Зміни механізмів пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори щурів в постнатальному онтогенезі

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЗМІНИ МЕХАНІЗМІВ ПУРИНЕРГІЧНОЇ КАЛЬЦІЄВОЇ СИГНАЛІЗАЦІЇ В НЕЙРОНАХ СЕНСОМОТОРНОЇ КОРИ ЩУРІВ В ПОСТНАТАЛЬНОМУ ОНТОГЕНЕЗІ

Лало Уляна Володимирівна

Київ - 1999

Анотації

Лало У.В. Зміни механізмів пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори щурів в постнатальному онтогенезі. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено дослідженню механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в нейронах II-III шарів сенсомоторної кори щурів in situ, в тонких зрізах мозку. Для вимірювання концентрації [Ca²⁺]_i був використаний неінвазивний метод завантаження нейронів мембранопроникною формою флуоресцентного барвника Fura-2/AM. Були охарактеризовані основні механізми генерації кальцієвих сигналів в нейронах сенсомоторної кори щурів різних вікових груп, а також вперше показано існування іоно- та метаботропних пуринергічних механізмів збудження в цих нейронах. Описані властивості інозитолтрифосфат-чутливих і кофеїн-чутливих кальцієвих депо. Показано, що метаботропні Р_2У пуринорецептори експресуються в усіх нейронах 14-денних щурів, в той час як в нейронах дорослих щурів - тільки в 30% досліджених клітин. В переважній більшості досліджених нейронів кори 14-денних щурів механізм кальцій-індукованного вивільнення кальцію з кофеїн-чутливого депо відсутній, однак, в нейронах 30-денних тварин це депо вже відіграє значну роль у внутрішньоклітинній кальцієвій сигналізації.

Ключові слова: неокортекс, кальцієві канали, кальцієві депо, пуринорецептори, інозитолтрифосфат-індуковане вивільнення кальцію, кальцій-індуковане вивільнення кальцію.

Лало У.В. Изменения механизмов пуринэргической кальциевой сигнализации в нейронах сенсомоторной коры крыс в постнатальном онтогенезе.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика.- Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена исследованию механизмов внутриклеточной кальциевой сигнализации в нейронах II-III слоев сенсомотороной коры крыс in situ, в тонких срезах мозга. Для измерения концентрации [Ca²⁺]_i был использован неинвазивный метод загрузки нейронов мембранопроницаемой формой флуоресцентного красителя Fura-2/AM. Были охарактеризованы основные механизмы генерации кальциевых сигналов в нейронах сенсомоторной коры крыс разных возрастных групп (14- и 30-дневных), а также впервые показано существование ионо- и метаботропных пуринэргических механизмов возбуждения в этих нейронах.

Амплитуды АТФ-индуцируемых кальциевых транзиентов были дозазависимыми в диапазоне концентраций от 5 до 2000 мкМ. Принимая величину амплитуды кальциевого транзиента, вызванного приложением 2000 мкМ АТФ, за единицу, зависимость может быть представлена в виде сигмоидальной кривой, описываемой уравнением [Ca²⁺]_i = [Ca²⁺]_{i max} [ATP]/([ EС₅₀+[ATP])^m, где m=1.06 и EС₅₀= 72 мкM.

Показано, что в формировании АТФ-индуцированнрго кальциевого транзиента могут принимать участие потенциал-управляемые кальциевые каналы. Вклад в кальциевую сигнализацию разных типов каналов может значительно изменяться в ходе онтогенеза. Мы использовали блокаторы различных типов потенциал-управляемых кальциевых каналов до и во время приложения гиперкалиевого раствора. Ni²⁺ в концентрации 50 мкМ (блокатор низкопороговых кальциевых каналов Т-типа) уменьшал амплитуды [Ca²⁺]_i транзиентов, вызванных приложением 50мМ КСl, в нейронах 14-дневных крыс на 47%8% (n=12), а в нейронах 30-дневных крыс - только на 15%6%. А влияние блокаторов высокопороговых каналов L-типа верапамила и нифедипина было одинаковым в обеих группах нейронов. Результаты ясно показывают существенные сдвиги в экспрессии низкопороговых кальциевых каналов на протяжении исследованного периода развития: плотность низкопороговых каналов уменьшается.

Аппликация АТФ в бескальциевом растворе вызывала увеличение [Ca²⁺]_i только в 1/3 тестированных нейронов 30-дневных крыс (в 15 из 46). Более того, истощение внутриклеточных депо происходило гораздо быстрее чем в нейронах 14-дневных животных. В большинстве случаев уже вторая аппликация АТФ не вызывала кальциевого ответа (в нейронах 14-дневных крыс их можно было наблюдать при 3-4 аппликациях АТФ).

