Pисунок 4. Чувствительность к антибиотикам Е.coli, , Kl.pneumonia, Ps aeruginosa, патогенных для птицы

Из приведенных на pисунке 4 данных видно, что изучаемые культуры микроорганизмов обладают количественной резистентностью. В 97% отмечали снижение чувствительности к препаратам, которые широко применялись в хозяйствах. Отдельные культуры (31,4%) оказались резистентными к пенициллину, макролидам, олеандомицину, эритромицину. У незначительного количества культур (2%) была отмечена устойчивость к хлорамфениколу, тетрациклинам, стрептомицинам.

Наряду с этим у отдельных культур (15,3%) установлено повышение чувствительности к тетрациклину, полимиксину, что связано с длительным перерывом при использовании данных препаратов в хозяйствах. Опытные культуры микроорганизмов (Е.coli, , Kl.pneumonia, Ps aeruginosa) в большинстве случаев оказались малочуствительными и нечувствительными к неомицину, мономицину, стрептомицину, что, как видно, можно объяснить длительным применениям этих препаратов в хозяйствах с лечебно-профилактической целью.

Нашими исследованиями установлено, что чувствительность микроорганизмов - Ps.aeruginosa, Kl.pneumoniae, E.coli - не зависела от места их выделения.

Возникновение антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов и появление атипичных форм течения заболевания является тревожным сигналом и требует от ветеринарной науки и практики разработки мероприятий по уменьшению падежа от условно-патогенной микрофлоры. Одним из этих мер является применение эффективных антимикробных препаратов, которые обладают бактерицидной активностью по отношению к патогенным микроорганизмам. В качестве таких препаратов в своих опытах мы использовали левомицетин и байтрил. Чувствительность опытных микроорганизмов к ним была 100%.

Применение комплексных пробиотиков в птицехозяйствах.

Изучение влияния комплексных пробиотиков на сохранность и продуктивные качества цыплят.

Для повышения сохранности и продуктивности животных и птицы используются различные биологически активные вещества, в том числе и пробиотики. Рробиотики относятся к группе кишечных стабилизаторов и их применение в профилактике болезней птиц бактериальной этиологии является перспективным.

Возрастные иммунодефициты у цыплят проявляются на 3-5, 14-28 и 40-50 сутки жизни.

Ррименение пробиотиков профилактирует возрастную иммунную недостаточность, увеличивает местную защиту пищеварительного тракта, нормализует микрофлору, предохраняет от распространения патогенных бактерий, а также позволяет сократить применение противомикробных препаратов [27, 43, 101,116, 138, 147].

Учитывая данные микробиологического мониторинга вывода цыплят, значительный спектр условно-патогенной микрофлоры, выделяемой из воздуха выводных инкубаторов, обуславливающей существенный фактор риска заражения цыплят на выводе и повышенный падеж их в первые 7-10 дней выращивания, мы испытывали в качестве одного из возможных путей профилактики, применение комплексных пробиотиков: Кормо-токс, Биофлор, Био Плюс 2Б, Авигард.

Нами были изучены антагонистические свойства препаратов, эффективность при экспериментальном эшерихиозе.

При определении антагонистических свойств в качестве тест-микробов произвольно были взяты патогенные культуры, выделенные из воздуха выводных инкубаторов: E.coli (2 культуры), Ps.aeruginosa (1 культура), St.aureus (2 культуры), St.albus (1 культура), S.enteritidis (1 культура), Klebsiela pneumonia (1 культура). Выделение культур микроорганизмов проводили по общепринятым методикам [99, 123, 124, 131, 144].

В результате исследований пробиотиков на микроорганизмы были получены следующие данные: чувствительными к препаратам были все культуры. Чувствительность культур к пробиотикам определяли диско-диффузионным методом. Данные представлены в таблице 7.

В дальнейших опытах препараты были испытаны при экспериментальном эшерихиозе. Опыты были поставлены на 120 цыплятах 7-дневного возраста. Цыплята были разделены по количеству испытуемых пробиотиков на 4 группы по 30 голов, каждая группа - на три подгруппы (по 10 голов в каждой).

Таблица 7 Чувствительность микроорганизмов к пробиотикам

№ п/п	Культуры тест-микробов	К-во культур	Чувствительность (+/-)	Зона задержки роста, мм
			Био Рлюс 2Б	Кормо-токс	Авигард	Биофлор	Био Рлюс 2Б	Кормо-токс	Авигард	Биофлор
1.	E.coli	2	+	+	+	+	30	29	28	29
2.	Ps.aeruginosa	1	+	+	+	+	24	24	25	24
3.	St.aureus	2	+	+	+	+	24	24	24	24
4.	St.albus	1	+	+	+	+	26	27	25	26
5.	S.enteritidis	1	+	+	+	+	25	27	28	29
6.	Kl.pneumoniae	1	+	+	+	+	30	29	28	27
Всего	8

Цыплята двух подгрупп из каждой группы получали пробиотики (каждая группа - разный) в течение 10-ти дней согласно схеме применения по каждому из препаратов.

Цыплята контрольных подгрупп препараты не получали.

Цыплята опытных подгрупп (по одной в каждой группе) заражали внутрибрюшинно культурой кишечной палочки в дозе LD100 одновременно с началом вскармливания пробиотиков, а еще 4-х подгрупп - по окончании скармливания. Результаты заражения представлены в таблице 8.

В результате проведенных исследований было установлено, что процент сохранности птицы в этих группах был на 27.5% выше, чем в контрольных группах.

Помимо показателя сохранности цыплят учитывали также влияние препаратов на прирост живой массы. При этом пробиотики задавали цыплятам опытных групп ежедневно согласно схемам применения (с 7-дневного возраста).

До применения препаратов среднесуточный привес и живая масса цыплят опытных и контрольных групп существенно не различалась.

Таблица 8. Результаты скармливания комплексных пробиотиков цыплятам, зараженным культурой кишечной палочки

Пробиотик	Группа, подгр.	К-во цыплят	Пало	Выжило
Био Плюс 2Б	1(опытная)	10	2	8
	2(опытная)	10	1	9
	3(контрольная)	10	4	6
Авигард	1(опытная)	10	2	8
	2(опытная)	10	1	9
	3(контрольная)	10	5	5
Биофлор	1(опытная)	10	1	9
	2(опытная)	10	1	9
	3(контрольная)	10	4	6
Кормо-токс	1(опытная)	10	1	9
	2(опытная)	10	1	9
	3(контрольная)	10	3	7

Примечание: цыплят 1-х опытных подгрупп заражали перед началом применения пробиотиков; цыплят 2-х опытных подгрупп заражали после применения пробиотиков.

