Теоретические основы генетической инженерии

Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

ВВЕДЕНИЕ

С ростом населения Земли, человечество столкнулось с проблемой дефицита полноценной белковой пищи и не хваткой земель, отводимых под сельскохозяйственные нужды. За последние два десятилетия определилось новое биотехнологическое направление, помогающее решить эти проблемы - получение пищевых объектов с повышенным содержанием и улучшенным качеством белка и устойчивым к неблагоприятным условиям среды, в том числе и к насекомым-вредителям методами генетической инженерии.

Генетическая инженерия - это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых, в том числе и не встречающихся в природе, комбинаций ДНК. Сущность генетической инженерии заключается в переносе генов, отвечающих за проявление желаемого признака от организма-носителя в клетку реципиента1 , для получения растений, животных или микроорганизмов с рекомбинантными генами, а следовательно и с новыми полезными свойствами. Растения, животные и микроорганизмы, полученные генетической инженерией, называются генетически модифицированными изделиями (ГМИ), а продукты их переработки (мука из трансгенной сои или пшеницы, кетчуп из трансгенных томатов) - трансгенными пищевыми продуктами.

В данной работе рассмотрены общие подходы в получении и применении генмодифицированных объектов в технологии пищевых продуктов, а так же будут представлены некоторые точки зрения относительно безопасности генетически модифицированных изделий (ГМИ) и продуктов их переработки.

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Молекулярная биология заявила о себе в качестве самостоятельной науки в 1953 году, когда Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли знаменитую двойную спираль ДНК и постулировали матричный механизм ее синтеза. В соответствии с этим механизмом двойная спираль ДНК при репликации разделяется, и каждая цепь служит матрицей для синтеза дочерней цепи, которая по своей первичной структуре является зеркальным отражением матрицы.

В результате такого матричного синтеза образуются две совершенно идентичные двуспиральные молекулы ДНК, каждая из которых передается в дочерние клетки. Последние получают всю генетическую программу от родительской клетки. По такому же матричному механизму осуществляется синтез РНК, только РНК синтезируется в виде односпиральной цепи, которая комплементарна ДНК-матрице. Этот процесс получил название транскрипции. А процесс синтеза белка на РНК-матрице (мРНК) происходит на рибосомах, и структура белка соответствует структуре мРНК. Это очень сложный процесс, он называется трансляцией, и в нем участвует транспортная РНК (тРНК). Она доставляет в рибосому аминокислоты и адаптирует язык мРНК к языку белка. Таким образом, процесс матричного синтеза ДНК определяет передачу наследственной информации от родительской клетки в дочернюю.

В процессе матричного синтеза РНК происходит передача информации (генетического кода данного белка) от ДНК на мРНК, а мРНК переносит информацию на рибосому, где она реализуется в виде конкретной структуры белка. При половом процессе может происходить обмен участками между двумя хромосомами (молекулами ДНК) от двух скрещиваемых индивидуумов. Этот процесс получил название рекомбинации8, и в клетке чаще всего он может происходить только между гомологичными хромосомами, так как комплементарные по своей структуре молекулы ДНК притягиваются друг к другу и обмениваются генетическими детерминантами, в результате чего образуется дочерняя хромосома, содержащая элементы структуры от двух родительских хромосом.

Открытый недавно процесс негомологичной рекомбинации осуществляется только в том случае, если в одной из взаимодействующих молекул ДНК есть гены, кодирующие специальные ферменты разрезания ДНК.

Следующее важное открытие, предопределившее возникновение генной инженерии, - обнаружение в бактериальных клетках внехромосомных маленьких кольцевых молекул ДНК. Эти минихромосомы впервые были обнаружены в начале 50-х годов и получили название плазмид. Плазмиды обладают способностью к автономной от хромосомы репликации, поэтому плазмиды содержатся в клетке в виде нескольких копий.

Различаются плазмиды по генетическим детерминантам. Очень важно, что плазмиды из-за своих малых размеров могут быть выделены из клетки в неповрежденном, нативном состоянии.

