Вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних клітин миші

Размещено на http://www.allbest.ru/

вплив технологічних чинників на отримання

та культивування тотипотентних клітин миші

клітина біотехнологія культивування миша

Анотація

Медведовська М.І. Вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних клітин миші. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2007.

У дисертації розглянуті основні технологічні фактори, що здійснюють вплив на отримання та культивування поза організмом тотипотентних клітин миші. Визначені та удосконалені умови і методи отримання та довгострокового культивування ембріональних фібробластів миші, культуру яких використовують у якості фідерного шару для розвитку тотипотентних клітин ссавців. Визначені умови і методи ефективного отримання клітин-попередників ЕСК. Запропоновано більш простий та щадячий спосіб трипсинізації ЕС-подібних клітин та ембріональних фібробластів миші. Доведено можливість довгострокового культивування ЕС-подібних клітин миші зі зберіганням їх недиференційованого стану. Модифіковано метод культивування тотипотентних бластомерів миші з метою збільшення ідентичного генетичного матеріалу. Представлено ілюстративний матеріал, що послідовно відображає всі стадії розвитку ембріональних фібробластів, ЕС-подібних клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші у культурі.

аннотация

Медведовская М.И. Влияние технологических факторов на получение и культивирование тотипотентных клеток мыши. Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20. - биотехнология. Белоцерковский государственный аграрный университет, Белая Церковь, 2007.

В диссертации рассмотрены основные технологические факторы, которые оказывают влияние на получение и культивирование тотипотентных клеток мыши. Показана целесообразность фидерного способа культивирования ЭС-подобных клеток и тотипотентных бластомеров мыши.

В результате проведенных исследований определены условия и методы получения и культивирования эмбриональных фибробластов мыши. Установлено, что для получения первичной культуры эмбриональных фибробластов дезагрегацию эмбрионального материала нужно проводить механическим путем с последующей ферментативной обработкой. Для получения суспензии жизнеспособных клеток время ферментативной обработки эмбрионального материала раствором 0,25% трипсин - 0,2% ЕDТА не должно превышать 10 минут. Для пассирования культуры эмбриональных фибробластов мыши концентрация фермента должна составлять 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА, а время трипсинизации не должно превышать 3 минуты.

Показано, что пересев культуры эмбриональных фибробластов мыши возможен на протяжении 7 - 10 пассажей. В отсутствии пассирования фибробласты пролиферируют в культуре на протяжении 5 суток, затем начинаются процессы деградации, которые приводят к гибели культуры.

Фидерный монослой эмбриональных фибробластов мыши остается жизнеспособным на протяжении 4 суток поддержания в условиях in vitro. Его использование обеспечивает развитие бластоцист мыши с разрастанием трофэктодермальных выростов и формированием клеток-предшественников ЭСК, ЭС-подобных клеток, а также пролиферацию изолированных тотипотентных бластомеров мыши.

В результате исследований выявлено, что для развития эмбриональных клеток мыши вне организма имеет значение концентрация в культуральной среде основных энергетических веществ - глюкозы и глютамина. Установлено, что конечная концентрация глютамина 2 мг/мл в культуральной среде обеспечивает стабильное развитие эмбриональных фибробластов, клеток внутренней клеточной массы, ЭС-подобных клеток, а также тотипотентных бластомеров мыши. Конечная концентрация глюкозы 2 мг/мл достаточна для развития в условиях in vitro клеток внутренней клеточной массы и эмбриональных фибробластов мыши. Конечная концентрация глюкозы 5,5 мг/мл обеспечивает формирование и пассирование ЭС-подобных клеток мыши. Для пролиферации в культуре изолированных тотипотентных бластомеров достаточной является конечная концентрация глюкозы 1 мг/мл.

Установлено, что развитие бластоцист мыши с разрастанием трофэктодермальных выростов и формированием клеток-предшественников ЭСК происходит при условии использования фидерного монослоя.

Показано, что удаление зоны пеллюцида при помощи 0,5% раствора проназы не влияет на дальнейшее развитие эмбрионов с образованием клеток ВКМ и ЭС-подобных клеток.

Модификация метода трипсинизации ЭС-подобных клеток за счет пипетирования в растворе 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА под визуальным контролем при помощи микроскопа обеспечивает развитие ЭС-подобных клеток на протяжении 10 пассажей. ЭС-подобные клетки в определенных условиях формируют эмбриоидные тела, что подтверждает тотипотентный характер полученных ЭС-подобных клеток.

Определено, что восьмиклеточная стадия развития эмбрионов мыши является переходной с точки зрения сохранения бластомерами тотипотентности. Культивирование на фидерном монослое эмбриональных фибробластов обеспечивает пролиферацию тотипотентных бластомеров мыши, изолированных от 2-, 4- и ранних 8-и клеточных эмбрионов, до 8 -10 клеток с формированием колоний ЭС-подобного типа. Выявлено, что стадия развития эмбрионов не влияет на дальнейшее развитие в культуре изолированных бластомеров. Однако установлено, что с увеличением количества митотических циклов происходит уменьшение потенций изолированных бластомеров к развитию.

По результатам работы представлен иллюстративный материал, который последовательно отражает все стадии развития эмбриональных фибробластов, ЭС-подобных клеток и тотипотентных бластомеров мыши в культуре.

summary

Medvedovska M.I. Тechnological factors influencing on obtaining and culturing of totipotent cells in mice. Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of agricultural sciences by specialty 03.00.20. - biotechnology. Bila Tserkva state agrarian university, Bila Tserkva, 2007.

