Вплив умов вирощування на стабільність геному клітинних штамів Rauwolfia serpentina Benth
Молекулярно-генетична характеристика штамів культивованих тканин R. serpentіna. Підбір RAPD-маркерів, які дозволяють диференціювати штами культивованих тканин на молекулярно-генетичному рівні при тривалому вирощуванні. Генетичні зміни штамів К-20 і К-27.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 31.08.2012 |
| Размер файла | 42,5 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Вплив умов вирощування на стабільність геному клітинних штамів Rauwolfia serpentina Benth
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Підвищення попиту на лікарські препарати на основі біологічно активних сполук природного походження, у першу чергу рослинного, обумовлене не тільки їхньою унікальною структурою, відтворення якої шляхом хімічного синтезу є трудомістким і дорогим процесом, але також зростанням алергійних реакцій людського організму внаслідок застосування синтетичних медпрепаратів. У розвинених країнах світу загальна кількість лікарських засобів, які одержують із натуральної сировини природного походження, становить більше 50% всіх ліків, а в Японії - майже 90% (WHO, 2002).
Сьогодні в медицині використовують понад 3000 видів рослин, із них близько 100 видів культивуються, а решта - дикоростучі. При цьому більшість цінних лікарських рослин - рідкісні або зникаючі види. Руйнування природних біоценозів, обумовлене господарською діяльністю людини поряд зі значним скороченням територій, придатних для збору дикоростучих трав, зокрема через хімічне й радіаційне забруднення, збільшення обсягів заготівель і варварські методи збору рослинної сировини, - все це призводить до різкого обмеження природних ресурсів лікарських рослин (Hamilton, 2004).
Вирішити проблему дефіциту рослинної сировини для медицини, так само як і питання збереження природних рослинних багатств і їхнього різноманіття, дозволяє використання досягнень сучасної біологічної науки, а саме, клітинної біології й біотехнології, які забезпечують одержання в необхідній кількості екологічно чистої рослинної біомаси, близької за якісним складом до природної сировини, а в деяких випадках і кращої від неї, незалежно від географічних і ґрунтово-кліматичних умов (Collin, 2001).
У результаті комплексних досліджень, які Інститут молекулярної біології і генетики НАН України проводив разом із Ленінградським хіміко-фармацевтичним інститутом, були отримані високопродуктивні клітинні штами тропічної рослини раувольфії зміїної (Rauwolfіa serpentіna Benth.). Ця рослина є джерелом індолінових алкалоїдів, широко застосовуваних у медицині при лікуванні серцево-судинних захворювань. Отримані штами свого часу детально охарактеризовані на цитологічному й біохімічному рівні, і ці параметри використані при їхній паспортизації (Кунах, 2005). Разом з тим, завдяки бурхливому розвитку методів молекулярної генетики за останнє десятиліття стало можливим використання для ідентифікації штамів і контролю їхньої стабільності більш швидких і ефективних підходів.
Отримані високопродуктивні штами - це калюсні культури, які у лабораторних умовах вирощуються на твердих середовищах. Разом із тим, у випадку застосування культури тканин і клітин рослин для промислового отримання біомаси такий спосіб вирощування, пов'язаний із значними витратами ручної праці, може виявитися малоефективним. Економічно вигіднішими є культури, які ростуть у рідкому середовищі. У зв'язку із цим виникає необхідність видозміни регламенту одержання біомаси. При цьому подальше використання клітинних продуцентів як джерела певних метаболітів можливе лише за умови збереження стабільності якісного складу й кількісного вмісту цільових продуктів. З огляду на генетичний контроль цих характеристик, важливе значення має дослідження геному сформованих штамів пасивованої культури при зміні умов вирощування.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України в рамках бюджетної теми «Дослідження структурно-функціональної мінливості геному в процесах диференціювання й дедиференціювання клітин вищих рослин в інтактному організмі та при культивуванні іn vіtro» (№ держ. реєстрації 0101U000007, 2001-2005 рр.) і «Порівняльне вивчення геномної мінливості рослин у природі та в культурі іn vіtro» (№ держ. реєстрації 0105U005344, 2006-2010 рр.).
Мета й завдання дослідження. Метою роботи було вивчення стабільності геному сформованих штамів рослинних тканин R. serpentіna Benth. іn vіtro.
Відповідно до мети були поставлені такі завдання:
1. Молекулярно-генетична характеристика штамів культивованих тканин R. serpentіna з колекції відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
2. Підбір RAPD-маркерів, які дозволяють диференціювати штами культивованих тканин R. serpentіna на молекулярно-генетичному рівні.
3. Дослідження стабільності геному деяких сформованих штамів при тривалому вирощуванні (більше 10-и років) у стандартних (регламентних) умовах.
