Перекисне окислення ліпідів та функціональний стан еритроцитів великої рогатої худоби при лейкозі

Размещено на http://www.allbest.ru/

КАБІНЕТ МІНІСТРІВ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 619: 616. 9. 578. 828.11: 577. 1: 636. 2

КОВАЛЕНКО Лариса Володимирівна

ПЕРЕКИСНЕ ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ЕРИТРОЦИТІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ ПРИ ЛЕЙКОЗІ

03. 00. 04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН та відділах біохімії і біофізики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Білоус Аполон Максимович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, головний науковий співробітник

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, Лазарєв Олексій Павлович, Інститут ветеринарої медицини УААН, завідувач лабораторії біохімії - доктор медичних наук, професор Шляховенко Володимир Олексійович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Е. Кавецького НАН України, завідувач відділу ензимології

Провідна установа - Харківський державний університет, кафедра біохімії.

Захист дисертації відбудеться «_12__» березня 1999 р. о 14. 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 004. 08 у Національному аграрному університеті за адресою: 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 11, навчальний корпус 10.

окислення ліпід еритроцит лейкозна інфекція

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Широке розповсюдження лейкозу (М.О. Алексєєв, І.В. Воронцов 1988; В.П. Шишков і співавт., 1988; П.А. Сімонян 1995; П.П. Достоєвський, 1997; S.G. Hopkins, R.F. Digiacomo, 1996), подібність його патогенезу у людини і тварин, а також наявність загальних детермінант вірусів даної інфекції у великої рогатої худоби та Т-клітинного лейкозу людини ставлять дослідження лейкозу великої рогатої худоби в ряд важливих загальнобіологічних та народногосподарських завдань (З.А. Бутенко і співавт., 1984, 1989; М. С. Мандигра, 1995; В. І. Цимбал, 1998).

На фоні опублікованих наукових праць, присвячених вивченню етіопатогенезу лейкозів (Д. Ф. Глузман 1978; В.О. Шляховенко і співавт., 1993, І.В. Анікін і співавт., 1998; T.M. Cherney, R.P. Schuliz, 1996), властивостей білих клітин крові (В.Б. Бронштейн, 1979; М.І. Гулюкін і співавт., 1989; Н.В. Кузнєцова і співавт., 1992; M. van Lindern at all., 1992), є дуже незначна кількість робіт, автори яких вивчали метаболічні та структурно-функціональні зрушення еритроцитів при зазначеній патології у людини та сільскогосподарських тварин. Встановлено, що при лейкозі змінюється форма клітин (А.А. Раков і співавт., 1990), інтенсивність метаболічних процесів в них (О.М. Григор'єва, 1979) та склад фосфоліпідів мембран еритроцитів (В.П. Вендт, 1975); порушується їх кислотно-осмотична резистентность (Г.П. Кадирова, 1969; Л.В. Рогожина, Е.В. Люляєва, 1987; О.Г. Зибунова, 1994). Однак ці дані не дозволяють встановити загальні закономірності та характер біохімічних змін в еритроцитах, які призводять до зниження парціального тиску кисню в тканинах хворих на лейкоз тварин (П.А. Петраков, 1989) та розвитку анемії на термінальній стадії хвороби (В.П. Шишков і співавт., 1986).

Базуючись на літературних даних про враження вірусом лейкозу стволових поліпотентних клітин кісткового мозку (З.А. Бутенко, 1985; М.Н. Блінов, 1990; Р.П. Гейл, Д. Буттуріні, 1991), можна прогнозувати вірусіндуковані зміни біохімічних процесів в еритроцитах, які призводять до порушення функціонального стану цих клітин, і тим самим спричиняють розвиток вторинних патохімічних змін у хворому на лейкоз організмі.

Виходячи з вищесказанного, проведені нами дослідження були зосереджені на вивченні особливостей модифікації біохімічних процесів в мембранах та цитоплазматичних функціональних системах еритроцитів великої рогатої худоби в динаміці лейкозного процесу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності до наукової тематики «Створення інтегрованої системи захисту великої рогатої худоби від лейкозу» (номер державної реєстрації 0197V000756).

Мета і задачі досліджень. Мета роботи полягає у виявленні особливостей процесів перекисного окислення ліпідів мембран та функціонального стану еритроцитів великої рогатої худоби на різних стадіях розвитку спонтанного лейкозу.

У зв'язку з цим були поставлені такі задачі:

1) дослідити рівень перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), а також активність глутатіонзалежних ферментів - глутатіонпероксидази (GSH-Р; КФ. 1. 11. 1. 9) і глутатіонредуктази (GSH-R; КФ. 1. 6. 4. 2) ;

2) встановити характер модифікації білків примембранного каркасу еритроцитів;

3) вивчити стан проникливості мембран еритроцитів для іонів кальцію в динаміці лейкозного процесу;

4) дослідити вплив лейкозної інфекції на кількісні та якісні характеристики гемоглобіну;

5) з'ясувати швидкість розпаду фосфорорганічних сполук (АТP, АDP) в еритроцитах за допомогою методу ядерного магнітного резонансу (ЯМР).

