Вплив механічного навантаження на синтез колагену, еластину та в’язко-пружні властивості сполучної тканини

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 577.12:577.112:577.24

Вплив механічного навантаження на синтез колагену, еластину та в'язко-пружні властивості сполучної тканини

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Гарбузенко Ольга Борисівна

Харків 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у НДЧ Харківського державного університету Міністерства освіти України

Захист відбудеться «12» жовтня 1999 p. o 1515 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.17 при Харківському державному університеті Міністерства освіти України за адресою: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського державного університету: 310077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “3” вересня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук старший науковий співробітник Падалко В.І.

колаген шкіра аорта

Анотація

Гарбузенко О.Б. Вплив механічного навантаження на синтез колагену, еластину та в(яз-ко-пружні властивості сполучної тканини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук з спеціальності 03.00.04 - біохімія - Харківський державний університет, Харків, 1999.

Досліджено вплив механічного навантаження на синтез еластину, колагену, гід-роксилювання проліну і ступінь поперечного зв(язування колагену у шкірі, аорті, серцевому м(язі та сухожиллях 3- і 12-місячних щурів in vivo та in vitro.

In vivo показано, що формування в(язко-пружних властивостей сполучної тканини є результатом специфічних для кожного органа співвідношень інтенсивностей синтезу елас-тину, колагену та вивчених стадій його процесінгу. In vitro встановлені вікові особливості діапазонів напруг, де відбувається індукція синтезу колагену та його процесінгу. Вперше показано, що механічне навантаження викликає індукцію синтезу еластину. Показано, що в безкальцієвому середовищі, спостерігається збільшення, а у гіперкальцієвому - зменшення інтенсивності синтезу колагену. Встановлено, що жорсткість міжклітинного матриксу впли-ває на передачу сигналу про механічне навантаження на клітини.

Ключові слова: колаген, еластин, синтез, міжклітинний матрикс, в(язко-пружні властивості, механічне навантаження.

Аннотация

Гарбузенко О.Б. Влияние механического напряжения на синтез коллагена, эластина и вязко-упругие свойства соединительной ткани. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский государственный университет, Харьков, 1999.

Исследовано влияние механического напряжения на синтез эластина, коллагена, гидроксилирования пролина, и поперечное связывание коллагена в коже, аорте, сердечной мышце и сухожилиях 3- и 12-месячных крыс in vivo и in vitro.

In vivo показано, что формирование оптимальных вязко-упругих свойств соедините-льной ткани является результатом специфических для каждого органа соотношений интенсивностей синтеза эластина, коллагена и изученных стадий его процессинга. In vitro установлены возрастные особенности диапазонов напряжений, в которых происходит индукция синтеза коллагена и его процессинга. Впервые показано, что механическое напряжение вызывает индукцию синтеза эластина. Показано, что в бескальциевой среде происходит увеличение, а в гиперкальциевой - снижение синтеза коллагена, а жесткость межклеточного матрикса влияет на передачу сигнала о механическом напряжении на клетки.

Ключевые слова:, коллаген, эластин, синтез, межклеточный матрикс, вязко-упру-гие свойства, механическое напряжение.

Summary

Garbuzenko O.B. The influence of the mechanical load on collagen and elastin synthesis ane visko-elastic properties of the connective tissue. - Manuskript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kharkov State University, Kharkov,1999.

The investigation of the mechanical load influence on collagen and elastin synthesis, the degree of proline hydroxylation in collagen and level of collagen cross-linking in skin, aorta, heart and tendon of 3-month rats in vivo and in skin and aorta of 3- and 12-month rats in vitro has been done.

In vivo it was shown that in each of investigated organs the synthesis intensity of both proteins and studied steps of collagen metabolism are not the same. Achilles and tail tendons have the same collagen concentration, but the mechanical loads which Achilles tendons are exposed to are bigger. So the level of proline hydroxylation in collagen and the degree of its cross-linking in this tendons are also higher. As for the level of collagen metabolism it is higher in tail tendons which speaks about the less structural and metabolic stability of its supramolecular formations. In skin that is subjected to considerably bigger mechanical loads in comparison to aorta collagen concentration and the degree of its cross-linking are also higher. From the other side the aorta wall ability to large backing deformations depends on high enough elastin concentration in it. The distribution and the level of collagen formation and structural stability in heart sections are back proportional to the loads they have, because in heart the main resistance to the load do myofibrillar elements.

So, all these facts are the main condition for the formation of connective tissue visko-elastic properties, that are optimal to the quantity and distributions of the mechanical loads these organs have.

In vitro for the first time it was established that mechanical load leads to the increasing of elastin concentration in skin and aorta in basis of which according changes in its synthesis lying. Also it was determined the diapason of loads in which the intensification of collagen and elastin synthesis occurs in animals of different ages. It was shown that cells answer of skin and aorta connective tissue depends on the rats age. In 3-month animals the maximums of collagen concentration and synthesis are observed at higher mechanical loads than in 12-month rats. Besides the degree of collagen cross-linking of aorta and skin in younger rats with the increasing of load begins to decreasing and than increase but dose not reach the original level; in one-year rats this dependence has opposite character. Probably such differences in cell answer on the mechanical load connect with the increasing of the connective tissue extracellular matrix cruelty with age. For the confirming of such proposition there was investigated the influence on the mechanical load on collagen concentration and cross-linking in skin at the presence of semicarbazid - the blockator of cross-linking in collagen formations. In this case the cruelty of extracellular matrix brings down. It was shown the decreasing of collagen concentration.

