Анализ полиморфизмов генов антиоксидантноцй системы человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Полиморфизмы

ДНК-полиморфизмы - это вариабельные участки в последовательности ДНК, которые встречаются в популяции с частотой не менее 1%, и в подавляющем большинстве случаев обладают нейтральным эффектом.

Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило, заключаются в незначительных вариациях его "генетического" кода. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома, что приводит к изменению свойств гена (иногда в лучшую, а чаще, в худшую сторону). Некоторые изменения неизбежно являются причиной генных болезней и проявляются уже с рождения (например, муковисцидоз, мышечная дистрофия и др.), это - так называемые моногенные болезни, другие не приводят к болезням, но являются фактором предрасположенности к определенным заболеваниям (злокачественные опухоли, сердечно-сосудистые, аллергические и др. заболевания).

Функциональная значимость полиморфизмов связана с теми, что они расположены экзонах, генах микроРНК и некоторых интронах, содержащих в себе гены микроРНК) и регуляторных (промоторы, энхансеры, инсуляторы) регионах ДНК. Именно эти, наименее представленные типы полиморфизмов, являются предметом ассоциативных исследований.

Часто,когда говорят о полиморфизмах,имеют в виду SNPs. В принципе, возможно существование двух/би-, трёх- и четырёхаллельных полиморфизмов. Однако на практике чрезвычайно редки даже трёхаллельные SNP (менее 0.1% всех SNP человека (Lai 2001)). Биаллельные SNP могут быть четырёх различных типов: один вид транзиций C<=>T (<=>A) и три типа трансверсий: C<=>A (G<=>T), C<=>G (G<=>C) и T<=>A (A<=>T).

К полиморфизмам также относятся инсерции/делеции нескольких пар нуклеотидов, сегментальные дупликации и повторы.

полиморфизм генетический фермент детекция

Методы детекции полиморфизмов

Практический интерес к SNPs сильно возрос в ходе реализации проектов по определению полных нуклеотидных последовательностей ряда модельных организмов. В самом определении SNPs заложена ориентация на их использование в качестве генетических маркеров (ограничение по частоте встречаемости противопоставляет их редким мутациям).

Успешное развитие различных проектов привело к тому, что в 2000х в общедоступных базах данных имеется >1,8 миллиона SNPs (Database of Single Nucleotide Polymorphisms, release Sep 12 2001; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Компания Celera Genomics объявила о наличии в её базе данных более 3,5 миллионов вероятных SNP.

В настоящее время эффективное использование SNP генотипирования зависит от разработки дешёвых и эффективных способов детекции. Высокая потребность в надёжной методике приводит к тому, что множество лабораторий и фирм разрабатывают и предлагают свои собственные системы. Ключевыми параметрами эффективного скрининга являются цена (<0,2$ на SNP в 2001); частота ошибок (должна быть <1%) и производительность (по крайней мере 50,000 в день).

Существующие подходы к детекции аллельных вариантов можно условно разделить на несколько групп. Разделение условно прежде всего потому, что в большинстве случаев используются сочетания различных методов (например, все физические методы используют и ферментативные реакции).

Поиск новых SNPs включает два этапа: идентификация изменения первичной структуры ДНК и анализ частоты встречаемости этого изменения в исследуемой популяции. Выбор оптимального подхода для каждого этапа зависит от конкретной задачи. Некоторые методики, разработанные для скрининга уже локализованных полиморфных участков не подходят для поиска и характеристики еще неизвестных и наоборот .

Различные подходы к идентификации генетических изменений

Ферментативные подходы:

полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP);

полиморфизм длин аплифицированных фрагментов (AFLP);

расщепление Clevase I (CFLP);

расщепление резольвазой (EMD);

анализы, основанные на лигазной реакции (LDR, LCR, Padlock);

инвазивное расщепление олигонуклеотидов (Invader);

случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR);

ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR);

аллель-специфический ПЦР (AS-PCR).

Химические методы:

химическое расщепление гетеродуплексов;

химическое лигирование.

Методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК:

анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP);

гетеродуплексный анализ;

секвенирование ДНК.

Детекция на твёрдой фазе:

гибридизация на олигонуклеотидных матрицах;

оптиковолоконный ДНК гибридизационный анализ;

элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенс);

пиросиквенс.

Хроматографические методы:

денатурирующая HPLC.

Физические методы:

масс-спектрометрия;

резонансное тушение флуоресценции (FRET);

люминесценция зависящая от локального окружения.

Анализ in silico:

сравнение имеющихся в базах данных геномных и EST последовательностей.

