Особливості фізіологічної та мембранотропної дії біологічно активного комплексу фосфоліпідів з гідробіонтів

Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

03.00. 04 - Біохімія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості фізіологічної та мембранотропної дії біологічно активного комплексу фосфоліпідів з гідробіонтів

Шахман Олена Василівна

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, член-кор. НАН України

Донченко Георгій Вікторович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу біохімії коферментів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст.наук.співр.

Малишева Маргарита Костянтинівна,

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідувач відділу нейрохімії;

кандидат біологічних наук

Клімашевський Віталій Мар'янович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

ст. наук. співр. відділу біохімії ліпідів.

Провідна установа - Київський університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії.

Захист відбудеться “22” лютого 1999 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “21” січня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

Размещено на http://www.allbest.ru

Актуальність теми. За останні роки увага дослідників звернена до питання застосування фосфоліпідів та поліненасичених жирних кислот, як лікувальних препаратів широкого спектру біологічної дії, що виявляють ефект при різних інтоксикаціях у печінці, ендокринних розладах та серцево-судинних захворюваннях [Patel J.M., 1993].Останнім часом зроблено великий крок у розшифруванні значення ліпідних компонентів мембран, які виконують не лише структурну роль, але й беруть участь у ключових процесах передачі регуляторних сигналів, регуляції активності мембранозв'язаних ферментів. Адаптогенний характер при екстремальних ситуаціях та патологічних станах має зміна рівня фосфоліпідів, що пов'язані із змінами процесу їх синтезу та обміну речовин. Фосфоліпіди, як поверхнево-активні речовини, відіграють важливу роль у забезпеченні респіраторної функції та захисті легень від контакту з різними мікрочастками та з мікроорганізмами [Верболович В.П., 1983]. Біологічні мембрани тканин з різною функцією мають у своєму складі фосфоліпіди з певними варіантами жирнокислотних залишків. Від жирнокислотного складу фосфоліпідів залежить їх метаболічна активність, а також щільність або рідинність мембран [Правдина И.М., 1975]. На відміну від ссавців ліпіди морських організмів багаті полієновими жирними кислотами, особливо омега - ненасиченими ейкозапентаєновою та докозагексаєновою кислотами [Metzman M.S., 1978]. Питання про біологічні властивості, специфічну фізіологічну активність фосфоліпідів з морських організмів та механізм обміну в мембранах клітин не достатньо з'ясовано. Різноманітний жирнокислотний склад фосфоліпідів обумовлює існування різних пулів фосфоліпідів одного виду, що спричиняє виконання ними різних функцій -- від структурних та антиоксидантних до функцій регуляції активності ферментів, транспорту, передачі сигналів, - всіх процесів, які перебігають на рівні мембран. Тому вивчення біологічних властивостей, специфічної фізіологічної дії фосфоліпідів з морських організмів та їх регуляторної ролі в мембранах тканин організму визначає актуальність роботи у цьому напрямку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Проведені дослідження є органічною складовою частиною наукового напрямку роботи лабораторії технології біопрепаратів відділу коферментів Інституту біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України. Окремі розділи роботи виконувались згідно з планами науково-дослідних робіт по темах: “Розробка технології одержання із морських організмів фізіологічно активних сполук специфічної дії для потреб медицини” (НДР № державного реєстру ИА 01007145 р.), “Вивчення взаємозв'язку природних антиоксидантів та фосфоліпідів в регуляції структурно-функціонального стану мембран клітин з різною функцією” та науково-дослідних робіт, які одержали приоритетне фінансування за підсумками республіканських конкурсів: “Розробка нового засобу на основі фосфоліпідів з морських організмів, що має мембраностабілізуючі, антиоксидантні і сурфактантні властивості, впливаючого на обмінні та репаративний процеси”, “Регуляторний механізм обміну фосфоліпідів у мембранах клітин печінки і легень та роль природних антиоксидантів в регуляції структурної і функціональної організації мембран”, “Функціональні зміни репродуктивних та дихальних органів тварин під впливом малих доз радіації та розробка нових ефективних засобів відновлення змінених функцій за допомогою специфічних біорадіопротекторів з молюсків”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення хімічного складу, специфічної фізіологічної активності, біологічних властивостей комплексу “морських” фосфоліпідів, що були виділені з молюсків, та вивчення їх обміну у мембранах клітин для створення природного ефективного профілактичного та лікувального засобу ліпідної природи з гідробіонтів.

Віповідно до основної мети в роботі вирішувались наступні завдання:

Вивчити хімічний склад природного комплексу фосфоліпідів, отриманого з гонад головоногих молюсків, та визначити кількісний та якісний вміст фосфоліпідів, жирних кислот і амінокислот.