Наукова новизна одержаних результатів. Дані, які висвітлюють характер змін ряду структурно-функціональних систем еритроцитів великой рогатої худоби при лейкозі, отримані вперше. Встановлено, що еритроцити залучаються до патологічого процесу вже на прихованій стадії лейкозу, про що свідчить порушення рівноваги у співвідношенні форм гемоглобіну: підвищується вміст метгемоглобіну (Hi) та знижується оксигемоглобіну (HbO). Зростає також активність GSH-P, що є однією з причин зниження інтенсивності процесів ПОЛ на наступній, сублейкемічній стадії лейкозу. Поряд з цим відбувається зниження активностi GSH-R, інтенсивності проникнення Са²⁺ в еритроцити та посилення асоціативних зв'язків спектрину з якірними білками мембран еритроцитів. Лейкемічна стадія характеризується поглибленням патологічних зрушень у червоних клітинах крові. Встановлені біохімічні зміни структурного та функціонального стану систем клітини тісно пов'язані зі зміною метаболізму фосфорорганічних сполук та з пониженою здатністю еритроцитів підтримувати оптимальний рівень рН без доступу глюкози з розвитком лейкозу.

Практичне значеня одержаних результатів. Отримані дані дозволили встановити механізми змін структурно-метаболічних процесів як в еритроцитах, так і цілому організмі при лімфопроліферативних захворюваннях, що перебігають з розвитком імунодефіцитного стану. Результати роботи враховані при розробці наукової тематики Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, в лабораторіях біохімії та вивчення хвороб молодняка якого запроваджено ряд використаних у роботі методичних підходів, а також в учбовому процесі кафедри терапії Білоцерківського державного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача у розробку наукових результатів. Здобувачем власноручно проведено клінічні, серологічні та біохімічні дослідження, а також здійснено аналітичну та математичну обробку одержаних результатів. За безпосередньої участі здобувача розроблялась методика досліджень. При виконанні деяких видів робіт консультативну і технічну допомогу надавали співробітники відповідних підрозділів наукових установ, у яких виконувалась робота. Дослідження методом ядерного магнітного резонансу проводились спільно із завідувачем лабораторії ядерно-магнітного резонансу Інституту проблем кріобіології та кріомедицини, доктором біологічних наук В. Д. Зінченком.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації були представлені на Міжнародних науково-практичних конференціях (Мінськ, 1996; Володимир, 1996; Харків, 1997), республіканських наукових та науково-практичних конференціях (Львів, 1995, 1997; Біла Церква, 1995; Харків, 1995, 1997; Рівне, 1998) та засіданнях Вченої ради Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицинии УААН (Харків, 1994 1995).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, в яких висвітлено основний зміст наукових досліджень.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту, містить 9 табл., 19 рисунків і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів власних досліджжень, висновків та списку використаної літератури з 269 джерел, з яких 80 - іноземні.

ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконана у 1993-1995 р. р. в Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, відділах біохімії і біофізики Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України.

Об'єктом дослідження були еритроцити та плазма (при визначенні інтенсивності ПОЛ), виділені з крові 130 корів 3-5 річного віку в зимовий період. За результатами гематологічних та серологічних досліджень ці тварини були розподілені на 5 груп: перша група -тварини, вільні від вірусу лейкозу великої рогатої худоби (BLV), контроль; друга - з прихованим перебігом інфекції; третя - з сублейкемічними ознаками захворювання; четверта - з лейкемічним проявом захворювання; п'ята - на клінічній стадії розвитку лейкозу.

Клінічний стан та гематологічні показники тварин визначали за допомогою загальноприйнятих методик, а напруженість специфічного імунітету - за реакцією імунодифузії.

Спектрофотометричним методом визначали кількість еритроцитів (В.Т. Заболоцький, Б.Р. Поляков, 1965) та вміст в них загального гемоглобіну (Г.В. Дервіц, А.М. Воробйов, 1959).

Для біохімічних досліджень використовували кров, яку стабілізували глюкозо-цитратною сумішшю в співвідношенні 4: 1.

Білки мембран еритроцитів досліджували методом електрофорезу в ПААГ (U.K. Laemmli, 1970), з попереднім одержанням «білих тіней» шляхом гіпотонічного лізису та їх обробкою 1% -ним розчином SDS-Na.

Оцінюючи інтенсивність процесів ПОЛ, враховували характер спонтанної та індукованої іонами Fe^2±хемілюмінісценції (ХЛ) 5% -ної суспензії еритроцитів в розчині Dulbecco (Serva). Вимірювання проводили на біохемілюменометрі БХЛ-06 протягом 3 хв. Рівень дієнових коньюгатів (ДК) в гептанових екстрактах еритроцитів та плазми крові вимірювали за допомогою спектрофотометра СФ-16 при л=232 нм (В. В. Гаврилов, М. І. Мішкорудна, 1983). Кількість малонового диальдегіду (МДА) в еритроцитах та плазмі крові визначали за допомогою реакції з тіобарбітуровою кислотою (L. A. Buege, S. D. Aust, 1975).

