Розробка та впровадження способу одержання нейстонних біопрепаратів за допомогою флотації

Размещено на http://www.allbest.ru/

Український державний університет харчових технологій

УДК 612.3:576.8

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук

Розробка та впровадження способу одержання нейстонних біопрепаратів за допомогою флотації

Грегірчак Наталія Миколаївна

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Українському державному університеті харчових технологій Міністерства освіти України.

Науковий керівник: кандидат технічних наук, доцент Стабнікова Олена Всеволодівна, Український державний університет харчових технологій.

Офіційні опоненти:

- д.т.н., професор Циганков Сергій Петрович, заступник директора з науки і нової техніки Інституту харчової хімії і технології Держхарчопрому і НАН України.

- к.б.н. Карпенко Валерій Іванович, доцент кафедри екології і біології міжнародного незалежного університету "Києво-Могилянська академія".

Провідна установа: Державний університет "Львівська політехніка", м. Львів.

Захист відбудеться: "20" жовтня 1999 р о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.3 в Українському державному університеті харчових технологій за адресою: 252033, Київ-33, вул. Володимирська,68, корпус А, ауд.311.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Українського державного університету харчових технологій за адресою: 252033, Київ-33, вул. Володимирська,68.

Автореферат розісланий "16 " вересня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.т.н. В.О. Ромоданова

Анотації

Грегірчак Н.М. Розробка та впровадження способу одержання нейстонних біопрепаратів за допомогою флотації. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Український державний університет харчових технологій, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено питанням розробки способу одержання і застосування біотехнології нейстонних біопрепаратів. Основою таких біопрепаратів є клітини з підвищеною гідрофобністю поверхні. Ця властивість дозволяє клітинам концентруватися в поверхневому шарі води та інтенсифікувати її очищення. Розроблено новий флотаційний метод селекції клітин бактерій з підвищеними гідрофобними властивостями. Флотація дозволяє відбирати фракції клітин, які відрізняються за своїми морфологічними та біохімічними властивостями.

Запропоновано використання нейстонного препарату на основі Bacillus spp. з широким спектром антимікробної активності для обеззараження поверхевого шару води. Нейстонну форму Bac megaterium 1BD доцільно використовувати для очищення води від нафтових забруднень. Застосування такого біопрепарату в природних умовах показало значне збільшення біоочищення води від забруднення нафтопродуктами і дозволило зменшити суму збитку, завданого навколишньому середовищу в 40 разів.

Ключові слова: нейстон, бактеріальні препарати, флотація мікроорганізмів, гідрофобність, цитофлуориметрія, синхронізація.

Грегирчак Н.Н. Разработка и внедрение способа получения нейстонных биопрепаратов с помощью флотации. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Украинский государственный университет пищевых технологий, Киев, 1999.

Диссертация посвящена вопросам разработки способа получения и использования биотехнологии нейстонных биопрепаратов. Основой таких биопрепаратов являются клетки с повышенной гидрофобностью их поверхности, полученные с помощью флотации.

В работе изучены морфологические и биохимические особенности флотационных фракций клеток бактерий. Отмечено, что в ходе периодического культивирования культур бацилл увеличивается гидрофобность поверхности клеток, при этом показатель флотируемости для исследованных культур увеличивается: для Bас. thuringiensis с 33 до 65, Bас. licheniformis с 3 до 27, Bас. megaterium с 54 до 74. Коэффициент корреляции между показателем флотируемости и гидрофобности составляет 0,97 для Bас. thuringiensis, 0,85 для Bас. licheniformis и 0,98 для Bас. megaterium, что свидетельствует о значительном влиянии гидрофобных свойств поверхности клеток на их флотационную способность.

Использование флотационной обработки суспензии бацилл позволяет проводить их возрастное фракционирование: пена обогащается спорами, в то же время в культуральной жидкости остаются вегетативные клетки. Согласно математической модели флотационного фракционирования с помощью многоступенчатой флотации можно довести содержание спор в концентрате почти до 100%.

Показано, что при флотационном фракционировании бактериальных суспензий наиболее легко флотируются клетки, которые имеют повышенные гидрофобные свойства и меньшие размеры. Это подтверждает тот факт, что в условиях естественной флотации лучшую флотационную способность имеют клетки более мелких размеров с повышенной гидрофобностью поверхности.

