіді вже при дозі опромінення 24 сГр. У випадку опромінення протопластів з інтенсивністю 8 сГр/хв в дозі 48 сГр рівень однониткової ДНК на 6 годині інкубації після опромінення наближався до контрольного, що, напевно, обумовлено насиченістю ємності, як вже активованих, так і конститутивних репаруючих систем.

Якщо протопласти сосни опромінювали з потужністю дози 25 сГр/хв в дозі 9,6 сГр, то спостерігався понижений рівень однониткової ДНК, порівняно з контролем. Вірогідно, що такий понижений рівень обумовлений тим, що конститутивна система репарації елімінує всі пошкодження геному. Якщо доза опромінення складала 24 сГр, спостерігалося підвищення виходу пошкоджень ДНК, тоді як при дозі опромінення 48 сГр відбувалося зниження показника кількості однониткової ДНК на 1 та 6 годині після опромінення, що може бути обумовлено запуском повного каскаду процесів адаптивної відповіді. В такому випадку опромінення з такою інтенсивністю в дозі 24 сГр є тим інтервалом, де індукції адаптивної відповіді в повному обсязі не відбувається, а ємність існуючих репаративних систем вже вичерпана, тому вихід пошкоджень ДНК починає перевищувати контроль.

Був проведений дослід, де клітини опромінювали з еквівалентним фракціонуванням в дозі 48 сГр (24 сГр+24 сГр) та потужностями 25 сГр/хв та 8 сГр/хв (рис 5). Видно, що при додатковому опроміненні з потужністю дози 8 сГр/хв через 1 годину в еквівалентній дозі, значно знижується показник кількості однониткової ДНК, і стає нижчим за контроль. Додаткове опромінення на 4 годині після першого також знижує цей показник, але більш повільно. Можливо, що при другому опроміненні з інтенсивністю 8 сГр/хв через годину після першого може відбуватись активація додаткового синтезу ферментів репарації, що присутні в клітині і в нормальних умовах. У випадку, коли друге опромінення відбувалося через годину після першого з інтенсивністю 25 сГр/хв, спостерігається ситуація, коли показник однониткової ДНК підвищується. Таку поведінку кривої можна пояснити з позицій того, що опромінення в такий радіочутливий момент веде до того, що частина пошкоджень, спричинених опроміненням, може призводити до послаблення коректорської функції деяких ДНК-полімераз (Москальова, Илюшна 1990; Спирин 1990). З іншого боку, коли повторне опромінення проводили через 4 години після першого, то в цій ситуації мабуть відбувається повна елімінація всіх пошкоджень, бо на момент 4-годинної інкубації при одноразовому опроміненні в дозі 24 сГр рівень однониткової ДНК наближався до контрольного.

Коли опромінення протопластів сосни проводили в дозі 24 сГр з потужностями 8 сГр/хв і 25 сГр/хв та в присутності афідіколіну - інгібітору полімераз та (рис. 6), характер залежностей виходу однониткової ДНК від потужності дози опромінення змінюється. При опроміненні з потужністю дози 8 сГр/хв показник кількості однониткової ДНК збільшувався. Таке збільшення обумовлене тим, що афідіколін блокує роботу ДНК-полімераз ? та ?, тому можливості репаративної системи зменшуються і відбувається підвищення рівню однониткової ДНК. Видно, що при опроміненні протопластів з потужністю 25 сГр/хв в присутності афідіколіну, згодом вихід пошкоджень ДНК зменшується. Як було зазначено раніше, цей ефект може бути обумовлений тим, що опромінення з такою інтенсивністю в дозі 24 сГр здатне послабляти коректорські функції ДНК-полімераз при інцизійному процесі, внаслідок чого збільшується кількість помилок при репарації, і вихід пошкоджень ДНК збільшується (Спирин 1990).