Мы апплицировали 100 мкМ АТФ несколько раз подряд с интервалом 60 секунд. Амплитуды второго и последующих кальциевых ответов (а их можно было зарегистрировать до 10-12 раз) были меньше первой и составляли 70%4% (n=9) по сравнению с величиной амплитуды первого АТФ-индуцированного [Ca²⁺]_i транзиента. Уменьшение амплитуды второго и последующих ответов может быть вызвано а) десенситизацией пуринорецепторов и/или б) изменением вклада метаботропного компонента (истощением внутриклеточных запасников). Чтобы проверить данные предположения, мы использовали тот же протокол эксперимента, но в присутствии 1мкМ тапсигаргина. Амплитуда третьего и последующих [Ca²⁺]_i транзиентов в этих условиях остается постоянной и составляет 65%8% от контрольной (n=13). Очевидно, что именно эти [Ca²⁺]_i транзиенты представляют собой чисто ионотропную часть кальциевого ответа. При последовательных приложениях АТФ, начиная с 3-ей аппликации ионотропная часть кальциевого транзиента составляла около 65%, а доля метаботропной части уменьшалась с 63% (оценивая максимальный вклад метаботропных пуринорецепторов по величине амплитуды первого кальциевого ответа в бескальциевом растворе) до 35%. Это уменьшение может быть связано с тем, что а) внутриклеточные депо перезаполняются не полностью при последовательных аппликациях с 60-секундным интервалом и, таким образом, уменьшается количество ионов Ca²⁺, способных к высвобождению при активации метаботропных пуринорецепторов; б) возможно, происходит десенситизация Р_2У рецепторов; в) может быть, существуют различия в функционировании механизмов внутриклеточной кальциевой мобилизации в нормальном и бескальциевом растворах и, в силу этого, некорректно использовать величину амплитуды кальциевого транзиента в бескальциевом растворе для оценки вклада метаботропных рецепторов в общем ответе в нормальном растворе.

Повышение уровня [Ca²⁺]_i может также вызывать кальций-индуцированное высвобождение кальция (CICR) из кофеин-чувствительного депо. Поэтому при исследовании механизмов пуринэргической кальциевой сигнализации нельзя не уделить внимание функционированию кофеин-чувствительного депо. Перед аппликацией кофеина нейроны были деполяризованы приложением гиперкалиевого раствора, чтобы имеющиеся внутриклеточные депо были перезаполнены ионами кальция, способными к высвобождению. Однако, 10-20 секундные аппликации кофеина в концентрациях до 40 мМ не приводили к увеличению внутриклеточной концентрации свободного кальция в 90% (23 из 26)нейронов 14-дневных крыс, даже при повышенной [Ca²⁺]_i. Однако, в 28 из 42 исследованных нейронов 30-дневных крыс 5-10 секундная аппликация 20 - 40 мМ кофеина вызывала значительный [Ca²⁺]_i транзиент, практически не меняющийся в бескальциевом растворе, но исчезающий в присутствии 1 мкМ тапсигаргина. Был сделан вывод, что механизм кальций-индуцированного освобождения кальция связан с развитием дендритного дерева и, по-видимому, имеет значение для сигнальной функции созревших нейронов.

Ключевые слова: неокортекс, кальциевые канали, кальциевые депо, пуринорецепторы, инозитолтрифосфат-индуцированное высвобождение кальция, кальций-индуцированное высвобождение кальция.

сигналізація кальцієвий нейрон щур

Lalo U.V. Changes in mechanisms of purinergic calcium signalling in rat sensorimotor neurons in postnatal ontogenesis. - Manuscript.

The dissertation is presented in accordance with requirements for the degree of candidate of biological sciences in speciality 03.00.02 - biophysics.-Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1999.

Dissertation is devoted to investigation of intracellular calcium signalling mechanisms in neurons of II-III layers of sensorimotor cortex in thin brain slices in situ. Neocortical neurones were loaded with calcium indicator Fura-2/AM. The principal mechanisms of calcium signals generation were examined for different age group neurons and for the first time demonstrate the existence of iono - and metabotropic mechanisms of exiting these neurons. Property of inositoltriphosphate - and caffeine-sensitive calcium stores were described. It was demonstrated that metabotropic Р_2У purinoreceptors are present in all neurons of 14-days rats (P14), at the same time only 1/3 of the tested P30 neurones exhibited responses to applications of ATP in Ca²⁺- free solution. No caffeine - induced Ca²⁺-release has been observed in the P14 neurons. To the contrary, in neurones of the P30 group caffeine application induced considerable [Ca²⁺]_i transients and respective calcium store becomes play an essential role in intracellular calcium signalling.

Key words: neocortex, calcium cannels, calcium stores, purinoreceptors, inositoltriphosphate- induced calcium release, calcium-induced calcium release.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Внутрішньоклітинний кальцій є найбільш універсальним регулятором клітинних функцій. Зміни цитоплазматичної концентрації кальцію ([Ca²⁺]_i) забезпечують передачу сигналів від структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних систем, запускаючи ряд важливих процесів, що лежать в основі клітинної збуджуваності, секреції, регуляції генетичного апарата, метаболічних процесів. Регулювання рівня [Ca²⁺]_i забезпечується функціональною активністю як структур плазматичної мембрани, так і внутрішньоклітинних органел. В нервових клітинах ЦНС основні параметри цих систем, їх взаємодія та зміни під час онтогенезу вивчені недостатньо. Нещодавно було показано, що АТФ може виділятись як супутній медіатор з пресинаптичних терміналей в багатьох відділах ЦНС, тому питання про існування рецепторів до позаклітинного АТФ, пуринергічного компонента кальцієвої сигналізації є важливим для розуміння механізмів міжклітинної взаємодії. Дія позаклітинного АТФ як нейротрансмітера в центральних нейронах в значній мірі ще не вивчена. Про механізми пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах ЦНС, а також про їх онтогенетичні зміни даних практично немає.

