Перебудови структури плазміди pATV 8 у трансгенних мишей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Крисан Костянтин Вячеславович

УДК 577.29 577.218

Перебудови структури плазміди pATV 8 у трансгенних мишей

03.00.03 -- молекулярна біологія

Автореферат

диссертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ -- 1999

Диссертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук Соломко Олександр Петрович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

завідувач відділом біохімічної генетики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Швед Анатолій Давидович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ;

завідувач відділом молекулярної вірусології доктор біологічних наук Галкін Анатолій Павлович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ завідувач відділом біоінженерії.

Провідна установа: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться 18 травня 1999 р. о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, г.Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розісланий 14 квітня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л.Л. Лукаш.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Трансгеноз наразі став одним з важливіших підходів для вивчення механізмів функціонування геному в цілому, взаємодії його частин, ролі окремих генів та регуляції їх експресії. Цей метод широко використовується для виявлення функцій окремих генів шляхом їх спрямованого руйнування або випадкового інсерційного мутагенезу з наступним дослідженням отриманих фенотипових ефектів, вивчення активації промоторів на різних етапах онтогенезу та ін.. Надзвичайно широке використання цей метод також знаходить при розв`язанні прикладних завдань біотехнології та біомедицини. Тут слід назвати спрямовану зміну генотипу сільськогосподарських тварин для отримання порід, що мають нові господарчо-цінні ознаки, та корекцію генетичних захворювань людини шляхом введення ззовні в її геном повноцінних копій дефектних генів. Однак, дестабілізація геному реципієнта, викликана внесенням чужорідної генетичної інформації, а також нерідко важкопередбачувана поведінка трансгенів, пов'язана з їх частою модифікацією та неконтрольованою експресією, істотно утруднює використання трансгенозу як в дослідницьких, так і в прикладних цілях. В зв'язку з цим важливого значення набуває вивчення взаємодії між трансгенами та геномами хазяїв, а також створення модельних систем для пошуку закономірностей цієї взаємодії.

Відомі три основні варіанти поведінки трансгенів -- повна елімінація, інтеграція в геном реціпіенту та існування в екстрахромосомному стані. Як інтегровані, так і екстрахромосомні форми трансгенів часто зазнають істотних модифікацій, механізми і закономірності яких наразі практично не досліджено. Крім того, інтегровані трансгени (на відміну від більшості екстрахромосомних) можуть викликати небажані інсерційні мутації, що надає важливого значення вивченню спорідненості трансгенів до конкретних геномних нуклеотидних послідовностей. З точки зору передбачуваності та керуємості більш зручними видаються трансгени, здатні існувати позахромосомно. Однак, весь комплекс факторів, що визначають форму існування трансгену та впливають на його сталість, поки що залишається невивченим.

На протязі багатьох років у відділі біохімічної генетики ведуться роботи з вивчення взаємодії гетерологічних геномів. Суттєву частину цих робіт складає дослідження взаємодії геному миші та рекомбінантної плазміди pATV8, що містить нуклеотидні послідовності бактеріального вектору pBR322 та провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса (RSV). Цей вірус є реплікативно повноцінним високоонкогенним ретровірусом птахів. Миша не є пермісивним хазяєм RSV, але його довгі кінцеві повтори (LTR), що містять сильний промотор, використовуються при створенні експресуючих векторів ссавців. Як LTR, так і інші вірусні гени мають високу рекомбінаційну активність. Рекомбінаційна активність бактеріальних нуклеотидних послідовностей, що входять до складу більшості еукаріотичних човникових векторів, також цікава як фактор дестабілізації геному реципіенту та стабільності трансгену. У зв'язку з цим важливо з'ясувати характер взаємодії наведеної рекомбінантної плазміди та геному миші; виявити взаємний вплив гетерологічних геномів; дослідити фенотипові прояви наслідків трансгенозу. Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в рамках тематичних програм ІМБіГ НАНУ: № 2.34.1.3 “Вивчення регуляції експресії геному на ранніх стадіях ембріогенезу миші” (1991-1995) та № 2.28.7.2 “Дослідження ядерно-цитоплазматичних взаємодій в доімплантаційному розвитку миші” (1996-2000).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було дослідження структурно-функціональної взаємодії трансгену та геному хазяїна, а також аналіз біологічних ефектів трансгенозу у вищенаведеній модельній системі. Для досягнення поставленої мети, потрібно було вирішити такі завдання:

Визначити форму існування трансгену.

Дослідити структуру трансгену та її успадкування у мишей різних субліній.

Вивчити вплив трансгену на геном миші на фенотиповому рівні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що введення рекомбінантної молекули ДНК, яка містила клоновану провірусну ДНК вірусу саркоми Рауса курей у зиготи непермісивного хазяїна -- миші, призводить до утворення двох форм трансгену -- інтегрованої у геном та екстрахромосомної. Показано, що введена ДНК викликає суттєву дестабілізацію геному миші. Виявлено, що в результаті взаємодії з геномом зиготи, введена ДНК зазнає істотних перебудов у вигляді делетування значної частини провірусних нуклеотидних послідовностей. Як інтегрована, так і екстрахромосомна форми трансгену, змінившись одноразово на стадії зиготи, далі передаються наступним поколінням трансгенних мишей без змін. Вперше отримано молекулу ДНК, здатну до екстрахромосомної реплікації та сегрегації у клітинах трансгенних мишей на протязі багатьох поколінь. Стабільну реплікацію екстрахромосомної форми трансгену забезпечують новоутворені в результаті перебудов комбінації бактеріального та вірусного геномів. Вперше показано, що екстрахромосомний трансген миші також здатний до позахромосомної реплікації у клітинах комах без структурних змін.