Рrimary technological factors influencing on obtaining and culturing of mouse totipotent cells are analyzed. Methods and conditions of obtaining and long-term culturing of mouse embryonic fibroblasts for their use as feeder monolayer for animal totipotent cells development are specified and perfected. Methods and conditions of effective development of embryonic stem cells precursors are determined. Simplified method of trypsinization of mouse ES-like cells and embryonic fibroblasts is proposed. Possibility of long-term culturing of mouse undifferentiated ES-like cells is evidenced. Modified method of mouse totipotent blastomeres culturing to increase an identical genetic material is represented. Illustrative material is collected to show step by step all studies of mouse embryonic fibrolblasts, ES-like cells and totipotent blastomeres development in culture.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Основними напрямами використання тотипотентних клітин ссавців у новітніх біотехнологіях є створення трансгенних, химерних та клонованих тварин; медичні дослідження по цілеспрямованої диференціації цих клітин з їх наступною трансплантацією, а також отримання модельних тварин для досліджень на молекулярному рівні патогенезу і терапії хвороб людини (Anderson G.B., 1992; Глик Б., Пастернак Дж., 2002; Безуглий М.Д., 2002; Forsberg E.J. et al., 2002). Виходячи з цього, вирішення проблеми проліферації тотипотентних клітин in vitro набуває особливої актуальності. У якості тотипотентного матеріалу у біотехнологіях відтворення використовують ембріональні стовбурові клітини та бластомери ранніх стадій ембріогенезу (Квасницкий А.В. і співавт., 1988; Wilton L.J., Trounson A.O., 1989; Stice S.L. et al., 1996; Савченкова И.П., 1997; Turksen K., 2002).

На сьогоднішній день визначено загальний принцип отримання та культивування тотипотентних клітин ссавців. Проте, існують розбіжності щодо факторів, які є вирішальними при отриманні та культивуванні тотипотентних клітин in vitro з підтриманням їх недиференційованого стану. Для розробки нових та удосконалення існуючих методів біотехнології тотипотентних клітин ключовим підходом є використання матеріалу модельних тварин. Це робить актуальним та доцільним проведення досліджень, спрямованих на оптимізацію методів і умов отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу було виконано протягом 2001 - 2006 рр. у рамках тематичного плану Харківського біотехнологічного центру УААН та відділу біотехнології репродукції сільськогосподарських тварин Інституту тваринництва УААН. Здобувачка була виконавцем за темами: „Розробити для цілей новітніх біотехнологій ефективні методи отримання та культивування поза організмом тотипотентних клітин ссавців» (№ держреєстрації 0101U003378) та „Розробити та удосконалити ембріоінженерні методи отримання реконструйованих ембріонів і молекулярно-генетичні підходи для застосування у відтворенні та селекції сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0106U007896).

Мета та завдання досліджень. Мета даної роботи - оптимізація умов отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні завдання:

1. Удосконалити методи і умови отримання, а також довгострокового культивування ембріональних фібробластів миші, як однієї з передумов оптимізації культивування тотипотентних клітин ссавців.

2. Виявити технологічні фактори, що є суттєвими для отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

3. Підвищити ефективність отримання та довгострокового пасування ЕС-подібних клітин миші.

4. Визначити вплив стадії розвитку ембріонів миші на потенційну здатність до ізоляції та подальшої проліферації in vitro тотипотентних бластомерів.

5. Удосконалити на рівні розробки модифікованого методу умови культивування тотипотентних бластомерів миші.

Об'єкт досліджень - ембріони миші, ізольовані бластомери миші, ЕС-подібні клітини миші, ембріональні фібробласти миші.

Предмет досліджень - вплив технологічних чинників на отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

Методи досліджень. Хірургічний метод виділення доімплантаційних та пізніх ембріонів миші. Метод хімічної дебластомерізації ранніх ембріонів. Метод механічної дезагрегації ембріональних тканин. Метод трипсинізації ембріональних тканин та клітин. Метод оцінки клітин на життєздатність. Метод визначення концентрації клітин у суспензії. Методи культивування бластомерів, доімплантаційних ембріонів, ембріональних фібробластів, клітин внутрішньої клітинної маси ембріонів, ЕС-подібних клітин та ембріоїдних тіл миші. Морфологічний аналіз. Світлова мікроскопія. Статистичний метод обробки результатів експериментів.

Наукова новизна роботи. Вперше застосовано комплексний підхід для визначення ключових факторів, що впливають на отримання та розвиток in vitro всіх типів клітин, які мають потенційні тотипотентні здібності. З'ясовано основні фактори, що впливають на успіх при отриманні та культивуванні ембріональних фібробластів миші. Модифіковано методи трипсинізації для отримання та пасування ембріональних фібробластів та ЕС-подібних клітин миші. Запропоновано метод стабільного отримання та культивування ЕС-подібних клітин миші. Експериментально доведено та теоретично обґрунтовано доцільність використання моношару ембріональних фібробластів миші для культивування ізольованих тотипотентних бластомерів миші. Накопичено ілюстративний матеріал, що послідовно відображає всі стадії розвитку ембріональних фібробластів, ЕС-подібних клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші у культурі.