В 1970 году американцы Келли и Смит с сотрудниками выделили первую рестриктазу - фермент-нуклеаза10, который вызывает гидролиз ДНК в строго определенных местах с образованием так называемых «липких концов». В настоящее время описано множество таких ферментов, которые применяются в генной инженерии. Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии.

2. ЧЕМ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРИНЦИПИАЛЬНО ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ СЕЛЕКЦИИ?

Для того чтобы это понять, перечислим ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры при получении новых пород животных, сортов растений или активных рас практически ценных микроорганизмов:

1) нельзя скрещивать неродственные виды;

2) нельзя извне управлять процессом рекомбинации в организме;

3) нельзя предугадать, какое получится потомство.

Известно, что в природе скрещиваются между собой только близкородственные организмы, так как существуют специальные клеточные барьеры скрещивания клеток. Кроме того, процесс рекомбинации заключается во взаимодействии между гомологичными, то есть близкими по своей молекулярной структуре, хромосомами. Постоянство своего генетического состава организм очень надежно охраняет. Даже самая богатая фантазия не может вообразить, каких монстров породила бы природа, если бы не охраняла чистоту вида, препятствуя скрещиванию неродственных форм. Генетическая рекомбинация в организме - очень сложный процесс, которым управлять извне невозможно. Это обстоятельство делает путь к получению новой породы или расы очень тернистым, долгим, а подчас и невозможным.

Результаты скрещивания невозможно предсказать заранее. Как хочется, чтобы ребенок был таким же очаровательным, как мама, сильным и добрым, как папа, умным, как дедушка, и веселым, как бабушка. Но процесс рекомбинации - статистический, и нам не дано стопроцентно предугадать, какие признаки родителей унаследует потомство, и результат бывает иногда прямо противоположным ожидаемому.

Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятными причины ограничений классической селекции, а также то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.

А что если попытаться проводить рекомбинацию хромосом или отдельных генов вне организма (in vitro), в пробирке? Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов. Таким образом, суть генной инженерии состоит в том, что процесс рекомбинации производится вне организма и, таким образом, преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются ученые, используя приемы классической селекции. Итак, теперь все стало можно: можно скрещивать отдельные гены «ужа и ежа», можно управлять процессом, можно предсказать результат.

Схема 2. Возможности генной инженерии:

1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежит прием, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезатьразные ДНК с образованием одинаковых «липких концов».

2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.

3. Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК - клоны.

генный инженерия растение селекция

3. КАК ЭТО ДЕЛАЕТСЯ?

Как уже указывалось, процесс рекомбинации организме (in vivo) возможен в большинстве случаев между гомологичными молекулами ДНК. Однако оказалось, что in vitro притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможно, если они будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул (в настоящее время описаны двенадцатинуклеотидные «липкие концы»). Такие комплементарные односпиральные последовательности получили название «липких концов», так как две молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться) этими концами. Таким образом, если в пробирку поместить самые разные молекулы ДНК с одинаковыми «липкими концами», то будет происходить рекомбинация, даже если вся их структура очень различается. Как же получить гетерогенные молекулы ДНК с одинаковыми «липкими концами»?

Для этого используются ферменты-рестриктазы, которые “умеют” разрезать молекулы ДНК так, что у них образуются одинаковые (комплементарные) «липкие концы». Происходит такое разрезание в участках, несущих особым образом повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Рестриктазы узнают эти последовательности и разрезают ДНК в точках повтора: в результате односпиральный конец одной молекулы оказывается комплементарным «липким» концу другой молекулы.

Теперь, чтобы полученные в пробирке генные конструкции заработали, необходимо их ввести подходящую бактериальную клетку. Вот тут-то и пригодятся плазмиды. В генной инженерии их называют векторами13 (повозки, которые доставляют в клетку клонируемый ген). Для этого плазмиды тоже режут рестриктазами, чтобы получить односпиральные концы, комплементарные концам генов, проводят гибридизацию гена и плазмиды в пробирке, а затем рекомбинантную плазмиду (ее называют еще химерной) вводят в клетку.