4. Вивчення реакції геному штаму К-27 при переході до умов глибинної культури, а також впливу проміжного пасажу на середовищі спрощеного складу.
5. Аналіз генетичних змін штамів К-20 і К-27 при тривалому (біля 3-х років) вирощуванні на живильних середовищах, відмінних за складом від стандартного.
Об'єкт дослідження - мінливість геному культивованих тканин тропічної рослини R. serpentіna Benth.
Предмет дослідження - геном сформованих штамів культивованих тканин рослин.
Методи дослідження: культура тканин іn vіtro, RAPD-ПЛР, електрофорез в агарозному гелі, математична обробка результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що вирощування сформованих штамів культури тканин R.serpentіna у стандартних для них умовах забезпечує високу генетичну стабільність впродовж тривалого часу. Зміна умов культивування, зокрема складу живильного середовища, може спричиняти зміни геному. Перехід від поверхневого вирощування калюсних тканин до глибинної культури має більший вплив на геном культивованих тканин порівняно зі зміною складу живильного середовища. Введення проміжного пасажу на твердому середовищі зміненого складу, що передує переходу до глибинної культури, дозволяє знизити рівень змін геному.
Практичне значення одержаних результатів. Висока генетична стабільність поряд із установленою раніше сталістю показників продуктивності свідчить про те, що вивчені штами є надійним джерелом біомаси для одержання індолінових алкалоїдів. Підібрані RAPD-маркери дозволяють диференціювати штами культивованих тканин R.serpentіna на молекулярно-генетичному рівні. Той факт, що вирощування калюсної тканини штаму К-27 в умовах глибинної культури в рідкому середовищі РЖ не супроводжується помітними змінами геному протягом кількох перших пасажів, підтверджує можливість застосування даного підходу для промислового вирощування біомаси. Виявлені особливості реакції геному на зміни умов вирощування можна використовувати в практичній діяльності, пов'язаній з подальшим застосуванням досліджених штамів R. serpentіna у біотехнологічних розробках.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведено пошук і аналіз літератури за темою досліджень; експерименти проведено самостійно, або за безпосередньої участі здобувача. Зокрема, автор самостійно вирощував культивовані тканини штамів-продуцентів на різних за складом середовищах, виділяв ДНК, проводив ПЛР-аналіз ДНК і дослідження стабільності геному при тривалому вирощуванні за регламентом та при зміні умов вирощування. Разом із керівником було визначено загальний напрямок наукового пошуку та об'єктів дослідження, розроблено структуру дисертаційної роботи. Визначення стратегії та завдань дослідження, аналіз, обговорення й інтерпретація отриманих даних і підготовка наукових публікацій були здійснені разом з керівником дисертації д.б.н., професором, член-кор. НАНУ В.А. Кунахом і співробітниками відділу к.б.н., с.н.с. І.О. Андрєєвим і к.б.н., с.н.с. К.В. Спірідоновою. Автор висловлює щиру подяку за допомогу під час виконання роботи усім співробітникам відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, особливо, м.н.с. Л.П. Можилевській за надані з колекції культури та О.А. Потапчук за допомогу в роботі з культурою тканин, колективу групи молекулярно-генетичних досліджень за адаптацію у новому мовному і робочому середовищі.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Міжнародній конференції «Генетика в мире», присвяченій 40-річчю Інституту загальної генетики імені М.І. Вавилова РАН (Москва, Росія, 2006), VІІІ з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів імені М.І. Вавилова (Алушта, Україна, 2007), Конференції молодих учених, аспірантів і студентів з молекулярної біології й генетики, присвяченій 120-річчю від дня народження М.І. Вавилова (Київ, Україна, 2007), 2-й Міжнародній конференції з природничих наук «Роль генетики й біотехнології в охороні природних ресурсів» («The role of genetics and biotechnology in conservation of natural resources») (Ісмаілія, Єгипет, 2007), а також доповідалися на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у наукових фахових виданнях та тези 2 доповідей на наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, аналізу і обговорення результатів, висновків, списку літератури, що містить 136 найменувань. Дисертацію викладено на 121 сторінці. Вона містить 13 таблиць і 25 рисунків.
Основний зміст роботи
штам культивований маркер генетичний
Матеріали та методи досліджень. Досліджували клітинні лінії й штами раувольфії зміїної, які походять від калюсної культури Рс, отриманої в 1964 р. Р.Г. Бутенко (Воллосович, Бутенко, 1970) на середовищі МС із тканин фрагмента молодого зеленого стебла 5-річної рослини. Зокрема, було проаналізовано клітинну лінію А та штами К-20, К-27, М і R-31. Генеалогія, морфологічні, цитогенетичні та біохімічні характеристики цих штамів докладно описані в статтях (Воллосович и др., 1976; Kunakh, Alkhіmova, 1989; Кунах, 2001, 2006) і монографії (Кунах, 2005). Культури тканин раувольфії зміїної були отримані з колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.