Таблица 9

Влияние комплексных пробиотиков на прирост живой массы цыплят

Пробиотик	Группа цыплят	Сpеднесут. прирост	Прирост по отнош. к контр.	Сpед.живая масса на конец опыта	Прирост по отнош. к контролю
Био Плюс 2Б	опыт	26	+5,5	885	+165
	контроль	20,5		720
Авигад	опыт	25,5	+5	870	+150
	контроль	20,5		720
Коpмо-токс	опыт	26,5	+6	900	+180
	контроль	20,5		720
Биофлоp	опыт	27	+6,5	915	+195
	контроль	20,5		720

Рримечание: в опытах использовались цыплята со сpедней живой массой 105г на начало опыта; к-во цыплят в каждой группе - 10 голов

Взвешивание цыплят проводили в течение месяца один раз в три четыре дня. После применения препаратов 7-суточным цыплятам среднесуточный привес в опытных группах в течение 30 суток наблюдения был больше на 5-6,5г, чем в контрольной группе цыплят и эта разница была статистически достоверна.

Из представленных в таблице 9 данных видно, что у цыплят, получавших препараты, прирост живой массы был выше на протяжении всего периода скармливания и наблюдения. Через 30 дней разница средней массы цыплят в подопытных и контрольных группах составила 150-195г (в зависимости от применяемого пробиотика).

В производственных условиях мы испытывали комплексный пробиотик Биофлор на цыплятах первых дней жизни для профилактики бактериальных болезней из расчета 0,4 мл на голову с питьевой водой в течение 5 дней в проблемной лаборатории Сумского НАУ. Результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10.

Влияние комплексного пробиотика Биофлор на сохранность цыплят

№	Гpуппа	Возpаст	Количество, голов	Падеж,%	Сохpанность,%
1.	№1(опыт)	До10дней	50	1.5	98.5
2.	№2(контроль)		50	2.5	97.5
3.	№3(опыт)	До50дней	50	2.5	97.5
4.	№4(контроль)		50	4.0	96.0

Из представленных данных видно, что сохранность цыплят в обследуемых группах в 10-дневном возрасте составляла 98.5%, а в 50-дневном возрасте - 97.5%, в то время как в контрольных группах 97.5% и 96.5% соответственно. Таким образом, скармливание пробиотика Биофлора способствовало повышению сохранности цыплят на 1-1,5%.

Разработка тест-системы на основе ИФА для диагностики эшерихиоза птиц.

Характеристика антигенной структуры сероваров эшерихий.

Предварительно в ИФА в качестве антигенов были испытаны суспензии инактивированных нагреванием целых клеток различных сероваров патогенных для птицы E.coli (О2; О8; О4; O78) с ОП540 0,1 о.е.

Pисунок 5. Проверка различных сероваров эшерихий в качестве специфического антигена.

Перечень испытанных сывороток: 1 - отрицательная сыворотка кур; 2 - анти-E.coli О78; 3 - анти-E.coli О2; 4 - анти-E.coli О4;5 - анти-E.coli О8.

Изучение серологической специфичности антигенов проводили, раститровывая на них гомологичные и гетерологичные гипериммунные сыворотки кур. В качестве контролей служили нормальные сыворотки кролика и кур.

Анализ полученных данных позволил предложить в качестве aнтигена для ИФА клетки E.coli серовара О78, поскольку он выявлял антитела в сыворотках крови птиц ко всем исследованным сероварам эшерихий (О2, О4, О8, О78) в достаточно высоких титрах. Результаты представлены на pисунке 5 и хорошо согласуются с данными иммуноблота.

На первом этапе работы было проведено разделение ДСН-лизатов клеток в 15% ДСН-ПААГ с последующим окрашиванием гелей раствором Кумасси R-250 для сравнения белковых профилей штаммов, использованных в нашем исследовании. Были проанализированы серовары Esherichia coli (О78, О8, О2).

По данным электрофоретического анализа в ДСН-ПААГ лизаты различных сероваров эшерихий (О78, О8, О2) содержали набор белков с молекулярными массами от 30 до 70 кД, доминирующими среди которых являлись белки с молекулярными массами 34, 36, 39, 64 кД.

Таким образом, сравнение белковых профилей О78, О8, О2 сероваров E.coli показало идентичность полученных после гидролиза ДСН белковых полос.

На следующем этапе было проведено изучение антигенной специфичности белковых профилей Esherichia coli в иммуноблоттинге после электрофоретического переноса с гелей на нитроцеллюлозную мембрану и взаимодействия с гомологичными и гетерологичными сыворотками. Специфичность иммунологических реакций проверяли с сыворотками кур и кроликов против Esherichia coli О78, О8, О2.

Прежде всего следует отметить большую разрешающую способность иммуноблота в сравнении с электрофорезом, т.к. количество выявленных белков увеличивается. Иммунологическая специфичность сывороток проявляется в получении окрашенных полос различной интенсивности в широких пределах молекулярных масс, разделенных в электрофорезе белков.



A B

C

Рисунок 6. Иммуноблот анализ ДСН-лизатов сероваров после разделения в ДСН-ПААГЭ.

А - с антиэшерихиозной сывороткой к О2 серовару;

В - к серовару О8;

С - к серовару О78.

Дорожки: 1 - с нормальной сывороткой; 2 - E.coli О2; 3 - E.coli О8; 4 - E.coli О78; 5 - стандарт молекулярных масс

В результате опытов было установлено, что при взаимодействии лизатов исследованных сероваров эшерихий с сыворотками кур картины белковых профилей характеризовались идентичностью доминирующих полос при реакции как с сыворотками, полученными на аналогичный серовар, так и с

сыворотками, полученными против других сероваров эшерихий. Наиболее типичными для этих сероваров были белки с молекулярными массами 18, 29, 30, 34, 36, 39, 64, 75 кД

Гипериммунные сыворотки кур, полученные против различных сероваров эшерихий (О78, О8, О2), показали наличие в иммуноблоте общих антител к белковым антигенам с молекулярными массами 17, 27, 36, 39, 54 кД (рис. 8).

Таким образом, проведенные нами эксперименты позволили в качестве антигена при создании диагностической ИФА-системы эшерихиоза выбрать серовар О78.

Термостабильный энтеротоксин E.coli в качестве антигена при проведении ИФА.

Эшерихиоз, вызываемый энтеротоксигенными штаммами - это острая кишечная диарейная инфекция, протекающая с поражением тонкого кишечника.

Ускоренная диагностика острых кишечных диарейных инфекций может осуществляться без выделения чистых культур по обнаружению антигенов возбудителей и их токсинов или по уровню антисывороток на них. Известно, что большинство сероваров E.coli продуцируют энтеротоксины. Эти энтеротоксигенные E.coli (ЭТКП) являются общей причиной диареи. Серовары ЭТКП продуцируют термостабильный (до 70%) и термолабильный токсин.

Мы выделяли энтеротоксин из культуральной жидкости, как описано в разделе “Материалы и методы” и использовали его в качестве антигена при постановке ИФА.