Плазмиды, которые используются в генной инженерии, имеют очень важное свойство: они содержат так называемый маркерный ген, например ген, сообщающий клетке устойчивость к определенному антибиотику. Благодаря этому клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой плазмиды. Для этого бактерии высевают на среду с антибиотиком, на которой будут расти только клетки с плазмидой - так называемые рекомбинантные клетки, а процедура их отбора получила название молекулярного клонирования, так как рекомбинантные клетки представляют собой потомство одной молекулы ДНК.

В рекомбинантных клетках химерная плазмида, несущая чужеродный ген, начинает функционировать, то есть совершаются процессы репликации, транскрипции и трансляции нового введенного в клетку гена и синтезируется продукт этого гена, который в природных клетках никогда ранее не мог образоваться. Таким образом, in vitro проводится только рекомбинация, а все остальные превращения с химерной плазмидой происходят в клетке так же, как и со своими собственными генами. Иными словами, теперь можно ввести в бактериальную клетку ген, полученный из любого организма - слона, носорога, обезьяны и даже человека, и заставить чужеродный ген там функционировать.

Итак, основные процедуры в генной инженерии сводятся к следующему:

1) рекомбинация in vitro ДНК-вектора и ДНК-гена;

2) введение рекомбинантной плазмиды в клетку;

3) молекулярное клонирование.

4. НЕКОТОРЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Уже первые шаги в области изучения рекомбинантных молекул позволили считать, что достигнут не просто успех, но осуществлен прорыв, открывающий новые пути для познания наследственности. Возникли исключительные условия для изучения механизмов функционирования и структурной организации генома, в том числе и генома человека. Используя методы генной инженерии, ученые сделали много поразительных открытий. К одному из них относится явление дискретности генов эукариот. Если раньше было признано положение о коллинеарном переносе генетической информации от ДНК на мРНК и от мРНК на блок, то сейчас установлено, что гены животных и растений имеют внутри такие последовательности, которые после транскрипции удаляются и не копируются структуре белка. Значимые части гена назвали экзонами14, а удаляемые части - интронами15. Последовательности РНК, соответствующие интронам, вырезаются и не транслируются, а последовательности, соответствующие экзонам, сшиваются специальными ферментами. Процесс получил название сплайсинг (рис. ).

Другое очень важное открытие состоит в следующем. Было известно, что у бактерий, да и не только у них, в составе генома имеются такие гены, которые перемещаются, мигрируют, меняют свое место на хромосоме. Генная инженерия позволила глубже проникнуть в природу подвижных элементов, изучить их структуру, механизмы действия и биологическую роль. Именно при перемещении подвижных элементов (транспозонов12) и происходит часто негомологичная рекомбинация.

5. ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЛАЗМИД

Корончатые галлы растений

В группе почвенных бактерий, известных под общим названием Agrobacteria, есть несколько видов, которые могут заражать растения и вызывать образование опухолей, называемых корончатыми галлами, состоящими из недифференцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения. Клетки корончатых галлов во многих отношениях напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность к неограниченному, нерегулируемому росту. Когда клетки корончатых галлов культивируют in vitro, они растут при отсутствии специальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохранять эти свойства (трансформированный фенотип), даже если убить бактерии антибиотиками. Изучение индуктора опухолей Agrobacterium tumefaciens показало, что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является Ti-плазмида, которая частично интегрируется в хромосомы растений.

Агробактериальная трансформация растений: Ti-плазмиды

В A.tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA), которая составляет 12 -22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации.

Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Все полученные мутации Ti-плазмид разделяют на три основных класса. Мутанты первого класса не индуцируют синтез опинов, но вызывают образование корончатых галлов. Мутанты второго класса утрачивают способность индуцировать развитие опухолей. Мутанты третьего класса стимулируют аномальную дифференцировку нормальных клеток, например избыточный рост корней или побегов. Эти генетические исследования показали, что ДНК Ti-плазмид содержит гены, которые контролируют развитие опухолей, синтез опинов. Поскольку у растений с мутантными Ti-плазмидами второго и третьего классов с помощью фитогормонов можно стимулировать опухолеобразование, было предположено, что полученные мутации затрагивают гормональный метаболизм.

Какие гены локализованы в Т-ДНК

В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназа, который переводит триптофан в индолилацетамид. Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt , катализирует

ранние стадии биосинтеза природного цитокинина. Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лак-тата, который является продуктом превращения ауксина. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.

