Система транспорту ліпідів при оксидативному стресі у щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАНИ

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

УДК 577.125:57.044:57.016.6

Система транспорту ліпідів при оксидативному стресі у щурів

03.00.04 -- Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Загайко Андрій Леонідович

Харків 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохіміі Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна Міністерства освіти України (м.Харків).

Захист відбудеться «1» березня 2000 року о 1500 на засіданні вченої ради К 64.051.17 в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти України за адресою: 61077, Харків-77, пл. Свободи, 4.

Автореферат дисертації розісланий «28» січня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.б.н. Падалко В.І.

Загайко А.Л. Система транспорту ліпідів при оксидативному стресі у щурів. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 -- біохімія. -- Харківський національний університет, Харків, 1999.

Дисертацію присвячено вивченню вмісту та складу, а також оксидативного статусу ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів після введення хлориду кобальту або тетрамізолу. Вперше показано, що введення тваринам сублетальних доз есенційного мікроелементу -- кобальту -- викликає істотне і довгострокове підвищення в сироватці крові практично всіх ліпопротеїдних фракцій водночас зі зниженням в печінці фракцій, що там секретуються. Знайдено, що за цих умов відбувається активне окислення ліпопротеїнів, що проявляється в істотному підвищенні в їх складі вмісту первинних і вторинних продуктів ПОЛ, та зниження вмісту антиоксидантів; причому -ліпопротеїни найдовше з усіх фракцій залишаються в окисленому стані. Встановлено, що введення інгібіторів синтезу білку істотно згладжує гіперліпопротеїнемію при оксидативному стресі. Показано, що іони кобальту здатні безпосередньо впливати на ліпопротеїни, спричиняючи їх деструкцію. Встановлено, що атерогенний характер оксидативного стресу проявляється як в оксидативних модифікаціях ліпопротеїнів, так і в перерозподілі їх фракцій на користь атерогенних. Показано, що реакції відповіді на оксидативний стрес з боку транспорту ліпідів є в значній мірі неспецифічними, та не залежать від стресуючого агенту.

Ключові слова: ліпопротеїни, оксидативний стрес, оксидативні модифікації ліпопротеїнів, тетрамізол, кобальт, актиноміцин D, циклогексимид.

Загайко А.Л. Система транспорта липидов при оксидативном стрессе у крыс.-- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 -- биохимия. -- Харьковский национальный университет, Харьков, 1999.

Диссертация посвящена изучению содержания и состава, а также оксидантного статуса липопротеинов сыворотки крови и цитозоля печени крыс после введения хлорида кобальта или тетрамизола. Впервые показано, что введение животным высоких доз эссенциального микроэлемента -- кобальта -- вызывает существенное и долгосрочное повышение в сыворотке крови содержания практически всех липопротеидных фракций одновременно со снижением в печени уровня синтезирующихся там фракций. Обнаружено, что в этих условиях происходит активное окисление липопротеинов, проявляющееся в существенном повышении в их составе содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ, и снижении уровня антиоксидантов; причем -липопротеины дольше всех фракций остаются в окисленном состоянии. Установлено, что введение ингибиторов белкового синтеза сглаживает гипрелипопротеинемию при оксидативном стрессе. Показано, что ионы кобальта способны непосредственно влиять на липопротеины, вызывая их деструкцию. Установлено, что атерогенный характер оксидативного стресса проявляется как в оксидативных модификациях липопротеинов, так и в перераспределении их фракций в пользу атерогенных. Показано, что ответные реакции при оксидативном стрессе в значительной степени неспецифичны, и не зависят от стрессирующего агента.

Ключевые слова: лиопротеины, оксидативный стресс, оксидативные модификации липопротеинов, тетрамизол, кобальт, актиномицин D, циклогексимид.

Zagayko A. L. Lipid transport system under oxidative stress in rats. -- Manuskript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 -- biochemistry. -- Kharkiv National University, Kharkiv, 1999.

The thesis is devoted to the investigation of the lipid transport system under oxidative stress development, caused by cobalt chloride or tetamisol single intraperitoneal injection. The entering of the various xenobiotics such as heavy metals ions to the human and animal organism leads to different functional and metabolic disorders, including the disorders of lipid transport and metabolism. This process is accompanied by damage of the main classes of biological macromolecules and its complexes including biological membranes also by decrease of the reduced glutathione and macroergs contents. In reply to oxidative stress a number of protective reactions directed on braking free-radical oxidation also to maintenance of functional activity of cell are formed. The various stress effectors capable to loweing a level of compounds generating the active form of oxygen and to activation antyoxidant systems induction is shown. However, the role of lipids in protective reactions under oxidative stress is not investigated enough now. Oxidative modifications of low density lipoproteins is a known aspect of atherogenesis. So the lipoprotein spectrum and composition, their oxidative status in blood serum and liver cytosol in Wistar male rats (weight 180-220 g) in various terms after single injection of cobalt chloride or tetramisol have been investigated in present work.

The dissertation consists on the introduction, the review of the literature on the closen theme, the description of the main methods of the investigation, two parts of the experimental results with their discussion, conclusions and literature cited. The litrature review is devoted to the regulation of the lipid transport under extremal actions.