Практична цінність отриманих результатів. Розроблена модельна система надає можливості оптимізувати експерименти зі створення трансгенних тварин шляхом прогнозування поведінки екзогенної ДНК у гетерологічних клітинах та реакції геному на її введення. Аналіз отриманих результатів вказує на те, що при введенні екзогенної ДНК у ранні зиготи, частіше утворюються інтегровані, а у пізні -- екстрахромосомні форми трансгенів. Отриманий екстрахромосомний трансген може бути використаний для створення широкого спектру векторів для генотерапії, продукування біологічно активних протеїнів в еукаріотичних клітинах та для дослідницьких потреб.

Особистий внесок здобувача. Основні результати, викладені у дисертації, отримано автором самостійно.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися на відкритому семінарі групи з хондрогенезу, остеогенезу та раннього розвитку кінцівок ссавців (Сегед, Угорщина, листопад, 1996), науковій конференції інституту біохімії Угорської Академії Наук (Сегед, Угорщина, травень 1997), робочій нараді відділу біохімічної генетики ІМБіГ (лютий, 1998), міжвіддільському семінарі ІМБіГ (лютий, 1999).

Публікації. Зміст роботи викладено у 3 друкованих роботах.

Структура та об'єм роботи. Робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, результатів та обговорення, заключення та висновків. Дисертацію викладено на сторінках тексту. Ілюстративний матеріал представлено 1 таблицею та 10 рисунками. Список використаних джерел містить 309 робіт.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Мікроін'єкування плазмідної ДНК у зиготи мишей. Донорами яйцеклітин для проведення ін'єкцій були миші лінії ICR, гормонально стимульовані для одержання синхронізованих яйцеклітин. Мікроін'єкції проводилися у чоловічий пронуклеус зигот на стадії двох пронуклеусів. Вводили 200-400 копій плазміди на яйцеклітину, після чого зиготи пересаджували в ампулу яйцеводу псевдовагітних самок тієї ж самої лінії. Псевдовагітних самок отримували шляхом спарювання з вазектомованими самцями.

Аналіз трансгенних тварин. Дот- і блот-аналіз трансгенних мишей проводили, як описано у [Sambrook J. et al., 1989]. Нуклеотидну послідовність визначали за методом дідезоксітермінації (Сенгера) [Sanger F. et al., 1974]. Сіквенували одно- та дволанцюгову ДНК з використанням 35S-дАТФ та 32Р-дЦТФ з наступним розділенням фрагментів у 6% поліакріламідному денатуруючому гелі. Одноланцюгову ДНК отримували з використанням бактеріофага-помічника VSC M 13 за методом, описаним у [Sambrook J. et al., 1989]. Для сіквенування довгих фрагментів використовувалося їх ступінчасте вкорочення за допомогою нуклеаз Exo III та S1 [Sambrook J. et al., 1989].

Трансфекція клітин комах. Трансфекцію моношарової культури клітин Spodoptera frugiperda лінії SF 21, яка вирощувалася у пластиковому посуді фірми “Costar”, препаратами плазмідних ДНК (5 мкг ДНК на 3х106 клітин) проводили з використанням ліпофектину фірми “Boehringer Mannheim” в умовах, рекомендованих виробником.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Функціювання геномів еукаріотів (особливо, на ранніх етапах онтогенезу) тісно пов'язане із взаємодією окремих їх частин. Ця взаємодія включає стадіє- та тканиноспецифічні активацію чи репресію певних генів, збільшення їхньої дози шляхом ампліфікації та спадкові перебудови генетичного матеріалу. Порушення цих процесів у результаті патологічних змін у клітині, стресорних впливів або введення екзогенної ДНК, що здатна впливати на взаємодію елементів геному, здатне призвести до істотних порушень життєдіяльності клітини та, навіть, до загибелі усього організму. Моделювання згаданих ситуацій та вивчення ефектів, що виникають при цьому, надає важливу інформацію про функціювання геному. Найбільш перспективним методом видається введення екзогенних ДНК у пронуклеус запліднених яйцеклітин, що дозволяє створити модельну систему, за допомогою якої можна як вивчати вплив на розвиток організму введених ДНК з певними функціональними нуклеотидними послідовностями, так і стежити за долею самих трансгенів.

З метою створення такої модельної системи, у зиготи миші шляхом мікроін'єкції було введено плазміду pATV 8. Ця плазміда складається з провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса курей, що містить один довгий кінцевий повтор, яку було клоновано по сайту для рестриктази Hind III у бактеріальний вектор pBR 322 [Katz R.A. et al., 1982]. Аналіз результатів зхрещення трансгенних мишей з інтактними особинами тієї ж самої лінії показав, що частина трансгенних мишей передавала трансген нащадкам за менделевським типом успадкування, що свідчило про інтеграцію введеної нуклеотидної послідовності в одну з хромосом миші. У іншої частини (сублінії В 1 та В 6) менделевське успадкування було відсутнє -- від 80 до 100% нащадків містили трансген. Це дозволило припустити, що в цих сублініях трансген або існував у екстрахромосомному стані, або був інтегрований, щонайменше, у дві негомологічні хромосоми.

Дослідження сумарної ДНК з хвостів трансгенних мишей субліній В 9 та В 14 шляхом блот-гібридизації з радіоактивно міченою pATV 8 показало, що у порівнянні з введеною плазмідою pATV 8, що мала розмір близько 14 т. п. н. та містила чотири сайти для рестриктази Eco RI (розміри фрагментів: 7,7; 3,4; 2,3; 0,44 т. п. н.), у різних сублініях трансгенних мишей покоління F0 виявляється по одному фрагменту однакового розміру. Фрагменти мали розмір близько 2,6 т. п. н., що не відповідає жодному з Eco RI-фрагментів pATV 8. Гібридизація сумарної ДНК наступних поколінь трансгенних мишей тих самих субліній, розщепленої Eco RI, з тим самим зондом, дала аналогічний результат -- одну смугу розміром близько 2,6 т. п. н.. Відсутність характерного патерну рестрикції свідчило про перебудову структури введеної плазміди. Інтенсивність сигналу була приблизно однаковою у всіх зразках ДНК. Порівняння з інтенсивністю сигналу позитивного контролю дозволило оцінити копійність трансгену як одну копію на диплоїдний геном . У той самий час очевидно, що змінившись одноразово, структура трансгену стабілізувалася та він передавався наступним поколінням трансгенних мишей без змін. Аналогічне явище, коли трансген (високоонкогенний аденовірус мавп SA 7) після мікроін'єкції у зиготу миші, інтегрував у геном, зазнаючи, однак, при цьому змін у вигляді делецій окремих нуклеотидних послідовностей, описане у роботі [Кузнецова Е.Д. и др. 1988]. Змінившись у поколінні F0, цей трансген успадковувався наступними поколіннями без змін.