Проведено изучение специфичности профилей энтеротоксина E.coli в иммуноблотинге с гомологичными и гетерологичными сыворотками.

Как видно из данных, представленных на рис.7, гипериммунные сыворотки кур, полученные против сероваров О78, О8, О2 показали наличие общих антител к энтеротоксинам E.coli, что говорит об идентичности антигенов с молекулярными массами 14, 22 и 29кД.

Рисунок 7. Иммуноблот-анализ ДСН-лизатов энтеротоксинов после разделения в ДСН-ПААГЭ

1 - лизат E.coli c антиэшерихиозной сывороткой к серовару О78;

2 - ЭТКП О78 с антисывороткой к О78;

3 - ЭТКП О8 с антисывороткой к О8;

4 - ЭТКП О2 с антисывороткой к О2;

5 - ЭТКП О78 с антисывороткой к О8;

6 - ЭТКП О78 с антисывороткой к О2;

7 - ЭТКП О2 с антисывороткой к О8

Объем среды и соотношение всех других параметов является главным для достижения достаточного выращивания микроорганизмов и, следовательно, выделения токсина. Объем от 2мл (не менее) до 25мл является лучшим.

Выделенный термостабильный энтеротоксин в культуре будет снижать активность в период свыше указанного времени. Поэтому необходимо использовать культуру по возможности сразу после выращивания. А также и потому, что надосадок и фильтрат не мутнеют и не снижают вязкость.

Культуру нельзя держать в тепле. Хотя термостабильный энтеротоксин выживает и при 100°С, высокая температура может быть неблагоприятной для теста. Реактивы, такие как азид натрия и формалин, которые могут воздействовать на пероксидазу и реактивировать её, не рекомендуется использовать. Некоторые недоработки могут давать ложные результаты.

Подбор оптимальной концентрации антигенов для сенсибилизации плашек.

Степень связывания белков с полистироловым носителем непосредственно зависит от многих причин, среди которых и содержание белка в сенсибилизирующем растворе. При использовании растворов с высоким содержанием белка на единицу поверхности эффективность адсорбции снижается и в результате большее количество белка подвергается последующей десорбции. При этом наблюдается ослабление прочности связывания из-за насыщения поверхности носителя [81, 122, 151].

В работе изучено влияние сенсибилизирующей концентрации инактивированных корпускулярных антигенов из штаммов E.coli серовариантов О78, О4, О2, О8 на величину показателей ОП490 анти-эшерихиозных положительных сывороток при постановке твердофазного ИФА, осуществляемого в стандартном непрямом варианте. Для постановки ИФА использовали разведения указанных антигенов в ЗФР, рН 7,3 со следующими значениями оптической плотности суспензии (ОП540): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о.е. мутности.

Антигены вносили в лунки полистироловой планшеты по 100 мкл/лунку по следующей схеме: одну половину планшеты (ряды с 1 по 6) заполняли эшерихиозным антигеном и осуществляли ее сенсибилизацию, инкубируя в течение 60 мин при 37°С. После отмывки в лунки планшеты вносили гипериммунную куриную анти-эшерихиозную (О78) сыворотку в разведении 1:12800 на антиген, а также нормальные сыворотки кролика и кур в ЗФРТ. Рабочие разведения сывороток для отработки условий постановки ИФА были подобраны по предварительному титрованию сывороток. Инкубацию проводили 1 час при +37°С. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляли анти-куриный пероксидазный конъюгат в подобранном рабочем разведении. После инкубации с конъюгатом в течение 1 часа при +37°С и отмывки учитывали результаты реакции с субстратом (ОФД) по оптической плотности образовавшегося реакционного продукта, измеренной на приборе MicroELISA Auto Reader MR 580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм. Реакцию останавливали после 15-ти минутной инкубации добавлением 20 мкл 0.5 М раствора H2SO4. Результаты представлены на рисунке 8.

Как следует из приведенных данных, наиболее предпочтительной концентрацией эшерихиозного антигена для сенсибилизации полистироловой плашки явилась суспензия клеток с оптической плотностью (ОП490) равной 0,1 о.е. При этом разведении антигена позитивные сыворотки давали наиболее высокие значения ОП490 при наименьшем фоне негативных сывороток.

Рисунок 8. Зависимость оптической плотности продукта ИФА от концентрации сенсибилизирующего антигена

Увеличение концентрации антигена более 0.1 о.е. не приводило к возрастанию фактических данных ИФА по величине экстинкции. При концентрации белка менее 0.1 о.е. имело место значительное снижение величин экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. В дальнейших экспериментах антигены использовали в этой концентрации (0,1 о.е.).

Определение оптимального времени сенсибилизации иммунологических плашек антигенами.

Степень связывания белков с полистироловым носителем непосредственно зависит от продолжительности их контакта. Увеличение времени инкубации не всегда приводит к повышению чувствительности определения. Поэтому в каждом случае необходимо проверять, происходит ли при более длительной инкубации улучшение результатов анализа.

Влияние продолжительности инкубации на адсорбцию эшерихиозного антигена на плашках изучали с использованием оптимальной концентрации микробных клеток (ОП540 0,1 о.е) в ЗФР при рН 7,3, определенной в предыдущем опыте. Сенсибилизацию лунок антигенами проводили в течение 5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут, после чего плашки промывали 3 раза.

После сенсибилизации в лунки вносили по 100 мкл положительной анти-эшерихиозной (1:12800) сыворотки и отрицательных сывороток здоровых животных, взятых в одном разведении в тройной повторности. Далее опыт проводили по обычной схеме.

Влияние продолжительности сенсибилизации антигенами на результаты ИФА приведены на рисунке 9.

Полученные данные позволили сделать вывод о том, что оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет корпускулярными антигенами из штамма E.coli сероварианта О78 является инкубация его при 37° С в течение 15 минут.



Рисунок 9. Зависимость оптической плотности (ОП 490) конечного продукта ИФА от времени сенсибилизации иммунологической плашки антигенами.

Сенсибилизация лунок в течение 5 и 10 минут несколько снижает чувствительность реакции по сравнению с 15-минутной инкубацией. Тогда как увеличение времени инкубации более 15 минут не приводит к значительному росту интенсивности окраски конечного продукта реакции и показателей ЕД ИФА.

Подбор оптимального значения рН буферной системы для сорбции антигенов и антител

Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является рН инкубационного буфера, используемого для разведения антигенов и антител. Плашки сенсибилизировали эшерихиозным антигеном, разведенным в ЗФР с рН 7,3; фосфатном буфере с рН 6,2 и 8,2; карбонат-бикарбонатном буфере с рН 9,6. Сенсибилизацию проводили в подобранных оптимальных условиях. После чего на антиген вносили 100 мкл положительной антиэшерихиозной (1:12800) сыворотки и отрицательные сыворотки кур в тройной повторности, разведенных в ЗФРТ. Результаты представлены на рисунке 10.