In blood serum 5 lipoprotein fractions were investigated (1-LP, 2-LP, -LP, pre--LP and chilomicrones), and in liver cytosole -- 4 fractions (-LP, -LP, pre--LP and fraction of start zone). In the experiments it has been shown that one-time intraperitonial administration of cobalt chloride or tetramisol in doses near to LD50 leads to tocopherol content in lipoprotein decreasing and lipoprotein oxidative modifications. There were no lipoperoxides in - and pre--lipoproteins after long-time (24 hr) exposure howewer -LP remain oxidatively modified. Аctivation of free-radical oxidation is accompanied by changes in lipoprotein content and composition. The role of -LP peroxide modifications, rising their phospholipids content and cholesterol level in antioxidant and antiatherogenic defence is discussed. Decreasing in liver cytosole by 30 min pre--lipoproteins content, obviously, suggests to emission available pool of ready lipoproteins to blood. Changes in the prae--lipoproteins structure in liver and blood probably reflects the increasing of the tissues requirement in lipids, connected with activation of lipid peroxidation. Decrease of the total lipids, phospholipids and cholesterol ethers contents in liver cytosole start zone, probably, favours to amplification of lipid inclusion into lipoproteins. Changes of structure liver -lipoproteins confirms an intensive lipid exchange between lipoproteins of blood and periferal tissues cells. Decreasing of the phospholipid content also in pre--lipoproteins in blood serum, probably, is connected to their active utilization by tissues for homeostatic correction of lipid constitution of membranes. It confirms also by the phospholipid content in liver pre--lipoproteins continues to increase, i.e. weakening of their inclusion to synthesized anew particles does not occur. Normalisation of total lipids content in liver pre--lipoproteins to 24 hr on a background of essential increasing of the fraction total content could testify about transition of biosynthetic systems of liver on new higher basal level. In liver cytosole the total lipid and lipoprotein content to 96 hr is reduced in comparison with the control that probably is connected with still intensive lipoprotein emission to blood.

So the data obtained also show that the oxidative stress caused by one-time cobalt chloride or tetramisol injection leads to essential activation of lipid transport. The increase of the contents mostly all of lipoprotein fractions in blood serum and liver cytosole, and atherogenic changes (increasing cholesterol level and oxidative modifications) in lipoprotein structure were found. Total lipid content in lipoproteins was found to decrease, and hyperlipidemia is arrived at increasing in level lipid-poor lipoproteins. It has been shown that lipoprotein fractions are redistributed with increasing level of atherogenic ones.

Co-administration cobalt chloride and by actinomycine D or cycloheximide (the inhibitors of the protein synthesis) has realy prevented hyperlipoproteinemia in many cases byt hasn't influenced on lipoprotein oxidation. It has been concluded that apoprotein synthesis is very important process influenced on adaptive reactions under free-radical oxidation activation conditions. Pre-- and -lipoproteins were discussed to have mRNA pool in hepatocytes. In the in vitro conditions it has been found that cobalt ions directly cause lipoprotein disaggregation and free lipid level increasing in blood serum and liver cytosole.

It has been concluded that system of lipids homeostasis consists of lipid synthesis and transport mechanismes in the organism is activated under oxidative stress conditions.

Key words: lipoproteins, oxidative sterss, oxidative modifications of lipoproteins, tetramisol, cobalt, actinomycine D, cycloheximide.

ліпопротеїн кров щур печінка

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. За умов сучасності перед біологічними науками та медициною дуже гостро постала проблема дослідження нових форм патологій, розвиток яких викликаний впливом на організм з боку навколишнього середовища [Авцн А.П. и др., 1991]. Багато з ксенобіотиків, що надходять до навколишнього середовища і організму людини з техносфери, зрушують баланс в системі прооксиданти антиоксиданти в бік перших [Барабой В.А. и др., 1992]. Такою властивостю володіють також інші стресорні фактори, наприклад, надходження до організму надлишкових кількостей есенціальних мікроелементів, зокрема, іонів кобальту [Stohs S.J., Bagchi D. 1995]. За умов генерування великої кількості активних форм кисню пошкоджуються всі основні класи біологічних макромолекул та надмолекулярних комплексів, у тому числі біологічні мембрани, знижується вміст відновленого глутатіону та макроергів [Голиков С.Н. и др., 1986]. При цьому різні фізіологічні системи, що підтримують гомеостаз, часто мають витримувати неадекватні навантаженням і перенапруження, що супроводжується розвитком оксидативного стресу [Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Менщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997, Калиман П.А. и др., 1997, 1998]. У відповідь формується ряд захисних реакцій, спрямованих на гальмування вільнорадикального окислення та підтримання функціональної активності клітини.

Ліпіди, як сполуки, що містять подвійні зв'язки (ненасичені жирні кислоти та їх залишки в складних ліпідах), становлять об'єкт, що легко пошкоджується активними метаболітами кисню [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Для коригування порушень мембран недостатньо активності ліпідсинтезуючих ферментів періферичних тканин, значна частина ліпідів повинна бути синтезована в печінці та транспортована до тканин у вигляді ліпопротеїнів крові. Проте підтримання гомеостазу клітинних мембран за умов активації вільнорадикального окислення та роль ліпідів і ліпопротеїнів у захисних реакціях при оксидативному стресі вивчені недостатньо. Крім того, важливою ланкою розвитку стрес-реакції є перемикання метаболізму з використання вуглеводів як джерела енергії на утилізацію ліпідів [Панин Л.Е., 1983, Калиман П.А. и др., 1997].

Таким чином, безперечно велике значення становить вивчення системи транспорту ліпідів в енергетичному обміні та в механізмах підтримання гомеостазу клітинних мембран за умов оксидативного стресу.

Ліпопротеїни крові відіграють важливу роль в атерогенезі [Климов А.Н., 1995]. Враховуючи відомий факт атерогенної дії іонів кобальту і стресу взагалі, важливим було вивчити стан окислення ліпопротеїнів, особливо апо-В-вміщуючих ліпопротеїнів, що є одними з пускових елементів атеросклерозу, на різних термінах розвитку оксидативного стресу, викликаного введенням іонів кобальту або тетрамізолу. Введення тетрамізолу було прикладом, необхідним, щоб довести неспецифічність реакцій адаптації з боку системи транспорту ліпідів. Цей гідрофільний ксенобіотик, як відомо [Калиман П.А.и др., 1998], викликає в дозах, близьких до ЛД50, розвиток оксидативного стресу.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослідження стало частиною держбюджетної теми НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна“Клітинні і молекулярні механізми адаптації метаблізму при оксидативному стресі” (№ ДР 0197U008188).

