Характерні особливості культивованих клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тема: “Характерні особливості культивованих клітин”

1. Первинні клітини та трансформація

клітина тварина трансформація

Клітини, отримані від тварини і підтримувані в культурі, називають первинними клітинами до тих пір, поки вони не будуть субкультивовані. При успішному встановленні культури первинні клітини починають розмножуватися, і їх необхідно періодично пересівати (субкультивувати).

Первинну культуру потрібно пересіяти в 2 або 4 нових флакона, причому розсів культури може повторюватися приблизно з тижневим інтервалом протягом декількох місяців. Клітини можуть при цьому залишатися диплоїдними і зберігати багато характерних особливостей початкового екземпляра. Таку культуру називають клітинною лінією.

Раніше дослідники вважали, що при підтримці соматичних клітин у культурі в підходящих умовах клітини можуть ділитися протягом необмежено тривалого часу. Однак подальші дослідження показали, що це не так. Культури первинних клітин легко отримати з багатьох тканин. Якийсь час ці клітини ескпоненціально розмножуються, але потім приблизно через 6 місяців швидкість росту культури знижується, а через 10 місяців клітини дегенерують і гинуть. Це спостерігається після ~ 50 генерацій, коли з кожної початковій первинної клітини утворюється культура приблизно з 10 в 22 степені клітин.

На ранніх стадіях клітини залишаються еуплоідними, тобто володіють правильним диплоїдним набором хромосом, а пізніше вони стають анеуплоїдних. В деяких випадках деякі з цих анеуплоїдних клітин виживають і розмножуються це призводить до утворення клітинного штаму. Частоту таких трансформацій можна збільшити, обробивши, первинні клітини мутагенами або деякими вірусами. Так, наприклад, обробка метілхолантреном привела до отримання штаму мишачих L-клітин. Ми в інституті працювали з лінією клітин L 1210 - клітини раку крові мишей.

Клітинні штами володіють специфічними властивостями, які зберігаються протягом тривалого культивування. Багато стабільних клітинних штамів здатні до тривалого росту, і розмноженню в культурі, причому, як правило, це пов'язано з анеуплоїдних каріотипом. Деякі штами клітин, наприклад фібробласти хом'ячка ВНК21, володіють правильним диплоїдним числом хромосом, але їх каріотип, мабуть, змінений. Ці клітини лише мінімально трансформовані, оскільки вони певною мірою зберігають чутливість до контактного гальмування і можуть бути далі трансформовані вірусом поліоми (з утворенням PyY-клітин) або вірусом SV40 (з утворенням клітин SV28)

Інші штами клітин, наприклад клітини HeLa, які початково отримані з пухлинних тканин, виникають, очевидно, в результаті трансформації in vivo. І хоча не всі популяції неопластичних клітин здатні до необмеженого росту in vitro, багато широко використовувані штами клітин людини мають саме цю природу (наприклад, штами НЕР2, KB, Детройт 6).

Культури первинних клітин можуть бути «заражені» клітинами інших ліній, які ведуться в цій же лабораторії. Так сталося в лабораторії Паркера, коли клітини L929 випадково потрапили в кілька первинних культур і згодом витіснили первинні клітини. Ця подія була підтверджена тільки після ретельного каріотипічного аналізу. Часте повторення таких випадків призвело до посилення правил роботи з клітинами, але випадки «взаімозабруднення» клітинних культур все ж мають місце, особливо в таких лабораторіях, в яких постійно пасажують багато клітинних ліній.

Співвідношення між кількістю генерацій і кількістю пасажів залежить від відношення пасажів. Якщо клітини пасажуються таким чином, що вміст одного флакона розділяють між двома новими флаконами (відношення пасажування 1:2), то кількість пасажів і кількість генерацій виявляються одним і тим же. При відношенні пасажування 1:4 вік клітин, виражений у кількості генерацій, буде вдвічі вищий, ніж кількість пасажів.