It was suggested, that lowering of matrix cruelty leads to the breaking in chain of mechanical load signal translation to the cell membrane.

For the first time it was obtained, that in noncalcium environment (with the presence of EGTA) without mechanical load the increasing of collagen synthesis occurs. At the presence of calcium (2,5mM) the decreasing of collagen synthesis is occur. At the incubation with chlorpromasin which is the anticalmodulin agent the increasing of collagen synthesis was observed. It was supposed that the complex Ca/calmodulin takes place in collagen metabolism.

Key words: collagen, elastin, synthesis, extracellular matrix, visko-elastic properties, mechanical load.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. Механічні властивості сполучної тканини лежать в основі однієї з її важливих функцій - опорної. В усіх без винятку різновидах сполучної тканини серед основних конструкційних елементів, що визначають ці властивості, є колаген, а в деяких з них (шкіра, судини та інш.) - також еластин [Никитин, Перский, Утевская, 1977; Серов, Шехтер, 1985; Turner, Oliver, 1986; Glagov, 1994]. Конкретні механічні властивості кожного з цих різновидів сполучної тканини (міцність, жорсткість, розтяжність) в значній мірі залежать від концентрації обох білків, характеру розподілу їх надмолекулярних утворень - волокон та будови останніх, перш за все кількості в них поперечних ковалентних зв(язків [Хорошков, 1980; Paoli, Morchio, 1983]. В свою чергу усі ці структурні параметри визначаються характером обміну колагену та еластину - інтенсивностями їх синтезу і про-цесінгу, який відбувається як на молекулярному, так і на надмолекулярному рівнях.

У величезній кількості процесів життєдіяльності ( ріст, загоєння ран, періодичні зміни будови органів жіночого репродуктивного тракту, різні патології сполучної тканини) обмін колагену та еластину змінюється [Слуцкий, 1969]. Структурно-функціональні перебудови сполучної тканини органів, що відбуваються при цьому, відповідають зміненим вимогам організму до них. Серед причин, що викликають таку зміну обміну, важлива роль належить механічному навантаженню органів, яке веде до деформації клітин сполучної тканини. У великій кількості досліджень in vivo показано існування зв(язку між механічним напруженням сполучної тканини та концентрацією в ній колагену і властивостями його надмолекулярних утворень [Цедерс, Слуцкий, 1975; Бэр, Хилтнер, 1975]. В останні роки було виявлено, що деформація ізольованих фібробластів також веде до індукції синтезу ко-лагену. У цьому випадку можливий механізм передачі сигналу включає специфічні транс-мембранні рецептори - інтегрини, які при деформації клітинної поверхні передають сигнал про це за допомогою ряду внутрішньоклітинних посередників на промотори відповідних структурних генів [Hynes,1992; Meredith et. al., 1995; Sundberg,1996;].

Однак до цього часу не існує результатів досліджень впливу механічного наван-таження на процесінг колагену. Не вивчено внесок міжклітинного матриксу в механізм передачі сигналу про деформацію у клітину та його особливості.

Досі немає інформації про вплив механічного навантаження на синтез еластину. Невідомий діапазон механічних напруг, в якому може відбуватися індукція синтезу колагену та еластину, а також його вікові особливості.

Не вивчалися особливості причинно-наслідкових зв(язків у ланцюзі: обмін колагену та еластину - структура їх надмолекулярних утворень - властивості сполучної тканини при дії механічного напруження.

Недостатньо вивчена можливість спрямованої дії біологічно активних речовин різного походження на формування структурно-фунціональних властивостей сполучної тканини шляхом впливу на деякі етапи обміну колагену.

У зв(язку з цим результати, отримані при вивченні впливу механічного навантаження на синтез еластину, колагену та ключові стадії його процесінгу in vivo та in vitro в різних органах, можуть вносити певний вклад у сучасні уявлення про регуляцію процесів морфогенезу і розвитку сполучної тканини, а також мають важливе значення для герон-тології, педіатрії, та клініки захворювань сполучної тканини.

Зв(язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана у НДЧ Харківського університету в межах тем “Структурно-метаболічні механізми адаптації сполучної тканини до дії екстремальних факторів”, № держреєстрації 0197U003060 і “Адаптаційні зміни метаболізму та структури опорних білків сполучної тканини під дією екстремальних факторів”, № держреєстрації 0198U4005758.