Дослідити біологічні властивості та специфічну фізіологічну дію біопрепарату, створеного на основі комплексу “морських“ фосфоліпідів.

Вивчити антиоксидантні властивості комплексу фосфоліпідів in vitro та in vivo та його вплив на систему антиоксидантного захисту організму.

Дослідити роль “морських” фосфоліпідів у модуляції структурно-функціонального стану мембран клітин тварин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було вивчено чімічний склад комплексу фосфоліпідів з гонад головоногих молюсків і показано, що їх головна відмінність від фосфоліпідів ссавців полягає в особливостях жирнокислотного складу. На основі “морських” фосфоліпідів вперше створено та охарактеризовано новий ефективний, природний, лікувально-профілактичний засіб - біопрепарат “Кальмофіл”, встановлено його сурфактантну, антиоксидантну та мембраностабілізуючу дію. Виявлено, що мембранотропна дія фосфоліпідів з гідробіонтів пов'язана з регуляцією структурно-функціонального стану мембран і що даний фосфоліпідний комплекс має широкий спектр фізіологічної та фармакологічної активності.

Практичне значення отриманих результатів. Базуючись на наведених експериментальних даних, виявлено, що досліджуваний препарат “Кальмофіл” є ефективним у лікуванні ряду експериментальних патологій: він запобігає розвитку набряку легень, коригує недостатність сурфактанту та поліпшує стан

печінки при токсичному гепатиті. Показано його антиоксидантні властивості, здатність впливати на активність антиоксидантних ферментів у тканинах з різною функцією, нормалізувати фосфоліпідний склад мікросомальних мембран, змінювати склад жирних кислот мембранних фосфоліпідів. Запропоновано застосування препарату з “морських” фосфоліпідів для лікування та профілактики хвороб, які супроводжуються окислювальним стресом.

Одержано "Методику державних випробувань” та “Настанову” для застосування препарату у ветеринарії під назвою “Морефіл”.

Для розробки медичного засобу “Кальмофіл” складено документи доклінічних випробувань для представлення у фармакологічний комітет МОЗ України. фосфоліпід гідробіонт молюск антиоксидантний

Особистий внесок здобувачки полягає у виконанні експериментальної частини роботи, підборі та обробці літературних даних. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на засіданнях відділу біохімії коферментів, наукових семінарах Інституту біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, V Міжнародній конференції “Биоантиоксидант”.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті та 1 тези доповіді.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, висновків і списку літератури з 292 найменувань. Робота викладена на 120 сторінках основного тексту, ілюстрована 5 рисунками і 17 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Фосфоліпідний комплекс із головоногих молюсків отримували за методом Даценко З.М. та ін. (Авт. Свід 1175486 СССР А 61К 37/22).

Експерименти проводилися на щурах-самцях лінії Вістар вагою 120-150 г, які перебували на стандартному раціоні годівлі та на Е-авітамінозній дієті. Об'єктом досліджень служила печінка та легені.

Експериментальний Е-гіповітаміноз у щурів моделювали, утримуючи їх з чотиритижневого віку на напівштучній дієті без вітаміну Е протягом 4 місяців за методом В.Б. Спиричева та ін. (1979). Для корекції Е-гіповітамінозного стану щурів одній групі вводили перорально по 2 мг вітаміну Е у вигляді олійного розчину на 100 г маси тіла тварини на добу протягом двох тижнів, іншій групі - протягом такого ж часу внутрішньоочеревинно вводили “Кальмофіл” по 50 мг на 100 г маси тіла на добу у вигляді емульсії у фізіологічному розчині, продовжуючи утримувати щурів на Е-авітамінозній дієті.

Інтоксикацію CCl 4 у щурів моделювали:

1) для досліду з хронічним ССl4-індукованим гепатитом - шляхом внутрішньом'язевого введення 50% олійного розчину ССl4 з розрахунку 0,4 мл/100 г маси тварини (ЛД50) протягом 4 діб. Коригуючий вплив “Кальмофілу” вивчали при його внутрішньоочеревинному введенні 10 мг/100 г маси тіла тварини починаючи з 4 до 12 доби;

2) для досліду з гострим ССl4-індукованим гепатитом - шляхом одноразового внутрішньоочеревинного введення 50% олійного розчину ССl4 з розрахунку 0,2 мл/100 г маси тварини (ЛД25), іншій групі одночасно з ССl4 вводили у такий же спосіб по 50 мг 50% олійного розчину “Кальмофілу” на 100 г маси тіла. Контрольній групі тварин вводили такий же об'єм олії.