При опроміненні протопластів сосни з потужністю дози 46 сГр/хв в дозі 48 сГр, видно суттєве зниження рівню однониткової ДНК на 6 годині інкубації. Такий прояв ефекту можна пояснити тим, що при опроміненні в такому режимі, крім конститутивних систем репарації, додатково активується синтез репараційних ферментів, що існують в клітині в нормальних умовах. Напевно, при потужності дози опромінення 46 сГр/хв відбувається зміщення в дозовий діапазон 9,6 сГр активації синтезу репаруючих ферментів, що функціонують у клітинах і при нормальних умовах. У випадку, коли доза опромінення складала 24 сГр, а потужність опромінення 46 сГр/хв, спостерігається ситуація, при якій існуючі в клітині репаративні системи працюють на межі перенавантаження, але активації всього каскаду захисних механізмів адаптивної відповіді не відбувається.

Якщо потужність дози складала 84 сГр/хв. а доза 24 сГр, рівень однониткової ДНК ставав менше контрольного. Швидше за все, що при опроміненні в дозах 24 та 48 сГр відбувається активація систем адаптивної відповіді в повному обсязі. У випадку, коли протопласти сосни звичайної опромінювали в такому режимі, але в дозі 9,6 сГр, спостерігається повна елімінація всіх пошкоджень ДНК системами конститутивної репарації, крім того додатково синтезуються репаративні ферменти, що функціонують в клітині і в нормальних умовах.

При опроміненні протопластів сосни з потужністю дози 118 сГр/хв та дозі 24 сГр слід звернути увагу на те, що реєструється незначне підвищення показника кількості однониткової ДНК, і величина цього показника практично не змінюється у часі. Такий ефект обумовлений тим, що відбувається перевантаження роботи конститутивних і вже частково індукованих систем репарації.

Як це не дивно, але ДНК протопластів тютюну має більшу чутливість до дії низьких рівнів радіації, ніж у протопластів сосни. У випадку опромінення протопластів тютюну з потужністю дози 4 сГр/хв (рис. 7) найнижчій рівень однониткової ДНК спостерігається при опроміненні в дозі 24 сГр. Цей показник практично не змінює своїх характеристик у часі. Дуже схожа ситуація спостерігається і при опроміненні протопластів тютюну з потужністю 8 сГр/хв в тій же самій дозі. При дозі опромінення 9,6 сГр та потужності 4 сГр/хв показник однониткової ДНК знижується майже до контрольного за досить короткий проміжок часу, а у випадку з опроміненням при потужності 8 сГр/хв цей показник реєструвався навіть нижче контрольного рівню. Можна припустити, що при опроміненні в дозі 9,6 сГр з потужністю 4 сГр/хв та 8 сГр/хв конститутивна репаративна система клітини спроможна практично повністю відновити всі пошкодження ДНК. Мінімального значення показник однониткової ДНК протопласти з тютюну набуває при опроміненні в дозі 24 сГр. При збільшені дози до 48 сГр вихід пошкоджень ДНК починає знову збільшуватись, що обумовлене поступовим насиченням ємності репаруючих систем клітини Якісно інша ситуація спостерігається при опроміненні протопластів тютюну з потужністю 25 сГр/хв, мінімальна кількість однониткової ДНК спостерігається, коли доза опромінення складає 24 сГр. Крім того підвищення виходу однониткової ДНК реєструється і при опроміненні в дозі 9,6 сГр. Подібний характер виходу однониткової ДНК спостерігається і при опроміненні протопластів тютюну з потужністю дози 46 сГр/хв. При подальшому збільшенні потужності опромінення до 84 та 118 сГр/хв відмічено деяке зменшення рівню однониткової ДНК у випадку отриманої дози 9,6 сГр. Напевно, таке зниження рівня однониткової ДНК обумовлене активацією додаткового синтезу ферментів репарації, що функціонують в клітині і за нормальних умов. Системи адаптивної відповіді починають працювати в повному обсязі лише при дозі опромінення 48 сГр. Слід зазначити, що при опроміненні протопластів тютюну в дозі 48 сГр та потужності 118 сГр/хв система адаптивної відповіді працює на межі насичення, тому що рівень однониткової ДНК наближається до контрольних меж.