Калюсні культури вирощували в колбах об'ємом 250 мл, що містили 50 мл агаризованого середовища, у темряві при 24-26°С. У рідких середовищах культури вирощували в колбах об'ємом 250 мл, що містили 50 мл середовища, на поздовжньому шейкері при погойдуванні із частотою 60-70 коливань у хв. При пересадженнях маса експланта становила 4-5 г. тканини на колбу. За умов двоетапного вирощування тканину переносили в інше середовище й культивували протягом кількох пасажів. Для культивування використовували оригінальні живильні середовища: 5С, 6С, 10С і РЖ, які розробляли спеціально для тканин раувольфії зміїної (Воллосович и др., 1979; 1985; Каухова и др., 1981) і які забезпечують високий приріст біомаси з підвищеним вмістом алкалоїдів.
Матеріал для аналізу відбирали на 20-25 день росту в рідкому та на 30-35 день росту на агаризованому середовищах. ДНК виділяли з використанням цетилтриметиламонію броміду. Якість препаратів ДНК оцінювали гель-електрофорезом порівнюючи з розчинами ДНК фага л відомої концентрації.
Молекулярно-генетичний аналіз проводили методом полімеразної ланцюгової реакції із праймерами довільної послідовності (RAPD-ПЛР). У роботі використано 25 праймерів. Реакційна суміш об'ємом 20 мкл містила: 20 нг ДНК, 0,2 мМ dNTP, 1,25 од. Taq-полімерази, 0,25 нМ праймера, 1ЧПЛР-буфер з 1,5 мМ MgCl2. ПЛР проводили за програмою: 94°С - 2 хв, 5 циклів (94°С - 30 с; 37°С - 30 с; 72°С - 1 хв), 35 циклів (94°С - 20 с, 37°С - 20 с, 72°С - 40 с), 72°С - 2 хв 30 с. Реакцію з кожним праймером повторювали двічі, враховували тільки відтворювані амплікони.
Продукти ампліфікації розділяли електрофорезом в 1,5% агарозному гелі з додаванням 0,5 мкг/мл бромистого етидію, в 1ЧТВЕ буфері при напруженості поля 3-4 В/см. Для визначення розміру фрагментів користувалися ДНК-маркером «100 bp +1,5 Kb» (СибЭнзим, Росія). Для кількісної оцінки RAPD-поліморфізму електрофоретичні спектри ПЛР-продуктів записували у вигляді матриці бінарних ознак, де наявність або відсутність фрагментів у спектрі, а також їхні значні кількісні відмінності (більше, ніж в 4-5 разів), позначали як «1» або «0». На основі складених матриць за допомогою комп'ютерної програми PopGene розраховували генетичні відстані (за Неєм) і методом незваженої попарно-групової кластеризації (UPGMA) будували дендрограму взаємозв'язків між дослідженими об'єктами.
Результати досліджень та обговорення
Молекулярно-генетична характеристика штамів-продуцентів індольних алкалоїдів. Проведено RAPD-аналіз ДНК клітинної лінії А і створених на її основі чотирьох високопродуктивних штамів: К-20, М, К-27 і R-31. Загальну схему генеалогічних зв'язків досліджених штамів наведено на рис. 1. Використали 25 RAPD-праймерів, які раніше успішно застосовували для оцінки міжвидового поліморфізму роду Rauwolfia, і, отже, дозволяють аналізувати варіабельні ділянки досліджуваного геному.
Усього було враховано 260 ампліконів, з яких 37 (14,2%) виявляли поліморфізм між дослідженими об'єктами. Зокрема, отримані спектри ПЛР-продуктів вказують на відмінності вивчених штамів від вихідної клітинної лінії А, а також їхні індивідуальні особливості.
Рис. 2. Варіабельність RAPD-спектрів клітинних ліній і штамів культивованих тканин R. serpentina: 1-5 - об'єкти дослідження (назви подано над рисунком); М - маркер «100 bp + 1,5 kb»; назви праймерів вказано під електрофореграмами; стрілками позначено варіабельні амплікони, зірочками - амплікони з варіабельністю за кількістю
Поліморфізм проявлявся у вигляді відмінностей, пов'язаних з наявністю окремих смуг, а також варіаціями їхнього кількісного вмісту (інтенсивності) у спектрах ПЛР-продуктів. Поліморфізм виявили 13 праймерів, найваріабельнішими були спектри ампліконів, синтезованих із праймерами А11, А16, А19 і В08. На основі даних RAPD-аналізу для кожної пари генотипів були розраховано генетичні відстані та побудовано дендрограму взаємозв'язків між штамами R.serpentina (рис. 3).