Ті ж самі фільтри, що використовувалися для блот-гібридизації у попередньому експерименті, було відмито від зонду та перегібридизовано з радіоактивно міченими ізольованими фрагментами провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса, які містили окремі гени провірусу. Результат виявився негативним у всіх випадках. Це свідчило про повну елімінацію провірусних послідовностей з інтегрованого трансгену. Подібна елімінація нуклеотидних послідовностей трансгенів зустрічається досить часто. Так, у провірусній ДНК вірусу саркоми Рауса, яку було ін'єковано у зиготи мишей, відбувається елімінація окремих ділянок цієї ДНК [Газарян К.Г. и др., 1985; Hu W.-S. et al., 1990]. Провірусна ДНК іншого ретровірусу -- вірусу лейкемії Молоні, у трансгенних мишах також зазнає глибоких перебудов, у першу чергу, довгих делецій [Varela-Echavarria A. et al., 1993]. Делеції вірусної ДНК виявлено також в інтегрованому вірусі SV 40 у клітинах мишей [Gurney T. Jr. et al., 1989].

За допомогою детального аналізу з використанням набору рестриктаз та блот-гібридизації, вдалося встановити приблизні межі інтегрованої ділянки pATV 8 (рис. 1). Розмір ділянки -- близько 1,5 т. п. н., та вона інтегрована у Eco RI-фрагмент геномної ДНК розміром 1,1 т. п. н.. Один з кінців інтегрованої ділянки належить гену стійкості до ампіциліну, а другий гену-репресору, що обмежує копійність pBR 322 у клітинах E. coli. У складі ділянки залишилася бактеріальна стартова точка реплікації pBR 322. Можна припустити, що чужорідна ДНК не захищена, наприклад, метилюванням, від дії нуклеаз реципієнта або формує структури, які впізнаються цими ферментами, як мішені. Відомо, що кільцеві молекули ДНК, після введення у зародок, лінеаризуються хазяйською нуклеазою, після чого відбувається делеція окремих ділянок [Козлов А.П. и др., 1988]. З іншого боку, сильний промотор, що міститься у довгому кінцевому повторові вірусу саркоми Рауса, може слугувати точкою ініціації транскрипції при взаємодії з відповідними факторами клітини. Слід відзначити, що ввімкнення ембріонального геному миші відбувається на двоклітинній стадії, а на одноклітинній більшість генів репресовано [Clegg K.B. et al., 1983]. Разом з тим, на одноклітинній стадії геном миші стає транскрипційно пермісивним (так звана, мінорна активація геному) [Schultz R.M., 1993]. Завдяки цьому явищу, вже на пізній одноклітинній стадії може відбуватися експресія трансгенів [Ram P.T. et al., 1993; Kasuya M. et al., 1994; Christians E. et al., 1995]. Це говорить про те, що фактори, які є необхідними для ініціації транскрипції та подальших подій, присутні у зиготах мишей вже на одноклітинній стадії, та лише репресія промоторів блокує експресію геному. Не виключено й те, що експресія трансгенів на одноклітинній стадії пояснюється дерепресованим станом промоторів та інших регуляторних послідовностей, які входять до їхнього складу (тобто, відсутністю метилювання, зв'язку зі специфічними білками, тощо). Саме таке явище могло відбутися у нашому випадку, коли сильний промотор (у складі довгого кінцевого повтору вірусу саркоми Рауса), що знаходився у активному стані, потрапив до зиготи миші. Утім, оскільки миша не є пермісивним хазяєм для вірусу саркоми Рауса, навіть у разі ініціації транскрипції на вірусному промоторі, елонгація може не відбуватися (механізм ініціації є більш консервативним, ніж механізм елонгації). У цьому випадку одноланцюгова ділянка, що утворилася під час ініціації, може стати мішенню для нуклеаз, які утворюють дволанцюговий розрив, а далі інші ферменти продовжують гідроліз в обох напрямках. Зупинитися цей процес може у місці знаходження вторинних структур ДНК, які часто утворюються повторюваними послідовностями.

Іншим механізмом, здатним здійснити елімінацію окремих частин трансгену, є внутрішньо- та міжмолекулярна рекомбінація. Міжмолекулярна рекомбінація відбувається між трансгеном та хромосомами хазяїна перед його інтеграцією, а внутрішньомолекулярна -- між ділянками обмеженої гомології всередині трансгену перед або після його інтеграції у хромосому хазяїна. Провірусні нуклеотидні послідовності вірусу саркоми Рауса є вельми рекомбінаційно активними. Довгий кінцевий повтор вірусу містить “гарячі точки” рекомбінації, здатні рекомбінувати з гомологічними послідовностями ендогенних ретроелементів [Edelmann W. et al., 1989]. Наявність згаданої гомології може сприяти як елімінації окремих послідовностей трансгену, так і інтеграції його у хромосому в результаті гомологічної рекомбінації. Дуже важливим є той факт, що під час аналізу трансгенних мишей було виявлено дві сублінії (В 9 та В 14), ДНК яких давала при гібридизації смуги однакового розміру. Це говорить про наявність специфічної інтеграції даного трансгену.