2. Контроль росту. Клітинний цикл і цикл росту

Зростаючі клітини регулярно діляться приблизно один раз в кожні 24 години. У період між поділами, тобто в інтерфазі, клітини подвоюють кількість ДНК протягом певної фази клітинного циклу, так званої фази синтезу ДНК або фази S. Фаза S відділена від клітинного поділу або мітозу двома періодами G1 i G2. При відсутності будь-яких обмежень клітини рівномірно розподілені по клітинному циклу, і якщо кількість клітин подвоюється через правильні проміжки часу, то говорять, що культура знаходиться на стадії експоненціального росту.

Зазвичай після короткого періоду експоненціального зростання той чи інший фактор стає лімітуючим. Це може відбуватися в результаті виснаження якогось фактора середовища або ж в результаті того, що культивовані клітини повністю покриють поверхню, на якій вони ростуть. Швидкість росту культури при цьому сповільнюється, і кількість клітин у культурі досягає насичення (кінцева щільність клітин). Коли подальші ділення клітин припиняються, настає стаціонарна фаза росту культури. При відновленні в культурі лімітуючого фактора клітини повертаються у фазу G1 клітинного циклу, відбувається цикл синтезу ДНК, після чого клітина ділиться. Є кілька теорій, що пояснюють такий тип контролю росту, але всі вони виходять із припущення, що контроль здійснюється на якомусь етапі, розташованому незабаром після ділення. Після проходження цього етапу клітини включаються в клітинний цикл і діляться.

Велика частина клітин у тварин знаходиться під такою формою контролю росту, що вони припиняють просування по клітинному циклу, незабаром після мітозу. Отже, для стимуляції первинної клітинної культури, перш ніж клітини відновлять рух по циклу до фази ділення, слід усунути обмеження зросту. Клітини деяких швидко зростаючих пухлин втрачають чутливість до контролю росту, і тому отримані з пухлин первинні клітини легко адаптуються до росту в культурі і можуть доростати до більш високої щільності у порівнянні з клітинами з нормальних тканин.

У культурах іноді утворюються гігантські клітини особливо у випадках зростання в неоптимальних умовах. Утворення таких клітин обумовлено тим, що зростаючі клітини втрачають можливість ділитися і можуть збільшуватися в розмірі, поки не досягнуть у діаметрі 1 мм і більше. Частота утворення гігантських клітин клітин помітно збільшується в результаті опромінення. Наявність невеликої кількості гігантських клітин в популяції, ймовірно, не представляє загрози для досліджень, але якщо їх число зростає, то це відображає погані умови культивування; такі культури повинні бути замінені новими культурами, зростаючими в нормальному середовищі.

3. Фірми-постачальники і транспортування

Деякі первинні клітини можуть бути придбані у фірм -постачальників. Якщо фірма-постачальник розташована неподалік і може доставляти клітини в день виділення, то таке джерело клітин цілком прийнятний. В інших же випадках культури первинних клітин слід отримувати самостійно. У всіх випадках самостійне отримання первинних культур необхідно при використанні тканин експериментальних тварин.

Штами і лінії клітин легко можуть бути отримані від фірм-постачальників або з Американської колекції типових культур (АТСС), де вони утримуються разом зі своїми попередниками. Отримання клітин з АТСС коштує дорого, і якщо дослідник не має достатнього досвіду культивування клітин, то слід передати отримання клітин найближчій фірмі-постачальнику, щоб забезпечити їх подальшу безпечну доставку.

АТСС підтримує стоки (stocks - маткові культури, концентрати, клітин в замороженому і рідкому азоті. Та транспортує їх замороженими в твердій вуглекислоті. Оскільки клітини мають низьку життєздатність при температурі сухого льоду, то відразу після отримання їх слід використовувати або перезаморозити в рідкому азоті.

Середовища та сироватки для клітинних культур найпростіше одержувати від спеціалізованих фірм, таких, як Flow Laboratories або Gibco Biocult. Можна купувати середовища, які вимагають тільки лише додавання сироватки перед використанням, але краще використовувати концентровані і сухі середовища, особливо при необхідності великих кількостей середовища.

Размещено на Allbest.ru