Исследования проводились в 1997-2000гг. на базе Сумского Национального аграрного университета, птицеводческих совхозах Сумской области, в 2000-2003гг. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности, г.Щёлково, Российской Федерации, в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой «Комплексная разработка диагностикумов и вакцин против вирусных и бактериальных болезней животных» (РК 01.200.1.12.689).

Эпизоотологические исследования включали изучение источников возбудителей инфекции, механизм передачи и развитие патогенных микроорганизмов в организме цыплят в условиях групповой профилактики бактериальных инфекций. При этом выясняли степень распространения, динамику гибели и значение факторов передачи инфекций.

Объектами исследований были эмбрионы и цыплята породы леггорн, кросса “Беларусь-9” от одно- до 60-дневного возраста, которые содержались в типичных условиях птицехозяйств.

Выделение микроорганизмов из эмбрионов, трупов птицы, патматериала, отобранного на санитарной бойне, изучение их культурально-морфологических, биохимических и патогенных свойств проводили по стандартным методикам [99, 106, 113, 118, 123, 124, 125, 143, 144, 202]. Выделение энтеропатогенных культур эшерихий проводили путем высева материала на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина и другие). Выросшие и изолированные колонии (не меньше четырех) пересевали на МПА, выдерживали в термостате при 37С в течение 24 часов. После этого часть пробирок использовали для приготовления мазков, посевов на дифференциально-диагностические среды и заражения лабораторных животных, а другие для изготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не агглютинировался поливалентными колисыворотками.

Посевы проводили из костного, головного мозга, сердца, печени, желчного пузыря и других органов на простые и элективные питательные среды. Посевы инкубировали 24 часа при 37С. Пересев материала проводили на среды Эндо, 0,3%-й МПА, МПБ, бульон Хоттингера, среды Кларка, Козера, Симмонса.

Идентификацию выделенных культур осуществляли в соответствии с требованиями, изложенными в “Кратком определителе бактерий Берги” (1980) [118].

Типизацию и идентификацию выделенных культур бактерий сальмонеллезной группы проводили методом последовательного обогащения. Материал, отобранный сразу после забоя птицы, размещали в колбе, которая содержала среду в соотношении 1:5 и помещали в термостат. Через 18-24 часа выращивания проводили высевы в бактериологические чашки с дифференциально-диагностическими средами (висмутсульфитный агар, селенитовый бульон, магниевая среда). После 16-тичасовой выдержки в термостате при 37С из обогащенных сред проводили пересев на чашки с висмут-сульфитным агаром и помещали в термостат. Засеянные чашки просматривали через 16, 24 и 48 часов культивирования.

Морфологические свойства выделенных культур изучали в мазках, окрашенных по Граму, подвижность определяли в полужидком агаре (0,25-0,3% концентрации). Изучение культуральных и биохимических свойств проводили, используя питательные среды с углеводами и многоатомными спиртами, которые содержат индикатор Андреде, а также на средах Кларка, Олькельницького, цитратно-амонийная среда, среда с мочевиной, среда Христинсена.

Типичные культуры исследовали с агглютинирующими комплексными сыворотками.

Культуры, у которых были положительные реакции, в дальнейшем исследовали с монорецепторными аглютинирующими сыворотками.

Серологическую типизацию культур эшерихий осуществляли с целью установления эпизоотических сероваров.

Для приготовления антигенов каждую предназначенную для типизации суточную культуру смывали стерильным физраствором, суспензию бактерий доводили физиологическим раствором до 3-4 млрд. микробных тел в 1см3 (по стандарту мутности), кипятили на водяной бане в течение 60 минут. Затем взвеси охлаждали, центрифугировали при 3000 - 4000 об/мин в течение 15 минут.

Потом на чистое, обезжиренное предметное стекло наносили по капле каждой комплексной сыворотки, разведенной физраствором 1:5 и добавляли по капле антиген, ингредиенты тщательным образом смешивали. Учет реакции проводили не позже трех минут при легком покачивании стекла.

Для определения кокковой микрофлоры проводили разведение материала. При этом в стерильные пробирки помещали 1г исследуемого материала и добавляли 10 см? стерильного физраствора, тщательным образом перемешивали содержимое, встряхивали и делали серийное разведение от 1:10 до 1:1 000000.