Молекулярно-генетические механизмы агробактериальной трансформации

Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа:

1. прикрепление бактерии к стенке растительной клетки

2. проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения

3. интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК (рис. ).

Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG.

Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов. Индукция vir -генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин - больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

Оперон16 VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК. Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение. Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения.Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода.

ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ можно использовать в качестве вектора

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti-плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход (рис. ).

Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий -Escherichia coli. E. coli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. coli , а затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмид Т-ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti-плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными методами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цель работы, состоявшая во введении данного гена в геном растения, будет достигнута. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами - помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir - генов способны вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir -гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений.

В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна:

1) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток;

2) не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт достигается с помощью транспозонного мутагенеза (транспозон -последовательность ДНК, способная перемещаться по геному). В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, которые приводят к опухолеобразованию (iaaM, iaaH, ipt), что не отражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Tn5,Tn7). При этом снимается блок с процессов регенерации.

При модификации Ti-плазмиды необходимо предусмотреть также наличие уникальных сайтов рестрикции, в которые будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК. Такие уникальные сайты рестрикции создаются включением в искусственные Ti-конструкции последовательностей, которые содержат множественные сайты разрезания для рестриктаз EcoR1,Hind III, BamH1 и др. В некоторых случаях в одном множественном сайте имеется 18 - 20 сайтов, узнаваемых разными рестриктазами, почему эти участки и называются полилинкерами. Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть предусмотрено наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор (участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органоспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, активность которых индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтез запасных белков, например зеина, который обнаружен только в тканях семян злаков. Наиболее популярным является промотор гена вируса мозаики цветной капусты (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях.

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB - это гены, выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в основную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популярностью другой репортерный ген -pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein).Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria . Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т-ДНК заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Создан даже специальный прибор -“Shotgun ”, который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.

Практическое применение генетической инженерии растений с использованием Ti-плазмид

Еще несколько лет назад ученые задавали вопрос, можно ли создать сорта, сбалансированные по составу аминокислот, устойчивые к холоду, засухе, не поражаемые вредителями. Сегодня можно с уверенностью утверждать, что такие трансгенные растения уже вышли в поле. По литературным данным, к 1997 году в 30 странах мира проведено более 3 тыс.полевых испытаний. В этих экспериментах использовали трансгенные растения 40 различных видов, относящихся к разным семействам, включая злаки. После успешных экспериментов появились опасения о возможном вреде генетической инженерии для природы и человечества. Однако уже более чем за четверть века своего существования генетическая инженерия не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Главное, в любых экспериментах по генной инженерии следует соблюдать разработанные правила.

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. В арсенале генной инже-

нерии растений есть много приемов, позволяющих получить трансгенные растения, устойчивые к насекомым.

Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis . Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt ,который, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. На рис.5 приведена схема конструирования вектора и получения трансгенных растений хлопка, которые приобретают признак устойчивости к насекомым. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами “Monsanto ”,“Ciba Seeds ”и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании еще не закончены.

Известно, что растения, так же как и животные, способны вырабатывать иммунитет. Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм. Например, у устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины (соединения, выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений.

Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген Н2О2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с “antisense RNA ”(перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 1800.В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG ,контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene - forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен -это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений. Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д.Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть формировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему “лишних косточек”, например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян. Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте возможностей использования Ti-плазмиды агробактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. В лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу.

На уровне лабораторных экспериментов ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному

содержанию солей и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам (химическим соединениям, которые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаменимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров. Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками (рис. ). На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ КОЛЬЦЕВОЙ ДНК ФАГОВ