Анализ известных аллелей

RFLP; (анализ длин рестрикционных фрагментов)

химическое лигирование;

AS-PCR; аллель-специфический ПЦР

Invader; инвазивное расщепление олигонуклеотидов

LDR, LCR; анализы, основанные на лигазной реакции

FRET; резонансное тушение флуоресценции

микроматрицы (потеря сигнала);

минисеквенирование;

пиросиквенс.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, Restriction fragment length polymorphism, RFLP) -- это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза).

При использовании данного исследования получаются различные результаты от различных образцов, и при помощи ПДРФ можно идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения. Анализ разнообразия ПДРФ является важным инструментом в картировании генома, локализации генов, ответственных за генетические заболевания, определения риска заболевания, получения генетических отпечатков и определения родства.

Наличие сайтов рестрикции в геномной ДНК и их взаимное расположение однозначно определяются последовательностью нуклеотидов исследуемой ДНК, поскольку сам сайт рестрикции - не что иное, как строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая и расщепляемая рестриктазами. Следовательно, любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт. Полное расщепление анализируемой геномной ДНК отдельными рестриктазами приводит к образованию определенного набора фрагментов ДНК, число и размеры которых соответствуют расположению сайтов рестрикции. Гибридизация по Саузерну позволяет определять размеры и взаимное расположение рестрикционных фрагментов ДНК после их электрофоретического разделения.Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. При наличии мутации в одном из сайтов рестрикции этот сайт остается нерасщепленным после завершения рестрикции, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделяемых мутантным сайтом, и образованию фрагмента ДНК большего размера. В результате длина рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих мутантные сайты, становится полиморфной, что выявляется при сравнении ДНК из разных источников методом ПДРФ.

Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну.

При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции.

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутсвии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайгу pecтрикции образуются два фрагмента меньшей длины. У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента, один из которых по длине будет соответствовать размеру амплификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использования для анализа блот-гибридизации по Саузерну, трем возможным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.

Супероксиддисмутаза

Супероксиддисмутаза (супероксид'супероксид-оксидоредуктаза, superoxide dismutase, КФ 1.15.1.1) представлена семейством металлоферментов, катализирующих реакцию дисмутации супероксидных радикалов.

Стадии реакции дисмутации, катализируемой СОД, следующие:

M(n+1)+ ? СОД + O2? > Mn+ ? СОД + O2

Металл восстанавливается

Mn+ ? СОД + O2? + 2H+ > M(n+1)+ ? СОД + H2O2.

где M (переходный металл) = Cu (n=1) ; Mn (n=2) ; Fe (n=2) ; Ni (n=2).

В данной реакции окислительное состояние катиона металла осцилирует между n и n+1.

SOD1, СОД1 (Cu/Zn-супероксиддисмутаза цитоплазматическая)

Cu,Zn-СОД представляет собой гомодимер с молек. массой 32 кДа.

Наивысшая активность Cu, Zn- и Mn-СОД обнаружена в печени. Высокой активностью Cu, Zn-СОД отличаются эритроциты, что позволяет использовать кровь как источник для выделения и очистки фермента.

(см. табличка)

Сод1 кодируется геном SOD1/

Преобладающим является аутосомно-доминантный характер наследования мутаций (Haberlandt ea 1961 , Husquinet ea 1980 ), хотя были выявлены семьи с рецессивным и Х-сцепленным наследованием ( Wilkins ea 1977 ).

Полиморфизмы выявлены миссенс мутации:

A4V (аланин в 4 кодоне на валин)

H46R (гистидин в 46 кодоне на аргинин)

G93A (глицин 93 аланин)

G12R (глицин на агргинин)

D90A

В основном все мутации являются редкими. Исключение составляет мутация с заменой в 90 положении аспарагина на аланин, которая является наиболее распространенной и впервые была обнаружена в Швеции и Финляндии (Andersen ea 1995 )

Мутация D90А является необычной мутацией. Во-первых, установлено, что специфическая активность мутантных молекул фермента не изменяется. Во-вторых, было показано, что мутация D90А имеет различные паттерны наследования в различных этнических группах. В Скандинавии, центральной Германии, южной Франции и южной Италии мутация D90А наследуется по аутосомно-рецессивному типу, в то время как в Бельгии, центральной Франции и Великобритании преобладает аутосомно-доминантный характер наследования ( Andersen ea 2000

Е.Гетцофф с соавт. в 1992 г. получили мутантную Cu,Zn-СОД человека с заменой в канале активного центра Glu-132 и Glu-133 на Gln-остатки. Нейтрализация отрицательных зарядов Glu приводит к существенному увеличению скорости реакции дисмутации, по-видимому, за счет снижения электростатического барьера и увеличения скорости диффузии О - к активному центру.