Метою роботи було дослідження пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори щурів, зокрема ролі пуринорецепторної системи в цьому процесі та онтогенетичних змін у відповідних механізмах.

Головні завдання.

1. Дослідити властивості іоно- та метаботропної пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори щурів різного віку.

2. Дослідити властивості інозитолтрифосфат-чутливого депо та його участь в пуринергічній кальцієвій сигналізації в указаних нейронах.

3. Дослідити властивості кофеїн-чутливого кальцієвого депо в нейронах сенсомоторної кори щурів різного віку.

Наукова новизна отриманих результатів. Виявлено функціонально важливі механізми, що беруть участь у регулюванні рівня цитоплазматичної концентрації іонів кальцію в нейронах сенсомоторної кори щурів різних вікових груп. Вперше встановлено існування іоно- та метаботропних механізмів пуринергічної кальцієвої сигналізації в указаних нейронах. Описано властивості внутрішньоклітинного інозитолтрифосфат-чутливого кальцієвого депо в нейронах сенсомоторної кори щурів різних вікових груп, вивчено онтогенетичні особливості функціонування кофеїн-чутливого внутрішньоклітинного кальцієвого депо в цих нейронах. Описані зв'язки між різними кальцієвими депо ендоплазматичного ретикулуму в указаних нейронах.

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати роботи мають фундаментальне значення, оскільки дозволяють оцінити внесок різних внутрішньоклітинних систем, що беруть участь в тонкій регуляції рівня цитоплазматичної концентрації іонів кальцію на різних етапах розвитку нейронів сенсомоторної кори. Практична цінність роботи полягає в тому, що виявлено особливості кальцій-регулюючих систем даних нейронів в процесі онтогенезу, що може бути важливим для корекції порушень функціонального стану нервової системи в процесі розвитку.

Особистий внесок здобувача. Підготовка препарату, фарбування зрізів флуоресцентним барвником і всі експерименти по реєстрації кальцієвих транзиєнтів були виконані автором особисто. В обговоренні результатів активну участь брали співавтори друкованих праць.

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАНУ (1997-1998), міжнародному семінарі ”Внутрішньоклітинна сигналізація” (Київ, 1997), ХV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), I Українській конференції нейронаук (Київ, 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 6 робіт, в тому числі 4 статті та 2 тез.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається з вступу, списку скорочень, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 207 найменувань. Робота викладена на 117 сторінках, ілюстрована 17 рисунками та 2 таблицями.

Підготовка препарату. Дослідження проводились на нейронах II-III шарів в тонких зрізах мозку щурів декількох вікових груп: молодих (14 днів), практично зрілих (21 день) та дорослих (1 місяць). Після декапітації мозок занурювався у холодний сольовий розчин (0 - 4 ⁰С) і поділявся на 2 півкулі. Процедура від початку декапітації до розділення мозку продовжувалася не більше 60-90 секунд. Потім одна з півкуль приклеювалася поліакриламідним клеєм до підложки вібротома (Campden, Campden Instrument LTD, U.K.); камера вібротома заливалась холодним сольовим розчином. Зрізи нарізувались сагітально 200-250 мкм завтовшки; швидкість подачі леза - 1 см/с, частота коливань - 11 Гц. Після нарізування зрізи витримували в розчині, насичуваному карбргеном (5% СО₂ + 95% О₂). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи витримувались 20 хвилин при температурі 30 ⁰С. Після процедури фарбування і до початку експериментів зрізи витримували при кімнатній температурі (20-22⁰С) не менше 1 години. Якість отриманих зрізів дозволяла проводити дослідження протягом 4-6 годин. Ділянки сенсомоторної кори були ідентифіковані за стереотаксичним атласом (Paxinos & Watson, 1944).

Флуоресцентне вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Для вимірювання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію в нейронах сенсомоторної кори використовували мембранопроникну форму флуоресцентного барвника Fura-2/AM. Для його завантаження зрізи інкубували в розчині, що містив естерифіковану форму барвника Fura-2/AM в концентрації 5 мкМ, розчинену в диметилсульфоксиді з доданням детергенту Pluronic F-127 (0,02%). В такій формі барвник проходить в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи відокремлюються, зонд стає зарядженим і залишити клітину не може. Фарбування проводилось при температурі 35 ⁰С 35 хвилин для 14-и 21-денних щурів і 20 хвилин для зрізів одномісячних тварин. Оптична частина установки забезпечувала збудження флуоресценції зонда при довжинах хвиль 3605 і 3905 нм і реєстрацію його емісії при 5305 нм за допомогою фотопомножувача. Основними елементами експериментальної установки для двохвильового вимірювання концентрації іонів кальцію були: джерело світла (ртутна лампа потужністю 50 Вт), система зміни фільтрів (колесо з вмонтованими фільтрами, що оберталось зі швидкістю 5 Гц), мікроскоп (Axioskop, Zeiss), модуль попередньої обробки сигналів, що також керував зміною фільтрів (Luigs und Neumann, Німеччина) і комп'ютер.

