Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МкАт в иммунологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АО «Медицинский Университет Астана»

Реферат

Тема: Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МкАт в иммунологии

Астана-2012

План

Введение

1. Общие сведения

2. История открытия

3. Гибридомная технология получения моноклональных антител

4. Области применения моноклональных антител

Заключение

Список использованной литературы

Введение

Моноклональные антитела (МкАт) являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью изучили структуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые компоненты клеток и тканей. Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в раличных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых МкАт. МкАт позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время - увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера. Поэтому создание МкАт для систем иммуноанализа было и остается актуальной задачей.

Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определяет результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных клеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании гибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры. Это приводило к сужению спектра эпитопов, распознаваемых полученными МкАт. Представлялось целесообразным в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые МкАт по эпитопной специфичности могли дополнять ранее созданные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств МкАт остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии.

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.

биологический иммунология моноклональный антитело

1. Общие сведения

Моноклональные антитела -- антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки.

Моноклональные антитела связывают различные белки, которые влияют на активность клеток, такие как рецепторы или другие белки, представленные на поверхности нормальных и раковых клеток. Специфичность моноклональных антител позволяет им связывать раковые клетки и, взаимодействуя с цитотоксическими агентами, такими как сильная радиоактивы, разрушают раковые клетки, не повреждая здоровые.

Раковые клетки, которые способны реплицироваться бесконечно, сливаются с клетками млекопитающих, которые продуцируют специфические антитела, что приводит к образованию гибридом, постоянно продуцирующих антитела. Эти антитела называют моноклональными, которые происходят из одного типа клеток, т.е. из клеток-гибридов. Антитела, получаемые с помощью традиционных методов, получают из клеток различного типа и называют поликлональными.

Присутствие большого количества специфических моноклональных антител в крови говорит о присутствии в организме аномального белка. Как правило, этот белок может быть обнаружен в процессе клинического обследования и идентифицирован с помощью скринингового анализа крови, например, с помощью белкового электрофореза. Источником аномального производства моноклональных антител является популяция плазматических клеток в костном мозге.

Анти-вирусные (9 продуктов): ANT-143 (анти-денге тип 2), ANT-150 (вирус гепатита В), ANT-156 (вирус гепатита С NS3), ANT-158 (вирус гепатита D), ANT-152 (HIV-1 p24), ANT-159 (HIV-1 gp41), ANT-151 (HIV-1 gp120), ANT-153 (HIV-2 gp39), ANT-178 (нуклеокапсидный белок SARS), ANT-179 (SARS Spike)

Анти-мышиные лимфоциты (9 продуктов): ANT-175 (CD3), ANT-165 (CD4), ANT-136 (CD11b-FITC), ANT-135 (CD11a), ANT-133, ANT-142 (CD90 Thy-1), ANT-140 (CD90 Thy-1.1), ANT-141 (CD90 Thy-1.2), ANT-139 (B220)

Анти-мышиные цитокины (8 продуктов): ANT-116 (CTLA-4), ANT-105 (интерлейкин-2), ANT-103 (рецептор интерлейкина-2), ANT-108 (интерлейкин-4), ANT-113 (интерлейкин-10), ANT-114 (интерлейкин-12p40), ANT-209 (интерлейкин-12p75), ANT-166 (IFN-гамма)

Анти-человеческие лимфоциты (12 продуктов): ANT-206 (CD1A), ANT-207 (CD2), ANT-144 (CD3), ANT-137 (CD3-FITC), ANT-138 (CD3-биотинилированный), ANT-145 (CD4), ANT-132 (CD4-FITC), ANT-167(CD4-биотинилированный), ANT-171 (CD5), ANT-148 (CD8), ANT-131 (CD8-FITC), ANT-134 (CD8-биотинилированный)

Анти-человеческие хемокины (9 продуктов): ANT-126 (эотаксин-1), ANT-127 (эотаксин-2), ANT-119 (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор), ANT-120 (хемотоксический фактор-3 макрофагов-моноцитов), ANT-118 (воспалительный белок макрофагов-1a), ANT-121 (воспалительный белок макрофагов-3), ANT-212 (белок воспаления макрофагов-3), ANT-212 (b)(белок воспаления макрофагов-3 бета), ANT-170 (фактор активации нейтрофилов)