Мета та завдання дослідження. Встановити, як впливає механічне навантаження на синтез колагену та еластину, процесiнг колагену, структуру та в(язко-пружнi властивості сполучної тканини різних органів щурів лінії Вiстар in vivo та in vitro. Вивчити, як впливає структура міжклітинного матриксу на процес передачі сигналу про механічне навантаження на синтез i процесiнг колагену. Виявити роль деяких внутрішньоклітинних ланок ланцюгу передачі сигналу про механічне навантаження в синтезі та процесінгі колагену. Для цього були поставленi такi завдання:

Вивчити вплив механічного навантаження на синтез колагену та еластину, гiдроксилювання та поперечне зв'язування колагену у шкірі, аорті, сухожиллях i серцевому м'язi in vivo та у шкірі і аорті in vitro.

Встановити межі механiчних навантажень, у яких вiдбувається індукція синтезу колагену та еластину у шкірі та аорті щурів in vitro, та їх вікові особливості.

Вивчити вплив механічного навантаження на в'язко-пружнi властивості сполучної тканини шкіри та аорти щурів in vitro.

Дослiдити вплив семiкарбазиду, хлорпромазину та iонiв кальцію на синтез та процесiнг колагену i в(язко-пружнi властивості сполучної тканини.

Наукова новизна роботи. Вперше показано, що в органах, які зазнають різних за величиною механічних навантажень in vivo (шкіра, аорта, серцевий м(яз, сухожилля), інтенсивність синтезу колагену та еластину, рівень гідроксилювання проліну в колагені, а також ступінь його поперечного зв(язування різні. Порівняльний аналіз отриманих даних показує, що у кожному органі співвідношення інтенсивностей синтезу обох білків і вивчених стадій процесінгу колагену веде до формування в(язко-пружних властивостей сполучної тканини, оптимальних відносно до величини та розподілу механічних напруг, що припадають на цей орган. Виявлена позитивна кореляція між величиною механічного навантаження та інтенсивностями синтезу еластину, колагену, гідроксилювання проліну та поперечним зв(язуванням колагену в різних органах.

In vivo та in vitro вперше виявлено, що механічне напруження викликає індукцію синтезу еластину.

In vitro вперше показано, що відповідь клітин аорти та шкіри 3- та 12-місячних щурів на деформацію складається з інтенсифікації синтезу колагену і зниження ступеня гідрок-силювання у ньому проліну. При цьому рівень поперечного зв(язування колагену у одноріч-них щурів зі зростанням навантаження спочатку підвищується, а потім знижується; у 3-місячних - ця залежність має протилежний характер

Виявлено, що механічні напруги, при яких спостерігаються максимальні величини інтенсивностей синтезу та концентрацій колагену в шкірі та аорті щурів, у 3-місячних тварин вищі ніж у 12-місячних. Це може бути пов(язане з більшою жорсткістю міжклітинного матриксу сполучної тканини однорічних тварин, за рахунок вищого ступеня поперечного зв(язування в ньому колагену.

На прикладі шкіри in vitro виявлено, що в умовах дії механічного навантаження у присутності семікарбазиду - блокатору утворення поперечних ковалентних зв(язків у колагені - спостерігається зниження концентрації колагену в тканині, яке пов(язане, можливо, з порушеннями у ланцюзі передачі сигналу від міжклітинного матриксу до ядра.

Вперше показано, що в безкальцієвому оточенні у відсутності напруги спостері-гається підвищення, а в оточенні з 2,5 мМ Са2+ - зниження інтенсивності синтезу колагену, що може свідчити про участь кальційзалежних білків, зокрема комплексу Са/кальмодулін, в передаванні сигналу на промотори структурних генів колагену.

Теоретичне та практичне значення. Проведені дослідження дозволяють виявити внесок міжклітинного матриксу в механізм передачі сигналу про дію механічного напруження на структурні гени колагену та еластину і гени, які відповідають за синтез деяких ферментів процесінгу колагену. Виявлені етапи обміну колагену, які безпосередньо впливають на в(язко-пружні властивості сполучної тканини при дії на неї механічного навантаження. Вивчена дія біологічно активних речовин (Са2+, ЕГТА, хлорпромазин, семікарбазид), що дозволяють виявити роль внутрішньоклітинних посередників в регуляції інтенсивності різних етапів обміну колагену та спрямовано регулювати і задавати в(язко-пружні властивості його надмолекулярних утворень і сполучної тканини в цілому.

Одержані результати дозволяють доповнити сучасні уявлення про молекулярні ме-ханізми становлення функціональних властивостей сполучної тканини у нормі та патології. Вони можуть бути використані у спортивній медицині, педіатрії, геронтології, а також у кліниці захворювань сполучної тканини.

Особистий внесок здобувача: підбір, обробка та аналіз літературних даних; участь у постановці наукової задачі; вибір і реалізація аналітичних методів ії вирішення; участь у розробці схеми можливих механізмів структурної адаптації міжклітинного матриксу сполучної тканини різних органів щурів до впливу механічного навантаження; аналіз та інтерпретація одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати і основні положення роботи доповідались на: XIV з(їзді Українського фізіологічного товариства (Київ, 1994), симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 1994), II конгресі патофізіологів України (Київ, 1996), VII Українському біохімічному з(їзді (Київ, 1997), XV з(їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998), III Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 1998), II з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 робіт.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, розділів: літературний огляд, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення, підсумкових висновків та переліку використаної літератури із 22 наймену-вань. Роботу викладено на 120 сторінках друкованого тексту, вона містить 5 таблиць і 18 рисунків.