Escherichia Coli

Нитевидные фаги

«Нитевидные вирусы» М13, fd, f1 бактерии Escherichia coli (кишечной палочки), называемые обычно бактериофагами или просто фагами, наиболее подходят для создания одноцепочечных векторных молекул ДНК. Частицы этих фагов представляют собой трубочку (1000 Ч 6 нм) из гидрофобного фагового белка pVIII, внутри которой содержится молекула кольцевой одноцепочечной ДНК. На одном из концов фаговой частицы молекула ДНК взаимодействует с несколькими молекулами фагового белка pIII, называемого белком-лоцманом. Последовательность нуклеотидов фаговой ДНК расшифрована (6407 нуклеотидов для фага M13, 6408 для фага fd). Нитевидные фаги адсорбируются на половых ворсинках клеток E. coli (белковых трубочках, предназначенных для переноса ДНК из клетки в клетку), и одноцепочечная кольцевая ДНК фага в комплексе с белком лоцманом проникает в цитоплазму клетки, где происходит достройка второй цепи фаговой ДНК. Образовавшаяся двухцепочечная кольцевая молекула ДНК (рис. , в), называемая репликативной формой (РФ), реплицируется, достигая 200 - 300 копий на клетку. Затем репликация этих молекул ДНК в основном осуществляется асимметрично и синтезируется большое количество одной из двух цепей (обозначается как (+)-цепь), которая покрывается димерами фагового белка pV и взаимодействует с белком-лоцманом pIII. При выходе фаговой ДНК из клетки через плазматическую мембрану белок pV постепенно замещается на белок оболочки pVIII, находящийся на клеточной мембране. Образующиеся при инфекции фаговые частицы постоянно секретируются из клеток без лизиса (разрушения) последних. Длина вирионов зависит от величины фагового генома и может варьировать в широких пределах. Скорость роста клеток E. coli, зараженных нитевидным фагом, на 25 - 50% ниже, чем неинфицированных. Поэтому при титровании на твердой агаризованной среде нитевидные фаги образуют на бактериальном газоне мутные бляшки. При размножении данных фагов их геном в бактериальной клетке одновременно присутствует в виде большого числа копий двухцепочечной кольцевой плазмиды и одноцепочечной ДНК в составе вирионов. На одноцепочечной вирионной ДНК обычные генно-инженерные эксперименты невыполнимы. Однако их с успехом можно осуществить на репликативной форме генома нитевидных фагов. Все это обусловило использование данных фагов для создания клонирующих векторов.

Фаг М13 в качестве клонирующего вектора

Наличие в фаговом геноме области, несущественной для его жизнедеятельности, является важным условием использования этого фага для конструирования гибридных молекул ДНК. У нитевидных фагов существует лишь межгенная область размером 500 нуклеотидов, в которой могут быть произведены изменения (делеции17, вставки) без нарушения жизнеспосо-бности фага. Репликативная форма фаговой ДНК не имеет участков узнавания многих рестриктаз, образующих при гидролизе липкие концы, а кроме того, фаговый геном не содержит генетических маркеров, которые позволили бы легко выявлять гибридные фаги. Поэтому конструирование векторных нитевидных фагов включает в себя прежде всего введение в геном селективных маркеров и уникальных участков расщепления определенными рестриктазами.

Первый гибридный фаг M13 был описан Лессингом с соавторами в 1977 году. Репликативная форма ДНК фага M13 гидролизуется рестриктазой BsuRI на 10 фрагментов, имеющих тупые концы.

Чтобы получить полный фаговый геном в линейной форме, РФ гидролизовали ограниченным количеством Рестриктазы BsuRI так, что каждая молекула ДНК в среднем расщеплялась лишь в одном из участков действия BsuRI. Линейные молекулы размером в полный фаговый геном выделили электрофоретически и к ним добавили HindII-фрагмент лактозного оперона E. coli, имеющий размер 789 пар нуклеотидов (пн) и содержащий часть гена lacI, промоторно-операторную область и начальную часть гена lacZ, кодирующую 145 N-концевых аминокислот b-галактозидазы (рис. ). Полученные фрагменты сшили по тупым концам с помощью ДНК-лигазы фага T4 и провели трансфекцию клеток E. coli.

Для понимания принципа осуществленного затем отбора гибридных фагов рассмотрим строение лактозного оперона E. coli.