Рисунок 10. Влияние рН буферных систем, использованных в ИФА на сорбцию антигенов антител

В результате проведенных исследований было установлено, что связывание антигена с твердой фазой находится в сильной зависимости от рН буфера, которым разводили антиген. Оптимальным рН комплексирующего буфера при сенсибилизации плашек антигенами является значение 7,3. При использовании буфера с рН 6,2 в лунках с негативной сывороткой наблюдалось значительное окрашивание (фон), что объясняется тем, что в этих условиях сорбция антигенов происходит не полностью, часть поверхности лунки остается свободной, в результате чего происходит неспецифическое связывание сывороточных белков с полистиролом, т.е. уменьшается специфичность реакции. При использовании буферов с рН 8,2 и 9,6 понижается чувствительность реакции, что выражается в некотором снижении ОП490 положительных сывороток. В обоих случаях происходит уменьшение величин ЕД ИФА.

Подбор оптимального режима инкубации сывороток и конъюгатов.

Для определения температурного режима инкубации сывороток и конъюгатов на результаты ИФА использовали плашки, сенсибилизированные антигеном с учетом подобранных выше условий.

Положительные (антиэшерихиозные) и негативные сыворотки инкубировали с антигенами при 37°С или при комнатной температуре (22 24°С) в течение 1 часа. Результаты представлены на рисунке 11.



А - нормальная сыворотка кур

Б - антиэшерихиозная сыворотка кур.

Рисунок 11. ИФА при разных температурах инкубации антиген - антитело

Из представленных данных видно, что использование комнатной температуры (22-24°С) для проведения реакции связывания антигена с антителом не снижает чувствительности метода по сравнению с инкубацией в условиях термостата (37°С), хотя показатель ЕД ИФА во втором случае несколько выше (4231±51), чем в первом (4065±58).

Определение влияния продолжительности взаимодействия сывороток с антигенами проводили на плашках, сенсибилизированных антигенами в рабочем разведении (ОП540 0,1 о.е.) в ЗФР с рН 7,3.

Таблица 11.

Влияние времени инкубации сывороток на результаты ИФА

Сыворотки	ЕД ИФА при времени инкубации
	30 минут	60 минут
антиэшерихиозная куриная	1347±38	3607±51

Положительные анти-эшерихиозные сыворотки и отрицательные контроли инкубировали в лунках планшетов в течение 30 и 60 минут при комнатной температуре. Результаты представлены в таблице 11.

Из полученных данных можно сделать вывод, что оптимальным режимом связывания антител с иммобилизованным на плашке антигеном является 1 час при комнатной температуре. За более короткий срок полного связывания антитела с антигеном не происходит, что ведет к уменьшению чувствительности реакции.

Срок хранения плашек, сенсибилизированных антигенами.

Одним из факторов, влияющих на эффективность ИФА и срок годности тест-системы, является нарушение связи антигена с носителем в условиях хранения.

Для определения влияния продолжительности хранения плашек, сенсибилизированных эшерихиозным антигеном, на результаты анализа, в опыте были проверены плашки, хранившиеся после нанесения на них антигенов при 4°С в течение разного срока.

Результаты активности в ИФА положительной антиэшерихиозной сыворотки представлены в таблице 12.

Таблица 12. Влияние хранения плашек, сенсибилизированных антигенами, на чувствительность ИФА

Сыворотка	ЕД ИФА при хранении
	2 дня	6 месяцев	10 месяцев
Антиэшерихиозная куриная	1886±52	1782±50	1763±48

Как показали опыты, допустимо хранение иммунологических плашек, сенсибилизированных антигенами, в течение 10 месяцев при температуре 4°С (срок наблюдения). За это время чувствительность тест-системы не снижалась.

Проверка чувствительности и специфичности разработанной ИФА тест-системы.

При исследовании специфичности подобранного антигена в отработанной тест-системе ИФА было проверено 117 гетерологичных сывороток, полученных из различных птицехозяйств:

- девятнадцать О- комплексных агглютинирующих сальмонеллезных куриных сывороток;

- двадцать три куриных микобактериальных сывороток;

- тридцать четыре куриных кампилобактериозных сывороток;

- сорок одна куриная пастереллезная сыворотка;

В качестве контроля использовали анти-эшерихиозную сыворотку и сыворотки от здоровых птиц.

В результате была установлена высокая специфичность данной диагностической тест-системы ИФА. Положительных результатов при испытании антисывороток к другим бактериям в разведении 1:100 (минимальное разведение) и выше обнаружено не было.

Таблица 13

Изучение сывороток крови птицы на эшерихиозном корпускулярном антигене в ИФА (диагностическое значение ЕД ИФА > 200)

Сыворотка	ЕД ИФА ± 2у на инактивированном эшерихиозном О78 корпускулярном антигене
Гиперимунная куриная анти-E.coli сероварианта:	О78	1445±67,3
	О8	635±50,0
	О2	1640±54,1
	О86	1018±38,9
	О132	1235±57,6
	О4	1158±45,7

Примечание: анти-E.coli - антиэшерихиозная

Специфичность и чувствительность предложенного способа также оценивали путем сравнения ЕД ИФА антиэшерихиозных к О4 сероварианту сывороток кур, гипериммунных куриных сывороток, полученных к различным серовариантам E.coli О2, О4, О8, О78, О86, О132; нормальных кроличьих и куриных сывороток. Режим постановки ИФА был выбран с учетом подобранных условий. Полистироловые планшеты сенсибилизировали инактивированным корпускулярным антигеном из штамма E.coli сероварианта О78 при концентрации антигена по ОП540 - 0,1 о.е. мутности в ЗФР с рН 7,3, в течение 15 мин при 37°С. Сыворотку вносили в лунки планшеты в разведении 1:400 в ЗФРТ в трёх повторностях. Результаты представлены в таблице 13.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что предложенный способ является чувствительным и специфичным. Средние значения ЕД ИФА положительной анти-эшерихиозных сывороток были положительными (>200) на гомологичных антигенах и отрицательными (<150) на гетерологичных. Положительные сыворотки кур, полученные от птиц, зараженных E.coli O4,отличались от всех остальных тем, что имели положительные ЕД ИФА (>200).

Сравнение специфичности и чувствительности различных антигенов для диагностики эшерихиоза.

Было проведено изучение чувствительности и специфичности разработанной нами диагностической тест-системы ИФА. Полистироловые планшеты сенсибилизировали антигенами двух типов:

1. инактивированным корпускулярным эшерихиозным антигеном из штамма E.coli сероварианта О78 в оптимальном отработанном режиме;

2. энтеротоксином, полученным из культуральной ростовой среды E.coli. Сенсибилизацию полистироловых планшет антигеном (12,5-25,0 мкг/мл) проводили в течение 16 ч при 4°С. После инкубации планшеты тщательно отмывали ЗФРТ.