Інтеграція трансгену в хромосому могла відбутися також шляхом рекомбінації по ділянках слабкої гомології між короткими повторами, що входять до його складу та повторюваними послідовностями геному миші. У цьому випадку перебудови трансгену могли відбутися внаслідок інтеграції у нестабільні області хромосом, які зазнають частих перебудов у процесі ембріогенезу [Rudiger N.S. et al., 1995; Gibbs M. et al., 1993]. Однак, не виключено, що інтеграція відбулася по місцю дволанцюгового розриву хромосоми та наступною репарацією пошкодження. Утім, в цьому випадку слід припустити наявність специфічності утворення такого розриву та спорідненості до нього трансгену, оскільки принаймні у двох сублініях трансгенних мишей інтеграція відбулася у те ж саме місце хромосоми.

Не виключена можливість того, що перед стабілізацією структури трансгену, він пройшов кілька раундів інтеграції-ексцизії, кожен з яких супроводжувався втратою частини його нуклеотидних послідовностей. Разом з тим, після всіх перебудов, трансген став настільки стабільним, що не змінювався на протязі багатьох поколінь, хоча досить часто спостерігається менша стабільність трансгенів -- поступова елімінація, аж до повного зникнення з геному [Reik W. et al., 1985].

Поведінка трансгену у нашому випадку говорить про те, що: а) перебудова трансгену відбулася на ранній стадії розвитку зародка, оскільки трансгенні миші не були мозаїками; б) зі складу трансгену елімінувалися всі рекомбінаційно активні та вразливі нуклеотидні послідовності; в) інтеграція трансгену відбулася у стабільну ділянку геному. У перебудовах трансгену брали участь два механізми: a) нуклеазна деградація, ініційована виникненням розривів у місцях утворення одноланцюгових ділянок та б) рекомбінація гомологічних областей та ділянок слабкої гомології.

Структура екстрахромосомного трансгену миші.

У той час, як у сублініях В 9 та В 14 трансген інтегрував у геном миші у кількості однієї копії та спостерігалося його менделівське успадкування, в сублініях В 1 та В 6 трансген успадковували від 80 до 100% нащадків трансгенних мишей. Це було показано шляхом гібридизації сумарних ДНК, виділених з хвостів трансгенних мишей та розщеплених рестриктазою Eco RI, з радіоактивно міченою pBR 322. При цьому розмір фрагменту, що гібридизувався, складав близько 5,5 т. п. н.. З метою підтвердження екстрахромосомної локалізації трансгену ми трансформували препаратами сумарної ДНК з печінки, щитовидної залози, тимусу, мозку та шкіри трансгенних мишей згаданих субліній компетентні клітини E. coli з наступною селекцією на середовищах, що містили: а) ампіцілін+тетрациклін; б) ампіцілін; в) тетрациклін. З ДНК субліній В 1, В 5, В 6 було отримано трансформантів, стійких до ампіціліну, з В 4 -- до тетрацикліну. Однак, колонії отримані з ДНК субліній В 4 та В 5, росли надзвичайно повільно навіть на багатих живильних середовищах, що завадило їхньому напрацюванню для дослідження та згодом їх було втрачено. На середовищі, що містило ампіцілін+тетрациклін, не було отримано жодної колонії з жодної сублінії.

Провірусну ДНК вірусу саркоми Рауса, що входила до складу pATV 8, було вбудовано у Hind III-сайт рBR 322, розташований у 5`-кінці гену стійкості до тетрацикліну, що інактивувало цей ген. Тому поява у кількох сублініях трансформантів, стійких до тетрацикліну, говорить про повну елімінацію провірусних нуклеотидних послідовностей зі складу трансгена та відновлення функціонального гена. Така точна ексцизія трансгенів та відновлення генів, пошкоджених у результаті інсерційного мутагенезу, показана у роботі К. Т. Газаряна та співробітників [Газарян К.Г. и др., 1984]. При введенні у ранні ембріони дрозофіли провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса, аденовірусу SA 7 та інших ДНК, було одержано фенотипові мутації. У нащадків трансгенних мух ці мутації зникали, тобто функції пошкоджених генів відновлювалися. Причиною такого точного “видалення” чужорідних нуклеотидних послідовностей з геномів реципієнтів може бути відсутність у цих послідовностях специфічних сигналів, що забезпечують метилювання та, відповідно, стабільність (наприклад, стійкість до нуклеаз) оточуючих ділянок геному.

Детально було досліджено плазміду, “врятовану” з ДНК сублінії В 6. Цю плазміду було названо рВ6.5, за номером тієї миші, з якої її було вперше виділено. При ефективності трансформації 1х107 колоній/мкг ДНК, для однакових кількостей сумарної ДНК було одержано такі результати: ДНК шкіри -- 40 колоній, ДНК печінки -- 12 колоній, ДНК тимусу -- 135 колоній, стійких до ампіціліну. Після розмноження колоній та виділення з них плазмідних ДНК, було встановлено ідентичність їхніх розмірів та патернів рестрикції у всіх досліджених органах. Нащадки миші В6.5 також містили екстрахромосомний трансген, який виявився ідентичним тому, що був виділений з миші покоління F 0 [Чащина Л.И. и др., 1997]. Той факт, що даний трансген був здатний до реплікації у бактеріальних клітинах, свідчив про наявність у його складі, поряд з геном стійкості до ампіціліну, бактеріальної стартової точки реплікації.

Плазміда рВ6.5, виділена з трансгенних мишей, мала розмір близько 5,5 т. п. н., тоді як pATV 8, яку було введено -- 14 т. п. н.. Це говорило про те, що у ході взаємодії з геномом миші трансген зазнав глибоких перебудов, пов'язаних з делецією довгих ділянок. Для локалізації делетованих нуклеотидних послідовностей було побудовано фізичну карту трансгену (рис. 2). Слід відзначити, що під час блот-гібридизації сумарної ДНК трансгенних мишей сублінії В 6, розщепленої рестриктазою Eco RI, було виявлено фрагмент розміром 5,5 т. п. н., що гібридизувався. Таким самим був і визначений пізніше розмір екстрахромосомного трансгену, тобто, дані гібридизації свідчили про наявність у трансгені одного сайту для Eco RI. Однак, під час детального картування плазміди рВ6.5, напрацьованої у клітинах E. coli, виявилося, що вона містить два сайти для Eco RI. Ймовірність модифікації трансгену під час розмноження у бактеріальних клітинах виключена, оскільки аналогічні результати отримано в кількох контрольних експериментах. Цей факт “резистентності” одного з Eco RI-сайтів трансгену, скоріш за все, свідчить про наявність специфічного метилювання цього сайту, або, швидше, цілої області трансгену, де він знаходиться. Після розмноження у клітинах бактерій, патерн метилювання, характерний для клітин миші, не зберігся. “Часткове” метилювання трансгену може бути викликане наявністю у ньому специфічних сигналів впізнавання для еукаріотичних метилаз.