Проведено автоселекцию бактериальных культур за показателем гидрофобности их поверхности. В процессе автоселекции исследуемых культур наблюдается увеличение показателя клеток бактерий за 6 пересевов: для A. paradoxus БС-1 от 26 до 54; Ps. putida БС-2 - от 35 до 72; Mеthylobakterium sp. 1K - от 31 до 57; Bac. thuringiensis - 30 до 54; Bас. megaterium 1БД- 32 до 64. При периодическом (96 час культивирования) та непрерывном (72 час культивирования со скоростью разбавления 0,06 час-1) культивировании нейстонной формы Bас. megaterium 1БД и Ps. putida БС-2 показатель гидрофобности клеток на конец культивирования составлял соответственно 63 и 62 для Bас. megaterium 1БД и 67 і 70 для Ps. putida БС-2, то есть наблюдается сохранение отселекционированного признака.

Установлена возможность получения нейстонной формы биопрепарата на основе бацилл, которые обладают широким спектром антимикробного действия. При выдерживании сточной воды с биопрепаратом на протяжении 48 часов наблюдали понижение общего микробного числа и освобождения от присутствия в воде стафилококков и шигел. Эффективность обеззараживания зависела от дозы внесенного биопрепарата.

На основании отселекционированной культуры Bас. megaterium 1БД с повышенными гидрофобными свойствами получен биопрепарат, который исследовался на возможность использования его для очистки водоемов от нефтепродуктов. При использовании нейстонной формы биопрепарата эффективность процесса очистки составляла 89%, тогда как в контроле и при использовании биопрепарата без повышенной гидрофобности клеток она составляла 61% и 72% соответственно.

Эффективность очистки и скорость деградации нефтепродуктов зависит от дозы внесенного биопрепарата в очищаемую воду. Увеличение дозы биопрепарата в тысячу раз (от 0,3 мг/ л до 300 мг/л) позволяет повысить эффективность очистки за 30 дней с 63,3% до 93,3%, а скорость деградации нефти в 1,5 раза (начальное содержание нефти в воде 790 мг/л).

Показана эфективность использования нейстонного биопрепарата для очистки водоема от нефтезагрязнения в пойме реки Сула. Внесение биопрепарата сопровождалось снижением концентрации углеводородов в 3-4 раза за 90 дней. В результате использования нейстонной формы бацилл для ликвидации аварийного розлива бензина величина ущерба, нанесенного окружающей среде уменьшилась в 40 раз.

На основании проведенных исследований разработаны практические рекомендации по производству и внедрению нейстонного биопрепарата для очистки водоемов от нефтепродуктов.

Ключевые слова: нейстон, бактериальные препараты, флотация микроорганизмов, гидрофобность, цитофлуориметрия, синхронизация.

Gregirchak N.M. Development and inculcation of recipiency method neuston biopreparations by means of flotation . - Manuscript.

The dissertation on winning of scientific candidate degree of technical sciences by speсiality 03.00.20 - biotechnology. - Ukrainian State University of Food Technologies, Kyiv, 1999.

The subject of the dissertation is the development of manufacturing and application biotechnologies of neustonic biopreparation. Neustonic biopreperation іs based on the cells with increased hydrophobicity. This character allows them to concentrate within the surrface layer of water and to intensify its purification. New flotative method for the selection of the cells with high hydrophobicity was developed. Flotation allows to select the cell fractions, which differ by their morphological and biochemical properties.

One neustonic biopreparation from Bacillus spp. with wide spectrum of antimicrobial activity was proposed to use for the decontamination of surface layer of water. Another biopreparation, which is based on neustonic variant of Bac. megaterium 1BD, was proposed for the bioremediation of the oil polluted water. Application of this biopreparation in the field showed that it significantly increased the bioremediation of water polluted by oils and decreased the sum the damage to environmental in 40 times.

Key words: bacterial preparation, flotation of microorganisms, neuston, hydrophobicity, flow cytofluorometry, synchronization.

Загальна характеристика дисертаційної роботи

Актуальність теми. Біотехнологія на сьогоднішній час визнана пріоритетною галуззю розвитку народного господарства в Україні, що відмічено у рішенні Ради з питань науки та науково-технічної політики при Президентові України від 15. 01. 98р. "Про основні пріоритети розвитку науки та науково-технічної політики в Україні та систему державних наукових та науково-технічних програм".