Для сравнения использовали планшеты из коммерческой тест-системы DAKO (Дания), сенсибилизированные ЛПС E.coli О78 и тест-системы Oxoid (Англия), сенсибилизированные термостабильным энтеротоксином.

Исследовали сыворотки: гипериммунные куриные к эшерихиям различных серовариантов (О78, О8, О2, О4, О86, О132) и нормальные сыворотки кролика и кур в разведении 1:400 в ЗФРТ.

Таблица 14. Сравнение результатов исследования сывороток крови птиц в ИФА в разных системах

Сыворотка	ЕД ИФА +2у на антигене
	Корпускулярном эшерихиозном О78	Энтеротоксин О78	Система DАКО	Система Oxoid
Гипериммунная куриная анти-Е.сoli к серовару:	О78	555,4±89,4	500±73,4	189,0±66,0	500±72.4
	О8	302,0±50,0	301±48,3	150,4±44,2	310±47,3
	О2	587,5±18,1	579,5±22,1	298,1±44,1	577±19,1
	О86	349,3±71,7	344,2±65.0	151,3±38,0	329±67.8
	О132	459,6±60,1	452,3±59,2	173,1±20,0	439±59,1
	О4	370,3±24,1	369±25,3	205,3±58,1	370±25,1

Примечание: анти-Е.сoli - антиэшерихиозная

Как следует из таблицы 14, предложенный способ является более чувствительным и специфичным, поскольку все исследованные гипериммунные сыворотки кур, полученные к различным серовариантам эшерихий, дают на корпускулярном эшерихиозном антигене из штамма E.coli сероварианта О78 положительные результаты (ЕД ИФА>200). Применяя энтеротоксин, полученный нами и тест-системы Oxoid, были получены, в основном, идентичные результаты. Показатели ОП490 в тест-системе DАКО были в 1,5 - 2 раза ниже, чем в системе Oxoid и предлагаемой нами.

Сравнительная оценка различных серологических методов для диагностики эшерихиоза.

Методом ИФА было исследовано более трёхсот сывороток птиц, полученных из различных птицехозяйств, и определены благополучные и неблагополучные птицехозяйства. Из исследованных сывороток произвольно взяли 107 с установленным титром в ИФА и исследовали в реакции непрямой гемагглютинации (таблица 15).

Таблица 15.

Сравнительная оценка титров эшерихиозных антител в ИФА и РНГА

Титры в РНГА	Количество сывороток	Титры в ИФА	К-во положит. сывороток
	отрицат.	положит.
0 - 1:4	28	-	1:400	28
1:8 - 1:16	-	26	1:400 - 1:800	20
1:32 - 1:64	-	25	1:1600 - 1:3200	27
1:128 - 1:256	-	28	1:6400 - 1:12800	32

Сравнительные исследования 107 сывороток кур в ИФА и в РНГА, представленных в таблице 15, показали, что 28 сывороток, отрицательных в РНГА (26,2%) были положительными в ИФА, 79 образцов, которые имели в РНГА титр антител 1:4 и выше, давали в ИФА значение ОП490 (при разведении сывороток 1:400) выше 0.200 ЕД ИФА. Коэффициент корреляции равен: r=0,86, Р < 0,01.

Чувствительность ИФА выше, чем РНГА. Это выражается выявлением большего числа антител-содержащих сывороток и показателями титров их активности. Титр антител в ИФА был в 50-100 раз выше, чем в РНГА. ИФА может быть использован при определении уровня эшерихия-антител при обследовании большого количества птицы.

На основании проведенных исследований была разработана НД на “Набор для серологической иммуноферментной диагностики эшерихиоза птиц “КАЭ - С”.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

В связи с ухудшением экологической ситуации и ряда других причин наблюдается снижение уровня резистентности птицы, развитие бактериальных инфекций, обусловленных условно-патогенной микрофлорой. Эшерихиоз - острая кишечная инфекция, вызываемая различными серологическими группами патогенных кишечных палочек, протекающая с симптомами общей интоксикации и синдромом поражения желудочно-кишечного тракта. Чаще всего в практике встречаются острые кишечные инфекции.

В связи с изменениями эпизоотической ситуации в птицеводческих хозяйствах в настоящее время стали малоэффективными лечебные, профилактические и диагностические средства, которые применяются редко из-за экономических трудностей [42, 56, 58, 105, 110, 147]. Бактериальные инфекции наносят ощутимый ущерб промышленному птицеводству. Часть микроорганизмов способна приживаться в организме птицы и длительное время персистировать без выраженной симптоматики. На последнем этапе технологии производства, а именно, при получении продукции, при отсутствии надлежащего контроля и нарушении ветеринарно-санитарных правил, происходит контаминация тушек птиц и яиц микроорганизмами.

Наши данные согласуются с результатами ряда учёных, которые также считают, что при смешанных инфекциях проявляет активность этиологический комплекс, представленный ассоциацией разных возбудителей [20, 56, 97, 175].

Наряду со многими факторами внешней среды определённое внимание следует уделять воздушной среде инкубатора. Воздух в инкубаторе имеет существенное эпизоотологическое значение, поскольку он может представлять прямую опасность в распространении возбудителей инфекционных заболеваний. По результатам наших опытов, в воздухе инкубатора содержится большое количество микроорганизмов, которые могут вызывать заболевание эмбрионов и цыплят, что подтверждается исследованиями Meger R.S., Rhoades H.E. [275].

Заражение цыплят после вывода происходит прежде всего через дыхательные пути [56, 73, 98, 147, 211]. Таким образом, наибольшая опасность распространения возбудителей приходится на выводные шшкафы инкубаторов. Контаминированный микроорганизмами воздух вместе с пылью распространяется не только внутри инкубатора, но и в близко расположенные птичники. Поэтому борьба с запыленностью воздуха как в инкубаторе, так и в птичнике имеет большое практическое значение в отношении предотвращения аэрогенного заражения птицы.

Ряд учёных предлагают с лечебно-профилактической целью применять аэрозольно взвеси антибиотиков и одновременно иммунизировать птиц против вирусных заболеваний. С профилактической целью цыплят обрабатывают однократно, с лечебной - по 2-3 дня подряд с перерывом в 4 дня, до окончания заболевания. Однако обрабатывать птицу аэрозолями антибиотиков и одновременно иммунизировать их против вирусных заболеваний не рекомендуется, так как некоторые антибиотики мешают выработке активного иммунитета[19, 32, 59, 60, 69]. Мы в своей работе изучали чувствительность E.coli, Kl.pneumoniae, Ps.aeruginosa к антибиотикам (мономицину, неомицину, стрептомицину, пенициллину, эритромицину, олеандомицину, тетрациклину, полимиксину-М, хлорамфениколу, стрептомицину, левомицетину, байтрилу) и установили снижение чувствительности данных возбудителей в 97% случаев к испытанным антибиотикам, которые широко применялись в обследованных хозяйствах.