Лактозный оперон (lac-оперон)

Lac-оперон E. coli состоит из трех генов, с которых транскрибируется единая полицистронная м РНК. Синтез мРНК lac-оперона регулируется белком, называемым репрессором. Этот белок кодируется геном lacI. В активной форме репрессор связывается на ДНК с операторным участком (о) lac-оперона и блокирует транскрипцию мРНК с промотора P. Блокированный таким образом оперон называют репрессированным. При инактивации репрессора (в результате мутации или связывания с определенными небольшими молекулами) он теряет способность образовывать комплекс с оператором.

Наибольший интерес для молекулярных биологов в lac-опероне представляет ген lacZ. Продукт этого гена в-галактозидаза (в - Gal) катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу и легко определяется по специфической ферментативной активности.

Наиболее популярный способ фенотипического выявления активности в -Gal состоит в том, что в агаризованную питательную среду, на которой выращивают колонии E. coli, добавляют 5-бром-4-хлор-3-индолил- b-D-галактозид (обозначаемый Xgal). Данное соединение само по себе бесцветно. Однако при его гидролизе b-галактозидазой образуется ярко-синий 5-бром-4- хлориндиго. Поэтому колонии E. coli lacZ + в присутствии Xgal окрашиваются в синий цвет, а мутантные lacZ варианты формируют белые колонии.

Рассматриваемый фермент обладает уникальными свойствами. В 1968 году была описана так называемая a-комплементация b-галактозидазы, которая относится к внутрицистронной (внутригенной) комплементации и состоит в том, что в результате нековалентной ассоциации различно измененных мутантных форм или фрагментов одного и того же белка образуется функционально активный фермент. Полипептид b-Gal состоит из 1021 аминокислотного остатка. Ферментативной активностью обладает белок, состоящий из четырех таких субъединиц (тетрамер с суммарной молекулярной массой 460 кДа). При изучении различных мутантов по гену lacZ были выявлены неактивные формы b-галактозидазы, обозначенные M15 и M112 и имеющие соответственно делеции аминокислот с 11-й по 41-ю (11 - 41 АК) и с 23-й по 31-ю (23 - 31 АК). Оказалось, что эти мутантные белки не образуют тетрамерной структуры, а являются димерами. Более того, было обнаружено, что если к препарату b-Gal M15 или M112 добавить пептид 3-92 АК, то происходит комплементация - восстанавливается ферментативная активность. Такой фермент, подобно нативному, имеет тетрамерную структуру.

Неактивные белки с делецией в N-концевой последовательности b-Gal получили название a-акцепторы, а комплементирующие их пептиды или мутантные формы белка - a - доноры. В более поздних исследованиях было показано, что пептид 3 - 41 АК также является полностью активным a-донором по отношению к b-Gal M15.

Таким образом, возвращаясь к экспериментам Лессинга с соавторами, подчеркнем, что гибридный фаг M13, содержащий встраиваемый HindII-фрагмент лактозного оперона, должен детерминировать в клетках E. coli синтез полноценного a-донора (1-145 АК) b-галактозидазы. Наиболее простой способ выявления такого синтеза состоит в использовании в качестве хозяина мутантного штамма E. coli, синтезирующего a-акцептор b-Gal. В этом случае in vivo будет происходить a-комплементация и фенотип Lac - исходных клеток изменится в инфицированных клетках на Lac + . Одним из наиболее простых методов тестирования такого изменения фенотипа является, как указывалось выше, цитохимическая реакция, происходящая в агаризованной среде, содержащей хромогенное соединение Xgal.

Газон реципиентных клеток E. coli, синтезирующих a-акцептор b-Gal (обычно используют мутант lacZ M15), на среде с Xgal будет белого цвета, а окрашивание в синий цвет должно выявляться только в районах скопления клеток, инфицированных гибридным фагом M13 (бляшках). При этом исходный фаг формирует бесцветные бляшки. Отобранный на среде с Xgal гибридный фаг, синтезирующий a-донор b-галактозидазы, обозначили M13mp1. Однако этот фаг еще нельзя было использовать в качестве векторного, так как в нем отсутствовали единичные места гидролиза рестриктазами в межгенной области. Поэтому была предпринята попытка образовать рестрикционное место, используя мутагены, специфично действующие на одноцепочечную ДНК. Из известной к тому времени нуклеотидной последовательности начала структурного гена lacZ следовало, что если гуанин в положении 13 заменить на аденин, то образуется специфичная последовательность, узнаваемая рестриктазой EcoRI.