Мета і задачі дослідження. Метою цієї роботи стало встановлення механізмів впливу оксидативного стресу, що був спричинений введенням хлориду кобальту або тетрамізолу, на транспорт ліпідів у щурів. В зв'язку з метою дослідження, а також враховуючи, що транспорт ліпідів здійснюється в формі ліпопротеїнів крові, синтез і катаболізм значної кількості яких відбувається в печінці, в роботі було вивчено:

Вміст та ліпідний склад ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів за умов розвитку оксидативного стресу, що спричинений введенням хлориду кобальу або тетрамізолу in vivo.

Вплив інгібіторів білкового синтезу (актиноміцину D та циклогексиміду) на вміст та ліпідний склад ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові через 2 год. та добу після введення хлориду кобальту на фоні дії інгібітора.

Оксидативні модифікації ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів за тих же умов.

Вплив іонів кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів цитозолю печінки і сироватки крові in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що введення тваринам сублетальних доз есенційного мікроелементу -- кобальту -- викликає істотне і довгострокове підвищення в сироватці крові практично всіх ліпопротеїдних фракцій водночас зі зниженням в печінці фракцій, що там секретуються. Знайдено, що за цих умов відбувається активне окислення ліпопротеїнів, що проявляється в істотному підвищенні в їх складі вмісту первинних і вторинних продуктів ПОЛ, та зниження вмісту антиоксидантів; причому -ліпопротеїни найдовше з усіх фракцій залишаються в окисленому стані. Вперше встановлено, що введення інгібіторів синтезу білку істотно згладжує гіперліпопротеїнемію при оксидативному стресі, що викликаний введенням хлориду кобальту. Показано, що іони кобальту здатні безпосередньо впливати на ліпопротеїни, спричиняючи їх деструкцію. Встановлено, що атерогенний характер оксидативного стресу проявляється як в оксидативних модифікаціях ліпопротеїнів, так і в перерозподілі їх фракцій на користь атерогенних. Показано, що реакції відповіді на оксидативний стрес з боку транспорту ліпідів є в значній мірі неспецифічними, та не залежать від стресуючого агента.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані в роботі дані поглиблюють відомості про механізми дії сублетальних доз іонів кобальту та розвитку окисного стресу в клітинах тварин в цілому. Виявлені деякі можливі механізми підтримання клітиною гомеостазу мембран на молекулярному рівні. Вказана роль системи транспорту ліпідів, що включає ліпопротеїни крові та печінки, в антиоксидантному захисті клітини. Ці дані можуть становити основу для подальшого вивчення механізмів розвитку стрес-реакції і адаптації клітини до несприятливих умов на клітинно-молекулярному рівні.

Практична значимість роботи полягає в пошуках шляхів до розробки засобів корекції пошкоджень ліпідних структур клітини і, можливо, організму в цілому за умов впливу факторів, що активують ліпопероксидацію. Вивчення деяких механізмів атерогенезу може бути використане при розробці заходів профілактики та лікування цього захворювання.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконано під керівництвом доктора біол. наук. П.А.Калімана, в співробітництві з Р.В. Шаламовим, з якими автор має сумісні публікації. Усі результати, що приведені в рукописі, отримані пошукачем самостійно. Дисертантом особисто проведені експерименти та визначення показників, що обрані для досліджень, обговорені отримані результати.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на засіданнях кафедри біохімії протягом 1995-1998 років, науковій конференції молодих вчених ХДУ в 1996 р., республіканській науково-практичній конференції молодих вчених “Сучасні фундаментальні та прикладні проблеми клініки внутрішніх захворювань”, Харків - 1997, конференції “Екологічна токсикологія на порозі ХХІ сторіччя”, Київ - 1997, VII Українському біохімічному з'їзді, Київ - 1997 (де отримала ІІ премію на конкурсі робіт молодих вчених), науковій конференції “Фундаментальні та прикладні аспекти сучасної біохімії”, С.-Петербург, 1998 р.

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, серед яких 6 статей та 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, двох розділів результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури та додатків. Робота викладена на 153 сторінках машинописного тексту і містить 11 рисунків та 33 таблиці. 3 рисунка та 3 таблиці винесено на окремі сторінки. Список літератури містить 287 джерел та розташований на 27 сторінках. Додатки містять 11 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури за темою дисертації. Особлива увага приділена розгляду стану системи транспорту ліпідів ссавців при дії на організм екстремальних чинників.

У другому розділі описано матеріали та основні методи дослідження.

ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Постановка експерименту. У роботі використовували білих щурів-самців лінії Wistar 3-х місячного віку, вагою 180-220 г, що утримувались у стандартних умовах віварію Харківського університету. Об'єктом дослідження виступали цитозоль печінки та сироватка крові щурів.

Після декапітації анестезованої хлоралозо-уретановим наркозом тварини печінку перфузували холодною середою виділення та гомогенізували у гомогенізаторі Поттера на льоду. Цитозоль печінки одержували шляхом диференційного центрифугування гомогенатів у центрифузі VAC-601 [Финдлей Дж., ванз У., 1990].

Проведення електрофорезу ліпопротеїнів. Сироватку крові або цитозоль печінки фарбували насиченим розчином Судана Чорного 10В. Ліпопротеїни фракціонували методом діск-электрофорезу у вертикальних пластинах ПААГ [Колб В.Г., Камшников В.С., 1979]. В залежності від розташування на електрофореграмі, ліпопротеїни ідентифікували як 1-, 2-, -, пре--ліпопротеїни та хіломікрони. Фарбу вимивали сумішшю оцтової кислоти та етанолу з додецилсульфатом натрію. Оптичну густину елюату визначали спектрофотометрично за допомогою СФ-26 для розрахунку відсоткового вмісту кожної з фракцій.

Концентрацію - та пре--ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки в сумі визначали також турбідіметричним методом [Колб В.Г., Камшников В.С., 1982]. Використовуючи здобуту таким чином концентрацію апо-В-вміщуючих ліпопротеїнів, та дані про відсоткове співвідношення між фракціями ліпопротеїнів, що були отримані за допомогою електрофорезу, розраховували вміст кожної з ліпопротеїдних фракцій.

Ліпіди з ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові після фракціонування екстрагували за методом Bligh and Dyer [1959] з деякими модифікаціями.