Літературний огляд

У першому розділі роботи надано обсяг літератури за темою дисертації. Особливу увагу приділено опису синтезу та процесінгу колагену і еластину та впливу на деякі стадії їх обміну біологічно активних речовин різного походження. Наведені дані про будову цих білків та їх надмолекулярних утворень, а також про зв(язок їх структурних параметрів з в(язко-пружними властивостями сполучної тканини органів.

Розглянута роль механічного навантаження у формуванні структурно-функціональних властивостей сполучної тканини різних органів.

Наведені сучасні уявлення про молекулярні механізми передачі сигналу на промотори структурних генів колагену при дії механічного навантаження на сполучну тканину.

Матеріали та методи досліджень

Дослідження були проведені на 3- і 12-місячних щурах - самках лінії Вістар in vivo та in vitro. Об(єктом досліджень були колаген хвостових та ахілових сухожиль, шкіри спини, аорти, серцевого м'язу; еластин шкіри спини та аорти і сумарні білкі шкіри, аорти та серцевого м'язу. Вивчали обмін колагену та еластину (інтенсивність синтезу та концентрацію обох білків у тканинах, ступінь гідроксилювання проліну в колагені та ступінь його поперечного зв'язування), а також в'язко-пружні властивості (міцність, жорсткість, розтяжність) сухожиль, шкіри та аорти.

У дослідах in vivo щурам робили внутрішньочеревні ін(єкції 14С- і 3Н- проліну з рахунку 0,5 мБк/г маси тіла за 48 годин до початку досліду.

У дослідженнях in vitro зразки тканин інкубували у розчині Рінгера-Кребса, що містив 3Н-пролін або 14С-аланін, протягом 6 годин при 37(С, як без напруги, так і під дією механічного навантаження [Лебедев, 1978; Martens, 1989]. Шкіру та аорту під час інкубації піддавали розтягуванню в діапазоні статичних напруг 0-5х105Н/м2 уздовж продольного напрямку зразків.

Інтенсивність синтезу колагену та еластину оцінювали за питомою радіоактивністю у них 14С-оксипроліну або 3Н-оксипроліну [Замараева, 1977; Лебедев, 1978; Martens, 1989] і 14С-аланіну [Foster, 1982] відповідно.

Ступінь гідроксилювання проліну у колагені визначали за відношенням 3Н-Опро/(3Н-Про+3Н-Опро) [Berg, 1982] після розподілу радіоактивних проліну та оксипроліну [За-мараева, 1977].

Концентрацію колагену та еластину оцінювали за вмістом оксипроліну [Stegemann, Stalder, 1967] після розподілу цих білків [Слуцкий, 1969].

Ступінь поперечного зв(язування колагену сухожиль та шкіри оцінювали за його роз-чинністю у 1 М розчині NaCl [ Утевская, Перский, 1982], а колагену аорти та серцевого м(язу - у 0,5 М розчині СН3СООН, що містив 2,5% пепсину [Никитина, 1993], для цих розчинів за допомогою електрофорезу в ПААГ була показана практично повна відсутність поліпептид-них ланцюгів, що зв(язані ковалентно.

Сумарну концентрацію інших білків вимірювали за тирозином [Арасимович, Ермаков, 1987].

Величини міцності на розрив, модуля Юнга в області пружної деформації та величину непружної деформації розраховували за кривими напруга-деформація для зразків тканин [Александер, 1970; Перский, 1987].

У частині експериментів досліджували вплив семікарбазиду (20 мМ), іонів Са2+ (2,5 мМ), ЕГТА (5мМ) та хлорпромазину (0,1 мМ) на досліджувані стадії обміну колагену шкіри та аорти і їх механічні властивості в умовах інкубації in vitro, що були наведені раніше.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.

2. Результати досліджень та їх обговорення

Обмін, склад та в(язко-пружні властивості сполучної тканини різних органів.

Для вивчення зв(язку між обміном колагену та еластину, вмістом цих білків, характеристикою їх надмолекулярних структур в тканинах та її в(язко-пружними властивостями, вивчені органи було розподілено на три групи - два типа сухожиль, шкіра та аорта, стінки лівого і правого шлуночків та міжшлункова перегородка. Надмолекулярні утворення сполучної тканини органів у кожній з цих груп зазнають аналогічних за характером, але різних за величиною функціональних (механічних) напружень, а їх біохімічний склад є достатньо схожим.

Так, ахілові сухожилля в організмі зазнають значно більших навантажень, ніж хвостові. Відповідно з цим, міцність на розрив і модуль Юнга в області лінійної деформації, що характеризує жорсткість, приблизно в два рази вище, а область непружної деформації приблизно в два рази нижче у ахілових, ніж у хвостових сухожиль (табл. 1). В сухожиллях ці властивості загалом визначаються концентрацією колагену та структурою його надмоле-кулярних утворень.