Активність GSH-P (КФ 1. 11. 1. 9). оцінювали за швидкістю окислення глутатіону в присутності гідроперекису третичного бутилу, використовуючи спектрофотометрію на СФ-16 (В.М. Моїн, 1986), а GSH-R (КФ. 1. 6. 4. 2) - за швидкістю окислення NADРH (Я.М. Герасімов, Л. Ф. Панченко, 1975) за допомогою двопроменевого спектрофотометра «Spekord» UV-VIS.

Швидкість входу ⁴⁵Са²⁺ в еритроцити розраховували за допомогою радіографічного методу (М.І. Покудін, В.В. Петруняка, 1988).

Вміст форм гемоглобіну в еритроцитах визначали шляхом диференційної спектрофотометрії за A. Zwart et al., (1973), використовуючи спектрофотометр PUE UNICAM SP-800.

Для неруйнівного контролю за швидкістю утилізації макроергічних сполук (АТР, АDP) використовували метод ³¹Р-ЯМР. Рівень рН в еритроцитах визначали за методикою R. B. Moon, J. M. Richards, (1973). Спектри ³¹Р-ЯМР отримували за допомогою спектрофотометра Bruker CXP-200 з робочою частотою 80, 99 Гц. Використовували 60-градіентні імпульси, які повторювались кожні 3 сек. Еритроцити отримували від здорових корів та тварин на прихованій і лейкемічній стадіях розвитку лейкозу. У кожній групі було досліджено не менше 5 тварин.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили на персональній ЕВМ з використанням критеріїв Фішера-Стьюдента.

ОСОБЛИВОСТІ КЛІНІКО - ГЕМАТОЛОГІЧНОГО ТА ІМУНОЛОГІЧНОГО СТАТУСУ ТВАРИН НА РІЗНИХ СТАДІЯХ ЛЕЙКОЗНОГО ПРОЦЕСУ

Серологічні дослідження показали, що розвиток лейкозного процесу супроводжується підвищенням титру антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби в сироватці крові з 1: 1-1: 2 на прихованій стадії інфекції до 1: 128 при клінічних ознаках захворювання. Кількість лейкоцитів в крові зростала до 17, 7+1, 35 тис/мкл і до 25, 2+5, 06 тис/мкл. на лейкемічній та клінічній стадіях відповідно, 92-98% яких становили лімфоцити. При визначенні кількості еритроцитів та вмісту в них загального гемоглобіну на стадіях, що вивчалися, в показниках здорових та хворих на лейкоз корів суттєвих відмінностей не виявлено.

Однак при дослідженні біохімічних процесів в еритроцитах було доведено, що з розвитком лейкозу великої рогатої худоби відбуваються зміни метаболічного та структурного стану мембрани і цитоплазматичних систем цих клітин, глибина прояву яких залежить від стадії інфекційного процесу.

ІНТЕНСИВНІСТЬ ПРОЦЕСІВ ПОЛ В ДИНАМІЦІ BLV - ІНФЕКЦІЇ

В еритроцитах та плазмі крові здорових корів не встановлено достовірних відмінностей між рівнем спонтанної та і індукованої хемілюмінесценції (ХЛ). Лейкозний процесс суттєво змінює інтенсивність перекисних процесів в організмі тварин (рис. 1). На прихованій та сублейкемічній стадіях прояву інфекції рівень спонтанної ХЛ еритроцитів підвищується на 22 і 27%, відповідно, а у тварин з лейкемічним перебігом неопластичного процесу ПОЛ пригнічується на 41% у порівнянні з контрольними показниками.

Інтенсивність індукованої Fе^2± ХЛ в біологічних об'єктах змінювалась по-іншому. В плазмі цей показник підвищувався в 1, 4 рази вже на прихованій стадії інфекції і залишався практично незмінним на наступних стадіях. В еритроцитах подібні зміни наставали лише на стадії гематологічного прояву лейкозу (3-тя і 4-та групи), що вказує на збереження антиоксидантних систем в цих клітинах на стадії прихованого перебігу інфекції.

Показники ХЛ характеризують загальний рівень процесів переокислення, але не розкривають їх динаміки. У зв'язку з цим ми визначали концентрацію дієнових коньюгатів (ДК) і малонового диальдегіду (МДА) в крові великої рогатої худоби на різних стадіях лейкозного процесу.

При визначенні рівня ДК було встановлено, що їх концентрація з перебігом інфекції змінюється. З даних рис. 2 випливає, що і в еритроцитах, і в плазмі крові приховано інфікованих корів (2-га група) спостерігається тенденція до зниження рівня ДК; різниця між показниками контрольної та 3-ї груп тварин стає статистично достовірною, а в еритроцитах корів 4-ї групи вміст ДК зменшується на 25% порівняно з контролем (р?0, 05). В плазмі крові виявлено незначні коливання рівня ДК, що залежали від стадії лейкозогенезу, однак найнижчийий їх рівень встановлено у тварин 4-ї групи.

Встановлене зниження концентрації вільних радикалів, ДК та МДА в мембранах еритроцитів і в плазмі крові свідчитить, що з розвитком лейкозу відбувається пригнічення процесів ПОЛ в крові великої рогатої худоби.

Це явище, очевидно, пов'язане з модифікацією ліпідного складу мембран клітин при неопластичному рості (В. П. Вендт, 1975) та виявленим нами підвищенням активності GSH-P на прихованій стадії інфекції.