Практичне значення отриманих результатів. Основні результати досліджень можуть стати базою для розробки новітніх біотехнологічних методів відтворення ссавців та створення принципово нових медичних засобів. Отримані результати можуть бути використані біологічними, медичними, фармацевтичними та біотехнологічними лабораторіями для отримання культур ембріональних фібробластів, тотипотентних бластомерів та ЕС-подібних клітин. Розроблені методичні та технологічні підходи, а також накопичений ілюстративний матеріал можуть бути використані у курсах лекцій відповідних спеціальностей вищих учбових закладів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачкою самостійно проведено аналіз джерел літератури, експерименти з отримання та культивування ембріональних фібробластів миші, ЕС-подібних клітин миші та ізольованих бластомерів миші, морфофункціональну оцінку ембріональних фібробластів, ЕС-подібних клітин, ембріонів та бластомерів. Здобувачкою самостійно проведено узагальнення, статистична обробка експериментальних даних, їх трактування й обговорення. Висновки сформульовані здобувачкою спільно з науковим керівником. Викладені в дисертації результати отримані здобувачкою особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та ухвалені на ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія. Освіта. Наука» (Львів, 2004); щорічній конференції молодих учених Інституту тваринництва Української академії аграрних наук (Харків, 2004); VI національному з'їзді фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку Фармацевтичної галузі України» (Харків, 2005); ІІ міжнародної науково-практичної конференції „Сучасні наукові дослідження - `2006» (Дніпропетровськ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів „Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2006); ІІІ міжнародній науково-практичній конференції „Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика - `2006» (Дніпропетровськ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції „Сучасність та майбутнє аграрної науки та виробництва» (Львів, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи опубліковано у 10 наукових роботах, 4 з яких - статті у фахових наукових виданнях відповідної спеціальності, затверджених ВАК України.

Структура і об'єм дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, 3 розділів, висновків, практичних пропозицій та списку використаних джерел. Загальний обcяг роботи - 127 сторінок машинописного тексту, 6 таблиць, 24 рисунки. Перелік використаної літератури включає 158 джерел, з яких 96 іноземних авторів.

матеріал і основні методи досліджень

У дослідах були використані лабораторні миші лінії СВА. Для отримання ембріонів на стадіях розвитку 2, 4, 8 клітин та бластоцисти самиць піддавали гормональній стимуляції множинної овуляції (Манк М., 1990). Ембріони вилучали хірургічним шляхом (Манк М., 1990).

Для отримання ембріональних фібробластів миші у ембріонів віком 12,5 - 14,5 діб видаляли голови, кінцівки й кров'яні скупчення. Ембріональний матеріал, що залишався, роздроблювали механічним шляхом (Boquest A.C. et al., 1999) та дезагрегували за допомогою трипсинізації (Гаврилов В.И., 1964; Савченкова И.П. і співавт., 1994). Клітини оцінювали на життєздатність за допомогою стандартного тесту (Адамс Р., 1983). Концентрацію клітин підраховували за допомогою камери Горяєва (Адамс Р., 1983). Матеріал, дезагрегований механічним та хімічним способами, культивували у середовищі ДМЕМ + 10% FCS + 10 мкл/мл гентаміцину, збагаченому глюкозою (2 мг/мл та 3 мг/мл) та глютаміном (1 мг/мл) в умовах 37⁰С та 5% СО₂ в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994). Отримання суспензії клітин для пасування проводили за допомогою трипсинізації. Клітини з однієї чашки Петрі висівали в дві із розрахунку 1 об'єм суспензії клітин: 1 об'єм свіжого культурального середовища (Адамс Р., 1983; Савченкова И.П., 1997). Культивування проводили в умовах 37⁰С та 5% СО₂ в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994). Для формування фідерного моношару культуру ембріональних фібробластів миші обробляли мітоміцином С у концентрації 10 мкл/мл протягом 2 годин в умовах 37⁰ С та 5% СО₂ в атмосфері (Савченкова И.П. і співавт., 1994; Turksen K., 2002).

Для отримання клітин ВКМ бластоцисти культивували: 1) у середовищі М16 + BSA з подальшим переносом бластоцист, що вилупилися, у середовище ДМЕМ + FCS у спеціальні чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної поверхні (Манк М., 1990); 2) одразу у середовищі ДМЕМ + FCS до виходу бластоцист із зони пеллюцида з подальшим переносом у таке ж свіже середовище у спеціальні чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної поверхні (Березовская О.П. і співавт., 1986); 3) на фідерному шарі після видалення зони пеллюцида 0,5% розчином пронази (Савченкова И.П. і співавт., 1994; Turksen K., 2002); 4) на фідерному шарі з виходом бластоцист із зони пеллюцида та формуванням ВКМ. Клітини ВКМ відділяли від трофектодермальних виростів за допомогою мікропіпетки, інкубували 5 - 10 хвилин у середовищі М2 + БСА, яке не містило іонів Са²⁺ і Mg²⁺, та дисоціювали піпетуванням (Манк М., 1990). Клітини ВКМ культивували на фідерному моношарі у середовище ДМЕМ + 15% FCS + 4,5 мг/мл глюкози + 1 мг/мл глютаміну + 0,1 мМ 2-меркаптоетанолу + 10 мкл/мл гентаміцину (Савченкова И.П. і співавт., 1994; Turksen K., 2002).