Характерно, що інтенсивність обміну колагену в хвостових сухожиллях вище, ніж в ахілових, про що свідчить менша питома радіоактивність в них 3Н-оксипроліну в колагені останніх (табл. 2). Це також вказує на більшу зрілість і структурно-метаболічну стабільність ахілових сухожиль у порівнянні з хвостовими.

При подібному характері розподілу механічних напружень в шкірі та стінці аорти, величини цих напруг у шкірі вище. У той же час стінка аорти зазнає значно більших оборотних відносних деформацій. Ці функціональні особливості обох органів забезпе-чуються різницями їх механічних властивостей.

Так, міцність шкіри практично в два рази вище, а її розтяжність в області непружної деформації в три рази нижче, ніж стінки аорти. При цьому остання в області пружної деформації має більшу жорсткість, що забезпечує оборотність в циклах її розтягування-зтягування (табл. 1). У свою чергу різниці механічних властивостей шкіри та аорти виз-начаються їх структурно-метаболічними характеристиками. Саме так більша міцність і мен-ша розтяжність шкіри у порівнянні з аортою забезпечуються значно більшою концентрацією в ній колагену і більш високим ступенем його поперечного зв(язування (табл. 2). На відміну від сухожиль в(язко-пружні властивості шкіри і аорти багато в чому залежать від вмісту еластину. Його концентрація в аорті приблизно в три рази вища, ніж у шкірі (табл. 2), що визначає значно більшу здібність її стінки до високих величин оборотних деформацій.

Так саме, як і у випадку сухожиль більша структурна стабільність надмолекулярних колагенових утворень шкіри пов(язана з нижчим рівнем обміну цього білку в ній у по-рівнянні з аортою (табл. 2).

Серцевий м(яз чинить не тільки пасивний (за рахунок колагенових), але й активний (за рахунок м(язових волокон) опір прикладеному до нього напруженню. Тому існує зв(язок між вмістом колагену, м(язових білків і механічним навантаженням, яке розвивається в різних відділах серця. Так, вміст колагену є мінімальним в стінці лівого, максимальним в стінці правого шлуночків і має проміжне значення в міжшлунковій перегородці (табл. 2). Це корелює з тим, що стінка лівого шлуночка, яка зазнає максимального кров(яного тиску, вміщує найбільшу кількість міофібрил, а в стінці правого шлуночка, який не зазнає такого тиску, їх значно менше [Слуцкий, 1969].

Так саме, як і в інших досліджених органах, інтенсивність синтезу колагену в відділах серця оберненопропорціональна ступеню стабільності його надмолекулярних утворень (табл. 2).

Таким чином, загальні закономірності зв(язку між інтенсивністю обміну колагену та еластину і структурною роллю, яку вони виконують у вивчених різновидах сполучної тка-нини, свідчать, що ці структурно-метаболічні особливості тісно корелюють з механічними напруженнями, яких зазнають ці різновиди.

Вплив механічного навантаження на обмін, склад та в(язко-пружні властивості шкіри та аорти in vitro. Результати досліджень в(язко-пружних властивостей обох органів свідчать, що під дією вивчених навантажень вони стають більш жорсткими і менш розтяжними (табл.3). Що ж стосується міцності, то в області напруг, де відбувається підвищення жорсткості, вона достовірно не змінюється, а при зниженні жорсткості - зменшується.

Природно, що така зміна в(язко-пружних властивостей сполучної тканини обох органів повинна залежати від впливу механічного навантаження на обмінні процеси в ній.

На рис. 1 наведені залежності концентрацій колагену, еластину та тирозину від напруження в шкірі та аорті після їх інкубації. В обох органах для колагену та еластину ці залежності являють собою криві з максимумом, який припадає практично на ту ж саму область напруг - (2,1-2,4) х 105 Н/м2

З рис. 2 видно, що загальні інтенсивності синтезу обох білків, яка визначається за питомою радіоактивністю 3Н-оксипроліну для сумарного колагену та 14С-аланіну для сумарного еластину, також являють собою криві з максимумом при (0,4-0,8) х105 Н/м2. Це вказує, що залежність концентрації цих білків в шкірі та аорті від напруги є результатом зміни інтенсивності їх синтезу. Важливо, що в обох органах області, де спостерігаються максимуми включення радіоактивних амінокислот до колагену та еластину та максимуми концентрацій цих білків, збігаються. Це може свідчити про те, що в різних органах відповідь сполучної тканини на деформацію якісно подібна і специфічна для клітин, що синтезують колаген та еластин.