Як показали проведені розрахунки, генетичні відстані між штамами культивованих тканин R.serpentina і клітинною лінією А варіюють від 0,039 до 0,123. Найбільшу подібність до вихідної лінії А має лінія М, найбільші відмінності - суспензійний штам R-31. Рівень відмінностей між окремими штамами коливається у вужчому діапазоні від 0,047 до 0,088 (табл. 1).
Таблиця 1. Генетичні відстані за Неєм і Лі між штамами культивованих тканин R.serpentina за результатами RAPD-аналізу
|
Назва штаму |
А |
К-20 |
М |
R-31 |
К-27 |
|
|
А |
**** |
|||||
|
К-20 |
0,088 |
**** |
||||
|
М |
0,039 |
0,047 |
**** |
|||
|
R-31 |
0,123 |
0,080 |
0,088 |
**** |
||
|
К-27 |
0,075 |
0,051 |
0,068 |
0,059 |
**** |
Генетичні відстані, розраховані за результатами RAPD-аналізу, у цілому узгоджуються з генеалогією вивчених штамів. Використання однотипних критеріїв селекції таких, як «швидкий приріст біомаси в культурі in vitro» і «високий вміст індолінових алкалоїдів», призвело до добору клітин із спільними ознаками. З іншого боку, між штамами виявлено відмінності, які, ймовірно, обумовлені особливостями умов культивування - всі вивчені клітинні лінії вирощують на різних за складом живильних середовищах. Хоча можливо, що характер мутагенного впливу конкретних умов in vitro, що застосовувалися при одержанні кожного штаму, також вплинув на формування певного типу клітин, які поряд зі специфічними цитогенетичними й біохімічними характеристиками мають також певні молекулярно-генетичні особливості.
В цілому, отримані результати дозволяють зробити такі висновки. У процесі одержання й селекції нових штамів культивованих тканин R. serpentina були сформовані якісно різні клонові клітинні популяції, кожна з яких має індивідуальний молекулярно-генетичний портрет. Використані в роботі RAPD-маркери дозволяють диференціювати штами культивованих тканин R. serpentina на молекулярно-генетичному рівні.
Геном культивованих тканин R. serpentina при тривалому вирощуванні в постійних умовах. Досліджували два високопродуктивних штами К-20 і К-27. Штами створені понад 25 років тому й протягом цього часу характеризуються стабільно високим рівнем накопичення індолінових алкалоїдів. Аналізували ДНК, виділені із тканин штамів у 1990 і 2004 рр. Для штаму К-27, окрім тканин із колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ, вивчали також варіант К-27 (Х), що культивували на Харківському хімфармоб'єднанні «Здоров'я» в 1988-1998 рр. і далі в колекції клітинних культур Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ.
У результаті проведеного ПЛР-аналізу було враховано 244 амплікони, з яких лише один фрагмент (див. спектри ампліконів праймера А16 на рис. 5) відрізняв зразки тканин штаму К-27 1990 і 2004 рр. Варіант К-27 (Х) також характеризується незначними відмінностями від колекційного штаму. При порівнянні зразків тканин штаму К-20 варіабельності спектрів RAPD-продуктів не спостерігали.
Результати RAPD-аналізу ДНК, виділеної із тканин штамів К-27 і К-20 з інтервалом понад 10 років, показали, що культивування в постійних умовах протягом такого тривалого проміжку часу не призводить до істотних генетичних змін. Отримані результати можна розглядати як свідчення генетичної стабілізації культивованих тканин після завершення штучної селекції та адаптації до конкретних умов вирощування.
У цілому, відсутність істотних змін спектрів ПЛР-продуктів штамів К-20 і К-27 за період з 1990 по 2004 рр. свідчить про їхню високу генетичну стабільність при вирощуванні в стандартних умовах, що поряд із незмінними показниками продуктивності є однією з важливих умов їхнього використання для одержання екологічно чистої біомаси в промислових масштабах протягом тривалого часу.
Реакція геному культивованих тканин штамів-продуцентів R. serpentina на зміну умов вирощування. Раніше у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ під керівництвом д.б.н., професора, член-кор. НАНУ В.А. Кунаха проведено комплексний експеримент, спрямований на адаптацію штаму К-27 до умов промислового виробництва, зокрема оптимізацію умов вирощування в рідкому живильному середовищі. Було показано, що в спеціально підібраних умовах глибинної культури відбувається прискорення накопичення алкалоїдів, що дозволяє скоротити час культивування тканин до збору врожаю. Результати вивчення накопичення індолінових алкалоїдів і загальної продуктивності штаму К-27 при вирощуванні його в різних умовах (поверхневому й глибинному) на різних типах живильних середовищ були опубліковані раніше (Кунах и др., 2006; Мирюта и др., 2006). Наведені дані є частиною цих досліджень.