Біотехнологічні методи мають велике значення при вирішенні проблем охорони довкілля, зокрема при розробці препаратів для очищення води від нафтопродуктів. Досвід використання біопрепаратів на основі мікроорганізмів, іммобілізованих на природних і синтетичних носіях, для інтенсифікації очищення води від вуглеводнів нафти є достатньо відомим і поширеним. Одне з основних призначень носія - утримання клітин мікроорганізмів в приповерхневому шарі води, де відбуваються процеси деструкції органічних забруднень.

Перспективним напрямком екологічної біотехнології може бути розробка методів одержання біопрепаратів на основі клітин зі зміненими поверхневими властивостями, що дозволяють їм самостійно концентруватися в нейстонній біоплівці і значно підвищувати швидкість деградації нафтопродуктів у воді.

В технології таких біопрепаратів можливо використання флотаційного фракціонування бактеріальних клітин за морфолого-біохімічними властивостями і виділення фракцій клітин з підвищеною здатністю до адгезії на поверхні розділу рідина-газ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота включає дослідження, проведені в рамках виконання програми Національного комітету по науці і технологіям 4.1.6. "Розробка наукових основ і створення нових біотехнологічних препаратів та продуктів", проект 4.1.6.28.

Мета роботи. Метою роботи є розробка способу одержання нейстонних біопрепаратів за допомогою флотації і дослідження ефективності їх використання для очищення води від нафтопродуктів та покращення санітарного стану водоймищ.

Поставлена мета припускає вирішення наступних завдань:

- дослідження флотаційної здатності бактерій і її взаємозв'язок з гідрофобними властивостями поверхні клітин;

- визначення режимів флотаційного фракціонування бактеріальних суспензій для виділення клітин з підвищеними гідрофобними властивостями;

- визначення умов проведення автоселекції бактерій з підвищеними гідрофобними властивостями їх поверхні за допомогою флотації;

- дослідження ефективності процесу очищення води від нафтопродуктів та її обеззараження при використанні нейстонних біопрепаратів;

- розробка рекомендацій для виробництва та застосування біопрепарату.

Наукова новизна роботи. Проведеними дослідженнями встановлено:

- існування позитивної кореляції між флотуємістю та гідрофобністю поверхні клітин бактерій;

- існування відмінностей флотаційних фракцій клітин бактерій за морфологічними та біохімічними ознаками;

- можливість автоселекції нейстонних форм бактерій з використанням флотації;

- можливість використання нейстонних біопрепаратів для обеззараження водоймищ та інтенсифікації очищення води від нафтопродуктів.

Практична цінність роботи. Базуючись на результатах проведених досліджень, запропонована технологія нейстонних біопрепаратів з використанням флотації. Показана ефективність використання нейстонних біопрепаратів для очищення води від нафтопродуктів та обеззараження води, що дозволяє рекомендувати використання нейстонних біопрепаратів для ліквідації аварійних виливів нафтопродуктів та покращення санітарного стану водоймищ.

Розроблено флотаційний метод отримання концентрату спор бактерій.

Запропоновано метод одержання синхронних культур бактерій при використанні флотації.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися Всеукраїнській науково-технічній конференції "Розробка та впровадження прогресивних технологій та обладання у харчову та переробну промисловість" (Київ, 1995) та на студентських конференціях УДУХТ 1989-1990рр.

Публікації. З теми дисертаційної роботи опубліковано 7 робіт.

Особистий внесок здобувача полягає у проведенні експериментів в лабораторних та дослідно-промислових умовах, підготовці до публікації результатів досліджень. Аналіз результатів та їх узагальнення проводились спільно з науковим керівником. Випробування нейстонного біопрепарату для очистки води від нафтопродуктів в реальних умовах проводили спільно з к.б.н., ст.н.с. відділу технології біосинтезу Інституту мікробіології і вірусології АН України О.М. Дульгеровим.

Об'єм та структура роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, 6 розділів, висновків, списку літератури (249 найменувань, в тому числі 107 зарубіжних) та додатку. Робота викладена на 126 сторінках друкованого тексту, містить 12 таблиць та 25 рисунків.

Робота виконувалась на базі кафедри біотехнології мікробного синтезу Українського державного університету харчових технологій, відділу технології біосинтезу Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії наук України (ІМВ НАН України) під керуванням д.б.н. Іванова В.М., Українського радіологічного центру, Інституту фізичної та біологічної хімії (Естонія).