Ліпідні екстракти отримували за методом L.Folch et al. (1957). Холестерин визначали за методом К.И.Розенцвейга (1962), вміст фосфоліпідів у ліпідних екстрактах за методом P.S.Chen (1956), вміст індивідуальних фосфоліпідів визначали за кількістю неорганічного фосфору за допомогою молібдатного реагенту за методом V.E. Vaskovsky (1975), вміст вуглеводів за методом R.J.Dimler (1952), вміст загального азоту за методом Д.Л.Фердмана (1957).

Хроматографічне розділення індивідуальних фосфоліпідів проводили за методом двовимірної тонкошарової хроматографії на платівках з силікагелем КСК-2 та платівках Sorbfil (СРСР). При розгонці у першому напрямку використовували систему хлороформ:метанол:бензол:28% аміак (65:30:10:6-8), а в другому - хлороформ:метанол:бензол:ацетон:льодова оцтова кислота (70:30:10:5:4:1) (V.I. Svetashev; V.E. Vaskovsky, 1972).

Ідентифікацію фосфоліпідів проводили за допомогою специфічних реакцій на їх функціональні групи (М. Кейтс, 1975; V.E. Vaskovsky, N.A. Latyshev, 1975; C.M. van Gert et al., 1973).

Вміст жирних кислот визначали хроматографічним методом за допомогою газо-рідинного хроматографа “Carlo Erba” (Italy) з попереднім метилюванням зразків (J.P. Carreau, J.P.Dubaco, 1978). Для кількісного аналізу метилових ефірів жирних кислот використовували набивні колонки розміром 3,5м х 3 мм. Як носій застосовували Chromatron NAW-DMSC із 7,5% нанесеною фазою Silar-5 СР (Serva, Германія). Відсотковий вміст жирних кислот в екстракті розраховували за площею піків.

Поверхневий натяг визначали за методом втягнутої сили пластинки за допомогою вертикальних терезів Вільгельма за методом А.А Биркун (1981).

Сурфактанти легень кролів та щурів одержували за методом R.H. Notter et al. (1983). Мікросоми тканин щурів виділяли за методом J.B. Shenkman et al. (1974). Вміст загального білку визначали за методом O.H. Lowry, et al. (1951). Супероксиддисмутазну фракцію отримували на основі методів J.M. Cord, I. Fridovich et al. (1969), B.B. Keele et al. (1971) у модифікації для мікросом.

Визначення активності супероксиддисмутази (СОД) мікросом проводили за методом Marklund S. еt al. (1974). Активність каталази визначали за методом М.А. Королюк та інш. (1988). Інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) вивчали по накопиченню малонового діальдегіду (МДА) за методами Ю.А. Владимирова та інш. (1972), І.Д. Стальной (1977), та по утворенню дієнових кон'югатів (ДК) за методом Ю.А. Владимирова та інш. (1972) та И.Р. Бияшевой та інш. (1991).

Результати дослідів оброблені статистично з використанням t-критерія Ст'юдента по И.А.Ойвину (1960). Вірогідними вважали результати при p0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

1. Вивчення хімічного складу фосфоліпідного комплексу з гонад молюсків

Таблиця 1.1.

Хімічний склад фосфоліпідного комплексу, виділеного з гонад головоногих молюсків.

Речовини	% від загальної кількості
Фосфоліпіди	75,0 - 85,0
Загальний холестерин	2,0 - 5,0
Вільні жирні кислоти	0,1 - 2,8
Вуглеводи	0,1 - 0,3
Пептиди	0,1 - 0,5
Білок	-
Індивідуальні фосфоліпіди :
Фосфатидилхолін	72,0 - 87,0
Фосфатидилетаноламін	7,0 - 12,0
Сфінгомієлін	7,0 - 9,0
Дифосфатидилгліцерин	0,4 - 0,8
Фосфатидилінозитол	1,5 - 2,2
Фосфатидилсерин	0,6 - 1,2

Примітка. У таблиці наведено узагальнені дані хімічного складу фосфоліпідних комплексів з гідробіонтів, що були отримані з різної сировини.

Результати досліджень хімічного складу фосфоліпідного комплексу, отриманого із гонад головоногих молюсків, свідчать, що до його складу входить до 80% фосфоліпідів, незначна кількість холестерину, вільних жирних кислот, вуглеводів, амінокислот, пептидів та слідові залишки вітаміну Е (табл.1.1).