После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости отбирали пробы и высевали на чашки Петри с 5% -ным кровяным МПА. Учет колоний проводили после инкубации в термостате в течение 48 часов при 37С.

Для идентификации стрептококков полученные колонии пересевали на молочную среду с 0,002% содержанием метиленового синего.

Буферные смеси и другие реактивы:

забуференный физиологический раствор (ЗФР), рН 7.3: 72 мл 0,2 М Na2HP04 х 12 Н2О, 28 мл 0,2 М NaH2PO4 x 2 Н2О и 9г NaCl доводили дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе;

забуференный физиологический раствор с добавлением 0,05% Твина-20?(ЗФРТ);

фосфатный буфер, 0.1М: рН 6.2: 18,5 мл 0,2М Na2HPO4 и 81,5 мл 0,2М NaH2PO4 доводят дистиллированной водой до 200 мл, при необходимости доводят рН до нужной величины Н3РО4 или NaOH;

рН 8.0: 94,7 мл 0,2М Na2HPO4 и 5,3 мл 0,2М NaH2PO4 доводят дистиллированной водой до 200 мл, при необходимости доводят рН до нужной величины Н3РО4 или NaOH;

карбонат-бикарбонатный буфер, 0.2М, рН 9.8: 22 мл 0,2М Na2CO3 и 50 мл 0,2М NaHCO3 разбавляют дистиллированной водой до 200 мл;

цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) 0.05М, рН 5.0: 9.7 мл 0.1М лимонной кислоты хН2О + 10.3 мл 0,2М Na2HPO4x2H2O разбавляют водой до 1000 мл;

10х буфер для переноса = 10х Трис-глициновый буфер: 0.25 М Трис, 1.92 М глицин, рН 8.3, фирмы "Serva".

Из него готовят " Товбин буфер " (0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 20% метанол) 10-кратным разбавлением с добавлением 20% метанола (100 мл 10х буфер для переноса + 200 мл метанола + 700 мл Н2О).

10х буфер для электрофореза = 10х ДСН-Трис-глициновый буфер: 0.25 М

Трис, 1.92 М глицин, 1% ДСН, рН 8.3, фирмы "Merck".

Из него готовят буфер для электрофореза (0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 0.1% ДСН) 10-кратным разведением: 50 мл 10х ДСН-Трис-глицин буфер довести до 500 мл дистиллированной водой.

Раствор мономеров (АА/Бис) (хранится при +4°С,в темноте) (30% Т, 2,7% С): 146 г акриламида (АА) + 4 г бисакриламида (Бис)> до 500 мл Н2О дист.;

4х буфер разделяющего геля (+4° С): 1,5 М Трис-HCl, рН 8.8:

Трис-основной……..........36,3 г

Н2О дист.…....................100 мл

НС1 1М…..…...............до рН 8,8

Н2О дист...............…..до 200 мл

4х буфер концентрирующего геля (+4° С): 0,5М Трис-HCl, рН -6.8:

Трис-основной.........…...6 г

Н2О дист.….................50 мл

НС1 1М...................до рН 6.8

Н2О дист.................до 100мл

Лизирующий буфер: 2х буфер для образцов (ОД25М Трис, 4% ДСН, 10% ДТТ, 20% глицерин, 0.001% бромфенолового синего, рН 6.8):

0,5МТрис-НС1,рН6,8.……2,5мл

Дитиотрейтол (ДТТ).........…...1 г

Глицерин....................……...2 мл

Н2О дист.........................до 10мл

Буфер для иммуноблота (ЗО мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0.05% Твин-20, 0.5мг/мл овальбумин, рН 8.0):

ЗМТрис-НС1........….…….2 мл

Твин-20..............……...100 мкл

Овальбумин..........…….1 00 мг

Н2О дист…...................до200мл

хромогенный субстрат ортофенилендиамин (ОФД): 10 мг ОФД растворяют в 25 мл ЦФБ с рН 5,0 и добавляют 50 мкл 3% Н2О2, готовится непосредственно перед использованием;

хромогенный субстрат диаминобензидин (ДАБ): 10 мг диаминобензидина растворяют в 10 мл Трис З мМ, рН 8.0 и добавляют 50 мкл 3% Н2О2;

1N раствор серной кислоты;

3% перекись водорода;

10% додецил сульфат натрия (ДСН);

10% персульфат аммония (ПСА);

Краситель для гелей:

- 0.3% Кумасси R250 в смеси Н2О : спирт : ледяная уксусная кислота в соотношении 5:3:1. Кумасси растворяют в спирте на мешалке в течение 15 минут. Затем добавляют воду и уксусную кислоту. Фильтруют.