Предотвращение возникновения смешанных инфекций птицы, а также их ликвидация в случае возникновения, без сомнения, является одной из важных задач птицеводства. Но на сегодняшний день нет универсальных средств лечения и профилактики их.

В современных условиях промышленного птицеводства для ветеринарной науки и практики не менее важной проблемой оказывается усовершенствование методов дифференциальной диагностики заболеваний и в том числе эшерихиоза. Лабораторное подтверждение эшерихиозов возможно лишь по результатам серологического исследования.

При диагностике бактериальных инфекций всё более широкое применение находит метод иммуноферментного анализа. Несмотря на длительность подготовительного периода, сама постановка реакции ИФА занимает мало времени. Отдельные модификации этого метода имеют различную чувствительность, которая бывает обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Известные рекомендации не решают вопроса проведения анализа ИФА в целом, поскольку в них были описаны лишь результаты опытов на определённых системах, чаще всего с высокоочищенными стандартными препаратами. Из большой же практики иммунологического анализа известно, что внесение в систему ИФА лишь одного элемента - сыворотки крови - создаёт столько проблем, сколько их может не встретиться в разработке метода в целом.

Таким образом, получение специфического антигена является необходимым условием при изготовлении диагностикумов и получения высокоактивных иммунных сывороток, используемых для создания иммуноферментных препаратов.

В результате проведенных экспериментов в качестве антигена для создания ИФА тест-системы для диагностики эшерихиоза был выбран серовар О78 Escherichia coli, так как он был наиболее типоспецифичным.

ИФА в разных вариантах применительно к эшерихиозу использовали многие исследователи, как у нас в стране, так и за рубежом. В основном этот метод использовался в исследовательских работах по изучению эпидемиологии эшерихиоза, возможностей его диагностики, исследованию перекрестных реакций возбудителя эшерихиоза с возбудителями других инфекций [249, 250, 272, 298].

Для этих целей использовались несколько модификаций ИФА с различными антигенами (целые клетки, ЛПС). Но готовых коммерческих тест-систем ИФА для диагностики эшерихиоза в ветеринарии нет. В медицинской практике известны несколько тест-систем ИФА для диагностики эшерихиоза (фирм DAKO, Дания и Oxoid, Англия) [131, 143].

Известен способ иммуноферментной диагностики эшерихиозов, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты протеиновым антигеном, свободно секретируемым в культуральную среду любой культурой патогенных эшерихий, с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки [131, 143]. Иначе говоря, с помощью общего для рода Escherichia антигена, проводится родоспецифическая серодиагностика заболеваний, вызванных любым из возбудителей вида.

Недостатком данного способа является невысокая чувствительность и специфичность к выявлению эшерихиозов, вызванных сероварами О2, О4, О8, О132. Кроме того, способ более трудоемок в исполнении, а на получение используемого антигена требуются значительные затраты времени и средств. Известен также способ диагностики эшерихиозов, включающий сенсибилизацию полистироловой плашки липополисахаридным антигеном (ЛПС), выделенным из клеток Escherichia coli, с последующей отмывкой ее от несвязавшегося антигена и выявление антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (коммерческая ИФА тест-система, предназначенная для определения IgA и IgG антител к E.coli (ELISA, DAKO, Дания).

В предлагаемой нами ИФА тест-системе в качестве антигена использованы специально обработанные целые клетки E.coli О78, содержащие на поверхности кроме ЛПС и другие компоненты клеточной стенки, обладающие видоспецифической активностью. Это расширяет возможности данной тест-системы при диагностике эшерихиозов, включая в область определения инфекции, вызванные кроме E.coli О78 также О2, О4, О8 и О132 серовариантами. В тест-системе ИФА DAKO в качестве антигена используется липополисахарид (ЛПС), который узкоспецифичен для E.coli О78, что подтверждается и в наших исследованиях: сыворотка к сероварианту О78 дала сравнимые с ОП490 в системе DAKO показатели. Сыворотки, полученные к О8, О2 и О132 серовариантам не давали окрашенной реакции конечного продукта в ИФА DAKO, тогда как все исследованные гипериммунные сыворотки кур, полученные к различным серовариантам эшерихий, дают на корпускулярном эшерихиозном антигене из штамма E.coli сероварианта О78 положительные результаты (ЕД ИФА>200).

Таким образом, ИФА тест-система DAKO обладает более узкой специфичностью по сравнению с предлагаемой нами, что делает невозможным ее использование в целях серодиагностики эшерихиозов, вызванных целым рядом серовариантов E.coli, т.е. она является сероварспецифической, тогда как предлагаемая нами тест-система обладает более широкой видоспецифической активностью.

Нами было сделано предположение, подтвержденное результатами экспериментальных исследований, что ИФА тест-система DAKO обладает более узкой специфичностью по сравнению с предлагаемой нами, что делает невозможным ее использование в целях серодиагностики эшерихиозов, вызванных целым рядом серовариантов E.coli серотипами О2, О8, О86, О132, т.е. она является видоспецифической, тогда как предлагаемая нами тест-система обладает типоспецифической активностью. Кроме того, для выполнения способа требуется очищенный антиген, на получение которого затрачивается значительное время, что усложняет его.

Цель работы состояла в повышении чувствительности и специфичности способа иммуноферментной диагностики эшерихиоза. Поставленная цель достигается тем, что для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированные корпускулярные антигены и термостабильные энтеротоксины из штаммов E.coli сероварианта О78 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с рН 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм. Сенсибилизацию полистироловой плашки указанным антигеном осуществляют путем ее инкубации при 37°С в течение 15 мин.

Разработанная тест-система имеет ряд преимуществ перед известными коммерческими, в частности - уменьшение трудоемкости исследования в результате использования в качестве антигена целых клеток E.coli О78, а не очищенных клеточных или внеклеточных субстанций; предлагаемая ИФА тест-система обладает более широкой сероварспецифичностью при диагностике E.coli по сравнению с известными способами. Все проверенные в ней гипериммунные сыворотки давали на использованном эшерихиозном антигене положительный результат, тогда как ни одна позитивная сальмонеллезная, кампилобактериозная, пастереллезная сыворотки не реагировали на нем положительно, что свидетельствует о ее высокой специфичности.

При сравнительной оценке различных методов определения эшерихиозных антител более эффективным был метод ИФА. Установлена линейная коррелятивная зависимость между результатами, полученными в РНГА и ИФА (r = 0.86, Р < 0,01). Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем метода РНГА и может применяться для определения уровня эшерихиозных антител при исследовании большого количества сывороток.