Зміст роботи

У вступі обґрунтована актуальність, сформульовані мета і задачі досліджень, показані наукова новизна та практична цінність роботи. Наведені результати про структуру, достовірність, апробацію роботи та особистий внесок дисертанта.

У першому розділі "Флотація в біотехнології" показано, що флотацію застосовують для згущення мікробних суспензій, для концентрування активного мулу при біохімічному очищенні стічних вод, а також для виділення деяких продуктів мікробного синтезу. Наведено дані, що при культивуванні дріжджів можна застосовувати флотацію для розділення біомаси за віковими та генетичними властивостями, хімічним складом біомаси клітин, а також видовим складом змішаних культур. На основі аналізу літературних даних зроблено висновок про можливість застосування флотації в процесах культивування бактерій.

У другому розділі "Поверхневі властивості клітин" відмічено, що електрокінетичні та гідрофобні властивості клітинної поверхні відіграють найбільш важливу роль в процесах взаємодії мікроорганізмів з поверхнею розділу рідина-газ.

Клітини мікробної популяції відрізняються одна від одної електрокінетичними властивостями своєї поверхні, мають різний по величині заряд або зв'язаний з ним дзета-потенціал, що визначає можливість флотаційного фракціонування клітин.

Відмічено, що гідрофобні властивості клітини відіграють певну роль в визначенні ступеня їх адгезії на поверхні розділу рідина-газ. Значення показника гідрофобності клітин мікроорганізмів залежить від фізико-хімічних факторів середовища їх проживання.

На основі аналізу літературних даних зроблено висновок про можливість застосування флотації для одержання клітин бактерій, які відрізняються поверхневими властивостями, визначено мету і завдання досліджень.

У третьому розділі "Матеріали і методи досліджень" наведено характеристику мікробіологічних об'єктів та подано перелік методів, якими користувалися при виконанні роботи.

В роботі досліджувались 12 штамів бактерій з колекції ІМВ НАН України, РНДІ сільськогосподарської мікробіології, кафедри мікробіології Московського державного університету (Росія).

Культивування мікрооорганізмів здійснювали на синтетичних середовищах різного складу. Як джерело вуглецю використовували глюкозу, сахарозу, галактозу, етанол, гексадекан, диетиленгліколь, дизельне паливо. Вирощування бактерій проводили в колбах на качалці (240 кач/хв), в апараті безперервного культивування АНКУМ-2М, в ферментері "Б - 0,1". Процес культивування вели в періодичному режимі та в режимі хемостата безперервно з швидкістю розбавлення 0,06 год-1. Фракціонування клітин бактеріальних суспензій проводили на лабораторній флотаційній установці.

Визначення морфологічної та вікової структури клітинних популяцій здійснювали за допомогою світлової та електронної мікроскопії на мікроскопах ЛЮМАМ-И 2 та JЕМ-7. Цитофлуориметричний аналіз розподілення клітин за вмістом ДНК, білка і розмірами проводили за допомогою проточного цитофлуориметра FACStar Plus. Вміст вуглеводнів в пробах води та культуральній рідині визначали методом інфрачервоної спектрофотометрії на аналізаторі нафтопродуктів АН-1. Гідрофобні властивості поверхні клітин вивчали за методом Rosenberg.

Автоселекцію нейстонних форм бацил здійснювали наступним чином: виділяли фракцію швидкофлотуючих клітин з підвищеними гідрофобними властивостями, використовуючи її як посівний матеріал для наступного культивування мікроорганізмів до досягнення стаціонарної фази росту. Вирощену культуру відстоювали, а потім за допомогою бактеріальної петлі переносили в свіже поживне середовище. Нейстонні форми бактерій одержували на протязі 5-6-кратного пересіву культури.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за спеціальними програмами для персонального комп'ютера.

У четвертому розділі " Дослідження флотаційної здатності клітин бактерій і її зв'язок з гідрофобними властивостями їх поверхні" наведено результати досліджень флотаційного розділення бактеріальних клітин за віком періодичної культури, показано зміни показника гідрофобності клітин в ході періодичного культивування. Вивчено морфологічні та біохімічні особливості флотаційних фракцій клітин бактерій, наведено характеристику гідрофобних властивостей флотаційних фракцій бактерій.