АКТИВНІСТЬ ГЛУТАТІОНЗАЛЕЖНИХ ФЕРМЕНТІВ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ ЕРИТРОЦИТІВ

Виходячи з важливої ролі глутатіонзалежних ферментів у метаболізмі еритроцитів та підтриманні гомеостазу їх внутрішнього середовища ми вивчали активність GSH-P та GSH-R в еритроцитах великої рогатої худоби в динаміці лейкозного процесу. Як видно з даних табл. 1, активність GSH-P різко (на 53%) підвищується у тварин 2-ї групи і на наступних стадіях захворювання перевищує контрольні величини на 41-38%. При цьому розвиток гематологічних ознак лейкозу, якщо порівнювати з прихованою стадією інфекції, супроводжується тенденцією до зниження цього показника.

Активність ферменту GSH-R в еритроцитах корів з розвитком лейкозного процесу знижується. У хворих тварин 3-ї групи це зниження стає статистично достовірним і сягає 31%, а на лейкемічній стадії - 53% порівняно з контролем.

Порушення активності вищезазначених ферментів призводить до зміни концентрацій фракцій глутатіону еритроцитах. В клітинах здорових тварин рівень відновленого глутатіону (GSH) становить 30, 8+1, 48 мг%; розвиток гематологічних ознак лейкозу супроводжується незначним зменшенням його вмісту, а клінічна стадія характеризується достовірним зниженням цього показника на 27% порівняно з контролем. Вміст окисленого глутатіону (GS-SG) підвищується в 1, 5 раза у корів 2-ї групи, а у тварин 3-Ї і 4-ї - в 2, 5 і 3, 6 раза, відповідно, порівняно з конторольним показником 2, 7±0, 25 мг%. Еритроцити корів 5-ї групи містять в 5, 6 раза більше неактивної форми глутатіону, ніж контрольної (р?0, 001).

Таблиця 1

Активність GSH-P і GSH-R еритроцитів корів, хворих на лейкоз (М±m)

Група	Стадія процесу	n	GSH-P, мкмольGSH/ г Hb хв	GSH-R, мкмоль NADPH/ 1 г Hb хв
1	здорові тварини	20	168, 5±14, 0	4, 5±0, 5
2	прихована	20	258, 5±20, 3*	3, 8±0, 6
3	сублейкемічна	14	237, 2±20, 8*	3, 1±0, 3*
4	лейкемічна	20	233, 2±19, 9*	2, 1±0, 8*

Примітка: * - відмінності достовірні (р?0, 05) по відношенню до контролю.

Враховуючи значення глутатіону та результати власних досліджень, можна зробити висновок, що однією з причин зниження інтенсивності процесів ПОЛ в еритроцитах великої рогатої худоби за лейкозу є активація GSH-P, тоді як зменшення активності GSH-R призводить до зниження ефективності поповнення пулу GSН.

Отримані результати співпадають з даними літератури про компенсаторну активацію антиокислювальних систем в організмі людини на початкових стадіях неопластичного росту (Ю. П. Козлов, 1979; И. Я. Серкіз, 1984; Б. Т. Білинський, Т. Г. Феціч, 1992).

СТРУКТУРНО - ФУНКЦІОНАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН ЕРИТРОЦИТІВ ПРИ ЛЕЙКОЗІ

Ендогенні перекиси ліпідів є фізіологічними модифікаторами гідрофобних властивостей мембран, і частково - функції транспортних білків (Ю. П. Козлов, 1979; Ю. А. Владіміров і співавт., 1989). Тому нами були досліджені структурно-функціональні характеристики мембран за швидкістю проникнення іонів Са²⁺ до еритроцитів та вмістом мембранних білків.

Встановлено, що у здорових тварин активність проникнення ⁴⁵Са²⁺ в еритроцити досить висока і складає 1, 8 мкмоль/мл клітин за хвилину. Вже на прихованій стадії лейкозу відмічено зниження швидкості проникнення Са²⁺ в еритроцити на 23% порівняно з контролем. Розвиток інфекції характеризується подальшим гальмуванням швидкості проникненя цього іона: на сублейкемічній стадії його інтенсивність знижується більш, ніж на 50%, а у хворих з лейкемічними ознаками захворювання - на 58% (р?0, 001).

Такі зміни можуть зумовлюватись порушенням канального транспорту Са²⁺ в результаті змін властивостей поверхні мембрани клітин, модифікації їх ліпідного складу або порушенням функції Са²⁺-АТФази (H. J. Schatzman, 1982; B. Sarcadi, 1980).

Зміна інтенсивності проникнкння Са²⁺ в клітини, як правило, викликає порушення балансу ряду структурно-функціональних систем клітин та регуляторних білків, функція яких регулюється іонізованою формою Са^2± (А. М. Білоус, 1983).

Нами встановлено, що в «білих тінях» еритроцитів тварин 3-ї групи, порівняно з контролем, після екстракції сумарних білків залишається на 20% більше спектрину, а на лейкемічній стадії це збільшення становить 35% і стає статистично вірогідним. Підвищується також вміст актину (табл. 2). В той же час кількісне співвідношення вмісту інших білків цитоскелету суттєво не змінювалось.