Користуючись фізичною картою, ми клонували та сіквенували фрагменти рВ6.5, що згодом дозволило визначити повну нуклеотидну послідовність трансгену, уточнити фізичну карту та одержати границі делетованих ділянок. Виявилося, що делеції торкнулися, головним чином, провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса. На відміну від інтегрованого трансгену, де провірусна ДНК була повністю елімінована, в екстрахромосомному трансгені залишився її фрагмент розміром близько 2850 п. н.. Він вміщує майже повну послідовність гену env та міжгенну область генів env та src. Один з кінців фрагменту знаходиться всередині кодуючої області гену env, за 110 п. н. після стартової точки транскрипції цього гену, а другий -- у міжгенній області генів env та src, за 170 п. н. після закінчення кодуючої послідовності гену env та перед початком некодуючої послідовності гену src. На обох кінцях фрагменту поблизу його границь є короткі АТ-багаті ділянки. У вихідній плазміді pATV 8 провірусну ДНК було клоновано у Hind III-сайт вектора pBR 322. У рВ6.5, крім елімінації більшої частини провірусних послідовностей, фрагмент, що залишився, був транспозований в іншу, розташовану поблизу ділянку вектора, причому сайт для Hind ІІІ відновився. Транспозиція відбулася у 5`-кінець гену стійкості до тетрацикліну pBR 322, при цьому делетувалася коротка ділянка цього гену довжиною близько 100 п. н.. Ця ділянка також була фланкована короткими АТ-багатими нуклеотидними послідовностями. Друга делеція бактеріальної частини pATV 8 мала розмір 560 п. н. та торкнулася гену-репресору, який обмежує копійність плазміди у клітинах E. coli. Делетований фрагмент був обмежений ділянками, багатими А і Т. Границі делецій та транспозицій, а також новоутворені ділянки, показано на рис. 3. Цікавим є те, що саме у районі гену-репресору знаходиться одна з границь інтегрованого трансгену. Можливо, причиною цього були структурні особливості даної області. Взагалі, звертає на себе увагу той факт, що всі області екстрахромосомного трансгену, які зазнали перебудов, були фланкованими АТ-багатими ділянками. В зв'язку з цим, здається ймовірним, що такі ділянки стали мішенями для специфічних рекомбінаційних механізмів, які діють на ранніх стадіях ембріогенезу миші. Це можуть бути як спадкові перебудови геному, так і ампліфікація чи підготовка до ампліфікації окремих нуклеотидних послідовностей. Оскільки ідентичні молекули трансгену містилися у всіх досліджених органах трансгенних мишей сублінії В 6, миші не були мозаїками, тобто, перебудови трансгену відбулися у ранньому зародку. Перебудови екстрахромосомного трансгену могли відбутися як у результаті інтеграції у нестабільну або здатну до ампліфікації область геному та наступної ексцизії, так і у позахромосомному стані, при рекомбінації з екстрахромосомними ДНК миші. Можливість такої рекомбінації показана у модельних системах у клітинах мишей [Hellgren D. 1992; Lin F.-L.M. et al., 1987] та інших організмів [Puchta H. et al., 1992]. Цікаво, що одна з границь делецій майже завжди знаходилася у 5`-кінці гену env. Оскільки у плазміді рВ6.5, яку ми досліджували, одна з границь делетованого фрагменту лежить саме у 5`-області гену env, можна припустити, що нуклеотидні послідовності, які знаходяться у цьому місці, є “гарячими точками” рекомбінації.

Так само, як і у випадку інтегрованого трансгену, у двох сублініях трансгенних мишей (В 1 та В 6) з неменделівським успадкуванням трансгену, було виявлено фрагменти однакового розміру, що гібридизувалися. Хоча згодом детально було досліджено екстрахромосомний трансген тільки з сублінії В 6, можна припустити, що в обох сублініях трансгени були однаковими. Те, що однакові екзогенні ДНК можуть надалі існувати як у екстрахромосомному, так і інтегрованому станах, можна пояснити по-різному. По-перше, це може бути наслідком інтеграції у різні ділянки геному, результатом чого стають різні перебудови трансгену та, відповідно, здатність чи нездатність до наступної ексцизії та екстрахромосомного існування. По-друге, якщо перебудови трансгену відбуваються у позахромосомному стані, стає можливою селекція плазмід, здатних до автономної реплікації, наприклад, разом з природними екстрахромосомними ДНК. По-третє, різні причини можуть обумовити перебудову трансгенів на окремих етапах раннього розвитку зародка, що вплине на характер перебудов та на форму існування трансгену. Такою причиною може бути неодночасність введення екзогенної ДНК при роботі з великою кількістю зародків. Навіть за невеликий проміжок часу у зиготі можуть відбутися процеси, що стануть вирішальними для долі трансгену, такі як перехід від репресованого стану геному до його мінорної активації у пізній G2-фазі.

Реплікація та сегрегація екстрахромосомного трансгену миші.