Вимірювання флуоресценції при збудженні світлом з двома довжинами хвиль дозволяє легко розрахувати [Ca²⁺]i в клітині за формулою (Grynkiewicz et al., 1985):

[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R),

де Кd - константа дисоціації комплексу Fura-2 с кальцієм (224 нмоль/л), R=F360/F390 - поточне відношення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390|_Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Ca²⁺, Rmax = F360/F390|_Ca - те ж відношення в розчині з високою концентрацією Ca²⁺, b = F390|_Ca0/F390|_Ca - відношення флуоресцентних сигналів в низькій і високій концентрації Ca2+ при збудженні світлом з довжиною хвилі 390 нм. Параметри Rmin, Rmax і b визначали експериментально в краплях означених вище розчинів, що розташовувались на дні експериментальної камери. В результаті для нашої системи отримали - Rmin= 0.6, Rmax= 4 та b=13.8.

Розчини. При роботі зі зрізами всі розчини готувались на основі такого розчину (в ммоль/л): NaCl - 135, KCl - 5.4, MgCl₂ - 1, CaCl₂ - 2.5, NaHCO₃ - 16, KH₂PO₄ - 1.6, глюкоза - 10, постійно насичуваний карбогеном (pH=7.4). Безкальцієвий розчин готувався еквімолярною заміною CaCl₂ на MgCl₂ та додаванням 1 ммоль/л EGTA; розчини з підвищеним вмістом калію або кофеїну - заміною NaCl на відповідну кількість KСl або кофеїну. Зміна розчинів проводилась протоком, швидкість якого регулювалась від 10 до 20 мл/хв. Об'єм експериментальної камери дорівнював 0.5 мл. Всі експерименти були проведені при температурі 32⁰С.

Існування пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори мозку щурів.

Аплікація АТФ в концентраціях від 5 до 2000 мкМ призводила до транзиєнтного збільшення [Ca²⁺]_i в більшості нейронів сенсомоторної кори як 14-, так і 30-денних щурів. Така дія АТФ могла бути опосередкована постсинаптичними іоно- та метаботропними пуринорецепторами або АТФ-індукованим вивільненям іншого нейротрансмітера з пресинаптичної терміналі. Однак, ні амплітуда, ні кінетичні характеристики кальцієвих транзиєнтів в нейронах обох вікових груп значно не змінювались в присутності антагоністів глутаматних рецепторів d-APV (25 мкМ) і CNQX (20 мкM), а також при інкубації зрізу в розчині, що містить ТТХ в концентрації 1 мкМ.

Таким чином, ми мали підстави вважати, що збільшення [Ca²⁺]_i при аплікації АТФ викликане значною мірою активацією пуринергічних рецепторів вибраної клітини.

Антагоністи пуринорецепторів - РРАDS (20 мкМ) і сурамін (100 мкМ) зменшували амплітуди кальцієвих АТФ-індукованих відповідей в обох групах нейронів на 26%10% (n=6) і 56%12% (n=5) відповідно.

Для визначення типу пуринорецепторів, експресованих в нейронах сенсомоторної кори щурів, ми визначили ряди ефективностей аналогів АТФ в концентраціях 100 мкМ. Вони були такими: в нейронах 14-денних щурів - ATФ-S-АТФ=AДФ-AMФ Aденозин-methylene ATФ-УТФ; а для 30-денних - ATФ-S-АТФ> AДФ methylene ATФ-AденозинУТФ, AMФ. Такі ряди ефективностей дозволяють припустити участь переважно Р_2У типу рецепторів (Burnstock G. et al., 1985). Необхідно відмітити, що в 1/3 досліджених клітин обох груп ми спостерігали помітне збільшення [Ca²⁺]_i при аплікації 100 мкМ аденозина.

Механізми пуринергічної кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори 14-денних щурів. Амплітуди АТФ-індукованих кальцієвих транзиєнтів були доза-залежними в діапазоні концентрацій від 5 до 2000 мкМ. Якщо амплітуду кальцієвої відповіді, викликаної прикладенням 2000 мкМ АТФ, прийняти за одиницю, залежність може бути представлена в вигляді сигмоідальної кривої, що описується рівнянням

[Ca²⁺]_i = [Ca²⁺]_{i max} [ATP]/([EС₅₀+[ATP])^m, де m=1.06 і EС₅₀= 72 мкM.