Вміст фосфоліпідів (ФЛ) визначали за фосфором, що входить до їх складу [Sundhu R., 1976].

Вміст моно-, ді- та тригліцеридів (ТГ) визначали за реакцією формальдегіду, що утворився при окисленні гліцерину [Tixer M., Claude J., 1976], з солянокислим фенілгідразином. В деяких випадках концентрацію гліцеридів визначали за допомогою стандартного ферментативного набору фірми “KONE” (Фінляндія).

Вміст вільного та етерифікованого холестеролу (ВХ та ЕХ) визначали за реакцією з хлорним залізом та подальшим осадженням ВХ дігітоніном [Финдлей Дж., ванз У., 1990]. В деяких випадках концентрацію ВХ та загального холестеролу визначали за допомогою стандартних ферментативних холестеролоксидазних наборів фірми “Boehringer Mannheim GmbH diagnostica” (Німеччина).

Концентрацію загальних ліпідів (ЗЛ) визначали за допомогою стандартного набору Eagle Diagnostics (США).

Визначення кількості продуктів переокислення ліпідів в ліпопротеїнах. Фракції ЛВГ (ліпопротеїнів високої густини) та ЛНГ+ЛДНГ (ліпопротеїнів низької та дуже низької густини) розділяли центрифугуванням сироватки крові та цитозолю печінки, до яких попередньо додавали розчини гепарину та СаCl2 в присутності ЕДТА. Вимірювали оптичну густину гептан-ізопропанольних екстрактів вказаних фракцій при довжині хвилі 220 нм (для ізольованих подвійних зв'язків), 232 нм (для дієнових кон'югатів) та 278 нм (для кетодієнів та сполучених трієнів) [Волчегорский И.Ф. и др., 1989]. Вміст загальних гідроперекисів вимірювали реакцією з тіоціанатом амонію [Романова Л.А., Стальная И.Д., 1977].

Визначення кількості -токоферолу проводили за кольоровою реакцією з двовалентним залізом (індикатор , `-біпіридил); до результатів визначення вносили поправку на присутність холестеролу [Кибардин С.А., 1951].

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Х-крітерію Ван-дер-Вардена [Закс Л., 1976].

У третьому та четвертому розділах дисертації наведено основні результати досліджень та їх обговорення.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВПЛИВ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ, СПРИЧИНЕНОГО ІОНАМИ КОБАЛЬТУ, НА ТРАНСПОРТНІ ФОРМИ ЛІПІДІВ У ЩУРІВ.

Вплив хлориду кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів. Тварин декапітували через 30 хв., 2, 24, 48, 72 та 96 год після одноразової ін'єкції солі або фізіологічного розчину (для контрольних тварин). Тривалий час експозиції кобальту дав змогу простежити розвиток оксидативного стресу на різних етапах з вмиканням як термінових, так і довгострокових механізмів регуляції. Вивчали вміст окремих фракцій ЛП (ліпопротеїнів), їх ліпідний склад, а також стан оксидації в ЛП.

В сироватці крові нами виявлено 5 фракцій ліпопротеїнів (1-ЛП, 2-ЛП, -ЛП, пре--ЛП та хіломікрони), а в цитозолі печінки -- 4 фракції (-ЛП, -ЛП, пре--ЛП та фракція стартової зони). Електрофоретична рухливість фракцій ЛП цитозолю печінки відповідала рухливості ЛП крові, з чого ми виходили при узгодженні змін в вмістах ЛП сироватки крові і цитозолю печінки.

В табл. 1 наведені дані вмісту загальних ЛП, а на рис. 1 -- вмісту фракцій ЛП сироватки крові та цитозолю печінки щурів за умов розвитку оксидативного стресу, спричиненого введенням СоСl2. Як видно, вміст загальних ЛП крові значно підвищується на 2 год спостереження та залишається підвищеним у подальшому. При цьому зростає вміст всіх фракцій ЛП, окрім хіломікронів (ХМ). Динаміку змінень вмісту загальних ліпопротеїнів повторюють фракції - та пре--ЛП, тоді як рівень -ЛП до 24 год залишається зниженим. Загальний рівень ЛП в сироватці крові залишається підвищеним протягом усього експерименту, а в цитозолі печінки він нормалізується через 3 доби, а потім знову знижується через 4 доби після ін'єкції.

Таблиця 1. Вплив хлориду кобальту на вміст загальних ліпопротеїнів сироватки крові та цитозолю печінки щурів, мг/мл(г), n=6

* -- Вірогідні зміни (р0.05 до контролю)

Зниження в цитозолі печінки вже на 30 хв вмісту пре--ЛП (Рис. 1), вочевидь, свідчить про викид пула готових ЛП до крові. Це можна розглядати як один з показників розвитку стрес-реакції та перемикання метаболізму на утилізацію ліпідів [Панин Л.Е., 1983, Калиман П.А., Шаламов Р.В., Загайко А.Л., 1997] у відповідь на дію хлориду кобальту. На користь цього говорить і різке зниження вмісту ХМ у сироватці крові, та їх зникнення до 72 год, можливо, пов'язане з активацією ліпопротеїнліпази (ЛПЛ) за умов стресу.

Спостереження в нашому експерименті істотного підвищення в ліпідному складі -ЛП печінки на 30 хв вмісту всіх ліпідних фракцій, з прийняттям до уваги, що насцентні -ЛП практично не містять ЕХ, які утворюються в кров'яному руслі під дією ЛХАТ [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995], дає змогу припустити, що ці ЛП захоплені печінкою з крові, тобто відбувається прискорення поглинання печінкою циркулюючих ЛП. Змінення до 30 хв складу і пре--ЛП печінки та крові, можливо, відображає підвищену потребу тканин у ліпідах, пов'язану з активацією ПОЛ. Зниження вмісту загальних ліпідів в стартовій зоні цитозолю печінки, можливо, свідчить про посилення включення ліпідів до ЛП, що синтезуються в печінці, головними з яких є пре--ЛП. Відзначене до 2 год підвищення вмісту всіх фракцій ЛП (окрім ХМ) сироватки крові та зниження їх у цитозолі печінки (Рис.1) свідчить про активацію секреції ЛП печінкою. Загальний вміст ЛП у сироватці крові до цього часу істотно підвищується (Табл.1).