Анти-человеческие цитокины (28 продуктов): ANT-128 (нейротропный фактор головного мозга), ANT-183 (белок морфогенеза костей-2), ANT-169 (эпидермальный фактор роста), ANT-187 (эритропоэтин), ANT-196 (эритропоэтин клон NYRhEPO), ANT-204 (анти-FAS-антитело), ANT-205 (FAS-активирующее антитело), ANT-197 (гормон роста), ANT-129 (КОЕ макрофагов-гранулоцитов), ANT-184 (КОЕ гранулоцитов), ANT-122 (нейтрализатор интерферона-альфа), ANT-208, ANT-185 (интерферон-бета), ANT-123 (интерферон-гамма), ANT-102 (интерлейкин-2), ANT-104 (рецептор интерлейкина-2), ANT-106 (интерлейкин-3), ANT-107 (интерлейкин-4), ANT-109 (интерлейкин-6), ANT-110 (интерлейкин-7), ANT-111 (интерлейкин-8), ANT-112 (интерлейкин-10), ANT-115 (интерлейкин-15), ANT-172 (лептин), ANT-117 (нейротрофин-4), ANT-124 (фактор некроза опухолей-альфа), ANT-168 (трансфоримрующий фактор роста-бета), ANT-125 (фактор роста ЭПР)

2. История открытия

Ещё в начале 20-го века Пауль Эрлих постулировал, что если бы мог быть выработан компонент, способный селективно связывать организм, вызывающий заболевание, то вместе с этим компонентом к патогенному организму мог бы быть доставлен токсин.

В 1970-е годы уже были известны опухолевые B-лимфоциты (клетки миеломы), которые синтезировали один и тот же тип антител (парапротеин). Эти клеточные культуры использовались для изучения строения молекулы антитела, но не было методики, позволявшей продуцировать идентичное антитело к заданному антигену.

Процесс получения моноклональных антител был изобретён Жоржем Кёлером и Сезаром Мильштейном в 1975 годах. За это изобретение в 1984 году они получили Нобелевскую премию по физиологии. Идея состояла в том, чтобы взять линию миеломных клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела и слить такую клетку с нормальным B-лимфоцитом, синтезирующим антитела, с тем, чтобы после слияния отобрать образовавшиеся гибридные клетки, синтезирующие нужное антитело. Эта идея была успешно реализована и уже к началу 1980-х годов началось коммерческое получение различных гибридом и очистка антител против заданных антигенов.

Однако, так как лимфоциты были мышиные и синтезировали мышиный иммуноглобулин, введение таких моноклональных антител человеку вызывало иммунную реакцию отторжения. В 1988 Грег Винтер разработал специальную методику «очеловечивания» моноклональных антител, что в основном снимало проблему иммунного ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагностическими целями. Антитела, в которых некоторая часть часть белков заменялась белковыми компонентами человека получили название химерных антител.

3. Гибридомная технология получения моноклональных антител

При введении антигена в организм возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся даже внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. Однако иногда требуется определённый вид антител, специфичных лишь к одной детерминанте антигена и имеющих одни и те же характеристики.

Моноклональные антитела - это антитела строго определённой специфичности, продукт одного клона. Моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам. В природе почти никогда не наблюдается истинный моноклональный ответ.

Для получения гибридов наиболее подходящими оказались клетки плазмоциты, опухоли, происходящей из плазматических клеток. Эти клетки по своей дифференцировке наиболее соответствовали антителообразующим клеткам, так как сохраняли способность к синтезу иммуноглобулинов. С использованием специальных приемов были получены мутантные плазмоцитомные клетки, не способныесинтезировать нуклеиновые кислоты по резервному пути из гипоксантина и тимидина.

Для получения АОК животных (мышей или крыс) активно иммунизировали определенным антигеном. Когда продукция антител достигала высокого уровня, из селезенки и лимфоузлов животных (мест скопления АОК) готовили суспензию клеток.