После мутагенеза ДНК вводили в клетки E. coli и индивидуальные фаговые клоны подвергали проверке на наличие участка гидролиза рестриктазой EcoRI на РФ фаговой ДНК. В результате такой работы выделили мутант фага M13mp1, имеющий участок узнавания рестриктазы EcoRI. Мутантный фаг обозначили M13mp2 (см. рис. ). В полученном фаге в аминокислотной последовательности синтезируемого фрагмента b-галактозидазы в пятом положении произошла замена аспарагиновой кислоты на аспарагин. При этом a-комплементация b-Gal M15 не нарушилась, так как данная область a-донора для комплементации несущественна.

При встройке чужеродных фрагментов ДНК по EcoRI-месту M13mp2 в большинстве случаев прекращается синтез функционального a-донора. В результате такие гибридные фаги образуют при инфекции мутантных клеток E. coli на среде с Xgal бесцветные бляшки, в то время как исходный фаг M13mp2 формирует бляшки синего цвета. Как видим, полученный фаг M13mp2 уже является клонирующим вектором, позволяющим осуществлять прямой отбор гибридов.

Для расширения возможностей клонирования различных фрагментов в векторном фаге M13mp2 в его ДНК по EcoRI-месту встроили синтетические двухцепочечные фрагменты ДНК (обычно называемые полилинкерами), которые содержат разные комбинации уникальных участков гидролиза различных рестриктаз. Созданные фаги получили названия M13mp7, M13mp8, M13mp9 и др. Используя данный набор векторных нитевидных фагов, можно решать большой спектр генно-инженерных задач.

Другие нитевидные фаги, которые можно использовать в качестве молекулярных векторов

Кроме векторов на основе фага M13 получены векторы на основе фагов fd и f1. На рис. приведены структуры нескольких векторных вариантов фага fd, которые были сконструированы по стратегии, разработанной при получении фага M13mp1. В данном случае векторные фаги обусловливают устойчивость к антибиотикам, и поэтому инфицированные ими клетки способны расти на питательной среде с соответствующим антибиотиком.

Расширить возможности использования одноцепочечных векторов удалось путем совмещения генетических элементов плазмид и нитевидных фагов в составе одной молекулы ДНК. Дотто с соавторами в 1981 году по EcoRI-участку плазмиды pBR322 встроили фрагмент репликативной формы ДНК фага f1 размером 1,3 тыс. пн, включающий все элементы генома, необходимые для инициации репликации и морфогенеза фага, и показали, что при суперинфекции фагом f1 клеток E. coli, содержащих созданную плазмиду pD4, примерно половина секретируемых в культуральную среду вирионов несет одноцепочечную ДНК фага f1, а другая половина - одноцепочечную ДНК гибридной плазмиды.

В дальнейшем был получен большой набор таких плазмид, которые часто называют фагмидами (phagemid) вследствие возможной двоякости их существования.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. РЕЦИПИЕНТ (от лат. recipiens, род. п. recipientis - получающий, принимающий), живой организм или клетка, которому пересаживают какой-либо орган, ткань, клетки или компоненты клетки от другого организма.

2. УОТСОН Джеймс Дьюи (р. 1928), американский биохимик, иностранный член РАН (1991; иностранный член АН СССР с 1988). В 1953 совместно с Ф. Криком создал модель пространственной структуры ДНК (двойную спираль), что позволило объяснить многие ее свойства и биологические функции. Нобелевская премия (1962, совместно с Ф. Криком и М. Уилкинсом).

3. КРИК (Crick) Фрэнсис Харри Комптон (р. 1916), английский биофизик и генетик. В 1953 совместно с Дж. Уотсоном создал модель структуры ДНК (двойную спираль), что позволило объяснить многие ее свойства и биологические функции и положило начало молекулярной генетике. Труды по расшифровке генетического кода. Нобелевская премия (1962, совместно с Дж. Уотсоном и М. Уилкинсом).