Слід вказати, що загальна інтенсивність синтезу - це інтегральний показник, який залежить як від всієї кількості синтезуючих клітин, так і від інтенсивності синтезу в кожній з них. Дані рис. 2 вказують, що в області (0,9-5) х 105 Н/м2 на фоні зниження питомої ра-діоактивності 3Н-оксипроліну в загальному колагені шкіри та аорти, питома радіоактивність свіжосинтезованого колагену продовжує рости. Такий ефект може свідчити про підвищення інтенсивності синтезу колагену в окремих клітинах протягом всього дослідженого діапазону напруг. Зниження ж загальної інтенсивності синтезу обох білків може бути пов(язане з порушенням або цілісності частини синтезуючих клітин, або структури міжклітинного матриксу під впливом великих напруг, або обома ефектами разом. В зв(язку з цим передача сигналу про механічне навантаження на клітинну поверхню змінюється.

З рис. 3 видно, що, судячи з динаміки залежності розчинності колагену, ступінь поперечного зв(язування його надмолекулярних структур спочатку знижується ((0-2,4) х 105 Н/м2), а потім знову підвищується, хоча й не досягає первинного рівня. Можна припустити, що це зниження поперечного зв(язування може бути наслідком зміни характеру передачі сигналу в умовах великих деформацій тканини.

Виявлене зменшення ступеня поперечного зв(язування колагену є також однією з при-чин зменшення міцності сполучної тканини (табл.3), що спостерігається в дослідах in vitro.

Рівень гідроксилювання проліну в колагені шкіри та аорти при дії невисоких ((0-1)(105 Н/м2) навантажень становить близько 0,5, а при подальшому рості навантаження знижується, досягаючи у шкірі величини 0,38+0,012, а в аорті - 0,35+0,011.

Таким чином, у 3-місячних щурів in vitro відповідь клітин сполучної тканини на деформацію, окрім індукції синтезу колагену та еластину, веде, можливо, до інгібірування деяких стадій процесінгу колагену.

Залежності концентрації тирозину від навантаження в шкірі та аорті наведені на рис.1. У шкірі під впливом деформації вміст тирозину змінюється так само, як і вміст колагену та еластину, а в аорті динаміка його концентрації має протилежний характер. Оскільки тиро-зин є показником білків, які в першу чергу входять до складу глікопротеінів та протео-гліканів і являють собою структурні компоненти міжклітинного матриксу [Robert, Moczar, 1985], одержані дані свідчать, що перебудови його структури, в яких беруть участь протеоглікани та глікопротеіни, мають в шкірі та аорті протилежний характер. Це, очеви-дно, пов(язане з особливостями функціональних властивостей цих органів.

Таким чином, проведене дослідження виявляє, що навіть in vitro в тканинах збері-гаються механізми, які здійснюють їх адаптацію до механічних навантажень за рахунок існування позитивного зворотного зв(язку у ланцюзі: механічне навантаження, що прикла-дено до тканини - обмін структурних елементів її міжклітинного матриксу - зміна в(язко-пружних властивостей тканини.

Вплив віку тварин та семікарбазиду на характер клітинної відповіді при дії механічного навантаження в шкірі та аорті. В розділі розглядається питання про зв'язок між будовою колагенового матриксу і особливостями передачі сигналу про механічне навантаження до ядра.

Для з'ясування цього питання було вивчено вплив віку тварин на клітинну відповідь шкіри та аорти при дії на них механічного навантаження in vitro.

На рис. 4 наведені дані про залежність концентрації колагену в шкірі та аорті від механічного навантаження у 3- та 12-місячних щурів. Як видно, максимальне значення кон-центрацій колагену спостерігається при набагато менших напругах у 12-місячних щурів, ніж у 3-місячних (рис. 4). Цій ефект є результатом аналогічних змін в інтенсивності синтезу цього білку (рис. 5).

При цьому ступінь гідроксилювання проліну в колагені шкіри та аорти у 12-місячних щурів, як і у 3-місячних, зменшується зі зростанням напруження і становить при макси-мальних навантаженнях ((=1,8 х 105 Н/м2 для шкіри та (= 2,0 х 105 Н/м2 для аорти) 0,35+ 0,011 та 0,33+ 0,012 відповідно.

Відомо, що однією з основних змін у будові колагенових структур з віком є збіль-шення в них поперечних ковалентних зв'язків, що в значній мірі підвищує жорсткість і знижує розтяжність тканини [Viidik,1985].

Для перевірки припущення про те, що поперечне зв'язування колагену може змінювати відповідь клітин на механічне навантаження, було вивчено вплив семікарбазиду на концентрацію та розчинність колагену шкіри в процесі ії інкубації in vitro з різними напругами. Семікарбазид у концентрації 20 мМ заважає утворенню поперечних ковалентних зв'язків в колагені [Слуцкий,1972].

З рис. 6А видно, що при інкубації з додаванням семікарбазиду у відсутності напруги концентрація колагену в шкірі знижується і навіть при максимальних навантаженнях вона не перевищує норми. Що стосується ковалентно зв'язаного колагену, його кількість, судячи з розчинності, різко зменшується (рис. 6Б).

Таким чином, одержані дані підтверджують припущення про те, що колагеновий матрикс сполучної тканини бере участь в передаванні сигналу про механічне навантаження. При цьому ступінь його жорсткості, яка визначається кількістю у ньому поперечних ковалентних зв'язків, впливає на величину напруження, при якому виникає клітинна відповідь.