- 0,1% раствор амидочерного в смеси изопропанол - уксусная к-та (25%-10%);

- коммерческая тест-система для количественного определения IgG- и IgA- антител к E.coli в сыворотках крови (E.coli O78 ELISA, DAKO, Дания);

- антитела диагностические против иммуноглобулинов кролика, меченные пероксидазой хрена, изготовленные НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (ФС 42- 3618-98);

- антитела диагностические против иммуноглобулинов кур, меченные пероксидазой хрена, изготовленные НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (ФС 42-3618-98).

3.1.9. Антигены.

В качестве исходного эшерихиозного антигена использовали суспензии микробных клеток Escherichia coli (сероварианты О78, О8 и О2), полученные из 2-х - суточных агаровых культур, выращенных на агаре Хоттингера при +37°С и инактивированных при +56°С в течение 24 часов, дважды отмытых от среды забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с последующим центрифугированием (4000 об/мин., 15 мин.).

Суспензии эшерихиозных антигенов для ИФА готовили в ЗФР (рН 7,3) путем доведения оптической плотности (ОП) от 0,01 до 0,50 о.е. мутности на фотоэлектроколориметре (КФК-2-УХЛ-4,2) при длине волны 540 нм в кювете 10 мм.

Выделение токсина из культуральной жидкости. Инокулировали 2мл стерильного бульона E.coli, выделенной после тестирования. Инокулированную культуру энергично встряхивали при 37°С в течение 18-24ч. Это обеспечивало достаточный рост культуры (минимум ОП540 в кювете 1см) от 0.5 до 1.0 о.е. мутности при 10-кратном разведении. После инкубации проводили центрифугирование при 900g в течение 30 минут при 4°С и использовали надосадок после фильтрации (фильтр 0.2-0.45µm) с низким белок-связывающим свойством в качестве образца.

Определение активности конъюгатов антивидовых иммуноглобулинов (анти-Ig G-кур )ферментом пероксидазой хрена (ПХ).

Рабочее разведение полученного конъюгата определяли титрованием с гомологичным (Ig G-кур) и гетерологичным (Ig-кролика) иммуноглобулинами, адсорбированными в лунках полистироловых планшет.

Готовили разведение конъюгата (исходя из концентрации ПХ в полученном конъюгате) до концентрации 400, 300, 200, 100 и 50 нг/мл в ЗФР.

Результаты ферментативной реакции учитывали после инкубации в течение 30 минут при 37°С и отмывки ЗФРТ и учитывали по величине ОП490 окрашенного продукта, полученного в результате взаимодействия фермента с хромогенным субстратом - ОФД.

За рабочее разведение конъюгата принимали такое разведение, при котором ОП490 в реакции с положительным антигеном составляла 1.2 - 1.4, с отрицательным - 0.02 - 0.05 о.е.

Постановка непрямого метода ИФА для диагностики эшерихиоза

Для отработки условий постановки ИФА опыты проводили по следующей схеме:

в качестве твердофазного носителя использовали 96-луночные полистироловые плашки (Dynatech, США). Для сенсибилизации иммунологических плашек в лунки вносили суспензии клеток Escherichia coli различных сероваров (О2; О8; О78) разведенных до рабочей концентрации, в объеме 0,1 мл. Условия адсорбции антигенов были подобраны в опытах. Не связавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали 3-х кратно ЗФРТ. После термической обработки в течение 15 минут при 65?С (для фиксации антигена) планшеты можно хранить не менее 6 месяцев (срок наблюдения) при 4°С.

для количественного определения антител в испытуемых сыворотках каждую из них титровали методом двукратных разведении в ЗФРТ на эшерихиозном антигене, либо вносили на антиген в одном разведении в тройной повторности и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Стандартно отмывали.