4. РЕПЛИКАЦИЯ (от позднелат. replicatio - повторение) (ауторепродукция, аутосинтез, редупликация), удвоение молекул ДНК (у некоторых вирусов РНК) при участии специальных ферментов. Репликацией называется также удвоение хромосом, в основе которого лежит репликация ДНК. Репликация обеспечивает точное копирование генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, и передачу ее от поколения к поколению.

5. КОМПЛЕМЕНТАРНОСТЬ, в биохимии - взаимное соответствие в химическом строении двух макромолекул, обеспечивающее их взаимодействие - спаривание двух нитей ДНК, соединение фермента с субстратом, антигена с антителом. Комплементарные структуры подходят друг к другу как ключ к замку.

6. ТРАНСКРИПЦИЯ, в биологии - биосинтез молекул РНК на соответствующих участках ДНК; первый этап реализации генетической информации в клетке, в процессе которого последовательность нуклеотидов ДНК «переписывается» в нуклеотидную последовательность РНК. Возможна также обратная транскрипция

7. ТРАНСЛЯЦИЯ, в биологии - биосинтез белков в живой клетке на рибосомах; 2-й этап реализации генетической информации, в процессе которого последовательность нуклеотидов информационной, или матричной, РНК «переводится» в аминокислотную последовательность синтезирующегося белка. Протекает с участием транспортных РНК и соответствующих ферментов.

8. РЕКОМБИНАЦИЯ (от ре... и позднелат. сombinatio - соединение), в генетике - появление новых сочетаний генов, ведущих к новым сочетаниям признаков у потомства. У высших организмов рекомбинация осуществляется при независимом расхождении хромосом в мейозе, при обмене участками гомологичных (парных) хромосом - кроссинговере; у многих микроорганизмов - в результате обмена участками молекул нуклеиновых кислот.

9. ПЛАЗМИДЫ, факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом; молекулы ДНК, способные к автономному размножению. Наиболее изучены бактериальные плазмиды (колициногенные, половые факторы, факторы лекарственной устойчивости и др.). Широко используются в генетической инженерии как переносчики генетического материала.

10. НУКЛЕАЗЫ, ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты (НК) в живых организмах. Участвуют в переваривании НК пищи, удалении чужеродных НК и в регуляции синтеза и распада НК в клетках. Нуклеазы используют для исследования структуры НК и для лечения некоторых вирусных заболеваний.

11. КЛОН (от греч. klon - ветвь, отпрыск), популяция клеток или организмов, происшедших от общего предка путем бесполого размножения. Клон - основная единица учета в генетике микроорганизмов. Клонирование клеток применяют в онкологии, генетике соматических клеток и др. Новый метод получения клона растений - выращивание их из одной клетки с применением клеточной культуры

12. ТРАНСПОЗОНЫ (подвижные, мобильные генетические элементы), фрагменты ДНК, способные к перемещению в геноме клетки или между геномами. Содержат гены ферментов, необходимых для их перемещения (транспозиции). Встраиваясь в различные участки хромосом, мобильные генетические элементы изменяют активность генов, вызывают различные типы мутаций, способствуя нестабильности и изменчивости генома. Мобильные генетические элементы эукариот часто называют также транспозонами.

13. ВЕКТОР в молекулярной генетике, самостоятельно реплицирующаяся молекула ДНК, способная включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Обычно вектор создают на основе ДНК плазмид и вирусов (в т. ч. бактериофагов). Вектор широко используют в генетической инженерии для размножения (клонирования) введенных генов или получения кодируемых этими генами белковых продуктов.

14. ЭКЗОН [от англ. ex(pressi)on - выражение, выразительность], участок гена, несущий информацию о первичной структуре белка. В гене экзоны разделены некодирующими участками - интронами.

15. ИНТРОН (от лат. inter - между), участок гена, не несущий информацию о первичной структуре белка и расположенный между кодирующими участками - экзонами. Обнаружены главным образом в генах эукариот.

16. ОПЕРОН, участок генетического материала, состоящий из 1, 2 и более сцепленных структурных генов, которые кодируют белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита. В оперон эукариот входит, как правило, 1 структурный ген. Оперон содержит регуляторные элементы.