Що стосується ефективної екстрахромосомної реплікації та сегрегації, то їх забезпечували, скоріш за все, утворені de novo внаслідок перебудов комбінації вірусної та бактеріальної складових трансгену. Не можна виключати можливість і того, що у виконанні цих функцій брали участь бактеріальні нуклеотидні послідовності, відповідальні за ці процеси у клітинах E. coli. Під час вивчення ori реплікації різних еукаріотів, було виявлено консервативну АТ-багату канонічну послідовність [Donovan S. et al., 1996]. Аналіз нуклеотидної послідовності рВ6.5 показав, що новоутворені в результаті делецій та транспозицій послідовності (нагадаю, що границі перебудов трансгену містять АТ-багаті ділянки), мають високу гомологію з канонічною послідовністю ori реплікації еукаріотів (рис. 4). Таким чином, можна припустити, що стабільна екстрахромосомна реплікація трансгену у клітинах миші здійснювалася завдяки цим нуклеотидним послідовностям. Такі факти, коли реплікацію ініціаціюють, крім ori, інші ділянки ДНК, відомі. Клоновані повтори родини Alu I, забезпечували реплікацію плазмід, що їх містять, у еукаріотичних клітинах [Johnson E.M. et al., 1986]. Крім того, відзначено, що ori реплікації pBR 322 впізнається еукаріотичними факторами реплікації [Goldberg E. Z., 1981].

Важливе значення може мати той факт, що у бактеріальній частині трансгену відбулася делеція області, що містила ген, який обмежує копійність pBR 322 у клітинах E. coli. Група дослідників під керівництвом M. Botchan показала, що саме ця ділянка pBR 322 (між бактеріальною стартовою точкою реплікації та сайтом для рестриктази Pvu II) містить цис-діючу послідовність, яка істотно інгібує реплікацію вірусу SV 40, клонованого у pBR 322, у пермісивних клітинах [Lusky M. et al., 1981].

Таким чином, здатність рВ6.5 до екстрахромосомної реплікації зумовлена: а) схожістю новоутворених у результаті перебудов трансгену або деяких бактеріальних послідовностей з послідовностями ori реплікації еукаріотів; б) втратою бактеріального гену-обмежувача копійності; в) наявністю у складі рВ6.5 фрагменту провірусної ДНК вірусу саркоми Рауса, що містить міжгенну область генів env та src.

Сегрегація трансгена могла відбуватися за хромосомним механізмом, якщо його послідовності взяли на себе функції центромер, але більш ймовірним здається один з двох інших механізмів сегрегації. Перший з них це розділ молекул трансгену між дочірніми ядрами у процесі клітинного поділу. На користь такого шляху сегрегації говорить малий розмір рВ6.5, який дозволяє плазміді швидко реплікуватися та накопичуватися у клітині у великій кількості. При цьому, в дочірні клітини під час поділу потрапляє приблизно однакова кількість трансгену.

Другий ймовірний механізм сегрегації трансгену -- це розподіл за принципом, що використовується при розділі низькокопійних плазмід у прокаріотів. Такі плазміди кодують білки, які зв'язуються з певними послідовностями цих плазмід, та одночасно, з бактеріальною хромосомою. Під час клітинного поділу плазміди розходяться у дочірні клітини разом з дочірніми хромосомами, а потім від'єднуються від них. рВ6.5 не кодує подібних білків, однак, можна припустити, що у клітинах миші є інші ДНК-зв'язуючі білки з двома центрами зв'язування. Такі білки, асоцийовані з хромосомами миші, можуть приєднувати рВ6.5 та переносити її у дочірні клітини під час клітинного поділу.

Реплікація екстрахромосомного трансгену миші у клітинах комах

Враховуючи той факт, що канонічна послідовність ori реплікації еукаріотів є консервативною у всіх еукаріотів, ми вирішили перевірити здатність екстрахромосомного трансгену миші реплікуватися у клітинах інших еукаріотів. Для цього ми ввели рВ6.5 у клітини комах лінії SF 21. В якості контролю у тіж самі клітини вводилися плазміди pBR 322 та pATV 8. В експериментах В. З. Тарантула рекомбінантна плазміда, що складалася з pBR 322 та довгого кінцевого повтора вірусу саркоми Рауса, при мікроін'єкції у грену тутового шовкопряду, набула здатності до екстрахромосомної реплікації внаслідок інсерції фрагменту геномної ДНК комахи [Николаев А.И. и др., 1992].

Тривалість клітинного циклу у клітин лінії SF 21 становить близько однієї доби, тому реплікативна поведінка плазмід досліджувалася на 2-й, 3-й, 4-й та 7-й дні після трансфекції. Для цього аліквоти клітинних культур, що містили однакові кількості клітин (3х105), наносили на нейлоновий фільтр, лізували та гібридизували з радіоактивно міченою pBR 322 (рис. 5А). На денситограмі (рис. 5Б) видно, що вміст рВ6.5 у клітинах залишається майже однаковим на 2-й, 3-й та 4-й дні, що говорить про реплікацію плазміди. Оскільки на кожному етапі аналізувалися однакові кількості клітин, при відсутності реплікації спостерігалося б прогресуюче зниження вмісту трансгену після кожного клітинного поділу. Враховуючи той факт, що у популяції клітин поряд з тими, що містили трансген, були і нетрансфіковані, можна зробити висновок, що реплікація відбувається досить активно та трансген не пригнічує життєдіяльність клітини та не впливає на тривалість клітинного циклу. На 7-й день відбувається деградація культури клітин. Вміст контрольних плазмід pBR 322 та pATV 8 вже на 2-й день був помітно меншим, ніж рВ6.5 (хоча для трансфекції використовувалися однакові кількості плазмідних ДНК), а далі різко знижувалося, аж до повного зникнення на 4-й день. Це свідчить про відсутність реплікації та короткочасне “переживання” плазмід у клітинах. Для встановлення факту саме позахромосомної реплікації рВ6.5 у клітинах комах, з них було виділено сумарну ДНК. Ця ДНК використовувалася для трансформації компетентних клітин E. coli штамму DH 5 з наступною селекцією на середовищі, що містило ампіцилін, в результаті чого було отримано колонії, які містили плазміду, що була ідентичною рВ6.5. Це було показано шляхом порівняння рестрикційних патернів двох плазмід при розщепленні рестриктазами Bgl II, Eco RI, Hind III та Pst I. Цей факт говорить про відсутність перебудов трансгену під час реплікації у клітинах нового хазяїна. Другу частину сумарної ДНК клітин, трансфікованих рВ6.5, було використано без розщеплення рестриктазами для проведення блот-гібридизації з тим самим зондом, що використовувався для дот-гібридизації (рис. 5В). Видно, що розміри смуг, які гібридизуються у сумарних ДНК, відповідають таким у контролю -- плазміди pВ6.5. Геномні ДНК трансфікованих клітин не гібридизуються, що свідчить про відсутність інтеграції трансгену у геном хазяїна.