ЕС-подібні клітини культивували протягом від 10 пасажів. Для пасування ЕС-подібних клітин проводили їх дисоціацію за допомогою трипсинізації (Evans M.J. et al., 1990; Turksen K., 2002). ЕС-подібні клітини пересівали у концентрації 2 - 4*10⁵ клітин/см². Культивування проводили на фідерному моношарі у середовищі ДМЕМ + 15% FCS + 4,5 мг/мл глюкози + 1 мг/мл глютаміну + 0,1 мМ 2-меркаптоетанолу + 10 мкл/мл гентаміцину в умовах 37⁰С та 5% СО₂ в атмосфері (Turksen K., 2002).

Культивування ЕС-подібних клітин з метою отримання ембріоїдних тіл проводили за стандартною методикою (Turksen K., 2002). Отримання ембріоїдних тіл проводили після кожного пасажу ЕС-подібних клітин.

Для ізоляції бластомерів проводили хімічну дебластомерізацію 2-х, 4-х та докомпактизаційних 8-и клітинних зародків (Манк М., 1990). Ізольовані бластомери культивували в умовах 37⁰С та 5% СО₂ в атмосфері в краплях середовища під мінеральною олією (Манк М., 1990; Tarkovski A.K., Wroblenska J., 1967), а також на фідерному моношарі ембріональних фібробластів миші. Для розвитку бластомерів використовували середовища М16 + BSA (Манк М., 1990), ДМЕМ + 10% FCS, ДМЕМ + 10% FCS + 1 мг/мл глюкози, ДМЕМ + 10 мг/мл FCS + 1 мг/мл глютаміну.

Документування результатів досліджень було проведено шляхом цифрової обробки відеозапису всіх маніпуляцій під мікроскопом.

Статистичний аналіз отриманих у результаті досліджень даних проводили за допомогою критерію Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990).

результати власних досліджень

Отримання та культивування ембріональних фібробластів миші. Аналіз методик з отримання ембріональних фібробластів визначив розбіжності в способі одержання ембріонального матеріалу, а саме необхідності етапу його трипсинізації (Савченкова И.П. і співавт., 1994; Boquest A.C. et al., 1999; Tao T. et al., 1999; Keefer C.L., Baldassare H. et al., 2001; Forsberg E.J. et al., 2002). Тому, було проведено порівняльний аналіз впливу механічної та ферментативної дезагрегації ембріонального матеріалу на отримання культури ембріональних фібробластів миші.

Механічна дезагрегація ембріонального матеріалу не приводила до прикріплення клітин до культуральної поверхні чашки Петрі та формування моношару клітин. Ми припустили, що відсутність адгезії ембріонального матеріалу до культуральної поверхні є наслідком його недостатньої дезагрегації.

Для повної дезагрегації ембріональний матеріал обробляли стандартним розчином 0,25% трипсин - 0,2% ЕDТА. У літературі час трипсинізації різниться та складає від 10 хвилин (Адамс Р., 1983) до 30 хвилин (Савченкова И.П. і співавт., 1994). Тому, встановлення найбільш відповідного для даного об'єкту часу трипсинізації було проведено за допомогою експозиції ембріонального матеріалу у розчині 0,25% трипсин - 0,2% ЕДТА протягом: 1) 5 хвилин; 2) 10 хвилин; 3) 20 хвилин; 4) 30 хвилин.

Як видно з рисунку 1, час трипсинізації 5 та 10 хвилин не призводить до порушень життєздатності клітин первинної культури порівняно з максимально визначеним часом ферментативної обробки у 30 хвилин, який, навпаки, залишає життєздатною лише незначну кількість клітин отриманої суспензії (р < 0,001). Однак, як показали результати трипсинізації, час обробки трипсином 5 хвилин залишає значну частину ембріонального матеріалу не дезагрегованою, тобто утворення суспензії клітин є неповним. Таким чином, можна зробити висновок, що утворення суспензії повністю дезагрегованих життєздатних клітин забезпечує режим трипсинізації 10 хвилин.

Клітини, дезагреговані у розчині 0,25% трипсин - 0,2% ЕDТА протягом 10 хвилин, ставили на культивування. Однак, формування моношару фібробластів також не відбувалося (табл. 1).

Ембріональний матеріал, отриманий як механічним, так і ферментативним шляхом, культивували у середовищі ДМЕМ, що використовується як стандартне для отримання ембріональних фібробластів миші. Аналіз літератури надав підстави припустити, що середовище ДМЕМ містить недостатню концентрацію глюкози та глютаміну, які складають по 1 мг/мл кожної речовини (Р. Фрешни, 1989). За літературними даними оптимальна концентрація глютаміну у культуральному середовищі складає від 0,7 до 2 мг/мл (Пол Д., 1963; Гаврилюк Б.К., Сафронов В.П., 1983; Фрешни Р., 1989), а глюкози - від 1 до 6 мг/мл, але деякі джерела визначають максимально можливу її концентрацію у середовищі як 2 мг/мл (Пол Д., 1963; Фридлянская Н.И., 1979; Фрешни Р., 1989). Тому, для культивування ембріонального матеріалу у середовищі ДМЕМ підвищували концентрації глютаміну до 2 мг/мл та глюкози до 2 мг/мл та 3 мг/мл.