Таким образом, разработана тест-система ИФА, предназначенная для серологической диагностики эшерихиоза у кур. Система является видоспецифической по отношению к E.coli и дает возможность выявлять эшерихиоз у птиц по содержанию антител в крови. Предложенная схема постановки ИФА проста в исполнении и может быть использована как в практических, так и в научных целях.

Проведены комплексные исследования и анализ эпизоотологического состояния 11 птицехозяйств. Установлено, что в этих хозяйствах широко циркулирует условно-патогенная микрофлора, которая может предопределить патологию смешанного течения эшерихиоза с другими инфекциями.

На основании проведенных исследований установлено, что в условиях интенсивного птицеводства условно-патогенная микрофлора, выделенная из воздуха выводных инкубаторов, трупов цыплят, объектов внешней среды идентична и играет существенную роль в патологии птицы разного возраста.

Установлено, что смешанная инфекция птиц является причиной внезапных, спонтанных вспышек эпизоотий в птицехозяйствах. При проведении бактериологических исследований было изолировано 1600 культур энтеробактерий, среди которых вид E.coli составил 34%, далее следуют: кокковая микрофлора - 20.6%, возбудители псевдомоноза - 15%, сальмонеллёза - 9.5%, клебсиеллёза - 8.3%, протей - 5.3%, аспергиллёза - 2.2%, цитробактер - 2.0%, гафния - 1.6%, энтеробактер - 1,5%.

Воздушная среда птичников и инкубаторов содействует аэрогенному инфицированию птицы и осеменению скорлупы инкубируемых яиц. Возникает замкнутая цепь, где циркулируют одинаковые серовары условно-патогенных микроорганизмов и при снижении резистентности птицы вызывают вспышки инфекционных заболеваний.

При изучении чувствительности изолированных культур микроорганизмов к антибиотикам, мы установили, что они проявляли резистентность к препаратам, которые широко применялись в хозяйствах с лечебно-профилактической целью. В связи с этим антибиотики оказывались слабо эффективными (в 97% случаев), за исключением левомицетина и байтрила (100%-ная чувствительность).

На основании экспериментальных данных установлено, что при применении пробиотиков Кормо-токс, Биофлор, Био Плюс 2Б, Авигард повышается сохранность птицы на 27.5%, ежесуточный привес у цыплят был на 5,0 - 6,5г больше, чем в контроле и через 30 дней разница средней массы составила150-195г.

На основе инактивированного корпускулярного антигена E.coli сероварианта О78 разработаны компоненты и схема постановки непрямого ИФА, предназначенные для диагностики эшерихиоза птиц.

Разработана тест-система ИФА на основе антигена термостабильного энтеротоксина без выделения чистых культур, предназначенная для диагностики эшерихиоза птиц.

Показано, что разработанная тест-система характеризуется специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью результатов. При сравнительной оценке методов ИФА и РНГА для определения эшерихиозных антител более эффективным был метод ИФА. Установлено, что ИФА имеет высокий коэффициент корреляции (r = 0.86, Р < 0.01).

Технология получения реагентов и методика проведения ИФА положены в основу разработанной тест-системы и создан “Набор для серологической иммуноферментной диагностики эшерихиоза птиц “КАЭ - С”. НД на набор представлен к утверждению в общепринятом порядке.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Алешкин В., Феклисова Л., Борисова И. Иммуноглобулиновые препараты для профилактики и лечения инфекционных заболеваний. // Врач. -- 1997. -- №6. -- С. 16--17.

Алексеев Ф. Ф. К вопросу неспецифической профилактики колисептицемии кур. // Ветеринария, 1991, №6 - С. 35.

Аллахвердиева И.И., Григорьева Н. А., Муцмахер Д. М. Микроклимат птичников и яичная продуктивность кур в конце продуктивного периода. Тр. Азерб. СХИ, серия «Ветеринария», 1981, вып.5.- С.36-38.

Андреев Е.В. Ассоциированное воздействие на организм вируса и условно-патогенных бактерий // Ветеринария. - 1984. -№7. - с.25-27.

Андрейчин М.А., Гебеш В.В., Гнатюк М.С. Энтеросорбция: достижения, проблемы, перспективы. // Врачеб. дело. -- 1991. -- №9. -- С. 12--19.

Андрейчин М.А, Ивахив О.Л. Энтеросорбция в комплексном лечении инфекционных больных. // Клин. медицина. -- 1994. -- Т. 72, №6. -- С. 11--14.

Андрейчин М.А., Копча В. С., Iвахiв О.Л. Пiдвищення ефективностi лiкування хворих на гострi кишковi iнфекцiї за допомогою eнтеросорбентiв i силiбору. // Iнфекцiйнi хвороби. -- 1995. -- №1. -- С. 12--16.

Андрейчин М.А., Луцук О.С., Андрейчин С.М., Копча B.C. Eнтеросорбцiйне лiкування хворих на гострi кишковi iнфекцiї та хронiчнi колiти з дiареєю. // Лiкарська справа. -- 1996. -- №7--9. -- С. 147--151.

Андреева О. С. О роли патогенных серотипов кишечной палочки при заболевании молодняка с/х животных. // Материалы Всесоюз. конф. по болезням молодняка с/х животных и птиц.- М., 1984.- С. 54-56.

Андрюнин Ю. И. Ветеринарно-санитарная защита ферм и методы дезинфекции.// Ветеринария, 1989, №11.- с. 8-12

Андрюнин Ю. И., Дукаценко В. Г. Дезинфекция в животноводческих комлексах.// Ветеринария, 1991, №10.- С. 42-46.

Анапенко В. М. Смешанные инфекции с/х животных. Киев, «Урожай», 1990.-172.

Анапенко В. М. Ассоциированные инфекции птиц в иммуноморфологическом аспекте. // Межвуз. сб. науч. трудов, Харьков, 1991.- С. 30-31.

Анапенко В. М. Ассоциированные инфекции и иммуностимуляция в условиях откормочных хозяйств. Новое в учении о заразных болезнях (вирусных, бактериальных, зоопарапзитарных). // Материалы 3-го съезда паразитоценологов.- Киев, 1994.- С. 151-160.

Антитела. Методы. 1 т. // Под ред. Д.Кэтти.- М.: Мир, 1991.-287с.

Аринкин А.В. Коррекция иммуного ответа у цыплят, заражённых смешанной инвазией. // Ветеринария, №1 - 1997, с.30.

Артишевская И.И., Боровая Т.В. Иерсиниозная инфекция и суставной синдром в практике терапевта. // Диагностика и лечение основных инфекционных заболеваний в современных условиях: III съезд инфекционистов Белоруссии: Тезисы докл. -- Минск, 1990. -- С. 78--79.

Аржаков В. Н. Чувствительность к антибиотикам патогенных штаммов E. coli, выделенных из различных птицеводческих хозяйств. -Сборник науч. работ Сиб. НИВИ -т. Инфекционные болезни животных , 1989, в. 34.-С. 105-110

Артемьева С. А. Колибактериоз птиц. М.: Колос, 1997.-95 с.