Інозитолтрифосфат-чутливе депо. Для визначення джерела Ca²⁺ ми прикладали АТФ в безкальцієвому розчині. Наявність значної відповіді в 90% нейронів 14-денних тварин при відсутності іонів кальцію в зовнішньоклітинному розчині говорить про те, що дані нейрони мають метаботропні пуринорецептори, активація яких викликає збільшення [Ca²⁺]_i шляхом вивільнення Ca²⁺ з внутрішньоклітинних депо. Однак, вже друга аплікація АТФ в безкальцієвому розчині викликала відповідь, амплітуда якої була на 52%7% меншою за першу (n=11). Третя або четверта аплікації практично не призводили до збільшення [Ca²⁺]_i. Інкубація зрізу протягом 5 хвилин в розчині, що містив 1 мкМ тапсигаргіна, специфічного блокатора кальцієвих АТФаз ЕР, призводила до зникнення АТФ-індукованої відповіді в безкальцієвому розчині (n=5).

Іонотропні механізми пуринергічної кальцієвої сигналізації. Ми аплікували 100 мкМ АТФ декілька разів підряд з інтервалом 60 секунд. Амплітуди другої та наступних кальцієвих відповідей були менше першої на 30%4% (n=9). Це зменшення може бути викликано а) десенситизацією пуринорецепторів та/або б) зменшенням внеску метаботропного компоненту (спустошенням внутрішньоклітинних запасників). При послідовних аплікаціях АТФ в присутності 1 мкМ тапсигаргіну амплітуда третього та слідуючих кальцієвих транзиєнтів залишається сталою і дорівнює 65%8% від контрольної (n=13). Очевидно, що саме ці [Ca²⁺]_i транзиєнти є виключно іонотропною частиною кальцієвої відповіді. Отже, при послідовних прикладеннях АТФ, починаючи з 3-ої аплікації іонотропна частина кальцієвого транзиєнта дорівнює 65%, а доля метаботропної частини зменшується з 63% (оцінюючи максимальний внесок метаботропних пуринорецепторів за величиною амплітуди першої кальцієвої відповіді в безкальцієвому розчині) до 35%. Це може бути пов'язано з тим, що а) внутрішньоклітинні депо перезаповнюються не повністю при послідовних аплікаціях з 60-секундним інтервалом і, таким чином, зменшується кількість іонов Ca²⁺, здатних до вивільнення при активації метаботропних пуринорецепторів; б) можливо, відбувається десенситизація Р_2У рецепторів; в) можливо, існують відмінності в функціонуванні механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої мобілізації в нормальному і безкальцієвому розчинах і, в силу цього, некоректно використовувати величину амплітуди кальцієвого транзиєнта в безкальцієвому розчині для оцінки внеску метаботропних рецепторів в загальній відповіді в нормальному розчині.

Таким чином, в нейронах сенсомоторної кори 14-денних щурів збільшення [Ca²⁺]_i при аплікації АТФ відбувається при активації як метаботропних, так і іонотропних пуринорецепторів. Але в цьому процесі можуть брати участь і потенціал-керовані кальцієві канали, оскільки струм іонів через неселективні іонні канали при активації Р_2Х рецепторів може викликати зміщення мембранного потенціалу. Дійсно, блокатори потенціал-керованих кальцієвих каналів верапаміл (100 мкМ), ніфедіпін (100 мкМ) та Ni²⁺ (50 мкМ) зменшували амплітуду кальцієвого транзиєнту, викликаного аплікацією 100 мкМ АТФ, на 28%8% (n=7), 23%8% (n=7) и 17%6%(n=9) відповідно. Ці дані підтверджують участь як високо-, так і низькопорогових потенціал-керованих кальцієвих каналів в формуванні кальцієвих транзиєнтів при аплікації АТФ.

Кофеїн-чутливе депо. Збільшення [Ca²⁺]_i може викликати кальцій-індуковане вивільнення кальцію (CICR) з кофеїн-чутливого депо. Однак, 10-20 секундні аплікації кофеїну в концентраціях до 40 мМ не призводили до збільшення внутрішньоклітинного кальцію в 90% досліджуваних нейронів (23 з 26), навіть при підвищенній [Ca²⁺]_i. Амплітуди відповідей на парні аплікації гіперкалієвого розчину (50 мМ КСl) в контролі і в розчині, що містить 1мкМ тапсигаргіну, були однаковими. Ці дані дозволяють припустити, що якщо такий запасник і існує в нейронах II-III шарів сенсомоторної кори 14-денних щурів, то його функціональна роль на даному етапі розвитку незначна.

Онтогенетичні зміни механізмів кальцієвої сигналізації в нейронах сенсомоторної кори щурів.

Вхід кальцію по потенціал-керованих каналах плазмалеми. Внесок в кальцієву сигналізацію різних типів каналів може дуже змінюватись в онтогенезі (Kostyuk et al., 1993; Tarasenko et al., 1998). Ми використовували блокатори потенціал-керованих кальцієвих каналів перед та під час прикладення гіперкалієвого розчину. Результати ясно демонструють суттєві відмінності в експресії низькопорогових кальцієвих каналів протягом 3-4 тижнів постнатального розвитку: їх щільність зменшується. Пуринергічна кальцієва сигналізація. Аплікація АТФ в безкальцієвому розчині викликала підвищення [Ca²⁺]_i тільки в 1/3 тестованих нейронів 30-денних щурів (в 15 з 46). Більш того, спустошення внутрішньоклітинних депо відбувалось значно швидше ніж в нейронах 14-денних тварин. В більшості випадків вже друга аплікація АТФ не викликала кальцієвої відповіді.