добавляли по 0,1 мл антивидовых пероксидазных конъюгатов в рабочем разведении в ЗФРТ и инкубировали 1 час при комнатной температуре.

после стандартной отмывки в лунки добавляли по 0,1 мл субстратной смеси.

Реакцию останавливали после 15-30 минутной инкубации при комнатной температуре добавлением 0,05 мл 1N Н2SO4. Регистрацию цветной реакции, возникающей в результате взаимодействия фермента с субстратом, проводили инструментально на вертикальном фотометре Micro ELISA Auto Reader MR580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм. Результаты реакции выражали в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывали по формуле, предложенной в документах ВОЗ [122]:

ЕД ИФА=

где ОПХ -- средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом;

ОП0 -- средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой.

За положительную реакцию принимали значения ЕД ИФА не менее 200 плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (ИФА+2у). В нашем случае этот показатель равняется 244.

В дальнейших опытах по исследованию сывороток из хозяйств применяли ИФА с подобранными условиями.

Полиакриламидный гельэлектрофорез (ПААГЭ) с додецил сульфатом натрия (ДСН):

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 0,1 % ДСН, проводили по методу Laemmli U.K. [267] в вертикальной камере SE400 фирмы "Hoefer Scientific Instruments" (США). Концентрирование полос проводили при силе тока 45 мА / 2 стекла, при переходе на разделяющий гель силу тока повышали до 60 мА / 2 стекла. Длительность электрофореза составляла 50-60 мин.

Полученные электрофореграммы фиксировали 20 мин в 20% ТХУ при комнатной температуре, затем окрашивали раствором Кумасси R-250 в течение ночи при комнатной температуре.

Молекулярную массу белков определяли путем сравнения со смесью молекулярных маркеров, подвергнутых гидролизу как и опытные образцы, фирмы "Merck" (мол. массы от 12 до 78 кД). Для определения молекулярных масс белковых полос были определены коэффициенты относительной подвижности Rf.

По значению коэффициента относительной подвижности для стандартных образцов был построен калибровочный график зависимости величины Rf от значений десятичного логарифма молекулярной массы.

Исходя из значений коэффициентов относительной подвижности для исследуемых белков, их молекулярные массы были определены по калибровочным графикам.

Иммуноблот-анализ

Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану после разделения в геле проводили на аппарате "Semi-phor TE-70" в "Товбин буфере" при постоянном токе 100 мА в течение часа. После переноса мембраны промывали в буфере для блота и оставляли в нем на забивку на 20 минут. Затем мембраны погружали в раствор сыворотки в рабочем разведении в том же буфере. Инкубировали с сыворотками ночь при комнатной температуре на мешалке. Отмывали 2-3 раза в блокирующем буфере и погружали в раствор конъюгата в рабочем разведении. Инкубацию с конъюгатом проводили 1.5 ч при комнатной температуре. Стандартно отмывали и погружали мембрану на 10-15 мин. в раствор субстрата (диаминобензидина). Результат реакции учитывали по появлению полос коричневого цвета, соответствующих местоположению разделенных белков. Реакцию останавливали, промывая мембрану дистиллированной водой.

Молекулярные массы окрашенных полос определяли по калибровочным графикам, исходя из значений коэффициентов относительной подвижности, как описано выше.

Результаты исследований обрабатывали статистически по таблицам Фишера и Стьюдента.

3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ изолятов условно-патогенной микрофлоры в птицехозяйствах разного технологического направления.

Эпизоотическое обследование было проведено в 11 птицехозяйствах, в которых содержатся цыплята.

Нами был проведен анализ изолятов условно-патогенной микрофлоры в птицехозяйствах разного технологического направления (хозяйства по производству яиц, племенные, бройлерные). При этом наибольший процент изоляции условно-патогенной микрофлоры приходится на хозяйства по производству яиц - 58% (рисунок 1).

Рисунок 1. Процентное соотношение условно-патогенной микрофлоры в хозяйствах различного технологического направления.

При проведении бактериологических исследований в хозяйствах по производству яиц установили постоянное наличие эшерихий и, в значительно меньшей степени, таких возбудителей как синегнойная палочка, клебсиелла, протей.

В племенных хозяйствах чаще всего обнаруживали кокковую микрофлору, в бройлерных - синегнойную палочку, протей, клебсиеллу.