Вивчали стабільність геному сформованого клітинного штаму К-27 при переході від поверхневого вирощування калюсної тканини до глибинної культури. Штам К-27 більше 25-и років вирощується в стандартних умовах на агаризованому середовищі 10С, що забезпечують при підтримуючому доборі накопичення 0,9-1,2% аймаліну в сухій біомасі й високий приріст біомаси. Тканину з агаризованого середовища 10С переносили в інше (5С, РЖ, 5Сж або 10Сж) і культивували 4 пасажі. Отримані варіанти тканин були позначені нами 5С(10С), РЖ(10С), 5Сж(10С) і 10Сж(10С). В іншому випадку тканини лінії К-27 (10С) протягом одного пасажу вирощували на простішому за складом середовищі 5С поверхневим способом (30 діб), а потім отриману тканину переносили в рідке середовище 5Сж або РЖ, і культивували в умовах глибинного вирощування 4 пасажі (варіанти 5Сж(5С) і РЖ(5С)). Як контроль використовували тканини штаму К-27, які постійно ростуть на безгормональному твердому середовищі 10С.
Використані в дослідженні живильні середовища відрізнялися від стандартного для штаму К-27 середовища 10С за вмістом мікро- і макросолей, цукру й вітаміну В1, а також за консистенцією: зокрема застосовували тверді середовища з додаванням агару (5С) і рідкі - без нього (10Сж, 5Сж і РЖ). У середовищах 5С, 5Сж і РЖ вміст цукру знижено в 2 і 4 рази, відповідно. Крім того, в 5С, 5Сж і РЖ майже в 2 рази зменшено вміст азоту, а в 5С і 5Сж співвідношення кількості азоту в складі аміногруп і нітратних груп змінено у бік збільшення останніх.
В результаті проведеного RAPD-аналізу було враховано 242 чітко виражених відтворюваних амплікони. Сума мажорних фрагментів склала 103, що становить 42,6% від загальної кількості ампліконів. Виявлено 10 (4%) поліморфних фрагментів у спектрах ПЛР-продуктів 8 праймерів (табл. 2).
Таблиця 2. Мінливість спектрів ПЛР-продуктів у культурі тканин штаму К-27
|
Назва варіанту |
Найменування праймера |
Кількість поліморфних ампліконів |
|||||||||
|
А-01 |
А-03 |
А-12 |
А-13 |
А-16 |
А-19 |
В-01 |
В-04 |
абс. |
відн., % |
||
|
5С |
1 |
1 |
0,4 |
||||||||
|
10Сж(10С) |
1 |
1 |
2 |
0,8 |
|||||||
|
5Сж(5С) |
1 |
1 |
1 |
1 |
4 |
1,6 |
|||||
|
5Сж(10С) |
1 |
1 |
2; 1+ |
1 |
1 |
7 |
2,8 |
||||
|
РЖ(5С) |
1 |
1 |
*1 |
1 |
1 |
1 |
6 |
2,4 |
|||
|
РЖ(10С) |
1 |
1 |
*1 |
1 |
1 |
1 |
1+ |
7 |
2,8 |
Більшість виявлених відмінностей полягала у зміні кількості окремих ампліконів. Появу нових фрагментів спостерігали лише у двох випадках: у варіантах 5Сж(10С) і РЖ(10С). У більшості випадків зміни RAPD-спектрів, індуковані зміною умов вирощування, мали подібний характер у різних варіантів. При цьому варіабельними були переважно мінорні фрагменти.
Аналіз отриманих даних виявив, що в усіх випадках зміна умов вирощування призводить до варіабельності ПЛР-продуктів. Вивчені варіанти культивованих тканин штаму К-27 відрізняються між собою за рівнем поліморфізму.
Найменше відмінностей виявлено у випадку вирощування на середовищах 5С і 10Сж. Найбільше - для варіантів РЖ(5С) і РЖ(10С). Варіанти 5Сж(5С) і 5Сж(10С) менше відрізняються від контролю порівняно з варіантами, які вирощували на середовищі РЖ. Встановлено також, що попереднє культивування протягом одного пасажу на середовищі 5С призводить до зниження кількості змін при наступному глибинному вирощуванні (табл. 2).