Треба зауважити, що адаптивна відповідь - складний і багатоетапний процес, і можлива ситуація, коли при певних дозових навантаженнях вже починають працювати деякі початкові ланки цього процесу, але цього навантаження не достатньо для запуску повного каскаду реакцій адаптивної відповіді. Активації початкових ланок адаптивної відповіді, зокрема активації синтезу ферментів репарації, що функціонують в клітині і в нормальних умовах, може не вистачати щоб повністю елімінувати всі пошкодження ДНК, а запуску повного каскаду реакцій адаптивної відповіді не відбувається. В такій ситуації слід очікувати підвищення виходу пошкоджень ДНК у опромінених клітин. Таким чином, при опроміненні протопластів сосни та тютюну з різними потужностями в низькодозовому діапазоні, доза опромінення 24 сГр може бути тою критичною величиною, при якій може відбуватися підвищення, порівняно з контролем, виходу пошкоджень ДНК, що обумовлено фактом неспроможності елімінації всіх пошкоджень ДНК, що утворились внаслідок опромінення.

Розділ 5. Характер ушкодженості ДНК клітин проростків сосни, що були опромінені рентгенівськими променями різної інтенсивності в низькодозовому діапазоні.

Результати лужного електрофорезу зразків ДНК проростків сосни, що були опромінені при різній інтенсивності та відразу після цієї процедури лізовані, демонструють, що при дозі опромінення 24 сГр найбільший рівень пошкоджень ДНК по відношенню до контролю спостерігається для зразків з потужністю дози 8 сГр/хв. Якщо доза опромінення складала 48 сГр, при інтенсивності дози 8 сГр/хв та 118 сГр/хв спостерігається найбільший рівень ушкодженості ДНК. Хроматографічний аналіз ДНК продемонстрував, що при потужності дози опромінення 4 сГр/хв та дозі 24 сГр реєструється найвищий показник однониткової ДНК відразу після опромінення, але з часом значення цього показнику зменшується (рис. 8). Подібна картина спостерігається і при опроміненні проростків в дозі 24 сГр з потужністю 8 сГр/хв.

У цьому випадку виходить, що найвищому рівню однониткової ДНК відразу після опромінення відповідає найменше значення цього показника на 6 годині після опромінення, що вказує на повільне протікання процесів відновлення ДНК. При опроміненні проростків в дозі 9,6 сГр з тими самими потужностями спостерігається незначне підвищення рівню однониткової ДНК, що практично не змінюється весь тестований період часу. Цілком ймовірно, що при таких умовах опромінення відновлення пошкоджень відбувається за рахунок конститутивних репараційних систем клітин. У випадку дози опромінення 48 сГр та потужності дози 4 сГр/хв у проростків сосни реєструється знову підвищення показника однониткової ДНК, що вказує на слабкі здатності відновлення. При опроміненні проростків з потужністю 8 сГр/хв, з часом реєструється поступове зменшення показника ушкодженості ДНК. Причому, тут також спостерігається, хоча і в меншій ступені, тенденція відповідності - чим вища ушкодженість ДНК відразу після опромінення, тим нижчий буде цей показник згодом після опромінення.

При опроміненні з потужністю дози 25 сГр/хв та дозі опромінення 9,6 сГр найвищий рівень однониткової ДНК реєструється відразу після опромінення, а найнижчий на 6 годині після опромінення. Напевно таке збільшення потужності дози опромінення призводить до зміщення запуску процесів відновлення в область менших доз. При опроміненні в дозах 24 сГр та 48 сГр видно, що показник кількості однониткової ДНК на 6 годині після опромінення вищий, ніж зареєстрований відразу після опромінення. Рівень однониткової ДНК на 6 годині після опромінення практично не відрізняється для цих доз. Можливо це і є той самий випадок, коли рівень пошкоджень ДНК вищий контрольного і не залежить від величини дози опромінення (область "плато"), що обумовлено роботою систем SOS-відповіді (Гераськин 1998).