Підвищення вмісту спектрину, який залишається в «білих тінях», може бути пов'язане з утворенням міцніших зв'язків спектрину з якірними білками мембрани.

Таблиця 2

Склад мембранних білків (%) в «білих тінях» еритроцитів корів, хворих на лейкоз (M±m)

Групи та стадії процесу	n	Фракція білків. Мол. маса, кД
		спектрин 220-240	білок полоси 3 95	актин 43
1-здорові тварини	10	7, 7±0, 3	11, 4±0, 3	3, 1±0, 7
2-прихована	10	7, 5±0, 6	12, 1±0, 4	4, 0±0, 5
3-сублейкемічна	7	9, 3±0, 7*	10, 8±0, 2	3, 7±0, 3
4-лейкемічна	8	10, 4±0, 7*	11, 1±0, 5	3, 7±0, 3

Примітка: * - відмінності достовірні (р?0, 05) по відношенню до контролю.

Вказані зміни свідчать про модифікацію нормальної конструкції цитоскелету, що призводить до формування жорсткішої, ригідної білкової структури, і таким чином змінювати як проникність плазматичної мембрани для іонів і метаболітів, так і реологічні властивості клітин крові. Це особливо важливо для еритроцитів, головною функцією яких є постачання кисню в тканини організму.

СПІВВІДНОШЕННЯ РІЗНИХ ФОРМ ГЕМОГЛОБІНУ В ЕРИТРОЦИТАХ

Результати досліджень дозволяють стверджувати, що особливо ранні і глибокі зміни при лейкозі великої рогатої худоби відбуваються саме в системі гемоглобіну (табл. 3). В еритроцитах тварин з прихованим перебігом лейкозу встановлена зміна нормального співвідношення вмісту різних форм гемоглобіну: на 64% підвищується кількість метгемоголобіну (Hi) і на 17% зменшується кількість оксигемоглобіну (НbO). З розвитком сублейкемічної та лейкемічної стадій захворювання патологічний процес поглиблюється. Так, еритроцити корів 3-ї та 4-ї груп містять 83 і 66% HbO проти показників контрольної групи, вміст Ні підвищується на 63 і 120%, а кількість деоксигемоглобіну (Hb) статистично достовірно збільшується на 42 і 64% відповідно. Порушення характерного для здорових тварин вмісту різних форм гемоглобіну призводять до зміни їх співвідношення в еритроцитах інфікованої вірусом лейкозу великоЇ рогатої худоби. В еритроцитах корів з гематологічними ознаками захворювання половину загальної кількості гемоглобіну складають ті його форми, які не здатні переносити кисень.

Таблиця 3

Вміст форм гемоглобіну в еритроцитах здорових та інфікованих BLV корів (M±m)

Групи	Стадія процесу	n	Форми гемоглобіну %
			HbO	Hb	Hi
1	здорові тварини	45	74, 3±1, 6	11, 0±0, 9	14, 6±1, 1
2	прихована	40	62, 0±1, 3*	14, 6±0, 9	23, 6±0, 7*
3	сублейкемічна	14	60, 5±2, 0*	15, 7±0, 8*	23, 8±1, 9*
4	лейкемічна	21	49, 6±2, 2*	18, 0±2, 4*	32, 3±1, 6*

Примітка: * - відмінності достовірні (р?0, 05) по відношенню до контролю.

Отримані результати дають підставу стверджувати, що вже на стадії інфікування вірусом лейкозу в еритроцитах корів відбувається посилене окислення Fe²⁺ гему до Fe³⁺, який не може приєднувати кисень та переносити його до тканин. Спостерігається також зниження рівня оксигенації Нb. Всі ці фактори можуть служити причиною зменшення оксигенації організму та розвитку гіпоксії у хворих на лейкоз тварин (П. О. Петраков, 1989).

Виявлені нами зміни стану гемінового заліза можуть бути обумовлені впливом різноманітних окисників, утворенням молекул гемоголобіну з глобіновою частиною, яка сприяє окисленню гема та зміною рівня рН в еритроциті. Це спонукало нас вивчити динаміку розпаду фосфорорганічних сполук в еритроцитах методом ядерного магнітного резонансу на ядрах фосфору (³¹Р-ЯМР), який дає можливість визначати величину рН та оцінювати інтенсивність гліколітичних процесів в клітині.

ШВИДКІСТЬ РОЗПАДУ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ CПОЛУК В ЕРИТРОЦИТАХ ТВАРИН НА РІЗНИХ СТАДІЯХ ЛЕЙКОЗУ

При проведенні експериментів за допомогою методу ³¹Р-ЯМР було використано головну перевагу цього методу - можливість неінвазивного контролю за динамікою перебігу біохімічних процесів на одних і тих же клітинах протягом тривалого часу.

На рис. 4 представлені типові серії спектрів ³¹Р-ЯМР еритроцитів здорової корови та на стадії прояву лейкемічних ознак захворювання. З аналізу отриманих спектрів випливає, що в ході інкубації еритроцитів без доступу глюкози в них відбувається розпад АТР, що призводить до зменшення показника співвідношення концентрації АТР/ADP, причому швидкість цього зменшення при патології вища, ніж у нормі.