Серед фосфоліпідів 70% становить фосфатидилхолін та у значно меншій кількості фосфатидилетаноламін, сфінгомієлін, фосфатидилінозитол, фосфати-дилсерин, фосфатидилдигліцерин.

При порівняльному дослідженні фосфоліпідного комплексу, отриманого з гідробіонтів, фосфоліпідів курячих яєць та різних тканин ссавців, виявлено, що “морські” фосфоліпіди крім основних жирних кислот, які характерні для всіх тварин, тобто пальмітинової (С 16:0), стеаринової (С 18:0), олеїнової (С 18:1), містять такі життєво необхідні кислоти, як ліноленова (С 18:3) та значну кількість біологічно активних жирних кислот- арахідонову (С 20:4), ейкозапентаєнову (С 20:5), докозагексаєнову (С 22:6), які у складі фосфоліпідів іншого походження містяться у слідових кількостях, або зовсім відсутні (табл.1.2).

Таблиця 1.2

Відсоткове співвідношення метилових ефірів жирних кислот у складі фосфоліпідів із різних джерел.

Жирні кислоти	Гонади кальмара	Яйця курячі	Серце тварин	Печінка тварин	Мозок тварин
С 16 : 0	48,4	33,9	22,7	13,4	29,8
С 16 : 1	0,7	1,0	-	-	1,1
С 18 : 0	6,5	10,5	5,7	22,3	14,1
С 18 : 1	9,8	31,1	14,5	11,3	30,3
С 18 : 2	0,5	17,7	39,8	14,5	9,2
С 18 : 3	10,6	-	-	-	-
С 20 : 0	-	-	-	-	-
С 20 : 1	-	-	-	-	-
С 20 : 2	-	-	-	-	-
С 20 : 3	-	-	3,5	6,3	-
С 20 : 4	1,5	3,1	7,6	15,7	6,1
С 20 : 5	4,5	-	-	-	-
С 22 : 0	0,9	-	-	-	-
С 22 : 5	3,0	-	-	-	-
С 22 : 6	12,3	-	-	4,0	2,6

Примітка. Дані складу ЖК з курячих яєць, тканин серця, печінки та мозку тварин взяті з літератури (Л.Д.Бергельсон; “Avanti” Polar Lipids,1995).

2. Сурфактантно-подібні властивості фосфоліпідного комплексу із гонад кальмарів

Виявлено подібність хімічного складу фосфоліпідного комплексу із гонад молюсків і сурфактантів легень ссавців, у якому фосфоліпіди також складають до 80% поряд з незначною кількістю холестерину, вільних жирних кислот, вуглеводів, пептидів. Серед фосфоліпідів у обох випадках переважає фосфатидилхолін (табл.2.1).

При вивченні біологічних властивостей “морських” фосфоліпідів виявлено, що комплекс, виділений з гонад головоногих молюсків, проявляє поверхневу активність, як і сурфактант легень тварин. Мінімальний поверхневий натяг препарату та сурфактанта щура становив 11,70,8 та 10,30,6 відповідно, а максимальний - 46,50,8 та 42,30,2.

При інгаляційному застосуванні препарату “Кальмофіл” на основі “морських” фосфоліпідів з молюсків при інтоксикації тварин аміаком, бензином, мепротаном виявлено позитивний вплив на загальний стан тварин та на їх виживання, а також, зокрема, на нормалізацію порушених функцій легень, - зниження інтенсивності процесу піноутворення, нормалізацію клітинної реакції сурфактанту легень, полегшення ходу токсичного процесу, як показано у табл.2.2., що свідчить про сурфактантноподібні властивості препарату.

Таблиця 2.2.

Стан поверхнево-активних властивостей легень досліджуваних тварин.

Інтоксика- ція	Контроль	Середня летальна концентрація речовини	Середня летальна концентрація + “Кальмофіл”
	Пов. натяг Ч10-3 н/м	Макрофа-ги у 10-3 мл	Пов. натяг Ч10-3 н/м	Макрофаги у 10-3 мл	Пов. натяг Ч10-3 н/м	Макрофаги у 10-3 мл
Норма	15,20±0,6	40,1±0,3
Мепротан	-	-	7,8±1,7	54,9±0,7	14,7±0,5	42,2±2,7
Аміак	-	-	6,4±0,9	51,3±1,6	13,8±0,6	42,0±0,9
Бензин	-	-	8,20±1,02	49,9±0,5	15,8±0,3	47,6±0,8

3. Антиоксидантні властивості “морських” фосфоліпідів

При дослідженні антиоксидантних властивостей препарату “Кальмофіл” у порівнянні із загальновідомим антиоксидантом вітаміном Е у дослідах in vitro виявлена дозозалежна здатність препарату гальмувати ПОЛ (табл.3.1).