Якщо проростки сосни опромінювали при потужністю дози 46 сГр/хв, рівень однониткової ДНК при дозі опромінення 9,6 сГр збільшувався з часом. Можливо, що при такій інтенсивності опромінення також спостерігається активація систем SOS-відповіді. Ситуація, яка спостерігається при опроміненні в більш високих дозах, напевно вже обумовлена тим, що в цьому випадку відбувається перехід клітин в "аварійний" режим роботи (Гераськин 1998). Вірогідно, що ефекти, які реєструється при опроміненні проростків сосни з потужностями дози 84 сГр/хв та 118 сГр/хв, обумовлені подібними процесами, що і при опроміненні з потужністю дози 46 сГр/хв. Ймовірно, що при посиленні інтенсивності опромінення відбуваються зміни не тільки на рівні клітин, але і на рівні цілого організму. З такої позиції коливання показника однониткової ДНК, що реєструється, обумовлене не тільки репараційними процесами, але і станом ДНК в клітинному ядрі, що пов`язаний з стадією клітинного циклу та фізіологічною функцією клітини.

З вищезазначеного матеріалу видно, що по критерію виходу однониткової ДНК від потужності дози/дози опромінення клітини проростків сосни є більш чутливими до впливу низькодозового опромінення, ніж протопласти цієї рослини. В наведених дозових діапазонах фактор потужності дози опромінення є важливим чинником, що може змінювати характер процесів відновлення.

ВИСНОВКИ

1. Хронічне іонізуюче опромінення насіння сосни в дозах 0,03 Гр, 3 Гр та 6 Гр за період його формування індукує "приховані" пошкодження ДНК. Пошкодження, що сформувались внаслідок хронічного опромінення в дозах 3 та 6 Гр, виступають активаторами систем відновлення.

2. При опроміненні сухого насіння сосни в дозах 24 сГр та 48 сГр спостерігається зростання рівню ушкодженності ДНК. Кількість пошкоджень ДНК визначається значенням потужності дози опромінення. Для проростків, що отримані з опроміненого насіння, не відмічено прямої залежності рівня ушкодженості ДНК з цим показником в насінні.

3. При опроміненні проростків сосни характерна більша чутливість ДНК до впливу низькодозового опромінення, ніж для протопластів цієї рослини.

4. При опроміненні протопластів сосни в дозі 24 сГр з потужністю дози в 25 сГр/хв та 118 сГр/хв спостерігається зростання рівню ушкодженості ДНК. Ці обставини свідчать про те, що при таких режимах опромінення системи репарації, що в данний момент функціонують в клітині, не спроможні елімінувати всі пошкодження ДНК.

5. Опромінення протопластів сосни в дозі 24 сГр та в присутності інгібітора ферментів репарації - афідіколіну може призвести як до збільшення, так і до зменшення рівня ушкодженності ДНК, що визначається показником потужності дози опромінення.

6. При опроміненні протопластів тютюну відмічається тотожна залежність між рівнем пошкодження ДНК, режимом опромінення та фактором часу після опромінення. ДНК протопластів тютюну є більш чутливою до впливу низькодозового опромінення різної інтенсивності, ніж ДНК протопластів сосни.

7. При низькодозовому опроміненні з різною потужністю дози клітин сосни та тютюну, існують такі потужності дози і дози опромінення, вплив яких не призводить до активації додаткових ланцюгів системи відновлення, а постійно існуючі в клітині відновлювальні системи вже не в змозі елімінувати всі радіаційно-індуковані пошкодження ДНК.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Соколов Н.В., Ісаенков С.В., Сорочинський Б.В. Хронічне опромінення в малих дозах здатне модифікувати показники життєздатності насіння сосни звичайної ( Pinus silvestris) // Цитол. и генетик.- 1998.- Т. 32., №4.- С. 65 - 71.

2. Исаенков С.В., Соколов С.В., Сорочинский Б.В. Биологические эффекты ионизирующего излучения в малых дозах. Анализ современных подходов и концепций // Пробл. Чорнобильскої Зони відчуження - 1998.- №5.- С. 102 - 112.