Сироватка крові

1-ЛП 2-ЛП -ЛП пре--ЛП ХМ

Цитозоль печінки

-ЛП -ЛП пре--ЛП старт

1- контроль, 2- 30 хв експозиції Со2+, 3-2 год, 4-24 год, 5-48 год, 6-72 год, 7-96 год

*-- Вірогідні зміни в порівнянні з контролем (р0.05)

Звернемо увагу на те, що рівень -ЛП підвищується разом зі зростанням концентрації пре--ЛП, що свідчить про активну роботу тригліцеридліпази (ТГЛ), що секретується печінкою. Активація ліполітичних ферментів -- важлива ланка стрес-реакції, спрямована на забезпечення клітин джерелами енергії.

Склад всіх ЛП крові (окрім пре--ЛП), як відзначалося, до 2 год характеризується істотним зниженням в них рівня ЗЛ, і характерна для стресу гіперліпідемія, що носить адаптаційний характер, досягається за рахунок підвищення вмісту цих обіднених ліпідами ЛП. Окрім зниження рівня ЗЛ, -ЛП крові збіднюються ФЛ, ВХ та ЕХ. Протилежні зміни складу -ЛП печінки вказують на інтенсивний обмін ліпідами між ЛП крові та клітинами периферичних тканин. Зниження вмісту ФЛ також в пре--ЛП сироватки крові, ймовірно, пов'язано з їх активною утилізацією тканинами для гомеостатичного коригування ліпідного складу мембран. Це підтверджується і тим, що у пре--ЛП печінки вміст ФЛ продовжує підвищуватись, тобто ослаблення їх включення у знову синтезовані частки не відбувається.

Збільшення вмісту ЗЛ у стартовій зоні цитозолю печінки вказує, очевидно, на активацію до цього часу ліпідсинтезуючих систем або на вичерпання пулу апоЛП, що призводить до накопичення ліпідів, не зв'язаних з білками.

Відзначена у літературі [Авцн А.П. и др., 1991] атерогенна дія кобальту може проявлятись у перерозподілі холестеролу між атерогенними пре--ЛП та антиатерогенними -ЛП на користь перших (при значному підвищенні вмісту загального холестеролу в сироватці крові [Шаламов Р.В., 1999]).

Важливим представляється зниження до 48 год вмісту ТГ у -ЛП цитозолю печінки. Воно, ймовірно, пов'язане з активацією за умов стресу печінкової ТГЛ, з урахуванням відомого факту [Machley R.W., Hussian M.M., 1991], що ТГ потрапляють до ЛВГ з ремнантів ХМ. Останні, як і збагачені ТГ -ЛП, є субстратом ТГЛ.

Р.В.Шаламовим [1999] було висунуто припущення про інгібування за умов розвитку оксидативного стресу лецитин:холестерол-ацилтрансферази (ЛХАТ). На користь цього свідчать і відзначені в нашій роботі зміни в складі -ЛП печінки до 24 год: того часу, як рівень ВХ в них підвищений, вміст його ефірів -- знижений в порівнянні з контролем.

У цитозолі печінки загальний вміст ЛП до 96 год знижується в порівнянні з контролем (Табл.1), що, ймовірно, пов'язано з все ще інтенсивною секрецією їх до кровообігу. Нормалізація рівня ЗЛП в цитозолі печінки до 3 доби при підвищеному їх рівні в сироватці крові може бути наслідком насичення до цього часу периферичних тканин ліпідами, і, отже, послаблення синтезу останніх печінкою.

Іони кобальту індукують окислення ЛНГ, що приводить до істотного змінення їх оксидативного статусу: вже на 30 хв експерименту вміст ізольованих подвійних зв'язків падає як у ЛВГ, так і у ЛНГ крові (Табл.2), причому у ЛВГ це зниження більш істотно (у 2 рази). Це може бути пов'язане з високим рівнем в ЛВГ ФЛ, що містять ненасичені жирні кислоти. До 2 год ці змінення ще більш виражені, та відзначаються навіть через добу після ін'єкції. Рівень продуктів ПОЛ у ЛВГ та ЛНГ крові підвищується до 30 хв експерименту, та повертається до норми тільки на 4 добу.

Таблиця 2. Вплив хлориду кобальту на показники перекисного окислення ліпідів - ліпопротеїнів сироватки крові та - +пре-- ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки щурів, n=6

* -- вірогідні зміни (р0.05 до контролю)

Окисляються і ЛНГ печінки: вже до 30 хв експозиції кобальту у них підвищується вміст первинних і вторинних продуктів ПОЛ. Привертає увагу динаміка -токоферолу: у ЛВГ та ЛНГ крові його вміст різко падає на 30 хв, а у ЛНГ крові та печінки він до 2 год експерименту не виявляється (Табл. 2).

Як видно, ЛВГ підвладні окисним модифікаціям не в меншому ступеню, ніж ЛНГ, але вони є і краще захищеними -- зокрема, мають первісно у 2 рази більш високий рівень токоферолу, ніж ЛНГ. За рахунок наявності в них великої кількості токоферолу, а також ненасичених ЖК фосфоліпідів, -ЛП можуть виступати пасткою вільних радикалів. Крім того, саме ці ЛП найдовше циркулюють в крові, виконуючи захисну функцію. У той час, як вміст -токоферолу у ЛВГ повертається до норми на 4 добу експерименту, його рівень у ЛНГ у цей час все ще знижений.

Ще раз підкреслимо, що окисно-модифіковані ЛНГ виявляються і в печінці. Те, що пік накопичення продуктів ПОЛ у них відзначається пізніше, ніж у крові, може свідчити як про поглинання печінкою окислених ЛП з кровообігу, так і про активацію ПОЛ в органі [Калиман П. А. и др., 1997].