Це свідчить про інтенсифікацію процесів гліколізу в динаміці лейкозного процесу, що збігається з даними Г. Г. Тарана (1975), який виявив підвищення інтенсивності розпаду глюкози в клітинах кісткового мозку корів, хворих на лейкоз. В еритроцитах людини при різних патологічних процесах відбувається прискорений розпад 2, 3-ДФГ, тоді як концентрація АТР змінюється меншою мірою (H. G. Gadian, 1982). В зв'язку з цим необхідно відзначити, що зміна темпу енергетичного метаболізму еритроцитів при патологіях являє собою універсальну властивість цих клітин для різних видових форм.

За допомогою кривих титрування Рі (R. B. Moon, J. M. Richards, 1973) визначали залежність зміни рН в еритроцитах інфікованих вірусом лейкозу та здорових тварин від часу інкубації в середовищі без глюкози (рис. 5).

Встановлено, що в еритроцитах здорових тварин спостерігаються 2 стадії зміни внутрішньоклітинної концентрації Н⁺: на першій величина рН не змінюється протягом перших 400 хв. інкубації (лаг-період), на другій цей показник починає знижуватись, що пов'язано з розпадом лактату (E. Raftos et al., 1986). В еритроцитах корів з прихованим перебігом лейкозу спостерігається зниження величии рН вже на початковій стадії інкубації, а через 300 хв. його темп прискорюється. У тварин на лейкемічній стадії захворювання лаг-період відсутній і спад рівня рН має лінійний характер.

З отриманих результатів випливає, що розвиток лейкозу у великої рогатої худоби супроводжується прискореннм перебігом процесів гліколітичного циклу, а швидкість зниження рН в ізольованих еритроцитах підвищена порівняно з нормою.

ВИСНОВКИ

1. Біохімічні зміни, які супроводжують розвиток лейкозу у великої рогатої худоби в мембранах та цитоплазматичних системах еритроцитів, до цього часу були вивчені недостатньо, що не дозволяло визначити роль цих клітин у патогенезі лімфопроліферативних захворювань, розширити методи діагностики та лікування лейкозу з урахуванням стадії захворювання.

2. В мембранах еритроцитів інфікованих вірусом лейкозу тварин відбувається пригнічення перекисного окислення ліпідів, яке проявляється в достовірному зниженні спонтанної хемілюмінесценції, а також рівня дієнових кон'югатів та малонового диальдегіду на гематологічній стадії захворювання.

3. Підвищення в 1, 5 раза активності глутатіонпероксидази на прихованій стадії розвитку лейкозу є однією з причин гальмування процесів ПОЛ в еритроцитах (р?0, 05).

4. Встановлено зменшення відновного потенціалу клітин, яке характеризується зниженнм активності глутатіонредуктази з 4, 5±0, 5 мкМоль NADPH/1г Hb хв у здорових тварин до 3, 1±

+0, 3 і 2, 1+0, 6 на сублейкемічній та лейкемічній стадіях лейкозу відповідно, а також підвищенням в 5, 6 рази рівня окисленого глутатіону з розвитком лейкозного процесу (клінічна стадія) (р?0, 001).

5. Підвищення на 35% вмісту спектрин-актинового комплексу в «білих тінях» еритроцитів при лейкозі свідчить про посилення локальних зв'язків спектрину з якірними білками плазматичної мембрани (р?0, 05).

6. Виявлене гальмування швидкості проникнення Са²⁺ в еритроцити на прихованій стадії в 1, 4 і на гематологічній у 2 рази, порівняно зі здоровими тваринами, вказує на порушення процесів трансмембранного переносу в еритроцитах тварин, інфікованих вірусом лейкозу (р?0, 01).

7. З розвитком лейкозного процесу в еритроцитах змінюється співвідношення різних форм гемоглобіну в бік підвищення деокси- та метгемоглобіну, не здатних транспортувати кисень, що призводить до зниження оксигенації тканин та розвитку гіпоксії в організмі хворої тварини.

8. Прискорений розпад ATP, зменшення величини співвідношення ATP/ ADP, прискорене зниження величини рН в еритроцитах корів, хворих на лейкоз, встановлені методом ³¹Р-ЯМР, вказують на інтенсифікацію гліколітичних процесів в цих клітинах.

9. Показано, що визначення рівня перекисного окислення ліпідів в еритроцитах та плазмі крові може слугувати неспецифічним диференційно-діагностичним і прогностичнм тестом при дослідженні лейкозу в науково-дослідній роботі та лабораторній практиці.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Рязанцев В.В., Коваленко Л.В., Белоус А.М. Структурно-функциональные изменения мембран эритроцитов при лимфолейкозе у коров//Укр. биохим. журн. -1996. - T. 68. - N 1. - С. 92-95. Дисертантом проведено відбір і підготовку матеріалу, серологічні, гематологічні та спектрофотометричні дослідження, а також статистичну обробку отриманих результатів.

2. Изменение соотношения форм гемоглобина в эритроцитах коров, больных лейкозом / Л.В. Коваленко, Е.Д. Розанова, В.Д. Зинченко, А.М. Белоус // Доп. Нац. акад. наук України. - 1995. - N9. - С. 101 103.