3. Isaenkov S.V., Sokolov N.V., Sorochinsky B.V. Genom changes in pine seeds after irradiation // Photosyn. : Mechanisms and Effects. - 1998. - Vol. V. - P. 4101 - 4104.

4. Исаенков С.В., Сорочинский Б.В., Соколов Н.В., Гродзинский Д.М. Радиационно-индуцированные изменения в геноме семян сосны, сформировавшихся в условиях хронического облучения в Зоне отчуждения ЧАЭС // Укр. биохим. журн. - 1999. - Т. 71., № 4. - С. 103 - 106.

5. Исаенков С.В., Соколов С.В., Сорочинский Б.В. Регистрация скрытых повреждений генома облученных семян сосны методом пульс-электрофореза // 3 Съезд по радиационным исследованиям (Москва, 14 - 17 октября 1997). - Тезисы докладов. - Пущино, 1997. - Том 1. - С. 169

6. Ісаєнков С.В., Соколов С.В., Сорочинський Б.В. Хронічне опромінення насіння сосни звичайної під час його формування впливає на геном та модифікує показники життєздатності насіння // Міжнародна конференція "Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі" (Львів, 1-4 липня 1998). - Матеріали міжнародної конференції - Львів, 1998. - С. 202 - 203.

7. Isaenkov S.V., Sokolov N.V., Sorochinsky B.V. Pine seeds genome changes after irradiation// XI International Congress on Photosintesis (Budapest, 17 - 22 August 1980): Abstr. - Budapest, 1998. - P. 207.

8. Ісаенков С.В. Вплив афідіколіну та потужності дози на характер виходу пошкоджень ДНК в протопластах сосни, опромінених в дозі 0,25 Гр //Науково-практична конференція молодих вчених “Інтегративність функцій рослинного організму” (Київ, 3-4 вересень 1998). - Тези доповідей - Київ, 1998. - С. 39 - 41.

9. Isaenkov S.V., Sorochinsky B.V. the role of chronic irradiation intensity in the induction of DNA singlebreakes // International Conference " Diagnosis and Treatment of Radiation injury ( de Doelen Rotterdam, 30 August - 3 September 1998): Abstr. - Rotterdam, 1998 - P. 46.

10. Sorochinsky B.V., Zelenaya L.B., Isaenkov S.V. Microevolution processes among coniferous plants from the Chernobyl Exclusion zone // II International Symposium on Plant Biotechnology (Kiyv, 4-8 October 1998): Abstr. - Kyiv, 1998. - P. 125.

SUMMARY

Isaenkov S.V. The influence of dose intensity irradiation on DNA-damages issuer in plant cells. - Manuscript.

Thesis for competition on scientific degree of the candidate of biological sciences on the speciality 03.00.01 - radiobiology. Kiyv University by Taras Shevchenko. Kyiv, 1999.

The thesis includes data about issuer of DNA-damages in plant cells irradiated with different dose intensities at low level dose. The dose intensity influence at low dose range on the character of DNA-damages issuer has been investigated. It was demonstrated that the dose intensity is sufficient for forming the answer of Nicotiana tabacum and Pinus silvestris cells by DNA damages index on influence of low dose irradiation. The dependence of DNA-damages issuer on dose intensity irradiation has complicated character and does not correlate with the value of dose intensity and absorbed dose. It was detected the increased DNA-damages issuer for some condition of irradiation. The fact of hidden damages realisation in pine seeds after low dose irradiation was registrated. Higher radiosensivity of pine shoots in comparison with pine protoplasts on low dose irradiation was registrated.

Key words: dose intensity, low dose irradiation, DNA-damages, DNA-repair, protoplasts, shoots, seeds.

рослинний протопласт насіння опромінення

АНОТАЦІЯ

Ісаєнков С.В. Вплив потужності дози на вихід пошкоджень ДНК в рослинних клітинах. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01. - радіобіологія, Київський університет імені Тараса Шевченка. Київ 1999.