Показано, що в ході періодичного культивування культур бацил спостерігається підвищення гідрофобності поверхні клітин (табл. 1), при цьому показник флотуємоті для досліджуваних культур збільшувався: для Bас. thuringiensis з 33% до 65%, Bас. licheniformis з 3% до 27%, Bас. megaterium з 54% до 74%.

Таблиця 1 - Зміна гідрофобних властивостей поверхні клітин бацил за час періодичного культивування

Мікроорганізм	Час культивування, год	Показник гідрофобності спор, Г %
	8	12	16	20
Bас.thurіngіеnsis	4,50,22	7,50,12	14,20,21	22,50,09	59,4 0,18
Bас.licheniformis	0	4,90,31	8,30,15	10,00,13	42,80,22
Bас.megaterium	3,00,18	3,50,21	12,60,12	30,00,15	61,90,31

Коефіцієнт кореляції між показником флотуємості та гідрофобності складає 0,97 для Bас. thuringiensis, 0,85 для Bас. licheniformis та 0,98 для Bас. megaterium . Одержані результати свідчать, що гідрофобні властивості поверхні клітин мають значний вплив на їх флотаційну здатність і це необхідно враховувати при розробці біотехнологічних процесів культивування мікроорганізмів.

В результаті досліджень встановлено, що в процесі періодичного культивування у бацил посилюється їх адгезія на поверхні розділу рідина-газ. Використання флотаційної обробки суспензії клітин бацил дозволяє проводити їх вікове фракціонування: піна збагачується спорами, в той час як в культуральній рідині залишаються вегетативні клітини.

Застосовуючи математичну модель флотаційного фракціонування бактеріальної суспензії, можна за допомогою багатоступеневої флотації довести вміст спор в концентраті майже до 100%.

Встановлена можливість флотаційного розділення бактеріальної суспензії за морфологічними ознаками (розміри клітин). При цьому фракції швидкофлотуючих клітин характеризуються меншим вмістом білка, проте відмінність у вмісті ДНК для флотаційних фракцій не встановлена.

Згідно даних проточної цитофлуориметрії флотуємість клітин не пов'язана з положенням клітини в циклі реплікації хромосомної ДНК (з вмістом ДНК в клітині).

За результатами аналізу фракцій клітин бактерій методом проточної цитофлуориметрії виявлено, що клітини з підвищеними гідрофобними властивостями мають менші розміри. Це підтверджує факт кращої флотуємості клітин бактерій, які знаходяться на початку клітинного циклу. В зв'язку з цим можна припустити, що в верхньому шарі ферментера будуть переважати дрібні клітини бактерій, які знаходяться на початку цикла ділення. нейстонний біопрепарат бактерія гідрофобний

Флотаційне фракціонування бактеріальної суспензії використовували для синхронізації розмноження бактерій. В результаті флотаційної обробки суспензії бацил одержували фракції швидкофлотуючих клітин, застосування яких як посівний матеріал, обумовлює синхронізацію розмноження бактерій (індекс синхронізації складав 0,56 - 0,64) і синхронізацію реплікації ДНК.

Флотаційний метод синхронізації дозволяє вивчати процеси життєдіяльності бактерій протягом клітинного циклу.

Показано, що при флотаційному фракціонуванні бактеріальних суспензій найбільш легко флотуються клітини, які мають підвищені гідрофобні властивості. В результаті досліджень встановлено, що гідрофобність швидкофлотуючих бактерій тим більша, чим менший відсоток біомаси переходить в пінну фракцію (табл.2).

Таблиця 2 - Показник гідрофобності флотаційних фракцій клітин бактерій

Культура бактерій	Біомаса в пінній фракції, % відбору	Витрати повітря, л/л хв	Гідрофобність,%
			швидкофлотуючих клітин	клітин, які залишилися в рідині
Bacillus	10	0,8	41,30,71	15,41,21
megaterium	20	1,2	22,71,18	18,70,94
Bacillus	10	0,8	14,60,52	6,30,75
licheniformis	20	1,2	9,61,09	7,70,84
Bacillus	10	0,8	39,71,01	15,40,36
thuringiensis	20	1,2	20,00,71	17,21,15

У пятому розділі "Автоселекція нейстонних форм бактерій" розглянуто можливість автоселекції мікроорганізмів, які мають підвищені гідрофобні властивості, для одержання нейстонних біопрепаратів.