В целом по всем хозяйствам наибольший вес имели эшерихии - 38.6%. Кокковой микрофлоры было выделено 20.6 %. В значительном количестве мы выделяли Ps. аeruginosa, Salmonella spp., Kl.pneumonia, Pr. vulgaris (рисунок 2).

А - хозяйства по производству яиц

Б - племенные хозяйства.

В - бройлерные хозяйства.

Рисунок 2. Выделение условно-патогенной микрофлоры в птицехозяйствах разного направления

При изучении зависимости выделения условно-патогенной микрофлоры от возраста птицы было установлено, что во всех возрастных группах циркулирует аналогичная микрофлора. Как видно на рисунке 3, из патматериала всех возрастных групп мы выделяли эшерихии: наибольшее количество - 63,4% в 61-150- дневном возрасте, несколько меньше от цыплят 1-30-дневного и 31-60-дневного возраста - 50,8% и 38,1% соответственно. Кокковую микрофлору чаще всего выделяли от цыплят 31-60-дневного возраста - 42,6%. В значительном количестве она была выделена и от цыплят к 30-дневному возрасту - 34%. От птицы старше 150-дневного возраста мы чаще всего выделяли синегнойную палочку и клебсиеллы.

Таким образом, при эпизоотическом обследовании птицехозяйств мы установили, что в этих хозяйствах широко циркулирует условно-патогенная микрофлора, которая вызывает смешаннное течение эшерихиоза.

Рисунок 3. Выделение условно-патогенной микрофлоры в зависимости от возрастных групп.

Примечание:

1 - 1-30-дневные цыплята;

2 - 31-60-дневные цыплята;

3 - 61-150-дневные цыплята.

Микробиологический мониторинг вывода цыплят.

Нами был проведен микробиологический мониторинг 20-ти выводов цыплят в пяти птицеводческих хозяйствах разного технологического направления (племенное, бройлерное, хозяйства по производству яиц). При этом было установлено, что в процессе вывода цыплят идет интенсивное накопление микрофлоры в воздухе выводного инкубатора. Так, общее количество микроорганизмов при выводе 30-40% цыплят в два раза больше, чем в начале вывода; при выводе 60% - в 10 раз, а при выводе 80% - в 12 раз. Такая же закономерность отмечена и в росте отдельных видов микроорганизмов. Так, количество эшерихий к концу вывода увеличивается в 8 раз, а стафилококков в 4 раза.

При идентификации микроорганизмов, изолированных из воздуха выводного инкубатора установлено, что они относятся к Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas aеruginosa, Aspergillus fumigatus, Salmonella spp., Enterobacter aglomerans, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia, Hafnia alvei, Citrobacter oiversus (таблица 1).

Таблица 1. Сравнительный анализ состава микрофлоры, выделенной из воздуха выводного инкубатора, от трупов цыплят первых дней жизни и птицеводческих объектов

Из таблицы 1 видно, что из воздуха выводного инкубатора выделяется широкий спектр микрофлоры. Поскольку вся микрофлора в воздухе выводного шкафа инкубатора выделяется при вылуплении цыпленка и, циркулируя в воздухе, попадает опять к нему аэрогенным путем, можно предположить, что в организме цыплят присутствует широкий спектр микроорганизмов. С этой целью мы провели бактериологическое исследование 495 трупов цыплят в возрасте 1-60 дней и установили наличие идентичных микроорганизмов.

Для бактериологических исследований отбирали трупы с наиболее характерными патологоанатомическими изменениями для бактериальных инфекций - катарально-геморрагический энтерит, фибринозный перикардит, перигепатит, аэросаккулит, пневмонии, серозно-геморрагическое воспаление в области крыльев и суставов конечностей. Кроме того, нами были проведены исследования относительно изучения спектра микрофлоры птичников, где содержались цыплята. Было установлено, что микроорганизмы, выделенные из воздуха выводных инкубаторов, трупов цыплят, объектов внешней среды в большинстве случаев идентичны.

Культурально-морфологические и биохимические свойства выделенных культур возбудителей. При дифференциальной диагностике были выделены условно-патогенные микроорганизмы из различных объектов птицехозяйств (таблица 2).