Таблиця 3.1

Накопичення МДА у гомогенаті печінки щурів в процесі спонтанного ПОЛ при додаванні окремо вітаміну Е та препарату “Кальмофіл” в дослідах in vitro (n=7, M±m).

Доза препаратів у пробі (мкг/за 60 хв.)	Вміст МДА (нмоль/мг білка)	Гальмування ПОЛ препаратами (%).
	Вітамін Е	“Кальмофіл”	Вітамін Е	“Кальмофіл”
Контроль	0,47±0,15	0
3	0,45±0,01	0,47±0,02	1	0
5	0,45±0,01	0,47±0,01	1	0
20	0,42±0,05	0,44±0,12	7	2
30	0,40±0,06	0,44±0,14	10	3
40	0,37±0,03	0,43±0,40	20	4
50	0,27±0,01	0,44±0,09	40	4
100	0,24±0,01	0,38±0,01	50	20
200	0,14±0,02	0,33±0,02	70	30
500	0,04±0,01*	0,21±0,06	92	45
1000	0,04±0,02*	0,16±0,03*	92	65

Примітка. * - відмінності, вірогідні у порівнянні з контролем (р<0,05).

Антиоксидантній дії 100 мкг вітаміну Е, тобто пригніченню ПОЛ на 50%, відповідає кількість препарату, що дорівнює 500 мкг.

При підвищенні показників окислювального стресу, МДА та ДК, у мембранах мікросом печінки та легень щурів з патологією, обумовленою недостачею природного антиоксиданта вітаміна Е (експериментального Е-гіповітамінозу), виявлено здатність “Кальмофілу” нормалізувати ці показники (табл.3.2). Причому виявлено, що в мембранах мікросом печінки за Е-гіповітамінозу інтенсивність процесів ПОЛ збільшується значно більше, ніж у мембранах мікросом тканини легень, та встановлено більш виражений вплив фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів на зниження окислювального стресу, обумовленого недостачею природного антиоксиданту, вітаміну Е, у мембранах мікросом печінки щурів.

Таблиця 3.2

Накопичення продуктів ПОЛ у мікросомальних фракціях легень та печінки щурів при експериментальному Е-гіповітамінозі та при введенні вітаміну Е і препарату “Кальмофіл” у дослідах in vivo (n=7, M±m).

Умови досліду	Кількість МДА (мкмоль/мг білка)	Кількість ДК (мкмоль/мг білка)
Мікросоми легень
Норма	0,33±0,01	6,00±0,27
Е-гіповітаміноз	0,58±0,06*	7,64±0,32*
Е-гіповітаміноз+вітамін Е	0,46±0,02*	5,67±0,50**
Е-гіповітаміноз+“Кальмофіл”	0,43±0,02***	4,97±0,60***
Мікросоми печінки
Норма	1,80±0,02	2,50±0,31*
Е-гіповітаміноз	3,90±0,64**	11,06±0,13
Е-гіповітаміноз+вітамін Е	0,61±0,11***	8,80±0,30***
Е-гіповітаміноз+“Кальмофіл”	0,35±0,01**	5,39±0,51**

Примітки.*- відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **- для нормальної групи і групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05); ***- для групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05).

“Кальмофіл” здатен також впливати на активність ферментів системи антиоксидантного захисту (СОД та каталази) мембран мікросом тканин легень та печінки щурів за умов Е-гіповітамінозу, як видно з табл.3.3.

Ці дані демонструють здатність “морських” фосфоліпідів коригувати гомеостаз різних тканин (легень та печінки) на рівні клітинних мембран шляхом стимуляції системи їх антиоксидантного захисту, а саме активностей антиоксидантних ферментів СОД та каталази.

Таблиця 3.3.

Активність ферментів антиоксидантної системи захисту в мікросомальних фракціях тканин легень та печінки щурів при експериментальному Е-гіповітамінозі та при введенні in vivo вітаміну Е і препарату “Кальмофіл” (n=7, M±m).

Умови досліду	Активність СОД (ум.од/мг білка)	Активність каталази (кат/мг білка)
Мікросоми легень
Норма	13,0±0,52	4,70±0,29
Е-гіповітаміноз	7,92±1,22*	3,15±0,35
Е-гіповітаміноз+вітамін Е	12,00±0,20**	8,8±1,31**
Е-гіповітаміноз+“Кальмофіл”	10,30±0,72**	5,49±0,45**
Мікросоми печінки
Норма	7,90±0,95	10,8±1,29
Е-гіповітаміноз	5,43±1,00	16,50±0,78*
Е-гіповітаміноз+ вітамін Е	8,60±3,17	15,75±0,56
Е-гіповітаміноз +“Кальмофіл”	11,10±1,48**	15,51±0,65*

* - відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **- для групи з Е-гіповітамінозом (р<0,05).