Проведений цитофлуориметричний аналіз розподілення клітин Bас. megaterium 1БД, Al. paradoxus БС-1, Ps. putida БС-2 за розмірами показав, що в нейстонній плівці переважають дрібні клітини, в той час як клітини бактерій, що знаходяться в товщі водного середовища, характеризувались великими розмірами. Порівняння показників гідрофобності поверхні клітин нейстонної та планктонної форм вказаних трьох культур бактерій підтверджує той факт, що в умовах природної флотації кращу флотаційну здатність мають клітини більш дрібніших розмірів з підвищеною гідрофобністю поверхні (рис.1).

Проведено автоселекцію бактеріальних культур за показником гідрофобності їх поверхні (рис.2).



Рис. 1 - Гідрофобність поверхні клітин бактерій: 1 - Bас. megaterium 1BD, 2 - Ps. putida БС - 2, 3 - Al. paradoxus БС - 1

Рис.2 - Гідрофобність поверхні клітин бактеріальних культур при їх автоселекції (Г,%): 1- Al. paradoxus БС-1, 2- Ps. putida БС-2, 3 - Mеthylobakterium sp. 1K, Bac. thuringiensis, 5 - Bас. megaterium 1БД.

В процесі автоселекції досліджуваних культур спостерігається збільшення показника гідрофобності клітин бактерій за 6 пересівів: для Al. paradoxus БС-1 від 26 до 54; Ps. putida БС-2 - від 35 до 72; Mеthylobakterium sp. 1K - 31 до 57; Bac. thuringiensis - 30 до 54; Bас. megaterium 1БД- 32 до 64.

При періодичному (96 год культивування) та безперервному (72 год культивування з швидкістю розбавлення 0,06 год-1) культивуванні нейстонної форми Bас. megaterium 1БД і Ps. putida БС-2 показник гідрофобності клітин на кінець культивування складав відповідно 63 і 62 для Bас. megaterium 1БД та 67 і 70 для Ps. putida БС-2, тобто спостерігається збереження відселекціонованої ознаки.

У шостому розділі "Практичне застосування нейстонних бактеріальних біопрепаратів" показано ефективність використання нейстонних препаратів для очищення природних водоймищ від нафтових забруднень та покращення їх санітарного стану.

Встановлена можливість одержання нейстонної форми біопрепарату на основі бацил, які мають широкий спектр антимікробної дії, в тому числі і на представників патогенної мікрофлори. При витримуванні стічної води з біопрепаратом протягом 48 годин спостерігали зниження загального мікробного числа та звільнення від присутності в воді стафілококків та шигел, наявність яких в воді свідчить про її забрудненість бактеріями групи кишечної палочки. Ефективність обеззараження залежала від дози біопрепарату, що вносився (табл. 3).

Таблиця 3 - Ефективність обеззараження стічних вод очисних споруд м. Рахова нейстонним біопрепаратом

Мікроорганізми	Контроль без препарата	Концентрація препарата, 105 кл/мл
		0,93	9,3	93
	0год - 48 год	24год - 48 год	24 год - 48 год	24 год - 48 год
Стафілококи	0,9x107 1,2x106	4,8x106 н/в	3,2x104 н/в	0,44x104 н/в
Шигели	0,9x107 2,0x103	3,1x104 н/в	2,7х 104 н/в	2,1 х 104 н/в
Загальне мікробне число, кл/мл	- -	- 10,0х 106	- 12,5х 104	- 11,8х 103

Примітка: н/в - мікоорганізми не виявлені

Препарат "73", що представляє собою набір штамів аеробних спороутворюючих бацил, любязно надано для наших досліджень доктором мед.наук С.Р. Резніком (відділ антибіотиків Ін-ту мікробіології та вірусології НАН України)

На основі відселекціонованої культури Bас. megaterium 1БД з підвищеними гідрофобними властивостями одержано біопрепарат, який досліджувався на можливість використання його для очищення водоймищ від нафтопродуктів.

Ефективність використання нейстонної форми отриманого біопрепарату на основі культури Bас. megaterium 1БД для очищення води від вуглеводнів нафти порівнювали з контролем - процесом самоочищення забрудненої води та з процесом очищення води порівнювали з контролем - процесом самоочищення забрудненої води та з процесом очищення води під впливом суспензії клітин Bас. megaterium 1 БД, що не мали підвищених гідрофобних властивостей.

При використанні нейстонної форми біопрепарату ефективність процесу очищення склала 89%, тоді як в контролі та при застосуванні біопрепарату, що не мав підвищеної гідрофобності клітин, вона склала 61% та 77% відповідно.