Якщо досліджуваний нейрон мав метаботропні пуринорецептори, то відносний внесок іонотропних механізмів у відповідь на першу аплікацію АТФ був, як і в нейронах 14-денних щурів, близько 35%, а при послідовних аплікаціях - збільшувався, але не до 65% (як в нейронах молодих тварин), а тільки до 50% (n=13). Це може свідчити про участь ще одного типу внутрішньоклітинного депо в формуванні кальцієвої відповіді при аплікації АТФ. Звичайно, найбільш імовірним “кандидатом” стало кофеїн-чутливе депо.

Кофеїн-чутливе депо. Дійсно, в 28 з 42 досліджених нейронів 30-денних щурів 5-10 секундна аплікація 20 - 40 мМ кофеїну викликала значний [Ca²⁺]_i транзиєнт, практично незмінний в безкальцієвому розчині, але зникаючий в присутності 1 мкМ тапсигаргіну. Спустошення кофеїн-чутливого кальцієвого депо призводило до зменшення амлітуди транзиєнта, викликаного гіперкалієвою деполяризацією на 325% (n=8). Ці дані можуть свідчити про наявність активного механізму CICR при формуванні кальцієвої відповіді в нейронах сенсомоторної кори 30-денних щурів. Амплітуди кофеїн-індукованих кальцієвих відповідей при послідовних аплікаціях, розділених 90-секундними інтервалами, зменшувались повільно: на 7%, 15%, 14% и 25% відповідно (n=12) порівняно з першою. Більш тривала аплікація кофеїну (більше 30-40 секунд) призводила до повного спустошення депо, однак вже після 15 секунд інкубування зрізу в нормальному розчині, амплітуда кальцієвого транзиєнту майже досягала початкового рівня (n=8). Ці дані говорять про те, що в зрілих нейронах кофеїн-чутливі кальцієві депо мають велику ємність і здатні швидко перезаповнюватись (на відміну від IP3-чутливих депо).

Взаємодія кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму в нейронах сенсомоторної кори 21-денних щурів.

В нейронах 30-денних щурів ми рідко могли виявити клітини, що мали б і інозитолтрифосфат-, і кофеїн-чутливе внутрішньоклітинні депо. Крім того, ємність інозитолтрифосфат-чутливого депо була дуже незначною. Саме тому для вивчення взаємодії внутрішньоклітинних кальцієвих запасників ми працювали з клітинами щурів “проміжного” віку (Р21), в яких частіше були представлені обидва типи депо. Довготривала аплікація кофеїну (більше 30 секунд) призводила до повного спустошення відповідного внутрішньоклітинного пула. При цьому амплітуда АТФ-індукованого [Ca²⁺]_i транзиєнта в безкальцієвому розчині зменшувалась на 34%7% (n=8). В той же час, спустошення IP3- чутливого пула призводило до зменшення [Ca²⁺]_i транзиєнта, викликаного аплікацією 40 мМ кофеїну на 62%11% (n=5). Ці результати можуть говорити про те, що в нейронах сенсомоторної кори існує функціональна взаємодія між інозитолтрифосфат- та кальцій-індукованим вивільненням кальцію, але можливо, що вони є двома різними, просторово відокремленими пулами.

В даній роботі проведено дослідження механізмів внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в нейронах II-III шарів сенсомоторної кори щурів in situ, в тонких зрізах мозку. Для вимірювання концентрації [Ca²⁺]_i був використаний неінвазивний метод завантаження нейронів мембранопроникною формою флуоресцентного барвника Fura-2/AM, що дозволило уникнути механічних пошкоджень внутрішньоклітинних органел, які беруть участь в гомеостазі кальцію. Були охарактеризовані основні механізми генерації кальцієвих сигналів в нейронах сенсомоторної кори щурів різних вікових груп, а також показано існування іоно- та метаботропних пуринергічних механізмів збудження в нейронах сенсомоторної кори. Раніше було встановлено, що в ЦНС найбільш поширеними іонотропними пуринорецепторами є Р_2Х2, Р_2Х3, Р_2Х4 та Р_2Х6 типи (Seguela, 1996; Vulchanova et al., 1997). Однак, виявлена нами низька чутливість пуринорецепторів в нейронах 14-денних щурів PPADS, відсутність значної десенситизації може бути пов'язана з активацією головним Р_2Х4 або Р_2Х6 рецепторів. Крім того, таке припущення підтверджується тим, що завдяки їх значній кальцієвій провідності (Buell, 1996), активація саме цих типів рецепторів може викликати значний вхід іонів кальцію.