Те, що нуклеотидні послідовності, які забезпечують реплікацію екстрахромосомного трансгену у клітинах миші, зберігають свої функції також у клітинах еволюційно далеких організмів, підтверджує високу консервативність реплікаційного апарату еукаріотів. Слід відзначити, що оскільки жодна з контрольних плазмід не була здатною реплікуватися у клітинах комах, нуклеотидні послідовності, які входять до їхнього складу, не можуть функціонувати як ori реплікації в цих клітинах. Тому можна зробити висновок, що у рВ6.5 ця функція виконується новоутвореними у результаті перебудов трансгену послідовностями ДНК. На основі цього можна припустити, що і у клітинах миші саме новоутворені нуклеотидні послідовності були точками ініціації реплікації трансгену. Той факт, що у клітинах комах рВ6.5 не зазнавала перебудов та не інтегрувала у геном, існуючи екстрахромосомно, говорить про стабільність структури трансгену та його низьку рекомбінаційну активність. Такі властивості, як сталі реплікація та сегрегація, стабільність структури, відсутність впливу на життєдіяльність клітин, дозволяють у майбутньому використовувати рВ6.5 для створення екстрахромосомних еукаріотичних векторів з широким колом хазяїв.

ФЕНОТИПОВІ ПРОЯВИ ТРАНСГЕНОЗУ

Аналіз результатів зхрещень трансгенних мишей з нормальними мишами тієї самої лінії свідчить про наявність порушень репродуктивної здатності у ряду трансгенних самок, які містили нуклеотидні послідовності pATV 8. Від однієї самки взагалі не вдалося отримати нащадків у зхрещеннях з самцями, яких перед цим було перевірено у інших зхрещеннях. Значне зниження репродуктивної здатності відзначено також у поколінні F1 трансгенних самок. У одній з субліній серед нащадків другого та третього поколінь виявлено мертвонароджених мишенят з недорозвинутими хвостами. При порівнянні мишей однакових вікових груп виявлено, що частота виникнення пухлин у трансгенних самок істотно перевищує контрольний рівень.

У трансгенних тварин обох статей у віці від шести місяців було виявлено дефекти шкіри, випадання шерсті, великі виразки на тілі та вухах, порушення координації рухів -- нейропатії. Частота проявів цих ознак змінювалася у наступних поколіннях, але вони виявлялися постійно. Крім того, у поколіннях F3-F5 відзначено появу мишей з феноменом “мокрої” шерсті, що істотно відставали у вазі від нормальних тварин.

Елімінація усіх провірусних та значної частини бактеріальних нуклеотидних послідовностей у випадку інтегрованого трансгену, не дозволяє пов'язати фенотипові ефекти з експресією генів, що входили до його складу. Отже, біологічні ефекти інтегрованого трансгену зумовлені, скоріш за все, тим, що під час інтеграції трансген порушив регуляцію або інактивував певний ген (або гени при наявності кількох раундів інтеграції/ексцизії). Аналогічний механізм міг діяти і у випадку екстрахромосомного трансгену, якщо його стабілізації у екстрахромосомному стані передувала інтеграція у геном та наступна ексцизія.

Той факт, що у деяких сублініях трансгенних мишей частота прояву ефектів змінювалася, а також з'являлися нові фенотипові ознаки (“мокра” шерсть та дефіцит ваги у мишей в поколіннях F3-F5), говорить про те, що у цих сублініях трансген міг інтегрувати у нестабільні області хромосом та внаслідок цього відбувалися його транспозиції у нові ділянки геному. При цьому послідовності трансгену зберігалися та впливали на трансгенних мишей, викликаючи появу фенотипових ефектів.

трансгеноз фенотиповий сегрегація екстрахромосомний

3. У складі екстрахромосомного трансгену залишилася майже повна послідовність гену env, яка була транспозована з сайту клонування у розташовану поблизу ділянку молекули. Реплікація екстрахромосомного трансгену забезпечувалася новоутвореними у результаті його перебудов нуклеотидними послідовностями.

4. Як екстрахромосомний, так і інтегрований трансгени стабільно успадковуються без подальшої зміни структури та виявляються у всіх тканинах і органах.

5. Аналіз структури трансгену свідчить на користь того, що у його перебудовах брали участь рекомбінаційні механізми та нуклеазна деградація. В екстрахромосомному трансгені рекомбінація відбулася за участю коротких АТ-багатих нуклеотидних послідовностей.

6. Екстрахромосомний трансген здатний стабільно реплікуватися у клітинах комах без зміни його структури.

7. Фенотипові відмінності трансгенних мишей від нормальних тварин зумовлені інсерційною інактивацією або порушенням експресії окремих генів, чи загальною дестабілізацією геному реципієнта.

ПЕРЕЛІК РОБІТ З ТЕМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чащина Л.И., Петренко А.И., Вагина И.Н., Крисан К.В., Соломко А.П. Модификация структуры ДНК плазмиды pATV8 у трансгенных мышей. 1. Исследование структуры интегрированного трансгенома и биологические эффекты трансгеноза / / Биополимеры и клетка.- 1997.- Т.13, № 4.- С.323-327.