Таким чином, отримані результати свідчать, що одноразове введення хлориду кобальту, який викликає розвиток оксидативного стресу, істотно впливає на транспорт ліпідів. Ймовірно, це пов'язано з функціонуванням систем, що підтримують структурно-функціональну цілісність біологічних мембран, та забезпечують клітини джерелами енергії. Можна стверджувати, що оксидативний стрес, викликаний введенням хлориду кобальту, носить атерогенний характер. Він проявляється як у перерозподілі ліпопротеїдних фракцій на користь атерогенних, так і у оксидативних модифікаціях ЛП.

Вплив інгібіторів білкового синтезу на вміст та склад ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки щурів при оксидативному стресі, викликакному введенням хлориду кобальту. Для вияснення можливих механізмів впливу оксидативного стресу, спричиненого введенням іонів кобальту, було проведено серію досліджень по вивченню змін відповіді на стрес з боку ліпідів за умов вимикання синтезу білку на етапах транскрипції і трансляції. Це дало підстави припустити, як відбувається зміна активності ферментів ліпідного обміну - за рахунок змін транскрипції відповідних генів, трансляції наявного пулу мРНК або через зміни активностей вже синтезованих ферментів, а також простежити вплив обмеження синтезу апобілків на характер реакцій відповіді з боку збирання та катаболізму ліпопротеїнів. Для цього за 30 хв. до ін'єкції тваринам СoCl2, їм вводили одноразово внутрішньочеревно AmD (актиноміцин D -- інгібітор транскрипції) або ЦГИ (циклогексимід -- інгібітор трансляції) [McCormick C.C., et al., 1991]. Вивчали вміст та склад ЛП цитозолю печінки та сироватки крові.

Самі антибіотики досить істотно впливають на вміст ЛП. Так, антибіотики до 2.5 год експерименту хоча і не викликали зміни загального вмісту ліпопротеїнів, але привели до певного перерозподілу їхніх фракцій (Табл.3). І Аm D, і ЦГИ викликали зниження вмісту фракцій -ЛП і пре--ЛП, тобто фракцій, переважно синтезованих печінкою. Ця дія аналогічна дії оксидативного стресу, спричиненого кобальтом. У той же час кількість -ЛП, що головним чином поглинаються печінкою, підвищується. Те, що Со2+ не викликає підвищення вмісту -ЛП, можна зв'язати з тим, що при оксидативному стресі окислені ЛП захоплюються у великій кількості макрофагами [Зенков Н.К., Меншикова Е.Б., 1996], а антибіотики, як було знайдено, не викликають істотних оксидативних модифікацій ЛП, хоча і, вочевидь, дещо активують вільнорадикальне окислення. Схожі тенденції спостерігаються і в апо-В-ЛП сироватки крові та цитозолю печінки.

В сироватці крові в умовах нашого експерименту відзначені розбіжності в дії антибіотиків і оксидативного стресу на вміст ЛП (Табл.3). Так, Аm D викликає зростання до 2.5 год концентрації 1-ЛП, а ЦГИ -- її зниження. Те ж характерно і для пре--ЛП. На підставі цих даних можна припустити, що зниження вмісту зазначених фракцій у печінці може бути зв'язане при введенні антибіотиків не тільки з необхідністю викиду ЛП у кров, як при оксидативному стресі, але і з гнобленням синтезу апобілків, концентрація яких у значній мірі лімітує швидкість утворення ЛП [Климов А.Н., 1995]. Причому останнє більш характерно для ЦГИ (інгібітору трансляції), що говорить про можливість існування в гепатоциті пула мРНК для апобілків пре--ЛП і -ЛП. Крім того, оксидативний стрес викликав зниження в цитозолі печінки вмісту ліпідів, не зв'язаних із білками (фракція стартової зони -- див. вище), мабуть, у результаті їхнього активного включення до ЛП, а антибіотики не виявляли такої дії, що також говорить на користь припущення про дефіцит апобілків, котрий викликається антибіотиками.

Таблиця 3. Вплив антибіотиків на вміст ліпопротеїнів цитозолю печінки та сироватки крові щурів при оксидативному стресі, мг/г тканини (мг/мл сироватки), Mm, n=6

*- вірогідно до контролю (р0.05); #- вірогідно до Со2+ (р0.05)

До 24 год антибіотики привели до зникнення з крові ХМ (Табл.3), можливо, у результаті інгібування синтезу їхніх апобілків у стінці кишечника, або впливу на процеси всмоктування жирів. Ймовірно, в результаті недостачі апобілків антибіотики викликають і підвищення загального вмісту ліпідів у складі -ЛП крові і печінки. Такий ефект не характерний для інших фракцій ЛП. Це, з прийняттям вищевисказаного припущення, говорить про найбільшу залежність саме цих ЛП від синтезу апобілків.

При спільному введенні з хлоридом кобальту, антибіотики в печінці до 2.5 год підсилюють зниження ЗЛП (Табл.3), яке при оксидативному стресі, могло бути пов'язано з посиленням секреції ЛП у кров. В крові цей ефект спостерігається більш виражено до 24 год, коли антибіотики істотно згладжують виникаючу при оксидативному стресі гіперліпопротеїдемію.