Для остаточної перевірки можливості отримання моношару після тільки механічної дезагрегації проводили культивування ембріонального матеріалу, отриманого як механічним, так і ферментативним шляхом.

Результати досліду представлені у таблиці 1.

Таблиця 1. Вплив умов отримання ембріонального матеріалу та складу культурального середовища на формування моношару ембріональних фібробластів миші

Спосіб отримання ембріонального матеріалу	Культуральне середовище
	ДМЕМ	ДМЕМ + глюкоза	ДМЕМ + глютамін	ДМЕМ + глюкоза + глютамін
механічна дезагрегація	відсутність	відсутність	відсутність	відсутність
трипсинізція	відсутність	частковий	частковий	повний моношар

Слід відмітити, що у наших дослідженнях не спостерігалося різниці у розвитку клітин в залежності від концентрації (1 мг/мл та 2 мг/мл) глюкози, що додавали. Таким чином, одночасне додавання глюкози та глютаміну до середовища є необхідним, але для проліферації ембріональних фібробластів миші концентрація глюкози в межах 2 - 3 мг/мл не є суттєвим чинником.

Пасування культури ембріональних фібробластів миші. Отриману культуру ембріональних фібробластів пасували. Обробка розчином 0,25% трипсин - 0,2% ЕDТА, який рекомендовано літературі, призвела до загибелі клітин, що спостерігалося візуально та підтверджувалося тестом на життєздатність, яка складала 1,8%.

Тому, для пасування культури ембріональних фібробластів у наших дослідженнях була зменшена концентрація розчину ферменту до 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА, яку запропоновано (Фридлянская Н.И., 1979) для клітин, що найбільш схильні до травматизації. Тривалість трипсинізації визначали експериментально при постійному мікроскопічному контролі.

У результаті було встановлено, що час трипсинізації не повинен перевищувати 3 хвилини. У цьому разі життєздатність клітин становила 81,7%.

Розвиток ембріональних фібробластів у культурі характеризувався наявністю всіх етапів клітинного диференціювання, описаного для даної культури: спостерігалися клітини-попередникі кулястої форми, малоспеціалізовані фібробласти, стиглі фібробласти, фіброцити та з'єднувальні волокна у вигляді міжклітинних тяжів.

Пересів ембріональних фібробластів миші проводився протягом 7 - 10 пасажів. Обмеження кількості пасажів пов'язано з уникненням фази старіння культури, яка відбивалася у зниженні темпів проліферації та відкріпленні клітин від культуральної поверхні.

Отримання фідерного моношару ембріональних фібробластів миші. Культуру ембріональних фібробластів миші отримували з метою її використання у якості фідерного моношару. Для цього блокували мітоз ембріональних фібробластів за допомогою обробки їх культури мітоміцином С.

Було встановлено, що фідерний моношар є представлений зрілими фібробластами та незначною кількістю фіброцитів та залишається життєздатним in vitro протягом чотирьох діб.

Таким чином, у результаті проведених досліджень отримано фідерний моношар ембріональних фібробластів миші, який є однією з передумов, що забезпечує ефективність отримання та культивування тотипотентних клітин миші.

Отримання клітин-попередників ЕСК миші. Попередниками ембріональних стовбурових клітин є клітини ВКМ (ембріобласт). Для визначення ефективних умов їх отримання було проведено ряд дослідів.

У першій серії дослідів культивування бластоцист миші було проведено в 2 системах: 1) розвиток ембріонів у середовищі М16 + BSA з подальшим переносом бластоцист, що вилупилися, у краплі середовища ДМЕМ + FCS у спеціальні чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної поверхні (Манк М., 1990). 2) Культивування бластоцист одразу в краплях середовища ДМЕМ + FCS до їх виходу із зони пеллюцида з подальшим переносом у таке ж свіже середовище у чашки Петрі з адгезивним покриттям культуральної поверхні (Березовская О.П. і співавт., 1986).

Результати досліду представлено у таблиці 2.

Таблиця 2. Розвиток доімплантаційних ембріонів миші у різних культуральних системах*

Культуральна система	Кількість ембріонів
	всього отримано, шт.	вийшли із зони пеллюцида, шт. (%)	прикріпилися до культуральної поверхні, шт. (%)	утворили трофектодермальні вирости та ВКМ, шт. (%)
М16+BSA та ДМЕМ+FCS	102	68a (66,7±2,4)	43c (42,1±2,1)	відсутність
ДМЕМ + FCS	98	73b (74,5±2,2)	47d (48±1,9)	відсутність

Різниця між обома запропонованими системами культивування бластоцист миші за такими параметрами, як кількість ембріонів, що вийшли із зони пеллюцида, та кількість прикріплених до поверхні чашки Петрі бластоцист є вірогідною (р<0,05). Однак, у запропонованих умовах не спостерігалося ні розростання трофектодермальних виростів, ні формування горбику ВКМ.

У другій серії дослідів для отримання попередників ЕСК використовували фідерний шар ембріональних фібробластів миші. Був проведений порівняльний аналіз двох фідерних способів отримання ВКМ: 1) культивування бластоцист миші на фідерному моношарі з їх виходом із зони пеллюцида та розвитком ВКМ; 2) культивування бластоцист з видаленою 0,5% розчином пронази зоною пеллюцида на фідерному моношарі з розвитком ВКМ.