Вплив Са2+ і хлорпромазину на обмін, структуру та в(язко-пружні властивості шкіри та аорти. Результати, наведені на рис. 7.1. і 7.2, показують, що при інкубації у при-сутності хлорпромазину (0,1мМ) або ЕГТА (5 мМ), який пов(язує позаклітинний кальцій, відбувається підвищення, а при інкубації у гіперкальцієвому оточенні (2,5 мМ) - зниження концентрації як загального, так і свіжосинтезованого колагену в шкірі та аорті. Цей ефект безпосередньо пов(язаний з відповідними змінами питомої радіоактивності 3Н-оксипроліну і в загальному, і в свіжосинтезованому колагені обох органів (рис. 7.3., 7.4).

Оскільки позаклітинний кальцій є посередником великої кількості внутрішньоклі-тинних процесів, у тому числі тих, що впливають на синтез білків [Hennigs, Holbrook, 1983; Gerday, Gilles, Bolis, 1988], одержані результати можна використовувати, як модель, що дозволяє запропонувати можливий механізм зв(язку між навантаженням у тканині і синтезом колагену в діапазоні їх пропорційної залежності. Одним з важливих компонентів у ланцюзі передачі сигналу про механічне навантаження від поверхні клітини до ядра є комплекс Са/кальмодулін [Klee, Crouch, Richman, 1980].

В гіперкальцієвому середовищі, коли кальцій поступає до клітини за рахунок концен-траційного градієнту, повинна утворюватися достатня кількість активних комплексів Са/кальмодулін, що супроводжується зниженням синтезу колагену (рис. 7.3, 7.4).

У відсутності іонів кальцію (при додаванні ЕГТА) різко знижується можливість утворення таких активних комплексів, тому що частка внутріклітинного кальцію виходить у міжклітинний простір. Хлорпромазин, що у вивченій концентрації входить у клітину і являє собою класичний антикальмодуліновий агент [Kuo, 1992; Klimowski, 1983], теж заважає ви-никненню достатньої кількості комплексів Са/кальмодулін. Як видно, в обох цих випадках при зменшенні числа активних комплексів Са/кальмодулін відбувається підвищення синтезу колагену (рис. 7.3., 7.4.).

При дії механічного навантаження на вивчені органи в них також спостерігається індукція синтезу колагену (рис. 2). Відомо, що при деформації клітин (наприклад фібробластів) змінюється структура їх цитоскелету, що веде до перебудови структурно-функ-ціонального зв(язку між компонентами ланцюгу передачі сигналу від міжклітинного мат-риксу через поверхню клітини до її ядра [Butt, Bishop, 1997].

Таким чином, одним з механізмів, що визначає збільшення синтезу колагену при механічному навантаженні, може бути зміна структурно-функціонального ланцюгу переносу сигналу у тканині. Одержані результати свідчать, що одним з елементів цього ланцюгу, який безпосередньо впливає на синтез колагену можливо є комплекс Са/кальмодулін.

У порівнянні з міцністю і розтяжністю шкіри (( = (3,3+0,44) ( 105 Н/м2, ( =16 %), яку інкубували при звичайних умовах, після ії інкубації у гіперкальцієвому оточенні ці меха-нічні властивості практично не змінюються (( = (4,0 + 0,56) х 106 Н/м2, ( = 17,5 %), а після інкубації у присутності ЕГТА міцність значно знижується (( = (0,69+ 0,015) х 106 Н/м2), а її розтяжність підвищується (( = 27%).

Відомо, що Са2+ є ініціатором утворення поперечних зв(язків між неколагеновими біл-ками в міжклітинному матриксі [Альбертс, Брей, Льюис и др., 1994]. Тому збільшення його концентрації у тканині веде до підвищення її міцності, а зниження - до зменшення цього показника.

Як видно з рис.7, після інкубації при підвищеній концентрації Са2+ вміст колагену в тканині знижується, а при його відсутності - збільшується.

Цей ефект можна розглядати, як адаптивний процес, що спрямований на збереження первинних механічних властивостей тканини.

Висновки

In vivo та in vitro проведено порівняльне дослідження впливу механічного навантаження на синтез колагену, еластину, посттрансляційні та постсинтетичні модифікації колагену в шкірі, аорті, сухожиллях та відділах серця, а також на в(язко-пружні властивості цих органів у 3- та 12-місячних щурів.

Показано, що in vivo в органах, які зазнають у порівнянні з іншими більших механічних навантажень, підвищується концентрація колагену та інтенсивність його синтезу, ступінь гідроксилювання у ньому проліну та його поперечного зв(язування. Рівень інтенсифікації кожного з цих процесів залежить від типу тканини.

На прикладі шкіри та аорти in vivo показано, що концентрація в них еластину корелює не з величинами напружень, яких вони зазнають, а зі ступенем максимальних зворотних деформацій цих органів.

Показано, що in vivo в діапазоні фізіологічних навантажень співвідношення концентрацій еластину та колагену, а також рівень модифікацій останнього формують оптимальні по відношенню до величини та розподілення механічних навантажень в(язко-пружні властивості сполучної тканини органів.