На основі отриманих результатів можна зробити висновок про те, що зміна умов вирощування, зокрема мінерального складу, вмісту цукру та типу середовища (перенос тканин із твердого середовища на рідке), може супроводжуватися перебудовами геному сформованого штаму К-27 на молекулярному рівні. Виявлено такі особливості геномних перебудов. По-перше, навіть при перенесенні тканин у рідке середовище без зміни його складу та подальшому глибинному вирощуванні протягом 4-х пасажів спостерігали незначні зміни в спектрах RAPD-фрагментів. Разом із тим, при поверхневому вирощуванні на твердому середовищі 5С рівень варіабельності значно нижчий, ніж у випадку глибинного вирощування в рідкому середовищі 5Сж. При глибинному вирощуванні в рідких живильних середовищах 5Сж і РЖ рівень відмінностей від вихідного штаму був порівнюваним, незважаючи на істотну різницю між цими середовищами за вмістом цукру й мінеральним складом (співвідношенням азоту у вигляді NH4+ і NO3 - груп). Ми припускаємо, що перехід від поверхневого вирощування до глибинної культури здійснює більший стресовий вплив на геном культивованих тканин порівняно зі зміною складу живильного середовища. По-друге, попереднє культивування на твердому середовищі, проміжному за вмістом деяких компонентів, зокрема сахарози, дозволяє послабити стресовий вплив, обумовлений зміною складу та консистенції середовища. Цей результат має важливе значення, оскільки показано, що введення проміжного пасажу на середовищі 5С при переході до глибинного вирощування в рідкому середовищі дозволяє також підвищити вихід аймаліну порівняно із прямим переходом до глибинної культури (Кунах и др., 2006; Мирюта и др., 2006).
Динаміка геномних змін калюсних тканин раувольфії зміїної при переході до умов глибинної культури. Вивчення геномної мінливості в динаміці культивування за умов тривалішого (до 6-и пасажів) вирощування в глибинній культурі не виявило змін геному клітинної лінії К-27 (10С) протягом кількох перших пасажів. Після 4-6 пасажів росту в глибинній культурі спостерігали поліморфізм RAPD-спектрів, що може бути пов'язане як зі змінами послідовностей ДНК, так і генетичної структури клітинної популяції штаму. Встановлено, що введення проміжного пасажу на твердому середовищі 5С простішого складу перед переведенням у рідке середовище РЖ істотно не впливає на рівень і характер змін геному після 4-6 пасажів вирощування в глибинній культурі. Оскільки отримані нами результати вказують на невисокий рівень мінливості геному калюсних тканин штаму К-27 при культивуванні в рідкому живильному середовищі, запропонований підхід вирощування калюсних тканин штаму К-27 у глибинній культурі протягом декількох пасажів може бути використаний з метою промислового отримання біомаси.
Тривале вирощування штамів К-27 і К-20 на живильному середовищі 5С. Вивчали калюсні тканини штамів К-27 і К-20, які вирощували на середовищі 5С протягом 3 років (30 пасажів) - варіанти К-27 (5С) і К-20 (5С), відповідно. Як контроль використали культури тканин із колекції відділу, які понад 25 років підтримували у стандартних умовах, а саме штам К-27 на середовищі 10С і штам К-20 на середовищі 6С.
При аналізі електрофореграм продуктів ампліфікації для варіантів штаму К-27 було враховано 233 фрагменти, а для штаму К-20 - 234 фрагменти. У варіантів штаму К-27 виявлено ряд відмінностей, зокрема, 5 поліморфних фрагментів у спектрах праймерів А11, А16, А19 і В08. В усіх випадках поліморфізм проявлявся у вигляді зміни інтенсивності ПЛР-продуктів. Поряд із цим, між варіантами штаму К-20, що вирощували на середовищах 6С та 5С, відмінностей не виявлено. За результатами оцінки електрофореграм ПЛР-продуктів проведено розрахунок генетичної дистанції між варіантами штаму К-27 (10С) і К-27 (5С), значення якої склало 0,019.
Ми припускаємо, що виявлену різницю в реакції двох штамів, які мають спільне походження, можна пояснити істотнішими відмінностями за складом між середовищами 5С і 10С, ніж 5С і 6С. Подібну картину спостерігали й при менш тривалому вирощуванні тканин штаму в нових умовах: рівень змін геному залежав від ступеня розходжень у складі середовищ.
При аналізі отриманих даних привертає увагу така особливість: генетичні зміни, що відбулися в результаті вирощування штаму К-27 на середовищі 5С, характеризуються зближенням спектрів ПЛР-продуктів варіантів К-27 (5С) і К-20 (6С). Можна припустити, що невипадковість змін RAPD-спектрів обумовлена адаптивним характером геномних перебудов.
Таким чином, переведення високопродуктивних штамів R.serpentina на середовища збідненого складу з наступним тривалим культивуванням у нових умовах може супроводжуватися змінами геному. При цьому рівень змін залежить від різниці між вихідним і новим середовищем.
Висновки
Проведено молекулярно-генетичне дослідження культури тканин R.serpentіna - продуцента індолінових алкалоїдів, яка є перспективним джерелом альтернативної сировини для виробництва лікарських препаратів серцево-судинного типу дії. Зокрема досліджено клітинну лінію А та отримані на її основі штами М, R-31, К-20 та К-27. Встановлено, що в процесі одержання й селекції нових штамів були сформовані якісно відмінні клітинні популяції, кожна з яких поряд зі специфічними цитогенетичними та біохімічними характеристиками, описаними раніше, має індивідуальний молекулярно-генетичний портрет. Вивчено вплив умов вирощування на стабільність геному штамів-продуцентів.