Затем вызывали слияние АОК с клетками плазмоцитомы, применяя для этой цели полиэтиленгликоль (ПЭГ) - полиэлектролит, способствующий слиянию клеточных мембран. Гибридома сохраняла способность к клеточному делению, в процессе которого хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали одно общее ядро, содержащее гены иммуноглобулинов обеих клеток - предшественников.

Для того чтобы отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые, авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей ГАТ-среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин является высокотоксичным агентом, блокирующим синтез пуриновых оснований, необходимых для дальнейшего синтеза нуклеиновых кислот. Это приводит к гибели опухолевых клеток, имеющих метаболический дефект, не позволяющий использовать резервный путь синтеза пуриновых оснований. АОК способны расти в ГАТ-среде, но будучи смертными погибают естественным путем через 1-2 недели. Гибридомы же сохраняют жизнеспособность, поскольку сочетают свойства «бессмертной» опухолевой клетки и АОК, использующих обходной метаболический путь синтеза пуринов.

Выжившие в ГАТ-среде гибридомные клетки рассеивают в пластиковые планшеты на 96 лунок ёмкостью 0,2 см3 (в каждую по 10 гибридом), через несколько дней содержимое лунок проверяют на наличие антител нужной специфичности (т. е. моноклональных). Клетки из лунок, содержащих таковые, клонировали, рассеивая по 1 клетке в лунку. Эта клетка-предшественник дает начало формированию «бессмертного» клона, продуцирующего моноклональные антитела. Процедура повторяется до 2 раз.

Полученные клоны гибридомных клеток можно хранить длительное время при -70 єС, как угодно долго культивировать на питательных средах, накапливая антитела, перевивать от одного подопытного животного другому. Секретируемые этими клетками антитела не содержат посторонних антител, физико-химически однородны и могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Следует отметить альтруизм создателей гибридомной технологии. В интересах развития науки Г. Келер и Ц. Мильштейн отказались от патентования своего метода, более того предоставили клеточную линию плазмоцитомы для исследования во все ведущие исследовательские лаборатории в мире.

В настоящее время гибридомная технология лежит в основе получения абзимов, о чем говорилось выше. Моноклональные антитела в силу своей высочайшей специфичности, стандартности и технологичности широко применяются как диагностикумы для определения широкого спектра биологически активных веществ: белков, гормонов, медиаторов воспаления, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов.

Моноклональные антитела широко используются в онкологии, с их помощью доставляются радиоактивные метки в опухоли и их метастазы, что позволяет по локализации радиоактивности обнаружить даже небольшие скопления опухолевых клеток. Сейчас во всем мире активно ведутся исследования по применению моноклональных антител как переносчиков токсических веществ в места локализации опухолей.

4. Области применения моноклональных антител

Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»). Перспективным лекарственным средством на основе моноклональных антител является Ипилимумаб или иначе Ервой, использующийся для лечения меланомы.

Важное достижение медицины последних лет -- разработка и клиническое использование биологических препаратов, созданных на основе моноклональных антител.

Первые моноклональные антитела использовали в основном с диагностической целью. Именно с помощью моноклональных антител к поверхностным молекулам определяют субпопуляционный состав лимфоцитов, проводят иммуногистохимические исследования для диагностики онкологических и аутоиммунных заболеваний при работе с материалами биопсии.

С помощью цитолитических моноклональных антител проводят сортировку клеток для выделения нужной популяции (например, выделение стволовых кроветворных клеток для трансплантаций). Возможно создание моноклональных антител к антигенам вирусов, бактерий и других патогенов для лечения инфекционных заболеваний.

Области применения моноклональных антител:

* с диагностической целью: определение экспрессии различных молекул;

* блокада рецепторов;

* инактивация и лизис клеток (лечение онкологических и аутоиммунных заболеваний).

Сначала были созданы гетероиммунные антитела (мышиные античеловеческие, овечьи антимышиные и т.д.). Их используют в основном для диагностических целей и селекции клеток. При введении в организм человека они вызывают выработку антител.