Показано, що in vitro, під дією механічного навантаження інтенсивності синтезу і концентрації колагену та еластину в шкірі та аорті щурів спочатку збільшуються після чого починають знижуватися. При цьому максимуми інтенсивностей цих залежностей у 12-місячних щурів спостерігаються при менших величинах навантажень, ніж у 3-місячних.

In vitro показано, що в шкірі та аорті тварин різного віку під дією механічного наван-таження відбувається постійне зниження ступеня гідроксилювання проліну в колагені - внутрішньоклітинної стадії його процесінгу. У той же час інтенсивність позаклітинної стадії процесінгу колагену - ступінь його поперечного зв(язування - залежить від віку тварин. У 3-місячних щурів зі зростанням навантаження вона спочатку знижується, а потім - підвищується; у 12-місячних - ця залежність має протилежний характер.

На підставі вивчення впливу Са2+ та хлорпромазину на інтенсивність синтезу та концентрацію колагену в шкірі та аорті 3-місячних щурів in vitro висунуто припущення, що збільшення кількості комплексів Са/кальмодулін призводить до інгібірування , а її зменшення - до інтенсифікації синтезу колагену. Припущено, що інтенсифікація синтезу колагену в шкірі та аорті при дії механічного навантаження відбувається за рахунок зниження внутрішньоклітинної концентрації іонів Са при їх виході з клітини в резуль-таті появи в її мембрані додаткових пор у процесі деформації.

Показано, що жорсткість міжклітинного матриксу сполучної тканини, що залежить від ступеня поперечного зв(язування в ньому колагену, визначає величину напруження, при якому відбувається клітинна відповідь на нього.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Перский Е.Э., Кузнецов И.В., Гарбузенко О. Б. Температурная зависимость некоторых стадий обмена коллагена в коже крыс in vitro // ДАН Украины. - 1997. - № 1. - С. 170-173.

2. Garbuzenko O.B., Kuznetsov I.V., Naglov A.V., Nikitina N.A., Persky E.E., Utevskaya L.A. Structural and metabolic mechanisms of collagen adaptation to endogenous and exogenous factors effects // School of fundamental medicine journal. - 1997. - V. 3, № 1. - Р. 27-30.

3. Кузнецов И.В., Гарбузенко О.Б., Кузьмис А.Э., Никитина Н.А., Перский Е.Э., Утевская Л.А. Особенности обмена коллагена в коже позвоночных животных при температурной адаптации // Проблемы криобиологии. - 1997. - № 3. - С. 27-31.

4. Гарбузенко О.Б., Емец Е.Б., Перский Е.Э. Влияние деформации на обмен белков и механические свойства аорты и кожи крыс in vitro // Вестн. пробл. биол. и мед. - 1997. - № 25. - С. 12-18.

5. Гарбузенко О.Б., Перский Е. Э. Влияние охлаждения на обмен коллагена и эластина в коже крыс при различных напряжениях // Проблемы криобиологии. - 1998. - № 1. - С. 66-67.

6. Перський Є.Е., Гарбузенко О.Б., Кузнєцов І.В., Наглов О.В., Нікітіна Н.А., Утевська Л.А. Роль окремих етапів синтезу в “швидкій” адаптації колагенових структур хребетних до різних температур // XIV з(їзд Українського фізіол. тов. - Тез. доп., Київ. - 1994. - С. 59.

7. Гарбузенко О.Б., Кузнецов І.В., Наглов О.В., Нікітіна Н.А. Біохімічні механізми резистентності колагенових структур сполучної тканини до дії пошкоджуючих фак-торів // ІІ конгрес патофізіологів України. - Тез. доп., Київ. - 1996. - С. 148.

8. Гарбузенко О.Б., Наглов О.В., Утевська Л.А., Перський Є.Е. Молекулярні механізми змін структури міжклітинного матриксу сполучної тканини при механічному навантаженні // VII Український біохімічний з(їзд. - Тез. доп., Київ. - 1997. - Т. ІІ. - С. 136-137.

9. Гарбузенко О.Б., Кузьміс А.Е., Нікітіна Н.А., Перський Є.Е. Вплив деформації на обмін білків та механічні властивості аорти щурів in vitro // Мат. XV з(їзду Українського фізіол. тов. - Фізіологічний журнал. - 1998. - Т. 44, № 3. - С. 148-149.

10. Перский Е.Э., Гарбузенко О.Б., Кузьмис А.Э., Васильева Л.В. Возрастные особенности функциональных возможностей коллагенсинтезирующих клеток // ІІІ Международный симпозиум “Биологические механизмы старения”. - Тез. докл., Харьков. - 1998. - С. 26.

11. Гарбузенко О.Б., Наглов О.В., Нікітіна Н.А., Перський Є.Е. Обмінні механізми зміцнення сполучної тканини під дією механічного навантаження // ІІ з(їзд Українського біофіз. тов. - Тез. доп., Харків.- 1998. - С.120.

Размещено на Allbest.ru