1. Підібрано RAPD-маркери, які дозволяють диференціювати штами на молекулярно-генетичному рівні. Здійснено молекулярно-генетичну характеристику штамів, значення генетичних відстаней між штамами й вихідною лінією складають від 0,039 до 0,123 і в цілому узгоджуються з їхньою генеалогією. Найбільшу подібність до клітинної лінії А має штам М, найменшу - суспензійний штам R-31. Відмінності між окремими штамами вкладаються у вужчий діапазон - від 0,047 до 0,088.
2. Вирощування штамів К-20 і К-27 у постійних стандартних умовах забезпечує їхню високу генетичну стабільність впродовж понад десять років. Варіанти штаму К-20 1990 і 2004 рр. не відрізнялися між собою, генетичні відстані між такими ж варіантами штаму К-27 склали 0,004. Висока генетична стабільність поряд із установленою раніше сталістю показників продуктивності свідчить про те, що вивчені штами є надійним джерелом біомаси для одержання індолінових алкалоїдів.
3. Зміна умов вирощування штаму К-27 при двоетапному культивуванні не призводить до істотних перебудов геному на молекулярному рівні. При цьому, перехід від поверхневого вирощування на твердому агаризованому середовищі до глибинної культури в рідкому середовищі має більший вплив на геном культивованих тканин порівняно зі зміною складу твердого живильного середовища. Введення проміжного пасажу на твердому середовищі спрощеного складу перед переходом до глибинної культури дозволяє знизити рівень змін геному.
4. Вирощування калюсної тканини штаму К-27 в умовах глибинної культури в рідкому середовищі, що відрізняється за складом від стандартного агаризованого середовища, не призводить до помітних змін геному протягом 1-3 пасажів. Тривалий ріст (4-6 пасажів) у глибинній культурі супроводжується виникненням поліморфізму RAPD-спектрів, що виявляється в зміні кількості окремих, переважно мінорних ПЛР-фрагментів. Введення проміжного пасажу на твердому середовищі спрощеного складу перед перенесенням у рідке середовище не впливає істотно на рівень і характер генетичних змін після 4-6 пасажів росту тканин у глибинній культурі.
5. Перенесення високопродуктивних штамів на агаризовані середовища збідненого складу з наступним тривалим культивуванням у нових умовах спричиняє зміни геному. Генетичні відстані між варіантами штаму К-27 на середовищах 10С і 5С склали 0,019, тоді як варіанти штаму К-20 на середовищах 6С та 5С між собою не відрізнялися, що свідчить про залежність ступеня змін від рівня відмінностей між вихідним і новим середовищем.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Спиридонова Е.В., Адноф Д.М., Андреев И.О., Кунах В.А. Стабильность генома высокопродуктивной клеточной линии К-27 Rauwolfia serpentina Benth. при изменении условий выращивания // Біополімери і клітина. - 2007. - Т.23, №2. - С. 86-92. Особистий внесок здобувача - проведення експериментів з культурою тканин, виділення ДНК та RAPD-аналіз, аналіз результатів, участь в написанні статті. Здобувачем досліджено вплив зміни умов вирощування і двоетапного культивування на геном клітин штаму К-27.
2. Андреев И.О., Адноф Д.М., Спиридонова Е.В., Кунах В.А. Стабильность генома высокопродуктивных клеточных линий раувольфии змеиной при длительном выращивании in vitro // Доп. НАН України. - 2007. - №10. - С. 147-152. Особистий внесок здобувача - проведено молекулярно-генетичний аналіз, математичну оцінку результатів, участь у написанні статті. Підібрано RAPD-маркери, які дозволяють диференціювати штами на молекулярно-генетичному рівні. Проведено молекулярно-генетичний аналіз штамів-продуцентів алкалоїдів К-20 та К-27 при тривалому вирощуванні у стандартних умовах.
3. Andreev I.O., Adnof D., Spiridonova K.V., Kunakh V.A. Long-term stability of two Rauwolfia serpentina cell strains // CATRINA: The international Journal of Environmental Sciences. - 2007. - V.2, №2. - P.133 -136. Особистий внесок здобувача - проведено RAPD-аналіз, досліджено вплив тривалого вирощування на середовищі постійного складу на мінливість геному культивованих тканин, участь в аналізі та обговоренні результатів, написанні статті.