Ефективність очищення та швидкість деградації нафтопродуктів залежить від дози внесеного біопрепарату в воду, що очищається (табл. 4).

Таблиця 4 - Вплив дози біопрепарату на процес очищенняи води від вуглеводнів*

Внесення біопрепарату, мг/л	Вміст нафтопродуктів у взірці, мг/л	Ефективність деградації нафтопродуктів, %	Швидкість деградації нафтопродуктів мг/л за день
Контроль (вода без біопрепарата)	347	56,1	15
0,30	290	63,3	17
3,00	268	66,1	17
30,00	200	74,7	20
300,00	48	93,9	25

- Початковий загальний вміст нафтопродуктів в воді - 790 мг/л.

Збільшення дози біопрепарату в тисячу раз (від 0,3 мг/л до 300 мг/л) дозволило підвищити ефективність очищення за 30 днів з 63,3% до 93,3%, а швидкість деградації нафти в 1,5 рази.

Досліджувався вплив температури на ступінь очищення води від нафтопродуктів нейстонним біопрепаратом (табл. 5).

Таблиця 5 - Вплив температури на процес деструкції нафтопродуктів нейстонним біопрепаратом (початковий вміст нафтопродуктів воді - 80 мг/л)

Температура, °С	Ступінь очищення, % в залежності від часу (діб)
	1	2	3	4	5
18	10	26	49	68	89
30	21	50	85	99	100

З наведених в табл. 5 даних видно, що при пониженні температури ступінь деструкції вуглеводнів нафти зменшується в 1,5-2 рази. Однак, гідрофобність бацил суттєво не змінюється: на початок очищення складала 0,68 і на кінець очищення - 0,7 для обох варіантів.

Показана ефективність використання нейстонної форми біопрепарату для очищення водоймища від нафтового забруднення в заплавині ріки Сула. Забруднення водоймища сталося в результаті аварійного руйнуваня трубопроводу газового конденсату і було локалізовано на невеликій ділянці водоймища (7 х 20 м) . Внесення біопрепарату супроводжувалось зниженням концентрації вуглеводнів в 3-4 рази за 90 днів.

В результаті використання нейстонної форми бацил для ліквідації аварійного виливу нестабільного бензину величина збитку, завданого навколишньому середовищу зменшується в 40 разів.

Для остаточної оцінки ефективності практичного використання нейстонного біопрепарату, проведено порівняння результатів очищення води від забруднення нафтопродуктами іншими відомими біопрепаратами (табл. 6).

Таблиця 6 - Порівняльні відомості по використанню біопрепаратів для очищення води від нафти і нафтопродуктів

Спосіб очищення	Забруднювач	Поч. концентрація вуглеводнів	Кінц. концентрація вуглеводнів	Тривалість очищення, діб	Ступінь очищення,%	Література
Acinetobacter deovorum	Диз. паливо	15 кг/мі	очищено	10	84,5	А.с. СССР 1809822
Біопрепарат "Эконадин"	Диз. паливо	5,0мл/л	очищено	6	97,6	Патент РФ 2031680
Acinetobacter valentis	Диз. паливо	7 г/мі	очищено	5	99,0	Патент РФ 2053204
Rhodococcus sp. ВКПМS	Нафта	14,5мг/л	0,07мг/л	20	99,5	Патент РФ 2039714
Біопрепарат "Деворойл"	Нафта	2,5 об.%	очищено	20	100	Патент РФ 2023686
Нейстонний біопрепарат	Нафта	800 мг/л	0,04мг/л	55	99,9	Наші дані

Як видно (табл. 6), нейстонний біопрепарат на снові культури Bacillus megaterium 1БД має велику біодеградуючу активність і може бути застосований при високих початкових концентраціях забруднювача у випадку аварійних розливів нафтопродуктів.

На основі проведених досліджень розроблено практичні рекомендації по виробництву та впровадженню нейстонного біопрепарату для очищення водоймищ від нафтопродуктів. В додатку наведено рекомендації по виготовленню нейстонного біопрепарату, які містять технологічну схему отримання біопрепарату та опис стадій основних технологічних процесів.