Не найден полиморфизм, удобный для ассоциативного анализа.

Ген SOD2

В кодирующем участке гена SOD2 обнаружен однонуклеотидный полиморфизм (остатки Т или С), которому соответствует аминокислотный полиморфизм (остатки аминокислот Ala или Val) в положении 9 сигнального пептида 122].

Установлено, что аллель содержащая аланиновую последовательность, ассоциирована с повышенным фактором риска развития БДН (Landeghem ea 1999). Данный полиморфизм интересен еще и тем, что скорее всего оказывает влияние на клеточную локализацию фермента, а не на его активность. Он приводит к изменению вторичной структуры, разрывая альфа-спираль, целостность которой важна для транспорта фермента из цитоплазмы в митохондриальный матрикс ( Rosenblum ea 1996, Shimoda-Matsubayashi ea 1996 ).

Ген SOD3.

Cодержит однонуклеотидный полиморфизм C637G, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Arg213Gly. Последняя мутация приводит к аминокислотной замене аргинина на глицин в кодоне 213, вызывает диссоциацию фермента с сосудистой стенки, в результате чего его концентрация в плазме крови возрастает более чем в 10 раз, что является одной из основных причин развития окислительного стресса, сопровождающегося поражением широкого спектра сосудов у больных.(Сакашита и соавт. 1998)

Глутатионпероксидаза

Глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9) - гомотетрамерный селенопротеин, имеет молекулярную массу около 74 кДа, состоит из 4 идентичных субъединиц, в состав активного центра входит селен, который содержится в виде Se-цистеина. Селен необходим для синтеза глутатионпероксидазы..

Данный фермент катализирует реакции, в которых фермент восстанавливает пероксид водорода до воды, а также восстановление органических гидропероксидов (ROOH) до гидроксипроизводных, и в результате переходит в окисленную дисульфидную форму GS-SG :

2GSH + H2O2 = GS-SG + H2O

2GSH + ROOH = GS-SG + ROH +H2O

Фермент локализирован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. В тканях млекопитающих максимальная активность глутатионпероксидазы в печени, эритроцитах, надпочечниках. Активность фермента зависит от количества образованных пероксидов.

Существует несколько изоферментов, которые кодируются разными генами. Изоферменты отличаются по локализации в клетке и субстратной специфичности. Глутатионпероксидаза 1 (GPx1) является наиболее распространенной формой фермента, и обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих, субстратом является пероксид водорода. Глутатионпероксидаза 4 (GPx4) имеет большое значение в метаболизме пероксдов липидов; GPx4 также экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих на более низких уровнях. Глутатионпероксидаза 2 (GPx2) экспрессируется в кишечнике и является внеклеточным ферментом, GPx3 также является внеклеточным ферментом и в основном встречается в плазме.У человека были идентифицированы восемь изоформ глутатионпероксидазы.

Ген глутатионпероксидазы локализован в 3-й хромосоме.

У носителей полиморфизм 599 C / T GPx-1 гена, активность глутатионпероксидазы в эритроцитах была ниже на 17% , чем в дикой гомозиготной аллели, в то время как содержание липопероксидов в ЛПНП было выше на 74%.

Каталаза

Каталаза - фермент класса оксиредуктаз. Хромопротеид , состоит из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой 62000. Катализирует разложение H2O2 до воды и кислорода.

Она широко распространена в тканях (особенно много ее в печени). В гепатоцитах ожидаемо высокий уровень активности наблюдается в пероксисомах, хотя СТ активен также в микросомах и в цитозоле. Ген каталазы находится в 11 хромосоме.

Было обнаружено, что -262C> T полиморфизм в промоторной области гена каталазы связан с изменением уровня каталазы. В исследовании лейкоцитов (Комина и соавт, 2012) активность каталазы измеряли после H2O2-индуцированного окислительного стресса. C / T и T / T генотипы были связаны со снижением уровня каталазы в отличие от C / C доноров, которые повышали активность каталазы в присутствии 0,4 и 0,7 мм H2O2. Зависимый от генотипа ответ каталазы на окислительный стресс мог бы быть связан со склонностью мутантных аллелей каталазы к нарушениям, установленным окислительным стрессом.

В этом гене недавно обнаружена "молчащая" мутация (замена цитозина (С) на тимидин (Т) в нуклеотиде 1167), не приводящая к изменению белковой последовательности.

Размещено на www.allbest.ru