4. Вплив фосфоліпідного комплексу з морських організмів на корекцію складу фосфоліпідів мембран мікросом в умовах патологічного стану



Рис.4.1. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом легень щурів (n=5, M ±m); зліва направо: 1- контроль; 2- Е-гіповітаміноз; 3- Е-гіповітаміноз+вітамін Е; 4- Е-гіповітаміноз+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).

Виявлено мембраностабілізуючий вплив “Кальмофілу” у дослідах in vivo по корекції фосфоліпідного спектру мембран мікросом печінки та легень щурів, порушеного як за умов Е-гіповітамінозу, так і інтоксикації ССl4. Як показано на рис4.1, рис.4.2 та рис.4.3, введення “морських” фосфоліпідів майже у 2 рази знижувало вміст лізоформ фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну мембран мікросом обох тканин, який значно зростав за умов Е-гіповітамінозу та ССl4 - інтоксикації і є, як відомо, одним з показників патології.



Рис. 4.2. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом печінки щурів (n=5, M±m); зліва направо: 1-контроль; 2- Е-гіповітаміноз; 3- Е-гіповітаміноз+вітамін Е; 4- Е-гіповітаміноз+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).

Рис. 4.3. Відсотковий вміст фосфоліпідів у мембранах мікросом печінки щурів при інтоксикації CCl4 (n=5, M±m); зліва направо: 1- контроль; 2- CCl4; 3-+CCl4 вітамін Е; 4- CCl4+”Кальмофіл” (*-відмінності вірогідні, р<0,05).

Після терапії Е-гіповітамінозу щурів “Кальмофілом” виявлено тенденцію до зростання, а при терапії інтоксикованих тварин CCl4,- вірогідне зростання кількості фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну у мембранах мікросом тканин легень та печінки, кількість яких зменшувалась за патології. Встановлено також нормалізацію відсоткового вмісту інших фосфоліпідів: сфінгомієліну, фосфатидилсерину, дифосфатидилгліцерину та фосфатидил-гліцерину, який порушувався у мембранах мікросом при нестачі вітаміну Е чи інтоксикації ССl4.

Нормалізуючий вплив “Кальмофілу” на жирнокислотний склад фосфоліпідів мембран мікросом печінки продемонстровано при інтоксикації тварин ССl4 (табл.4.3).

Таблиця 4.3.

Вміст жирних кислот у мембранах мікросом печінки після дії ССl4 та на його фоні препарату “Кальмофіл” (n=5, M±m).

Умови досліду	Жирні кислоти (% від суми)
	С 16:0	С 18:0	С 18:1	С 18:2	С 20:4	С 20:5	С 22:6
Норма	22,32± 0,11	21,75± 0,32	13,58± 0,34	12,74± 0,40	15,4± 0,32	-	1,57± 0,16
ССl4	22,92± 0,51	23,94± 1,59	9,88± 0,62*	11,82± 0,47	21,3± 0,63*	-	1,82± 0,13
ССl4+”Каль-мофіл”	26,94± 0,56***	27,54± 1,29*	16,3± 0,89***	19,24± 0,44***	11,16± 0,63***	0,42± 0,01	2,32± 0,24*

*-відмінності вірогідні у порівнянні з показниками, характерними для нормальної групи (р<0,05); **-для групи з ССl4 (р<0,05); ***-для нормальної групи і групи з ССl4 (р<0,05).

Введення щурам ССl4 призводить до підвищення вмісту у фосфоліпідах мікросом печінки стеаринової і арахідонової кислоти та зниження олеїнової та лінолевої кислоти, а введення “Кальмофілу” наближає ці показники до норми.

Таким чином досліджено склад фосфоліпідного комплексу з головоногих молюсків, показано його подібність до складу фосфоліпідів мікросомальних мембран печінки та сурфактанту легень тварин. Встановлено, що в умовах окислювального стресу (Е-гіповітамінозу та інтоксикації ССl4) в організмі комплекс природних фосфоліпідів з гідробіонтів забезпечує здатність організму регулювати окислювальний гомеостаз за рахунок: 1) відновлення активності антиоксидантних ферментів; 2) якісних та кількісних змін мембранних ліпідів; 3) властивостей фосфоліпідів синергічно підсилювати антиоксидантний потенціал організму.