2. Чащина Л.И., Крисан К.В., Матковский В.Й., Соломко А.П. Модификация структуры ДНК плазмиды pATV-8 у трансгенных мышей. 2. Физическое картирование автономного трансгенома и сиквенирование клонированных фрагментов его модифицированного участка / / Биополимеры и клетка.- 1997.- Т.13, № 5.- С.1-6.

3. Крисан К. В., Кихно И. М., Строковская Л. И., Соломко А. П. Модификация структуры ДНК плазмиды pATV8 у трансгенных мышей. 3. Анализ нуклеотидной последовательности экстрахромосомного трансгена и его репликация в клетках насекомых / / Биополимеры и клетка.- 1999.- Т.15, № 1.- С.57-62.

АННОТАЦИЯ

Крисан К.В. Перестройки структуры плазмиды pATV 8 у трансгенных мышей.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 -- молекулярная биология.-- Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена проблемам взаимодействия трансгена и генома хозяина в модельной системе. Показано, что при введении в зиготы мыши плазмиды pATV 8, состоящей из бактериального вектора pBR 322 и провирусной ДНК вируса саркомы Рауса, часть полученных трансгенных мышей содержит трансген в экстрахромосомной, а часть -- в интегрированной в геном форме. Как экстрахромосомная, так и интегрированная формы стабильно наследовались потомками трансгенных мышей.

Отмечено, что обе формы трансгена претерпели глубокие перестройки, которые произошли на самых ранних стадиях эмбрионального развития, поскольку трансгенные мыши не были мозаиками. При этом, изменившись однократно, структура трансгенов стабилизировалась, и в последующих поколениях трансгенных мышей не изменялась. При интеграции из состава трансгена элиминировались все провирусные и большая часть бактериальных нуклеотидных последовательностей. Один из концов интегрированного фрагмента принадлежит гену устойчивости к ампициллину pBR 322, а второй -- гену-репрессору, ограничивающему копийность плазмиды в клетках E. coli, размер фрагмента -- около 1,5 т.п.н.. Размер экстрахромосомного трансгена -- 5,5 т.п.н., от исходной плазмиды он отличается делецией значительной части провирусных и части бактериальных нуклеотидных последовательностей. Оставшийся фрагмент провирусной ДНК размером около 1,8 т.п.н. содержит почти полную последовательность гена env и межгенную область генов env и src. Этот фрагмент был транспозирован из сайта клонирования провирусной ДНК в другой, близлежащий участок молекулы. Делеция бактериальной части трансгена затронула упоминавшийся ранее ген-регулятор копийности. Анализ границ перестроенных участков показал, что все они были фланкированы короткими АТ-богатыми последовательностями. Исследование особенностей нуклеотидной последовательности трансгена позволило сделать вывод о том, что причиной его перестроек являются рекомбинация с клеточными гомологами провирусных генов и нуклеазная деградация, инициированная в местах локального плавления ДНК трансгена и образования одноцепочечных участков.

Стабильную экстрахромосомную репликацию трансгена обеспечивали новообразованные в результате его перестроек нуклеотидные последовательности. Анализ этих последовательностей позволил выявить участки, гомологичные канонической последовательности ori репликации эукариот.

Установлено, что при трансфекции в культуру клеток насекомых, экстрахромосомный трансген мыши способен устойчиво реплицироваться и сегрегировать без интеграции в геном и изменения структуры. Контрольные плазмиды pBR 322 и pATV 8 в аналогичном эксперименте не реплицировались и элиминировались из клеток после 1-2 клеточных делений. Предполагается, что репликация трансгена в клетках насекомых обеспечивалась теми же последовательностями, что и в клетках мыши, что говорит о высокой консервативности репликативного аппарата эукариот.

Ключевые слова: трансгенные мыши, провирусная ДНК вируса саркомы Рауса, интеграция, перестройки трансгена, репликация, трансфекция.

АНОТАЦІЯ

Крисан К.В. Перебудови структури плазміди pATV 8 у трансгенних мишей.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 -- молекулярна біологія.-- Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено проблемам взаємодії трансгену і геному хазяїна у модельній системі. Показано, що при введенні в зиготи миші плазміди pATV 8, яка містить провірусну ДНК вірусу саркоми Рауса, частина отриманих трансгенних мишей містить трансген в екстрахромосомній, а частина -- в інтегрованій у геном формі. Відзначено, що обидві форми трансгену зазнали глибоких перебудов. Аналіз границь перебудованих ділянок дозволив визначити механізми перебудов трансгену та вказати на особливості його нуклеотидної послідовності, що призвели до цих перебудов. Встановлено, що екстрахромосомний трансген миші здатний стабільно реплікуватися без структурних змін у культурі клітин комах. Дослідження його нуклеотидної послідовності дозволило виявити ділянки, гомологічні канонічній послідовності ori реплікації еукаріотів.

Ключові слова: мікроін'єкція у зиготи, трансгенні миші, вірус саркоми Рауса, інтеграція, перебудови трансгену, реплікація, трансфекція.

ANNOTATION

Krysan K.V. Rearrangements of plasmid pATV 8 structure in transgenic mice.-Manuscript.

Thesis for candidate's of sciences degree on speciality 03.00.03 -- molecular biology.-- Institute of Molecular Biology and Genetics, Ukrainian NAS, Kyiv, 1999.

Dissertation is devoted to the problem of interaction between host genome and transgene in the model system. It has been shown, that after introduction of plasmid pATV 8 into mouse zygotes, one part of the transgenic mice contained extrachromosomal and another part -- integrated form of the transgene. Both of the forms have undergone an essential rearrangements. Analysis of the boundaries of rearranged regions allowed us to determine the mechanisms of such rearrangements and the features of transgene sequence, led to their appearance. It was also found, that murine extrachromosomal transgene is able to replicate continuously in Insect cells without structural changes. Investigation of its nucleotide sequence has revealed the regions of homology to the eukariotic ori replication consensus sequence.

Key words: microinjection into zygotes, transgenic mice, Rous sarcoma virus, integration, transgene rearrangements, replication, transfection.

Размещено на Allbest.ur