В обох випадках культивування ембріонів було проведено у середовищі ДМЕМ + FCS, яке запропоновано у літературі для формування ВКМ. Як у першому, так і у другому випадках формування трофобластичних виростів та ВКМ не відбувалося. Для розв'язання цієї проблеми у середовищі ДМЕМ підвищили концентрації глюкози та глютаміну на 1 мг/мл кожної речовини. Такий підхід було обумовлено його ефективністю, яку було досягнуто при культивуванні ембріональних фібробластів, а також на підставі відповідних літературних даних. Отримані результати представлені у таблиці 3.

Таблиця 3. Порівняння умов отримання клітин-попередників ЕСК миші

Спосіб отримання ВКМ	Кількість ембріонів	Підсумкова кількість сформованих ВКМ, шт. (%)
	всього отримано, шт.	без зони пеллюцида, шт.(%)	утворили
			трофектодермальні вирости, шт.(%)	ВКМ, шт. (%)
розвиток ембріонів на фідері	115	102a (88,7±3)	80b (78,4±4,1)	66c (82,5±4,3)	66d (57,6±4,6)
видалення зони пеллюцида проназою	108	92a (85,2±3,4)	68b (74±4,6)	55c (80,9±4,8)	55d (51±4,8)

Статистичний аналіз отриманих даних не виявив вірогідної різниці між обома групами за всіма параметрами, що оцінювали.

Таким чином, можна зробити висновок, що 0,5% розчин пронази не впливає на формування клітин ВКМ. Отримання клітин-попередників ЕСК миші є можливим при культивуванні бластоцист на фідерному моношарі у середовищі ДМЕМ + FCS при одночасному підвищенні у середовищі концентрацій глюкози та глютаміну до 2 мг/мл кожної речовини.

Формування колоній ЕС-подібних клітин миші. Для формування колоній ЕС-подібних клітин проводили культивування клітин ВКМ на фідерному моношарі. Для визначення дії пронази на формування ЕС-подібних клітин зберігали розподіл ембріонального матеріалу на дві групи: 1) вихід ембріонів із зони пеллюцида на фідерному моношарі та їх подальше культивування; 2) культивування бластоцист з видаленими за допомогою пронази зонами пеллюцида.

Отримані результати представлені у таблиці 4. Статистичний аналіз отриманих даних не виявив вірогідної різниці у розвитку ембріонального матеріалу в обох групах за всіма параметрами, що оцінювали.

Таблиця 4. Вплив пронази на формування колоній ЕС-подібних клітин миші

Спосіб отримання бластоцист без зони пеллюцида	Кількість
	отриманих ембріобластів, шт.	структур трофобластичної морфології, шт. (%)	сформованих колоній ЕС-подібних клітин, шт. (%)
розвиток бластоцист на фідері	66	8a (12,1±4)	22b (33,3±5,8)
видалення зони пеллюцида бластоцист проназою	55	7a (12,7±4,5)	17b (31±6,3)

Таким чином, успішний розвиток на фідері бластоцист з їх виходом із зони пеллюцида та подальшим утворенням ВКМ і ЕС-подібних клітин дозволяє уникнути етапу використання пронази. Встановлено, що використання глюкози у концентрації 5,5 мг/мл та глютаміну у концентрації 2 мг/мл у культуральному середовищі забезпечує отримання ЕС-подібних клітин мишей.

Пасування ЕС-подібних клітин миші. Важливим етапом пасування Ес-подібних клітин є їх трипсинізація. Для визначення найбільш ефективного способу дисоціації колоній ЕС-подібних клітин був проведений порівняльний аналіз дезагрегації клітин за допомогою двох методів: 1) використання розчину 0,25% трипсин - 0,2% ЕДТА з його подальшим видаленням за допомогою центрифугування та наступного ресуспендиювання клітин у культуральному середовищі (стандартний метод) (Савченкова И.П., 1997; Turksen K., 2002); 2) модифікація даного методу за рахунок дисоціації клітин піпетуванням при постійному мікроскопічному контролі у розчині 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА.

Статистичний аналіз отриманих даних підтвердив, що при пасуванні ЕС-подібних клітин концентрація ферменту 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА значно збільшує (майже в 9 разів) життєздатність клітин (р < 0,001).

Час обробки розчином 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА був зафіксований від 30 секунд до 1 хвилини.

Також було проведено аналіз впливу центрифугування суспензії, отриманої у такий спосіб, на життєздатність ЕС-подібних клітин. У результаті при центрифугуванні кількість життєздатних клітин склала 5,3% (~0,16*106 клітин/см2). У разі інактивації дії трипсину середовищем, що містить фетальну сироватку теляти, без центрифугування кількість життєздатних клітин становила 91,1% (~2,7*106 клітин/см2). Таким чином, інактивація трипсину середовищем, що містить фетальну сироватку теляти, дозволяє уникнути центрифугування отриманої суспензії клітин.

Використання модифікованого методу дозволило провести пасування ЕС-подібних клітин з підтриманням їх недиференційованого стану протягом не менш 10 пасажів. Таке багатократне пасування без диференціювання цих клітин є підтвердженням їх тотипотентності.