4. Спиридонова Е.В., Адноф Д.М., Андреев И.О., Кунах В.А. Динамика изменений генома каллусных тканей раувольфии змеиной при переводе в условия глубинного выращивания // Цитология и генетика. - 2008. - Т. 42, №2. - С. 35-42. Особистий внесок здобувача - проведено експерименти з культурою тканин та RAPD-аналіз, побудовано дендрограму генетичних відстаней, участь у написанні статті. Проведено молекулярно-генетичне дослідження штамів при тривалому вирощуванні (4-6 пасажів) у глибинній культурі.
5. Адноф Д.М., Спірідонова К.В., Андрєєв І.О., Кунах В.А. Стан геному клітинних штамів-продуцентів Rauwolfia serpentina Benth. після більше десяти років культивування // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології / Зб. наук. праць, Т. 2. - К.: Логос, 2007. - С. 437 - 440. Особистий внесок здобувача - проведено RAPD-аналіз, вивчено вплив стандартних умов вирощування на стабільність геному штамів-продуцентів, участь в написанні статті.
6. Адноф Д.М., Андреев И.О., Спиридонова Е.В., Амори Ю., Бублик Е.Н., Можилевская Л.П., Потапчук Е.А., Кунах В.А. Влияние изменений условий выращивания на стабильность культуры тканей Rauwolfia serpentina Benth. - продуцента алкалоидов // Мат-лы межд. конф. «Генетика в России и мире». - Москва, Россия, 28 июня-2 июля 2006. - Москва, 2006. - С. 2. Особистий внесок здобувача - проведення експериментів з культурою тканин, RAPD-аналіз, участь в аналізі результатів і написанні тез.
7. Adnof D.M., Andreev I.O., Spiridonova K.V. Genome of Rauwolfia cell lines upon long-term growth in standard conditions // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov. - Kyiv, 20-22 September 2007. - Kyiv, 2007. - Р. 2. Особистий внесок здобувача - проведення RAPD-аналізу, участь в аналізі результатів і написанні тез.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Огляд термінаторних технологій, які використовують трансгенез з метою пригнічення фертильності на генетичному рівні. Розкрито молекулярно-генетичні основи технології, що обмежують використання на рівні ознаки. Опис технології створення гібридних сортів.
статья [608,3 K], добавлен 21.09.2017Селекція як наука. Особливості виведення сортів, пород, штамів. Опис мінливості тварин і рослин за елементами продуктивності. Генетика кількісних ознак в селекції. Типи схрещувань і добору. Явище гетерозису. Характерні риси закону гомологічних рядів.
презентация [426,3 K], добавлен 04.10.2013Дослідження штамів мікроорганізмів. Використання мутантів мікроорганізмів. Промисловий синтез амінокислот. Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти, лізину, метіоніну, треонина, ізолейцину та триптофану. Ход реакцій і блокуванням етапів синтезу.
реферат [34,9 K], добавлен 25.08.2010Вплив лікарських рослин на діяльність систем організму людини. Дослідження лікарської флори на території агробіостанції Херсонського державного університету. Аналіз та характеристика життєвих форм родин та видів культивованих та дикорослих рослин.
курсовая работа [33,0 K], добавлен 27.08.2014Будова, призначення та місцезнаходження одношарового, багатошарового, залозистого, війчастого епітелію. Види та структура сполучних і м'язових тканин, їх функції. Основні складові нервової тканини, її роль у зв'язку організму з навколишнім середовищем.
презентация [2,8 M], добавлен 01.10.2012Способность организмов передавать свои признаки и особенности развития потомству на молекулярно-генетическом уровне. Изменчивость наследственного материала. Процесс возникновения мутаций. Результаты, причины и значение генетических мутаций у человека.
презентация [21,5 M], добавлен 03.10.2014Фенотипические последствия гибридизации животных. Молекулярные методы определения видов. Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila. Разработка специфических праймеров для полимеразной цепной реакции. Особенности секвенирования по Сэнгеру.
дипломная работа [3,7 M], добавлен 25.06.2017Об'єкти і методи онтогенетики. Загальні закономірності і стадії індивідуального розвитку. Генетична детермінація і диференціація клітин. Диференційна активність генів і її регуляція в процесі розвитку. Летальна диференціація клітин за розвитку еукаріотів.
презентация [631,0 K], добавлен 04.10.2013Енергетичний баланс біосфери. Зміни енергетичного балансу, пов'язані з діяльністю людини. Біогеохімічні цикли. Кругообіг важливих хімічних елементів у біосфері. Антропогенний вплив на природні цикли основних біогенних елементів, стабільність біосфери.
реферат [2,3 M], добавлен 23.11.2010Виявлення еволюційних гілок живих організмів. Загальна характеристика Археїв. Пошук і підбір оптимальних засобів для живлення археїв. Будова і склад клітинних стінок. Особливості кислотолюбивих археїв, що використовують для життя органічні сполуки.
курсовая работа [52,7 K], добавлен 14.12.2014