На тлі підвищеного в крові рівня -ЛП, їхнє надходження до печінки, мабуть, не підсилюється і при сумісному введенні антибіотиків і хлориду кобальту. Раніше нами було висловлене припущення, що підвищення в печінці вмісту -ЛП при оксидативному стресі зв'язано з посиленням їхнього поглинання, а не синтезу. Про це свідчило підвищення в них кількості ЕХ. При введенні антибіотиків, особливо ЦГИ, навпаки, кількість ЕХ у -ЛП печінки знижене, на підставі чого можна припустити розходження в механізмах зниження концентрації цієї фракції під дією оксидативного стресу й антибіотиків, а саме -- пригнічення під дією антибіотиків складання ЛП. На користь ослаблення складання -ЛП говорить і згадуване вже збагачення цих ЛП у печінці ЗЛ, особливо ФЛ і ВХ. Ці ліпіди, як відомо, поряд з апобілками починають формування ЛП частинки, створюючи її поверхневий гідрофільний шар, і підвищення їхнього питомого вмісту в ЛП частинці може бути компенсаторним при нестачі апобілків. Цікаво, що самі антибіотики, ймовірно, викликають зниження активності ЛХАТ-реакції, можливо, через пригнічення синтезу самого ферменту або його білків-активаторів, про що свідчить підвищення в -ЛП крові вмісту вільного холестерину на тлі зниження в них кількості ЕХ. Антибіотики викликають до 24 год достовірне зниження вмісту пре--ЛП печінки і крові (Табл. 3) в порівнянні з дією оксидативного стресу, що вказує на високу швидкість обміну апобілків цих ЛП. Подібні зміни вмісту -ЛП можуть свідчити про те, що в умовах стресу можуть швидко обмінюватись загальні для цих ЛП апобілки, тобто апо С. На користь нестачі цього апобілка, що, як відомо, є активатором ЛХАТ (апо C I) і ЛПЛ (апо С II) говорять згадані вище дані про перерозподіл холестеролових фракцій, а також істотне підвищення рівня ТГ у -ЛП і -ЛП крові під впливом антибіотиків.

Таким чином, можна припустити, що в умовах розвитку оксидативного стресу синтез стресорних білків є найважливішою реакцією, і його порушення істотно псує хід процесів адаптації. Виявлено, що не стільки самі антибіотики, скільки антибіотики разом з хлоридом кобальту досить істотно впливають на вміст і склад ліпопротеїнів. Це може бути зв'язане як із їхньою безпосередньою дією як інгібіторів синтезу білка, так і з їхньою дією, як ксенобіотиків. Ми припускаємо можливість часткової заміни апоЛП, що виконують структурну функцію, амфіфільними ліпідними фракціями, а також різну швидкість обміну різних апобілків при оксидативному стресі.

Вплив іонів кобальту на вміст та склад ліпопротеїнів сироватки крові і цитозолю печінки in vitro. Зміни в ліпідному статусі, що спостерігаються in vivo є результатом складної взаємодії багатьох метаболічних ланок і чинників. У зв'язку з цим важливою є розробка модельних систем для вивчення окремих дільниць дії оксидативного стресу. Зокрема, це могло дати змогу вивчити дію іонів кобальту на ЛП, не опосередковану гормональною та іншими регуляторними системами.

Нами вивчено вплив іонів кобальту на вміст та склад ЛП сироватки крові та цитозолю печінки щурів.

Виявлені істотні відмінності між дією теплової їнкубації та інкубації в присутності іонів кобальту. Привертає увагу також різниця між вмістом ЗЛП, визначеним турбідиметричним методом, та сумою окремих фракцій. Це вказує на те, що в сироватці крові, інкубованій з додаванням іонів кобальту, з'являються вільні ліпіди, які при електрофорезі залишаються на старті, домішуючись до фракції ХМ. Схожа картина спостерігається і в печінці. Це може свідчити про індукцію іонами кобальту розпаду ЛП частинок.

Відзначимо, що найбільш чутливими як до теплової деструкції, так і до дії іонів кобальту, виявилися апо-В-ЛП. Так, вміст пре--ЛП крові падає при тепловій інкубації, хоча вміст решти фракцій залишається незмінним. В печінці теплова інкубація призводить до зниження рівня усіх фракцій ЛП, що може, як ми припускаємо, бути наслідком їх ще неповного збирання, зокрема, недостатньої кількості антиоксидантів. Іони кобальту спричиняють зниження вмісту апо-В-вміщуючих ЛП в порівнянні як з нормою, так і з холостою інкубацією.

Припущення про безпосередній розпад ЛП часток підверджується також і тим, що в складі ЛП сироватки крові відзначається зменшення загальної кількості ліпідів. В цитозолі ж печінки ці зміни більш виражені при інкубації з Со2+. Того ж часу, кількість ліпідів, що залишилися на старті, тобто не зв'язаних з білками, зросла в сироватці крові. В печінці ж, вочевидь, ліпіди перерозподіляються між ЛП різних фракцій. Зниження вмісту ЕХ, що спостерігається в ЛП цитозолю печінки, ймовірно, відбувається за рахунок їх гідролізу, а утворений ВХ, принаймні частково, утилізується -ЛП, внаслідок чого рівень ВХ в -ЛП підвищений. При інкубації з Со2+, вірогідно, до цього залучаються і пре--ЛП.

Приверає увагу зниження в усіх ЛП фракціях крові кількості ВХ та ЕХ. Саме випадання ВХ та зниження вмісту ФЛ може бути причиною розпаду ЛП часток.

Узагальнюючи вищевикладене, можна відзначити, що іони Со2+ безпосередньо впливають на ЛП частки, викликаючи руйнування останніх, причому до їх дії виявляються більш чутливими апо-В-вміщуючі ЛП, що узгоджується з відомими фактами. Це також підтверджує висловлені вище припущення про неспецифічність атерогенної дії високих доз кобальту. Також відзначимо, що під впливом як холостої, так і інкубації з Со2+ в печінці, ймовірно, відбувається головним чином розпад ЛП частинок, а в сироватці крові -- їх модифікація, того часу, як іони Со2+ можуть спричиняти інтенсивну деградацію ЛП і сироватки крові. В ефектах, які ми спостерігали при вивченні розвитку оксидативного стресу, спричиненого іонами кобальту, визначену роль відіграє і безпосередній вплив цих іонів на ЛП частки. Однак в умовах in vivo вільні ліпіди, які утворюються при розпаді ЛП, можуть зв'язуватись альбуміном або вільними апобілками, синтезованими печінкою [Климов А.Н., 1995], що в значній мірі нормалізує реакції відповіді на оксидативний стрес.

Вплив тетрамІзолу на вмІст та склад лІпопротеЇнІв сироватки кровІ І цитозолю пеЧІнки щурІв.