Утворення ЕС-подібними клітинами миші ембріоїдних тіл. При використанні стандартної методики ЕС-подібні клітини утворювали ембріоїдні тіла. Було встановлено, що підтримання ембріоїдних тіл у культурі є можливим протягом 7 - 9 діб: після 5 - 6 діб вони прикріплювалися до культуральної поверхні, а потім спостерігалися їх фрагментація та деградація. Слід відмітити, що формування ембріоїдних тіл відбувалося після кожного пасажу ЕС-подібних клітин, а характер поведінки ембріоїдних тіл у культурі був однаковим.

Таким чином, виходячи з джерела походження, формування колоній клітин з ЕС-морфологією, довгострокового пасування з підтриманням недиференційованого стану та утворення ембріоїдних тіл, можна зробити висновок, що отримані нами клітини є тотипотентними ЕС-подібними.

Вплив стадії розвитку ембріонів на кількість ізольованих тотипотентних бластомерів миші. Об'єктом біотехнологічних досліджень є у тому числі й тотипотентні бластомери ссавців (Квасницкий А.В. і співавт., 1988; Wilton L.J., Trounson A.O., 1989; Безуглий М.Д., 2002). На 2-х, 4-х та ранній 8-и клітинній стадіях ембріогенезу бластомери миші відрізняються властивостям, але залишаються тотипотентними. Зв'язок між клітинами на цих стадіях забезпечений лише адгезією. На стадії 8-и клітин відбуваються компактизація та рекомпактизація бластомерів, які призводять до утворення щілинних і тісних контактів між клітинами. Це обумовлює диференціювання бластомерів та, як наслідок, втрату ними тотипотентності (Дыбан А.П., 1988). На сьогоднішній день залишається не вирішеним питання можливості використання у якості тотипотентного матеріалу бластомерів, ізольованих від ранніх 8-ми клітинних ембріонів.

У даній роботі був проведений аналіз впливу віку ембріонів на кількість тотипотентних бластомерів, отриманих ферментативним шляхом, а також на подальший розвиток in vitro ізольованих бластомерів.

Статистичний аналіз отриманих даних вказує на відсутність вірогідної різниці у кількості ізольованих бластомерів від 2-х та 4-х клітинних ембріонів, а також підтверджує вірогідно (р<0,01) меншу кількість бластомерів, що отримано від ембріонів на стадії розвитку 8 клітин, порівняно з кількістю бластомерів, ізольованих від 2-х та 4-х клітинних ембріонів.

Таким чином, отримання тотипотентних бластомерів від 8-ми клітинних ембріонів стає ускладненим, але залишається можливим.

Вплив умов і середовищ культивування на розвиток тотипотентних бластомерів миші. Відомо, що ефективність проліферації in vitro ізольованих бластомерів є низькою (Квасницкий А.В. і співавт., 1988). Відмічено, що можливо її підвищити шляхом ускладнення середовища, зокрема за рахунок додавання до нього енергетичних речовин і ростових факторів (Wilton L.J., Trounson A.O., 1989).

Для культивування ізольованих бластомерів у даній роботі були використані: стандартне середовище М16 + BSA; більш складне середовище ДМЕМ + FCS; а також середовища ДМЕМ + FCS + глютамін та ДМЕМ + FCS + глюкоза.

Культивування бластомерів у всіх визначених середовищах було проведено за допомогою стандартного методу - у краплях середовища під мінеральною олією, а також на фідерному шарі ембріональних фібробластів миші.

Слід відмітити, що ростові фактори виділяються фідерними клітинами та присутні у сироватці, а концентрації глюкози та глютаміну були обрані на підставі відповідних даних літератури і склали по 1 мг/мл кожної речовини.

Для визначення впливу стадії розвитку ембріонів на подальший розвиток отриманих від них бластомерів та на зберігання клітинами тотипотентності, проводили порівняльний аналіз проліферації бластомерів, ізольованих на 2-х, 4-х та 8-и клітинних стадіях ембріогенезу миші.

У результаті проліферації бластомерів у краплях будь-якого середовища - у відсутності фідерного моношару - не спостерігалося внаслідок їх прилипання до культуральної поверхні.

Розвиток бластомерів на фідерному шарі відбувався у всіх середовищах (табл. 5) та мав однаковий характер: бластомери прикріплювалися до фідеру, розпластувалися та проліферували з утворенням колоній ЕС-подібного типу, що розглядають як зберігання ними тотипотентності (Wilton L.J., Trounson A.O., 1989). Для підтримки тотипотентного стану бластомерів їх культивування проводили не більш ніж до 8-10 клітин у колонії.

У результаті проведених дослідів не визначено впливу стадії розвитку ембріонів на рівень подальшої проліферації у культурі отриманих від них тотипотентних бластомерів (табл. 5). Таким чином, якісні відмінності, що мають місце в процесі дроблення, не є компетентними по відношенню до тотипотентності бластомерів, ізольованих від 2-х, 4-х та ранніх 8-и клітинних ембріонів.

Однак, у всіх середовищах до 2-3 клітин дробилося помітно більше бластомерів, ніж до 8-10 клітин (р<0,05) (табл. 5). Таким чином, зі збільшенням кількості мітотичних циклів відбувається зменшення потенційної здатності бластомерів до подальшого розвитку in vitro.

Встановлено, що середовище ДМЕМ + FCS порівняно з середовищем М16 + BSA вірогідно (р<0,05) підвищувало кількість бластомерів, що ділилися (табл. 5).