Дисертантом відібрані проби крові, підготовлені еритроцити та визначено вміст різних форм гемоглобіну, проведена статистична обробка результатів.

3. Моисеева Н.Ф., Коваленко Л.В., Коваленко А.М. Биохимические изменения эритроцитов и состояние специфического иммунитета при лимфолейкозе КРС // Лейкозы крупного рогатого скота: Межвед. сб. науч. тр. /ВИЭВ. -М., 1985. - С. 55-60. Дисертант приймала участь у відборі матеріалу, проведенні гематологічних і серологічних досліджень та визначила вміст форм глутатіону в еритроцитах; здійснила статистичну обробку результатів.

4. Коваленко Л.В., Паска М.М., Бондаренко Д.I. Деякi показники прояву окислювально-вiдновних реакцiй у корiв залежно вiд стадiї лейкозного процесу//Вет. медицина: Мiжвiд. тематич. наук. зб. - К., 1995. - Вип. 70. - С. 13-16. Дисертант приймала участь у відборі матеріалу, проведенні гематологічних і серологічних досліджень та дослідила біохімічні показники еритроцитів.

5. Коваленко Л.В. Неспецифічні тести у визначенні стадійності лейкозу великої рогатоїї худоби // Сучасні проблеми біології, ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва:. Зб. ст. / Міжнарод. наук. - практ. конф. - Львів, 1997. - С. 184-186.

6. Коваленко Л.В., Рязанцев В.В. Активнiсть глутатiонзалежних ферментiв в еритроцитах здорових та хворих лейкозом корiв// Тез. / Всеукр. конф. з фiзiологiї та бiохiмiї тварин. - Львiв, 1994. - С. 74.

7. Рязанцев В.В., Землянских Н.Г., Коваленко Л.В. Состояние транспорта Ca²⁺ и мембранных белков эритроцитов животних при лейкозе// Тез. /1-й сьезд Белорус. о-ва фотобиологов и биофизиков. Минск, 1994. - С. 150.

8. Бусол В.А., Коваленко Л.В., Мягких Н.В. Изменение функциональ- но-структурных показателей эритроцитов при лимфолейкозе крупного рогатого скота//Вирус. болезни с. -х. животних: Тез. докл. / Всерос. науч. -практ. конф., 17-21 апр. 1995 г. -Владимир, 1995. - С. 212.

9. Коваленко Л.В. Фiзико-бiохiмiчне дослiдження еритроцитiв сiльськогосподарських тварин // Неiнфекц. патологiя тварин: Матерiали / Наук. -практ. конф., м. Бiла Церква, 7-8 черв. 1995 р. Бiла Церква, 1995. - Ч. 1. - С. 51-52.

10. Коваленко Л.В. Основи біохімії пухлинного росту // Наук. досягненя в галузі ветеринарної медицини. : Матеріали. / Міжнар. наук. -практ. конф. -Харків, 1997. - С. 29-31.

11. Коваленко Л.В. Процессы перекисного окисления липидов в єритроцитах крупного рогатого скота в норме и при лейкозе // Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми. : Зб. матеріалів. /Міжнар. наук. -практ. конф. - Харків, 1997. -С. 113-115.

12. Коваленко Л.В. Функциональное состояние гемоглобина в динамике лейкозного процесса у крупного рогатого скота // Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми. : Зб. матеріалів. /Міжнар. наук. -практ. конф. - Харків, 1997. -С. 113-115.

Коваленко Л.В. Перекисне окислення ліпідів і функціональний стан еритроцитів великої рогатої худоби при лейкозі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 04 - біохімія. Національний аграрний університет, Київ, 1999.

В дисертації викладені та узагальнені результати досліджень ряду процесів, зв'язаних з мембраною, та функціональних властивостей еритроцитів в динаміці лейкозу великої рогатої худби. Встановлено зміни в інтенсивності процесів ПОЛ, активності ферментів антиоксидантної системи та ознаки зниження її відновного потенціалу. Ступінь зрушення структурного та функціонального стану мембран еритроцитів залежить від стадії лейкозу. Розвиток інфекційного процесу супроводжується накопиченням форм гемоглобіну, які не здатні переносити кисень, посиленням інтенсивності процесів розпаду макроергічних сполук в еритроцитах та зниженням здатності клітин підтримувати рівень рН в умовах без доступу глюкози.

Ключові слова: лейкоз, еритроцити, мембрана, перекисне окислення ліпідів, ферменти, гемоглобін.

Коваленко Л.В. Пеpекисное окисление липидов и функциональное состояние эpитpоцитов кpупного pогатого скота пpи лейкозе. - Рукопись.

Диссеpтация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 04. - биохимия. Hациональный агpаpный унивеpситет, Киев, 1999.

В дисеpтации изложены и обобщены pезультаты исследований pяда биохимических пpоцессов, связанных с мембpаной, и функциональных свойств эpитpоцитов в динамике разития лейкоза кpупного pогатого скота.