Концентрація АТФ ЕС₅₀ для нейронів в тонкому зрізі мозку виявилась на порядок більшою ніж для клонованих іонотропних рецепторів. Але вона співпадає з даними, отриманими раніше на багатоклітинних препаратах гладеньких м'язів (Benham, 1987); в культивованих нейронах гіпоталамуса вона сягала близько 300 мкМ (Chen et al., 1994), а ЕС₅₀ АТФ-активованого вхідного стрму в культивованих нейронах гіпокампа - 150 мкМ (Balachandran & Bennett, 1996).

Як відмічалося вище, ряди ефективностей аналогів АТФ вказують на участь переважно Р_2У типу пуринорецепторів, але оскільки майже в 1/3 тестованих клітин ми реєстрували значні аденозин-індуковані кальцієві транзиєнти, можна припустити, що існує субпопуляція нейронів, що мають аденозинові (Р₁) рецептори. Оскільки аденозин діє як інгібуючий нейротрансмітер, викликаючи калієвий струм і гіперполяризуючи мембрану, наявність 2-х типів, Р1 и Р2 рецепторів могло б забезпечити послідовну модуляцію активностей різних вторинних посередників, пов'язаних з одним стимулом - молекулою АТФ.

Досліджувані нейрони неокортексу мали також метаботропні пуринорецептори, активація яких забезпечує формування [Ca²⁺]_i транзиєнтів при відсутності іонів кальцію в зовнішньо-клітинному розчині. Раніше існування таких рецепторів було показано в культивованих нейронах гіпокампа і таламуса (Mironov, 1994), нейронах Пуркин'є мозочка (in situ)(Kirischuk еt al., 1996a), а також ізольованих нейронах задньокорінцевих гангліїв (Svichar et al., 1997a). В усіх цих випадках дія метаботропних пуринорецепторів забезпечувалась роботою ІР3-месенжерної системи. В нейронах сенсомоторної кори щурів АТФ-індуковане вивільнення іонів кальцію здійснювалось також з депо ендоплазматичного ретикулуму (блокувалося тапсигаргіном), тому ми припустили, що в генерації кальцієвої відповіді в безкальцієвому розчині бере участь IP3-чутливе депо. Для більш точної перевірки даного припущення слід було б перевірити вплив інгібіторів фосфоліпази С та IP3 рецепторів.

Метаботропний механізм пуринергічної кальцієвої сигналізації в досліджуваних нейронах виявився не дуже ефективним - при послідовних аплікаціях АТФ в безкальцієвому розчині відповідне депо швидко виснажувалось. Цікаво й те, що в нейронах 14-денних щурів кофеїн-чутливе депо, мабуть, не відіграє суттєвої ролі в мобілізації іонів кальцію при підвищеній [Ca²⁺]_i.

Результати наших досліджень чітко вказують на те, що протягом 3 і 4 тижнів постнатального розвитку нейронів сенсомоторної кори щурів в механізмах кальцієвої сигналізації відбуваються значні зміни. Цей період насправді є дуже критичним для дозрівання клітин неокортексу, формування дендритного дерева і нейрональної мережі (Miller 1988; Juraska & Fifkova, 1979).

Нами було показано, що існують значні зміни в експресії низькопорогових Ni²⁺- чутливих каналів (Т-типу) в процесі розвитку клітин. Це добре співвідноситься з даними, отриманими раніше стосовно вікових змін в експресії потенціал-залежних каналів нейронів зорової кори щурів (Tarasenko et al., 1998), а також нейронах латеродорсального ядра таламусу (Dzhura et al., 1996). Їх активація може бути необхідною для запуску локальних кальцієвих сигналів, пов'язаних з експресією генів, що відповідають за диференціювання та зростання відростків; вони також можуть бути залучені в процес генерації синхронізованих осциляцій [Ca²⁺]i, характерних для раннього періоду постнатального розвитку (Gu & Spitzer, 1995).

Існує значно менше даних про аналогічні вікові обмеження в експресії внутрішньоклітинних механізмів вивільнення кальцію. Раніше в гранулярних нейронах мозочку мишей було показано, що IP3-індуковане вивільнення Са²⁺ може відбуватись при активації метаботропних глутаматних рецепторів тільки на ранній стадії постнатального онтогенезу (6 днів). Пізніше (30 днів) цей механізм мобілізації кальцію повністю зникає (Kirischuk 1996b). В нейронах сенсомоторної кори нами були отримані аналогічні результати, однак, все ж в 1/3 тестованих нейронів 30-денних щурів ми реєстрували активацію метаботропних пуринорецепторів і підвищення [Ca²⁺]_і в безкальцієвому розчині.