Захищається дисертаційна робота, яка містить данні про вихід пошкоджень ДНК в рослинних клітинах, що були опромінені з різною потужністю дози іонізуючим низькодозовим опроміненням. Досліджено вплив фактору потужності дози в низькодозовому діапазоні на характер виходу пошкоджень ДНК. Було показано, потужність дози є важливим чинником в формуванні реакції відповіді клітин тютюну (Nicotiana tabacum) та сосни звичайної (Pinus silvestris), по критерію виходу пошкоджень ДНК, на низькодозове опромінення. Залежності виходу пошкоджень ДНК від потужності дози опромінення мають складний характер і не корелюють з величиною потужності та дози опромінення. При деяких режимах опромінення виявлений підвищений вихід пошкоджень ДНК в порівнянні з контролем. Зареєстрований факт реалізації прихованих пошкоджень в насінні сосни, що було опромінене в низькодозовому діапазоні. Показана більша радіочутливість проростків сосни, ніж протопластів цієї рослини на вплив низькодозового опромінення.

Ключові слова: потужність дози, низькодозове опромінення, хронічне опромінення, пошкодження ДНК, репарація ДНК, протопласти, проростки, насіння.

АННОТАЦИЯ

Исаенков С.В. Влияние мощности дозы на выход повреждений ДНК в растительной клетке. - Рукопись

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 - радиобиология, Киевский университет имени. Тараса Шевченка. Киев, 1999.

Защищается диссертационная работа, которая содержит данные о выходе повреждений ДНК в растительных клетках, которые были облучены с разной мощностью дозы в низкодозовом диапазоне. Появляется все больше эксперементальных данных, свидетельствующих о нелинейном характере проявления биологических эффектов в низкодозовом диапазоне. Существует, по крайней мере, две причины, которые обусловливают особенности биологического действия низкодозового ионизирующего облучения. Первая связана с возможностью качественных изменений в распределении по клетке событий поглощения энергии. Вторая связана с молекулярными механизмами, которые формируют реакции клетки на облучение. Можно предположить, что в формировании реакции клетки на слабое воздействие внешнего фактора главное значение имеют триггерные молекулярные механизмы, которые обуславливают переключение клетки в новый режим функционирования.

Исследовано влияние фактора мощности дозы облучения в диапазоне низких доз на характер выхода повреждений ДНК. Показано, что мощность дозы является важным фактором в формировании ответной реакции клеток табака (Nicotiana tabaccum) и сосны обыкновенной (Pinus silvestris), по критерию выхода повреждений ДНК, на низкодозовое облучение. Зависимости выхода повреждений ДНК от мощности дозы облучения имеют сложный характер и не корелируют с величиной мощности и дозы облучения. При некоторых режимах облучения отмечен повышенный выход повреждений ДНК в протопластах, клетках семян и проростках по сравнению с контрольным уровнем. Зарегистрирован факт реализации скрытых повреждений ДНК у семян сосны, облученных ионизирующим гамма - и рентгеновским излучением в низкодозовом диапазоне. Отмечена роль некоторых ДНК-полимераз в процессах элиминации повреждений ДНК в протопластах сосны.

Установлено, что хроническое ионизирующее облучение низкой интенсивности может модифицировать некоторые показатели жизнеспособности семян сосны, а в некоторых случаях увеличивать восстановительные способности при дополнительном остром гамма -облучении. Показано, что проростки сосны отличаются большей радичувствительностью, чем изолированные протопласты этого растения при облучении в низких дозах.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу недостаточной обоснованности применения общепринятой на данный момент линейно-безпороговой концепции. Повышенный выход повреждений ДНК в тестируемом дозовом диапазоне объясняется на основе предложенной гипотезы, которая состоит в том, что существует определенный диапазон доз, в котором конститутивные репаративные системы уже не в состоянии элиминировать все повреждения ДНК, индуцированные облучением, а активации индуцибельной репаративной компоненты не происходит вследствие недостаточной величины индукции повреждений ДНК ионизирующим облучением за временной интервал.

Ключевые слова: мощность дозы, низкодозовое облучение, хроническое облучение, повреждения ДНК, репарация ДНК, протопласты, проростки, семена.

Размещено на Allbest.ru