Таблица 2

Микрофлора, выделенная в хозяйствах из различных объектов

Выделенные культуры эшерихий представлены грамотрицательными палочками с округленными концами. Отдельные серовары бактерий имели коккоподобную форму, были расположены отдельно или попарно. Большая часть культур была подвижная (93,4%). На МПБ выделенные изоляты давали равномерное помутнение с образованием белого осадка, который легко разбивался при встряхивании. Ряд культур образовывали на поверхности МПБ пленку (25,62%). На МПА культуры формировали рост в виде округлых, серовато-белых колоний с гладкой блестящей поверхностью. На среде Эндо большинство изолятов образовывали ярко-красные с металлическим блеском колонии (72,76%).

В биохимическом отношении выделенные культуры были достаточно активные, сбраживали с образованием кислоты и газа или лишь кислоты, сахара и многоатомные спирты; 76,3% изолированных эшерихий обладали типичными биохимическими свойствами; 23,7% были атипичными, имели отклонение по одному или двум признакам (таблица 3).

Сальмонеллы имели вид мелких, с округленными концами грамотрицательных палочек, которые в 57,9% случаев были очень подвижные. В большинстве они давали типичный рост на среде Эндо в виде округлых, бесцветных или полупрозрачных колоний (89,9%). На висмут-сульфитном агаре они образовывали черные или коричневые колонии с характерным металлическим блеском, а на МПБ - вызывали диффузное помутнение среды. На МПА - колонии сальмонелл, диаметром 2 - 4 мм, а в 57,9% случаев - очень мелкие колонии до 1 мм.

Род Citrobacter представляли мелкие, грамотрицательные палочки, подвижные и только в 1,9% случаев были неподвижные. На МПБ регистрировали диффузный рост, а на МПА - бесцветные, в отдельных случаях серовато-белые колонии разного размера. На среде Эндо 49,5% случаев выделяли лактозопозитивные колонии, окрашенные в розовый цвет и в 50,5% случаев - лактозонегативные, образовывающие бесцветные колонии. На висмут-сульфитном агаре наблюдался обильний рост колоний светло-зеленого или коричневого цвета с характерным неприятным запахом.

Микроорганизмы рода Klebsiella представляли собой палочки неровной овальной формы, грамотрицательные, неподвижные. На МПБ формировали рост с образованием гомогенного помутнения; на МПА пышный рост, большие, влажные колонии (слизистые, выпуклые, блестящие). На среде Эндо лактозопозитивная клебсиелла образовывала черно-красные колонии с металлическим оттенком; лактозонегативные напоминали рост сальмонелл. С целью дифференциации делали высевы на среду Симмонса, где клебсиеллы образовывали куполообразные блестящие колонии.

Род Enterobacter был представлен грамотрицательными подвижными палочками, на МПБ они вызывали диффузное помутнение, на МПА - серовато-белого цвета колонии, слизистого характера. На среде Эндо они росли в виде малиновых колоний, напоминая эшерихии, а на среде Плоскирева - бесцветные колонии с желтоватым оттенком.

С целью выделения протея делали высевы на среде Плоскирева: изолированные микроорганизмы росли в виде больших, полупрозрачных колоний, обладающих характерным запахом. На висмут-сульфитном агаре - колонии черно-коричневого цвета.

Кокковая микрофлора была представлена грамположительными кокками. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки росли в виде мелких, росинчатых колоний, окруженных зоной гемолиза. Стафилококки образовывали круглые, выпуклые, блестящие колонии лимонно-желтого цвета. На МПБ Streptococcus haemolyticus давал придонный рост, который при встряхивании разбивался на хлопья. Staphylococcus aureus при росте на МПБ образовывал слизистый осадок, который при встряхивании поднимался в виде косички.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 3. Биохимическая идентификация энтеробактерий

Условные обозначения: + -положительный результат в первые сутки; - -отрицательный результат в первые сутки; (+) -замедленная реакция (позже суток); +- -положительный результат у большинства штаммов; -+ -отрицательный результат у большинства штаммов; х -вариабельный результат. -(+) -отрицательный результат у большинства штаммов, у остальных замедленная реакция

Str. haemolyticus давал характерный рост на среде с 40% желчью и вызывал редукцию метиленового синего. St. aureus дифференцировали от Str. haemolyticus посредством каталазной пробы и роста на МПБ, содержащего 10% хлорид натрия. Str. haemolyticus на данной среде роста не образовывал, в то время как St. aureus вызывал помутнение среды с образованием слизистого осадка.