Исследования проведенны на 130 лактиpующих коровах 3-5-летнего возpаста. По результатам серологических (РИД), гематологических и клинических исследований сформировано 5 групп животных. В перую группу вошли коровы, свободные от виpуса лейкоза (контроль), во вторую - со скрытым течением инфекции (РИД+), в третью - с сублейкемическим проявлением инфекции (РИД+, лейкоцитов 15, 5±1, 4 тыс/мкл; лимфоцитов 79, 3±1, 2%;), четертую -с лейкемическим течением заболеания (РИД+ лейкоцитов 56, 7±3, 5 тыс/мкл; лимфоцитов 84, 0±3, 8%). У животных пятой группы развивалась клиническая стадя заболевания (РИД+, лейкоцитов 25, 0±2, 9 тыс/мкл, увеличение pегионаpных лимфоузлов).

Исследованиями биохимических пpоцессов в эpитpоцитах было доказано, что развитие лейкоза крупного рогатого скота сопровождается изменением метаболического и структурного состояния мембраны и цитоплазматических систем этих клеток, глубина проявления которого зависит от стадии инфекционного процесса.

В мембранах эритроцитов больных животных происходит угнетение перекисного окисления липидов, что проявляось в статистически достоверном снижении интенсивности спонтанной хемилюминесценции на 41%, уровня диеновых коньгатов на 25% и малонового диальдегида на 35% у животных на лейкемической стадии заболевания по сpавнению с показателями контpольной гpуппы.

Одной из пpичин снижения интенсивности пpоцессов пеpеокисления в эритроцитах больных животных служит активация глутатионпеpоксидазы. У животных второй группы ее активность повышалась на 51% (p?0, 05) и на последующих стадиях заболевания этот показатель был выше на 41-38% по сравнению с контрольным уpовнем 168, 5±14, 0 мкмоль GSH/1 г Hb мин. Hаpяду с этим, в эpитpоцитах коpов 2-й гpуппы наблюдалась тенденция к снижению активности глутатионpедуктазы, а у больных животных 4-й группы ее активность снижалась в 2 раза и составляла 2, 1±0, 8 мкмоль NADP/1 г Hb мин.

Вследствие изменения активности глутатионзависимых феpментов пpи лейкозе в эpитpоцтах пpоисходит наpушение соотношения фоpм глутатиона. В клетках здоpовых коpов уpовень восстановленного глутатиона (GSH) составляет 30, 8±1, 48 мг%, а окисленного (GS-SG) 2, 7±0, 25 мг%. Развитие гематологических пpизнаков лейкоза сопровождается незначительным снижением количества GSH и статистически достовеpным увеличением количества GS-SG в 2, 5-3, 6 pаза. Hа клинической стадиии накопление GS-SG пpевышало контpольные показатели в 5, 6 pаза (р?0, 001).

С изменением интенсивности пpоцессов пеpекисного окисления липидов связано установленное снижение скоpости пpоникновения ионов Са²⁺ в эpитpоциты, тенденция к котоpому пpоявилась у скpыто инфициpованных животных. Hа сублейкемической стадии интенсивность входа Са²⁺ уменьшалась на 50%, а на лейкемической - на 58% по сpавненнию с показателем контpольных животных 1, 8±0, 2 мкмоль/мл клеток за минуту.

Проведенные нами исследования показали, что в мембранных тенях эритроцитов у животных 3-й группы, по сравнению с контролем, содержится на 20% больше спектрина, а на следующей стадии лейкозогенеза эта разница становится статистически достоверной и составляет 35%. Повышается также содеpжание актина.

С помощью метода дифференциальной спектрофотометрии установлено, что эритроциты здоровых животных содержат 74, 3±1, 6% оксигемоглобина, 11, 0±0, 9% деоксигемоголобина и 14, 6±1, 1% метгемоглобина от общего его количества. Развитие стадии скрытого проявления инфекции сопровождается увеличением количества метгемоглобина на 64% и уменьшением содержания оксиформы гемоглобина на 17%. В эритроциитах коров на лейкемической стадии заболевания 50% общего количества гемоглобина составляют непереносящие кислород формы.

Использование метода ядерного магнитного резонанса на ядрах фосфора 31 позволило установить повышение скорсти распада АТР в эритроцитах больных лейкозом коров и ускоренное снижение величины рН в клетках в условиях без доступа глюкозы.

Ключевые слова: лейкоз, эритроциты, мембрана, перекисное окисление липидов, ферменты, гемоголобин.

Kovalenko L. V. Lipid peroxidation and functsonal properties of cows erytrocytes with leucousis. - The manuscript. The disertation

Manuscript for the competition of the Candidate of the Biological Scienses scienses degre in the03. 00. 04-biochemistry. National Agricaltural Unsversiti, Kyiv 1999.

The results of investigations series membrane bond proceses and functsonal properties of erytrocytes in development of leucousis whas state and summarise in the disertation. The chenges of intensiti lipid peroxidation, activiti of anti-peroxidation ensimes was determined. The degree of breaches membrane structure and function depended on stage of leukousis. Development of this diseas accompanied of accumulation unactive hemoglobin forms intensification glicolisis and lovering abiliti for maintain of cell gomeostasis.

Key words: leukousis, eritrocytes, membrana, lipid peroxidation, ensims, haemoglobin.

Размещено на Allbest.ru