Препараты для клинического использования были созданы для обеспечения высокоспецифичного, высокоаффинного сродства моноклональных антител с антигеном в сочетании с минимизацией побочных эффектов, в частности выработки пациентом антител к чужеродному белку. Таким образом, антитело человека становится носителем антигенсвязывающего фрагмента мышиного иммуноглобулина. Эти препараты на 75% состоят из белка человека и на 25% -- из белка мыши. Такая структура обеспечивает высокое сродство к антигену и уменьшает (хотя и не исключает) возможность образования против них антител организмом хозяина, что может вызвать серьезные побочные реакции, вплоть до развития анафилаксии. Пример химерного антитела -- препарат ремикейд (инфликсимаб).

Следующим шагом стало создание гуманизированных моноклональных антител, на 80-95% состоящих из белка человека и только на 5-10% -- из белка мыши. Мышиного происхождения в этих молекулах -- только гипервариабельные участки, формирующие антигенсвязывающий центр.

Наконец, были созданы генно-инженерные, полностью гуманизированные моноклональные антитела, молекулы которых полностью состоят из белка человека.

Большинство препаратов на основе моноклональных антител пациенты переносят хорошо. При использовании химерных возможна выработка антител к ним и развитие анафилактических реакций. Препараты, подавляющие функции и уменьшающие количество различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, могут вызвать снижение противоинфекционной резистентности и/или обострение хронических инфекций. Для предотвращения этих осложнений необходимо тщательное наблюдение за пациентами, получающими лечение препаратами на основе моноклональных антител, и своевременное назначение адекватной сопроводительной терапии. Те же меры предосторожности необходимо предпринимать для уменьшения риска и тяжести течения токсических реакций, описанных при применении моноклональных антител для лечения онкологических заболеваний (например, препаратов, подавляющих ангиогенез). При лечении антителами против ФНО-ot возможна активация скрытого туберкулеза.

Перспективное направление в создании новых препаратов на основе моноклональных антител -- каталитические антитела абзимы. Это молекулы, обладающие свойствами антител (могут связываться с определенными эпитопами) и биологических катализаторов различных химических реакций (энзимов).

Области применения абзимов:

* Диагностика аутоиммунных заболеваний (анти-ДНК аутоантитела с каталитической активностью).

* Лечение аутоиммунных заболеваний.

* Лечение инфекционных заболеваний (создание абзимов, направленных на специфический катализ инфекционных агентов).

Заключение

МкАт служат незаменимыми инструментами в вирусологических исследованиях. Иммунохимические способы диагностики вирусных заболеваний основаны на выявлении вирусных антигенов в клетках и в биологических жидкостях, а также на определении спектра циркулирующих в крови антивирусных антител. Респираторно-синцитиальный (РС) вирус человека вызывает тяжелое заболевание нижних отделов дыхательных путей, особенно опасное для новорожденных и детей 1-го года жизни. Этот вирус характеризуется чрезвычайно нестабильной антигенной структурой - она легко нарушается при выделении, очистке и хранении препаратов вируса. Создание МкАт против антигенов РС вируса открывает пути совершенствования и стандаргишции методов иммунодиагностики этой вирусной инфекции.

При диагностике иммунодефицитов, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний используют методы иммуноанализа, основанные на выявлении иммуноглобулинов человека. В антигенном отношении они представляют собой молекулы с высокой степенью гомологии, в то же время они имеют антигенные детерминанты, отличающие отдельных типов, изотипов и субизотипов. Создание высокоспецифичных реагентов, способных дифференцировать и детектировать эти молекулы методами иммуноанализа, отвечает запросам фундаментальной и клинической иммунологии.

Список использованной литературы

1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б. Моноклональиые антитела: Гибридомы: новый уровень логического анализа. М.: Медицина, 1983.

2. Роит А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991.

3. А.Ю. Барышников, Е.Р. Полосухина. Моноклональные тела в онкологии.

4. Г.И. Абелев. Моноклональные антитела.

5. biomolecula.ru/content/1076

6. http://ru.wikipedia.org/wiki/Моноклональные_антитела

7. www.biotechnolog.ru/acell/acell4_4.htm

Размещено на Allbest.ru