Окрім впливу цього комплексу на систему антиоксидантного захисту в тканинах тварин, яка подібна до дії вітаміну Е, виявлено також його мембранокоректорну дію, яка дає змогу реконструвати пошкоджені за патологічних умов компоненти мембран на рівні їх фосфоліпідного та жирнокислотного складу. Це стало передумовою для рекомендації щодо використання фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів як нового ефективного препарату в медицині та ветеринарії.

ВИСНОВКИ

Встановлено, що морські головоногі молюски є цінною сировиною для одержання фосфоліпідного комплексу для створення нових біологічно активних препаратів. Досліджено біохімічний склад одержаного комплексу, на основі якого створено препарат “Кальмофіл”.

Препарат “Кальмофіл” на 80% складається з фосфоліпідів, де основним компонентом є фосфатидилхолін, у структурі якого є щ-поліненасичені довголанцюгові жирні кислоти С 20:5, С 22:6.

Показано, що препарат “Кальмофіл” є поверхнево-активним, подібним за біохімічним складом та фізіологічною дією до сурфактанту легень ссавців і сприяє нормалізації функцій легень тварин у разі токсичного впливу аміаку, бензолу, мепротану.

Досліджено антиоксидантні властивості препарату з гідробіонтів на мембранах мікросом печінки та легень. Встановлено пряму антиоксидантну дію препарату in vivo та in vitro і його стимулюючий вплив на ферментативну систему антиоксидантного захисту організму, а саме на активність супероксиддисмутази та каталази.

Показано, що препарат “Кальмофіл” має мембраностабілізуючий ефект, спрямований на відтворення нормального фосфоліпідного та жирнокислотного складу мембран мікросом при штучній інтоксикації ССl4, в умовах окислювального стресу (Е-гіповітамінозу).

Розроблено теоретичне обгрунтування та методичні умови для застосування препарту “Кальмофіл” як лікувального заходу в комплексній терапії захворювань легень, печінки при інтоксикаціях та інших патологіях, які супроводжуються окислювальним стресом і порушенням системи антиоксидантного захисту організму.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шахман О.В., Даценко З.М., Шумейко В.Н. Антиоксидантное действие фосфолипидного комплекса, выделенного из морских организмов // Укр. биохим. журн.-1994.-т.66, №4.-С.87-95.

2. Шахман Е.В., Донченко Г.В., Даценко З.М., Оценка активности супероксиддисмутазы в микросомах различных тканей крыс при Е-недостаточности // Укр. биохим. журн.-1995.-т.67, №6.-С.88-92.

3. Даценко З.М., Донченко Г.В., Шахман Е.В., Губченко К.М., Хмель Т.О. Роль фосфоліпідів у мембранах функціонально різних клітин за порушення антиоксидантної системи // Укр. биохим. журн.-1996.-т.68, №1.-С.49-54.

4. Даценко З.М., Шахман Е.В., Битютская О.В., Кривенко Е.Н. Влияние фосфолипидов из морских организмов на обмен липидов микросомальных мембран при нарушениях антиоксидантной системы организма // Материалы тезисов V Международной конференции “Биоантиоксидант”.-Москва, - 1998.-С.-36.

АНОТАЦІЯ

Шахман О.В. Особливості фізіологічної та мембранотропної дії біологічно активного фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04-біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено питанням фізіологічної та мембранотропної дії фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів .

Досліджено хімічний склад та біологічну активність фосфоліпідного комплексу з гонад головоногих молюсків. Виявлено, що комплекс складається з есенціальних фосфоліпідів, що містять значну кількість біологічно активних жирних кислот - ейкозапентаєнової та докозагекса-єнової. Вони обумовлюють значні поверхнево-активні властивості комплексу, які подібні до сурфактанту легень ссавців. Показано антиоксидантну дію комплексу і його стимулюючий вплив на ферментативну та неферментативну систему антиоксидантного захисту організму ссавців. Припускається, що механізм коригуючої дії фосфоліпідного комплексу з гідробіонтів обумовлений вмістом у його складі значної кількості поліненасичених жирних кислот.

Внаслідок проведених досліджень зроблено висновок про доцільність використання препарату “морських” фосфоліпідів з метою корекції метабо-лічних порушень, які супроводжуються окислювальним стресом, порушенням системи антиоксидантного захисту організму, детоксикаційних, імунозахисних механізмів та регулюючих функцій організму.

Ключові слова: фосфоліпіди, поліненасичені жирні кислоти, сурфактант, антиоксиданти.