Aspergillus fumigatus высевали на среды Чапека и Сабуро, на которых регистрировали бархатистые, шершавые, белого цвета колонии. На третьи сутки они изменяли белый цвет на зеленый, а затем на черный. При микроскопии находили септичный мицелий, короткие, гладкие кондиеносы.

Hafnia alvei представляла собой прямые грамотрицательные палочки. На МПА образовывали гладкие, влажные, прозрачные серые колонии. Оксидазонегативные. Изолированные культуры ферментировали глюкозу, арабинозу, мальтозу, маннит, рамнозу, не всегда ферментировали лактозу и сахарозу, не ферментировали дульцит, рафинозу, сорбит, адонит и инозит. Hafnia alvei не образовывали сероводород, индол и уразу. Давали позитивный тест с метиловым красным при 35С и негативный при 22С.

Серологическую типизацию изолированных культур проводили с набором типичных агглютинирующих О-поли- и моновалентных колисывороток посредством РА. Так, установили, что изолированные из патматериалов эшерихии были отнесены к сероварам: О1, О2, О4, О78. При исследовании культур, изолированных из воздушной среды, кроме вышеназванных, выделили серовар О103, тогда как в пробах из выводных шкафов серовар О103 отсутствовал.

Сальмонеллы, выделенные из патматериалов, отнесли к виду S. pullorum-gallinarum; аналогичные культуры регистрировались как в пробах из воздушной среды птицеводческих помещений, так и в смывах из выводных инкубаторов. Наряду с S.pullorum-gallinarum изолировали также S.typhimurium, S.enteritidis как в смывах из выводных инкубаторов, так и из трупов птицы.

Изоляцию Pseudomonas aeruginosa проводили на простых питательных средах. При окрашивании по Граму установили, что это грамотрицательная палочка, монотрих. Изолированная синегнойная палочка спор не образовывала. Выделяла пигмент пиацианин, разжижала желатин, а также разлагала с образованием кислоты без газа глюкозу и галактозу. При серотипизации с О- и Н-антигенами была отнесена к серовару О2.

Всего при проведении бактериологических исследований было изолировано 1600 культур энтеробактерий. Из них наибольшее количество культур идентифицировали как вид E.coli (34%).

Изучение патогенных свойств выделенных культур.

При сравнительном изучении патогенных свойств культур микроорганизмов, изолированных из патматериалов, воздушной среды птицеводческих объектов и смывов с поверхности воздушных шкафов, получены, главным образом, одинаковые результаты по микробиологическому составу. При заражении 30-дневных цыплят, отмечали неодинаковую длительность инкубационного периода заболевания, что зависело от вида возбудителя и его патогенности.

Самый короткий инкубационный период (15-18 часов), установлен при заражении цыплят культурами эшерихий (серовары О2, О4, О78), а также S. typhimurium. Больные цыплята были вялые, отказывались от корма, дыхание затрудненное, учащенное. Инфицированные цыплята погибали через 24 часа после заражения, а отход составлял 96-100%. Высокий процент гибели цыплят (80-96%) вызывали также культуры S. pullorum-gallinarum, St. aureus.

Падёж цыплят при введении эшерихий (серовары: О8, О103), а также Str.haemolyticus, Ps. aeruginosa составила 68-93%. Рри изучении энтеротоксигенных свойств установили, что культуры сероваров О4 и О78 имели выраженную энтеротоксигенность.

При вскрытии трупов и забитых в конце опыта цыплят находили патологоанатомические изменения, характерные для возбудителя эшерихиоза: выраженное наполнение кровеносных сосудов в мышцах сердца, точечные кровоизлияния на печени, фибринозный аэросаккулит, перикардит, эпикардит, перигепатит и пневмонию, желточные мешки увеличены, наполнены серой желтковой массой; катаральное воспаление слизистой оболочки кишечного тракта; наличие мелких кровоизлияний под серозными покровами.