Оскільки механізм IP3-чутливого вивільнення кальцію в досліджуваних нейронах виявився доволі слабким, особливо в нейронах дорослих щурів, для тонкої регуляції [Ca²⁺]_i механізм СIСR міг би бути необхідним. Нами була виявлена відсутність кальцієвих транзиєнів при аплікації 20-40 мМ кофеїну в нейронах 14-денних щурів. Чи пов'язано це з відсутністю кофеїн-чутливого депо, якимось його морфологічними особливостями на цьому етапі розвитку клітин, незрозуміло. Але в 70% досліджуваних нейронів 30-денних щурів аплікація кофеїну викликала уже значне підвищення [Ca²⁺]_i, причому в безкальцієвому розчині амплітуда відповіді практично не змінювалась. Ці дані знаходяться у відповідності з результатами імунохімічних досліджень локалізації IP3- і кофеїн-чутливих каналів в мозку щурів. Було виявлено, що в нейронах моторної кори IP3 рецептори знаходяться в сомі і проксимальних дендритах клітин, в той час як ріанодінові рецептори знаходяться переважно в довгих, тонких апікальних дендритах (Sharp, 1993). Відсутність кофеїн-індукованої відповіді в нейронах 14-денних щурів підтверджує те, що на цьому етапі формування дендритного дерева ще не завершено, але в зрілих нейронах 30-денних тварин цей процес закінчено, зформован великий ендоплазматичний ретикулум і кофеїн-чутливе кальцієве депо має значну ємність.

Дані наших експериментів свідчать про неповне спустошення запасів кальцію в ендоплазматичному ретикулумі в нейронах 21-денних щурів при перехресній активації ріанодинових та IP3-рецепторів, що може говорити про існування різних депо для цих двох шляхів вивільнення кальцію і/або їх просторової ізольованості. Цікаво, що в культивованих астроцитах спинного мозку навіть при активації різних типів метаботропних пуринорецепторів (Р_2У и Р_2U) вивільнення кальцію відбувалося також з різних, просторово відокремлених IP3-чутливих пулів (Indestrup & Salter, 1998). В культивованих нейронах гіпокампу і таламусу АТФ- і кофеїн-індуковані кальцієві транзиєнти були незалежними, що свідчило про участь 2 різних кальцієвих депо (Mironov, 1994).

Висновки

1. Результати даного дослідження показали, що онтогенетичний розвиток нейронів II-III шарів сенсомоторної кори щурів призводить до змін механізмів, що беруть участь в кальцієвій сигналізації.

2. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію_, викликане калієвою деполяризацією в зазначених нейронах сенсомоторної кори, відбувається за рахунок активації декількох типів потенціал-керованих Ca²⁺ каналів плазмалеми, причому нейрони 14-денних щурів мають більшу щільність низькопорогових нікель-чутливих кальцієвих каналів ніж 30-денні.

3. В нейронах сенсомоторної кори існує пуринергічна кальцієва сигналізація, причому в формуванні кальцієвих транзиєнтів беруть участь як іонотропні, так і метаботропні пуринорецептори, активація яких викликає внутрішньоклітинне вивільнення кальцію. Метаботропні Р_2У пуринорецептори експресуються в усіх нейронах 14-денних щурів; в той час як в нейронах дорослих щурів - тільки в 1/3 досліджуваних клітин.

4. В переважній більшості досліджуваних нейронів кори 14-денних щурів відсутній механізм кальцій-індукованого вивільнення кальцію з кофеїн-чутливого депо, однак, в нейронах 30-денних тварин це депо вже відіграє значну роль у внутрішньоклітинній кальцієвій сигналізації.

5. Таким чином, в ранньому періоді розвитку суттєвий внесок в формування кальцієвих транзиєнтів, необхідних для розвитку і диференціювання, вносять низькопорогові канали, а також система внутрішньоклітинного вивільнення кальцію, представлена IP3-чутливим депо ендоплазматичного ретикулуму. Механізм кальцій-індукованого вивільнення кальцію пов'язаний з розвитком дендритного дерева і, напевно, має значення для сигнальної функції дозрілих нейронів.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації

1. U.V. Lalo, I.A. Kruglikov, N.V. Voitenko (1997) ATP-induced calcium signalling in neocortical neurons in slices. Neurophysiology 29(4/5), 370.

2. У.В. Лало, Н.В. Войтенко, П.Г. Костюк (1998) Іоно- та метаботропно-індуковані кальцієві сигнали в нейронах неокортексу щурів. Фізіологічний журнал 44 (3), 8.

3. U. Lalo, N. Voitenko, P. Kostyuk (1998) Iono- and metabotropically induced рurinergic calcium signalling in rat neocortical neurons. Brain Research 799(2), 285-291;

4. U. Lalo & P. Kostyuk (1998) Developmental changes in purinergic calcium signalling in rat neocortical neurons. Developmental Brain Research 111(1), 43-50;

5. Лало У., Костюк П. (1998) Зменшення АТФ-індукованої метаботропної кальцієвої відповіді в нейронах неокортексу щурів, викликане спустошенням кофеїнчутливого кальцієвого депо. Нейрофизиология/Neurophysiology 30 (4/5), 353-356;

6. Костюк О., Лало У., Костюк П. (1998) Кальцієва сигналізація в кортикальних та таламічних нейронах щурів із стептозотоциніндукованим діабетом. Нейрофизиология/Neurophysiology 30 (4/5), 357-360.

Размещено на Allbest.ru