АННОТАЦИЯ

Шахман Е.В. Особенности физиологического и мембранотропного действия биологически активного фосфолипидного комплекса из гидробионтов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам особенностей физиологического и мембранотропного действия фосфолипидного комплекса из гидробионтов.

Исследован химический состав и биологическая активность фосфолипидного комплекса из гонад головоногих моллюсков. Установлено, что комплекс состоит из эссенциальных фосфолипидов, которые содержат значительное количество биологически активных жирных кислот - эйкозапентаеновой и докозагексаеновой. Среди фосфолипидов 70% составляет фосфатидилхолин, который вместе со значительно меньшим количеством других фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидил-инозитол, фосфатидил-серин, фосфатидилглицерид), обусловливает поверхностно-активные свойства комплекса, подобные сурфактанту легких млекопитающих. При ингаляционном применении фосфолипидного комплекса (препарат "Кальмофил") после интоксикации животных аммиаком, бензином, мепротаном обнаружена нормализация нарушенных дисфункций легких: снижение интенсивности процесса пенообразования, нормализацию клеточной реакции сурфактанта легких, уменьшение токсического процесса, - что свидетельствует о сурфактантных свойствах препарата.

Показано антиоксидантное действие комплекса и его стимулирующее влияние на ферментативную и неферментативную систему антиоксидантной защиты организма млекопитающих. При изучении влияния фосфолипидного комплекса на микросомальные мембраны тканей печени и легких в условиях дефицита природного антиоксиданта витамина Е, установлено его антиоксидантное действие по уменьшению образования продуктов ПОЛ, а также его стимулирующее влияние на повышение активности антиокси-дантных ферментов супероксиддисмутазы и каталазы.

Установлено, что положительное влияние препарата "Кальмофил" на мембраны различных тканей в условиях окислительного стресса усиливается наличием свободных ненасыщенных жирных кислот и полиненасыщенных эйкозаноидов в составе препарата. Кроме антиоксидантных и гепатопротектор-ных свойств показано, что препарат "Кальмофил" проявляет мембраностаби-лизирующие свойства, направленные на нормализацию фосфолипидного спектра в условиях окислительного стресса, уменьшая количество лизоформ фосфолипидов, повышая уровень фосфатидилхолина и фосфатидил-этаноламина, а также восстанавливая состав жирных кислот мембран.

Предполагается, что механизм корригирующего действия фосфолипидного комплекса из гидробионтов обусловлен содержанием в его составе значительного количества полиненасыщенных жирных кислот.

Вышеуказанные свойства фосфолипидного комплекса из морских организмов проявляются благодаря их уникальному составу, где основным компонентом является фосфатидилхолин, в структуре которого преобладают полиненасыщенные жирные кислоты, а также содержится незначительное количество свободных жирных кислот, холестерин, витамин Е, короткоцепо-чечные пептиды.

Вследствие проведенных исследований сделан вывод о целесообразности использования препарата “морских“ фосфолипидов для коррекции метабо-лических нарушений, которые сопровождаются окислительным стрессом, нарушением системы антиоксидантной защиты организма, детоксикационных и иммунозащитных механизмов. Созданы теоретические предпосылки и методические условия для применения препарата "Кальмофил" как лечебного средства в комплексной терапии заболеваний печени, легких, токсических и других патологий, которые сопровождаются нарушением системы антиоксидантной защиты организма.

Ключевые слова: фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты, сурфактант, антиоксиданты.

SUMMARY

Shakhman O.V. Specificities of physiological and membranotropic effects of biologically active phospholipid complex of the hydrobionts origin. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry.- A.V. Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The thesis is devoted to the peculiarities of the physiological and membranetropic action of phospholipid complex from hydrobionts. The chemical composition and biological activity of the phospholipid complex from the marine mollusca honades have been observed. It has been shown that the complex consists of essential phospholipids, which have a great number of biologically active fatty acids - eicosapentaenoic and docosahexaenoic. They cause the considerable surface-active peculiarities of this complex, which are similar to the mammals lung surfactant. The antioxidant action of the complex and its stimulating effect on the enzymatic and non-enzymatic systems of the mammals organism antioxidant protection have been shown. The hydrobionts phospholipid complex corrective effect affected by the considerable content of polyunsaturated fatty acids was suggested.

The necessity of usage of “marine” phospholipids preparation in order to the correction of metabolic disoders associated with oxidative stress, alteration of antioxidant system, detoxication and immunoprotection was concluded.

Key words : phospholipids, unsaturated fatty acids, surfactant, antioxidants.

Размещено на Allbest.ru