В наших опытах куриные эмбрионы оказались более чувствительными к патогенным культурам эшерихий, чем цыплята. У погибших эмбрионов, зараженных эшерихиями, отмечали вираженные отеки, кровоизлияние в аллантоисные оболочки, выраженную инъекцию сосудов желточного мешка, кровоизлияние в области головы. При заражении сальмонеллами выявляли изменения в желтке (зеленый цвет, плотная консистенция, выраженное инъецирование сетки кровеносных сосудов и др.). В куриных эмбрионах, погибших от аспергилеза, наблюдали в виде пленки колонии гриба в воздушной камере; плод - мацерирован, с большим множеством очагов некроза. В случае гибели эмбрионов от кокковой микрофлоры - регистрировали воспаление желточного мешка, кровоизлияния на сердце и печени, а также утолщение суставов.

При инфицировании куриных эмбрионов культурами E.coli (серовары О8, О4, О78), S.typhimurium - отмечали 100%-ю их летальность. При заражении эшерихиями (серовар О2), а также S. pullorum-gallinarum, St. aureus, Ps. aeruginosa - летальный исход составлял 80-94%; 72-93% куриных эмбрионов погибали в результате инфицирования Str. haemolyticus, Asp. fumigatus, E.coli (серовар О103) (таблицы 4-6).

Следует отметить, что белые мыши были более чувствительными к заражению культурой E.coli, чем цыплята и развивающиеся куриные эмбрионы.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 4 Ратогенные свойства культур, выделенных из патматериала погибших эмбрионов. (n=3)

Рримечание: в опытах использовались цыплята 30-дневного возраста; белые мыши, массой 14 - 16г; развивающиеся куриные эмбрионы 10 - 11-дневного возраста.

Таблица 5 Ратогенные свойства культур, выделенных из смывов с поверхности инкубаторов. (n=3)

Рримечание: в опытах использовались цыплята 30-дневного возраста; белые мыши, массой 14 - 16г; развивающиеся куриные эмбрионы 10 - 11-дневного возраста

Таблица 6 Ратогенные свойства культур, выделенных из воздушной среды птичников. (n=3)

Рримечание: в опытах использовались цыплята 30-дневного возраста; белые мыши, массой 14 - 16г; развивающиеся куриные эмбрионы 10 - 11-дневного возраста

Размещено на http://www.allbest.ru/

При инфицировании белых мышей эшерихиями (серовары О8, О4, О78) была зарегистрирована 100%-ная гибель.

При инокуляции культур Asp.fumigatus, Str. haemolyticus, E.coli (серовары О2, О103); Ps. аeruginosa - отход белых мышей составлял 84-100%. При этом у них наблюдалась общая слабость, нарушения координации движений, тремор головы и конечностей.

Культуральные, морфологические и серологические свойства культур, выделенных от погибших и вынужденно убитых цыплят, белых мышей и куриных эмбрионов, позволили установить их идентичность с исходными культурами возбудителей, отобранными для экспериментального заражения. При анализе изолятов мы установили, что патогенность зависит от видовой и серологической принадлежности культур. Результаты представлены в таблицах 4 - 6.

В наших опытах патогенными были не только изоляты, выделенные от погибшей и больной птицы, но также изолированные из воздушной среды птицеводческих объектов (инкубатор, акклиматизаторы, птичники) и из смывов инкубаторов. В соответствии с полученными результатами можно сделать вывод, что инкубаторы являются резервуарами инфекций в птицеводческих хозяйствах, а воздушная среда птичников и инкубатора содействует аэрогенному инфицированию птицы и осеменению скорлупы инкубационных яиц. В хозяйстве возникает замкнутая эпизоотическая цепь, где циркулируют одинаковые серовары патогенных микроорганизмов и при снижении резистентности возникают вспышки инфекционных заболеваний.

Определение антибиотико-резистентности патогенных для птицы микроорганизмов.

При изучении антибиотико-резистентности изолированных нами эпизоотических. культур Ps. aeruginosa, E. coli, Kl.pneumonia отмечена их различная устойчивость к разным антибиотикам: мономицину, неомицину, стрептомицину, пенициллину, эритромицину, олеандомицину, тетрациклину, полимиксину-М, хлорамфениколу, стрептомицину, левомицетину, байтрилу. На pисунке 4 показана их чувствительность к перечисленным антибиотикам.