Артемьева С. А. Бактериоциногения кишечной палочки и пастерелл. // Птицеводство, 1980, №11-С. 45.

Артемьева С. А. Смешанная инфекция пастереллёза и колибактериоза. // Птицеводство, 1986, №8-С. 45-46.

Артемьева С. А. Современные методы профилактики коли и паратифозных инфекций птиц.- Сб. тр. Всесоюз. НИВИ, 1987, В. 11/22/-С. 50-55.

Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. М.: Триада - Х, 1998. - 496с.

Атамась В. А., Масленникова С. И. Ассоциированное течение болезней бактериальной этиологии. // Ветеринария, 1985, №3.-С. 37-39.

Ахмедова А. Г. Биология бактерий группы кишечной палочки, выделенной от птиц. // Материалы науч.- произ. конф., Самарканд, 1987.С. 37

Ашмарин И. П., Воробьёв А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Л.: Медгиз., 1962.-179 с.

Бабина М.П. Коррекция имунного статуса и повышение продуктивности цыплят-бройлеров пробиотиками. // Актуал. пробл. интенсив. развития животноводства - Горки. - 1998. - с.294-299.

Байдевлятов А.Б. Справочник по болезням сельскохозяйственных птиц.- Киев, "Урожай",1980.-С.136.

Байдевлятов А.Б., Герман В.В., Киприч В.В. Система ветеринарно-санитарных мероприятий в промышленном и племенном животноводстве. - Киев: "Урожай",1987,- 222 с.

Байдевлятов А.Б. Пути повышения жизнеспособности птицы в промышленном птицеводстве - Научно-техн. бюл. УНИИП, 1990, №6, С. 38-42.

Байдевлятов А.Б. , Бессарабов Б.Ф., 0льховик Л.А. Справочник по болезням с/х. птицы.- Киев:"Урожай",1992.-200 с.

Байдевлятов А.Б., Фотина Т.И. Дезинфекция птичников при ассоциированных бактериозах. // Материалы межгос. конф. по научным и прикладным проблемам паразитоценологии.- Киев-Харьков-Луганск,1992.-С.34.

Байдевлятов А.Б. Сравнительная характеристика дезинфекционных средств при ассоциированных бактериозах. // Материалы 1V-го Съезда паразитоценологов Украины.- Харьков, 1995.-С.153.

Бактериальный эндотоксикоз /Шенкман Б.З., Андрейчин М.А., Степанов С.А., Богомолова Н.В./ -- Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1991. -- 240 с.

Белая О.Ф. Клинико-патологические, иммунологические и диагностические аспекты циркуляции в организме антигенов и токсинов энтеробактерий как факторов патогенности возбудителей при острых кишечных заболеваниях: Дисс. д-ра мед. наук.- 1994.- 426 с.

Белая Ю.А. Реакция коагглютинации -- чувствительный экспресс метод индикации антигенов и токсинов возбудителей кишечных и других заболеваний. // Новое в практике лаб. иссл. - Горький.- 1987.-С. 66-70.

Бессарабов Б.Ф. Ветеринарно-санитарные мероприятия по профилактике болезней птиц.-- М: Россельхозиздат.,1990,- 187 с.

Бессарабов Б.Ф., Байдевлятов А.Б. Рецептурный справочник по болезням птиц.- Сумы: МКИПП "Мрия",1992. - З04 с.

Блюгер А.Ф., Векслер Х.М., Новицкий И.Н. Клиническая иммунология кишечных инфекций. -- Рига: Звайгзне, 1980. -- 214 с.

Богомаз В.М., Дынник О.Б. Серологическая диагностика инфицированности Helicobacter pylori методом иммуноферментного анализа. Украiнський медичний часопис - №5 -IX/X - 2001 -c.108-110.

Богосьян А.А. Скрытые очаги инфекции в помещениях для птиц и новые способы их обеззараживания. // Тезисы 5-й межгос.межвуз. науч.конференции.- Санкт-Петербург,1993.-С.10-16.

Болезни птицы / Пер. с анг.О.В.Мищихи, О.А.Покорной - М.: Агропромиздат, 1985. - 349с.

Бондар Л.О. Ерготропіки в профілактиці та терапії хвороб птиці. // Вісник Сумського Державного аграрного університету.- Суми, 2000. - с.28-32.

Борисов А.Е. Респираторные инфекции телят при ассоциированном течении. // Материалы межгосуд. конф. по научным и практ. проблемам паразитоценологии.- Киев - Харьков - Луганск,1993.-С.17-18.

Бочаров Д.А. Дезинфекция на птицефермах.- Птицеводство, 1989, №6, С. 29-31

Бродов А.Е., Малеев В.Д., Машилов В.П. Осложнения у больных пищевыми токсикоинфекциями и сальмонеллезами. // Клин. медицина. -- 1996. -- №1. -- С. 36--38.

Бродов А.Е., Ющук Н.Д., Кареткина Т.Н. Трудности дифференциальной диагностики между рядом инфекционных заболеваний и пищевыми токсикоинфекциями. // Клин. медицина. -- 1989. -- №7. -- С. 131--135.

Бродов А.Е., Ющук Н.Д., Малеев В. В. Клинико-патогенетические особенности инфекционно-токсического шока у больных острыми кишечными инфекциями. // Эпидемиология и инфекционные болезни. -- 1997. -- №2. -- С. 22--26

Бродянский Ю.М., Чайко Н.А. Улучшение методов бактериальных и серологических исследований при кишечных инфекциях. // Острые кишечные инфекции.-Л.- 1982.-вып. 6.- С. 124-132.

Бублик В.Н., Борисов А.Е. Роль паразитоценологии при промышленном содержании животных. // Материалы межгосуд. науч. конф. Харьков, 1995.- С. 348-351.

Бурханова Х.К. Химиотерапия и специфические средства при колибактериозе и пуллорозе-тифе цыплят. // Передовой науч.- технич. опыт в птицеводство.--Загорск,1980, №2,- С. 32--34.

Бусол В. А. Теоретические и практические аспекты управления эпизоотическим процессом при хронических инфекционных болезнях. // Материалы международ. науч. конф.- Харьков,1995.- С.16-20.

Васильев В. С., Комар В. И., Цыркунов В. М. Практика инфекциониста. М.: Высш. шк., 1993. -- 495 с.

Войно-Ясенецкий М.В. Биология и патология инфекционных процессов. -- Л.: Медицина, 1981. -- 207 с.

Використання ентеросорбентів у комплексному лікуванні хворих на гострі кишкові інфекциї: Метод. Рекомендациї. /Склали Андрейчин М.А., Гебеш В.В., Івахів О.Л./ -- Тернопіль, 1992. -- 18с.