Введення тетрамізолу ([+]-2,3,5,6-тетрагідро-6-феніламідазо-{2, 1-b}-тіазолу) щурам у дозах, близьких до ЛД50 активує вільнорадикальне окислення, що супроводжується розвитком оксидативного стресу [Калиман П.А. и др., 1998]. Виходячи з цього, ми використали одноразове внутрішньочеревне введення тваринам тетрамізолу як модель оксидативного стресу, щоб вияснити, чи є реакції відповіді, що спостерігалися в експериментах з введенням хлориду кобальту, специфічними для саме цього стресуючого агента.

Вже через 30 хв після введення тетрамізолу у фракції -ЛП крові підвищується вміст гідропероксидів ліпідів, що свідчить про активацію ПОЛ. У подальші 1.5 год їх вміст ще більше зростає (р<0.05) та знижується вміст -токоферолу. Підвищення вмісту вторинних продуктів ПОЛ, а також зменшення кількості речовин, що містять неушкоджені подвійні зв'язки у -ЛП через 2 год свідчить про продовження вільнорадикального окислення і може розглядатись як показник розвитку оксидативного стресу. До 2 год після введення тетрамізолу спостерігаються оксидативні модифікації також фракції - та пре--ЛП крові. При цьому вміст -токоферолу у цій фракції також знижується. Схожі тенденції ми спостерігали і при введенні хлориду кобальту.

Через 30 хв після введення тетрамізолу в сироватці крові різко знижується вміст ХМ, що може свідчити про активацію ЛПЛ. Істотно зросла і кількість пре--ЛП, очевидно, за рахунок секреції наявного пулу цих ЛП печінкою. Підвищується також загальний рівень ЛП. Зниження до 2 год рівня пре--ЛП в порівнянні з 30 хв зі зростанням вмісту -ЛП свідчить про активну роботу ТГЛ. Ми вже висловлювали припущення про активацію цього фермента за умов оксидативного стресу, викликаного кобальтом і введення тетрамізолу підтверджує нашу думку.

Зміни вмісту та складу ЛП, які викликає тетрамізол, в основному подібні до спостеріганих після введення хлориду кобальту.

Таким чином, порівняння впливу введення тетрамізолу з ефектом високих доз хлориду кобальту виявляє одноманітну картину реакцій відповіді, хоча тетрамізол і викликає дещо слабшу реакцію. Це доводить неспецифічність реакцій відповіді на оксидативний стрес, викликаний різними індукторами, з боку системи транспорту ліпідів.

Висновки

Введення щурам сублетальних доз хлориду кобальту або тетрамізолу викликає активацію перекисного окислення ліпідів ліпопротеїнів.

Під впливом хлориду кобальту та тетрамізолу спостерігається істотне та тривале підвищення вмісту ліпопротеїнів сироватки крові, більш виражене при введенні СоСl2.

Встановлено, що за цих умов змінюється і склад ліпопротеїнів, зокрема, зниження в них вмісту загальних ліпідів і перерозподіл ліпідних фракцій.

Стрес, викликаний хлоридом кобальту та тетрамізолом, носить атерогенний характер, який проявляється в перерозподілі ліпопротеїдних фракцій на користь атерогенних, та підвищенні рівня холестеролу в ліпопротеїнах, а також в оксидативному модифікуванні ліпопротеїнів низької густини.

Виявлено, що інгібітори синтезу білку при попередньому введенні істотно згладжують гіперліпопротеїнемію, викликану введенням СоСl2.

Підвищення в складі -ліпопротеїнів вмісту фосфоліпідів, та довгостроковий окислений стан ліпопротеїнів високої густини можуть розглядатися як один з механізмів антиоксидантного захисту шляхом їх фукнціонування, як пастки вільних радикалів. Встановлено, що підвищення рівня ліпопротеїнів в сироватці крові в ранні строки розвитку оксидативного стресу сполучене зі зниженням їх вмісту в цитозолі печінки, а в пізні -- зі зростанням. Не виявлено принципової різниці в характері реакцій відповіді на введення хлориду кобальту та тетрамізолу з боку вмісту та складу ліпопротеїнів. Встановлено безпосередній вплив іонів кобальту на ліпопротеїни, що призводить до руйнування останніх.

Список основних робіт, опублікованих за темою дисертації

1. П.А.Калиман, Р.В.Шаламов, А.Л.Загайко. Влияние хлорида кобальта на содержание липидов и липопротеинов в печени и сыворотке крови крыс // Биохимия. -- 1997. -- т.62, №7. -- С. 850-857

2. П.А.Калиман, Р.В.Шаламов, А.Л.Загайко, Г.В.Ганусова, Т.В.Баранник, Э.В. Скрипник, В.В.Соколик, Б.К.Шаби. Содержание и состав липопротеинов крови и печени крыс и некоторые показатели окислительного стресса при введении хлорида кобальта // Укр. биохим. журнал. -- 1997. -- т.69, №5. -- С.138-148

3. Р.В. Шаламов, А.Л.Загайко. Изменения липидного обмена при окислительном стрессе, вызванном введением хлорида кобальта// Укр. биохим. журнал. -- 1998. -- т.70, №4. -- С.68-79

4. П.А. Каліман, А.Л.Загайко, Р.В.Шаламов. Деякі механізми детоксикації екотоксичної дії кобальту// "Екологічна токсикологія". -- 1997, №1. -- С.108-111.

5. А.Л. Загайко Атерогеннй характер окислительного стресса, взванного введением хлорида кобальта// Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. -- Труды научной конференции, С.-Петербург. -- 1998 -- Т.1. -- С.282-287

6. П.А.Калиман, А.Л.Загайко, Р.В. Шаламов. Система гомеостаза липидов клеточных мембран при окислительном стрессе// там же -- С.287-291

7. Р.В. Шаламов, А.Л.Загайко, П.А.Каліман. Вплив іонів кобальту на спектр ліпідів, вміст та склад ліпопротеїнів цитозолю печінки і сироватки крові щурів in vitro// VII український біохімічний з'їзд (тези доповідей). Ч.1. -- Київ, 1997. -- С.121-122.

Размещено на Allbest.ru