Висновки та рекомендації

1. Показано, що вегетативні клітини, проспори та спори бацил відрізняються за своєю здатністю до флотації. Флотаційна обробка суспензії клітин бактерій Bac.cereus і Bac. subtilis дозволяє проводити їх вікове фракціонування: піна збагачується спорами, в той час як вегетативні клітини та проспори залишаються в рідині. Використання двостадійного флотаційного фракціонування дозволяє підвищити частку спор до 85% для Bac.cereus і до 94% для Bac. subtilis .

2. Показана можливість одержання синхронних культур за допомогою флотації. Використання як посівний матеріал фракції швидкофлотуючих клітин асинхронних культур Bac. acidocaldarius і Bac. thuringiensis забезпечує синхронізацію їх розмноження з індексом синхронізації 0,56-0,64.

3. Встановлено, що швидкофлотуючі клітини бактерій мають менші розміри і містять менше білка, ніж клітини вихідної популяції. Найбільша здатність до адгезії спостерігається у клітин, що діляться, або тільки но розділених клітин.

4. Встановлено, що флотаційна здатність клітин бактерій залежить від гідрофобності їх поверхні при коефіцієнті кореляції 0,97 для Bac. thuringiensis, 0,85 для Bac. licheniformis, 0,98 для Bac. megaterium. Флотаційне фракціонування бактеріальної суспензії дозволяє виділити клітини з підвищеними гідрофобними властивостями при 10% відборі біомаси пінної фракції.

5. Можливо проводити автоселекцію нейстонних форм бактерій з підвищеною в 3-4 рази гідрофобністю поверхні клітин. Використання нейстонної форми бактерій, одержаних на основі аеробних спороутворюючих бацил, що мають широкий спектр антибіотичної активності, дозволяє проводити біологічне обеззараження стічних вод.

6. Нейстонну форму бактеріальних препаратів доцільно використовувати в процесах очистки водоймищ від нафтових забруднень. При використанні нейстонної форми бактерій B.megaterium 1БД ступінь деструкції вуглеводнів складала 89% в порівнянні з контролем (вихідна культура B.megaterium) -77%.

7. Застосування нейстонної форми бактерій B. megaterium 1БД для ліквідації аварійного виливу нестабільного бензину у природному водоймищі дозволяє зменшити суму збитку, завданого навколишньому середовищу в 40 разів.

8. За результатами лабораторних та дослідно-промислових досліджень розроблено рекомендації по технології нейстонного біопрепарату для очищення водоймищ від нафтових забруднень.

Публікації за матеріалами дисертації

1. Стабникова Е.В., Цимберг Е.А., Грегирчак Н.Н. Синхронизация размножения бактерий с помощью флотации // Микробиология.-1990. -Т. 59, № 2. - с.278-282.

2. Стабникова Е.В., Грегирчак Н.Н., Тараненко Т.О. Особенности флотации клеток и спор бацилл / /Микробиол.ж. -1991.- Т.53, № 3. -с.37-42.

3. Стабникова Е.В., Милько Е.С., Грегирчак Н.Н. Флотационное фракционирование клеток R- и S- вариантов бактерий // Микробиол. ж.-1991. -Т. 53, № 4. - с.52-54.

4. Стабникова Е.В., Грегирчак Н.Н., Тараненко Т.О., Нудьга А.Ю. Автоселекция нейстонных форм бактерий // Микробиол. ж. -1991. -Т. 53, № 5. - с.33-36.

5. Стабникова Е.В., Грегирчак Н.Н., Иванов В.Н. Возрастная специфичность взаимодействия клеток бацилл с поверхностью раздела жидкость-газ // Микробиология. -1992. -Т. 61, № 6. - с.1038-1042.

6. Стабникова Е.В., Иванов В.Н., Грегирчак Н.Н., Дульгеров А.Н. Использование нейстонных форм бацилл для очистки и обеззараживания водоемов // Микробиол. ж. -1993. -Т. 55, № 2. - с.88-93.

7. Ivanov V.N., Svechnikova T.A., Stabnikova E.V., Gregirchak N.N. Structure of cell cycle and age structure of Bacillus population // Микробиол.ж. -1995. -Т. 57, № 4. - с.3-11.

8. Стабнікова О.В., Салюк А.І., Грегірчак Н.М. Біотехнологія очищення грунтів та водойм, забруднених нафтопродуктами // Всеукраїн. науково-техн. конф-я "Розробка та впровадження прогресивних технологій та обладнання у харчову та переробну промисловість. Київ, 17-20 жовтня. -1995. - с.105.

Размещено на Allbest.ru