Таблиця 5. Вплив культурального середовища на розвиток бластомерів, отриманих від мишачих ембріонів ранніх стадій розвитку

Культуральне середовище	Стадія розвитку ембріону
	2-клітинна	4-клітинна	8-клітинна
	Стадія розвитку бластомерів	Стадія розвитку бластомерів	Стадія розвитку бластомерів
	2-3 кл., %	4-6 кл., %	8-10 кл., %	2-3 кл., %	4-6 кл., %	8-10 кл., %	2-3 кл., %	4-6 кл., %	8-10 кл., %
М16 + BSA	46 ±3,5	34 ±3,4	26 ±3,3	46,3 ±2,8	36,3 ±2,7	27,5 ±2,5	38,8 ±2,7	33,6 ±2,6	23,6 ±2,4
ДМЕМ + FCS	62 ±3,5	54 ±3,6	38 ±3,5	63,7 ±2,2	52,5 ±2,8	37,5 ±2,7	58,6 ±2,7	48,6 ±2,8	33,8 ±2,6
ДМЕМ+FCS+ глютамін	77,1 ±2,6	71,4 ±2,7	55,7 ±3	77,5 ±2,4	71,3 ±2,6	45 ±2,8	71,3 ±2,5	63,8 ±2,7	48,8 ±2,8
ДМЕМ+FCS+ глюкоза	63 ±3,2	48,6 ±3,7	34,3 ±3,1	60 ±3,5	48,4 ±3,5	36 ±3,5	57,5 ±3,2	46,3 ±3,2	35 ±3,1

Підвищення концентрації глюкози до 2 мг/мл у культуральному середовищі не впливало на проліферацію окремих бластомерів миші, а підвищення концентрації глютаміну у середовищі ДМЕМ + FCS до 2 мг/мл вірогідно (р<0,01) стимулювало проліферацію ізольованих тотипотентних бластомерів до 8-10 клітин.

Таким чином, модифікація методу культивування бластомерів за рахунок використання фідерного шару ембріональних фібробластів миші, а також середовища ДМЕМ+FCS, збагаченого глютаміном, забезпечує підвищення ефективності проліферації in vitro тотипотентних бластомерів миші.

висновки

1.У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове практичне вирішення проблеми удосконалення технології отримання та культивування тотипотентних бластомерів і ЕС-подібних клітин, яке досягається за рахунок:

a.використання фідерного моношару ембріональних фібробластів миші;

b.селективного підходу до вибору способу дезагрегації ембріональних клітин: для бластомерів і клітин-попередників ЕСК - піпетуванням у безкальцієвому середовищі та для ембріональних фібробластів і ЕС-подібних клітин -трипсинізацією, режими якої дозволяють отримувати життєздатні клітини;

c.розробки окремо для кожного типу ембріональних клітин відповідної концентрації глюкози культурального середовища при постійному підвищеному рівні глютаміну.

2.Трипсинізація ембріонального матеріалу у розчині 0,25% трипсин - 0,2% ЕДТА протягом 10 хвилин забезпечує утворення суспензії життєздатних клітин для отримання культури ембріональних фібробластів миші. Для пасування ембріональних фібробластів концентрація розчину даного ферменту має становити 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА, а час ферментативної обробки не повинен перевищувати 3 хвилини.

3.Довгострокове культивування ембріональних фібробластів миші є можливим протягом 7 - 10 пасажів. У відсутності пасування фібробласти проліферують у культурі протягом 5 діб, потім починаються процеси деградації, які призводять до загибелі культури.

4.Фідерний моношар ембріональних фібробластів миші є життєздатним протягом 4 діб підтримання в умовах in vitro. Його використання забезпечує вихід бластоцист миші із зони пеллюцида з подальшим формуванням клітин-попередників ЕСК, ЕС-подібних клітин, проліферацію ЕС-подібних клітин та ізольованих тотипотентних бластомерів миші.

5.Концентрація глютаміну 2 мг/мл у культуральному середовищі забезпечує стабільний розвиток ембріональних клітин миші in vitro. Концентрація глюкози 2 мг/мл у культуральному середовищі є достатньою для розвитку клітин ВКМ ембріонів та ембріональних фібробластів миші. Її концентрація 5,5 мг/мл забезпечує формування та пасування ЕС-подібних клітин миші. Концентрація у середовищі глюкози 1 мг/мл є достатньою для проліферації у культурі тотипотентних бластомерів миші.

6.Стимулюючий вплив ембріональних фібробластів на формування ЕС-подібних клітин дозволяє уникнути етапу використання пронази, хоча її 0,5% розчин не впливає на подальший розвиток ембріонів з утворенням клітин ВКМ та ЕС-подібних клітин.

7.Модифікація методу трипсинізації ЕС-подібних клітин за рахунок піпетування у розчині ферменту 0,05% трипсин - 0,02% ЕDТА при постійному мікроскопічному контролі дозволяє досягнути розвитку ЕС-подібних клітин у культурі зі зберіганням їх недиференційованого стану протягом не менш 10 пасажів.

8.Якісні відмінності, що мають місце в процесі дроблення, не є компетентними по відношенню до тотипотентності бластомерів, ізольованих від 2-х, 4-х та докомпактизаційних 8-и клітинних ембріонів. Восьмиклітинна стадія розвитку мишачих ембріонів є перехідною з точки зору зберігання бластомерами тотипотентності.

9.Культивування на фідерному моношарі ембріональних фібробластів забезпечує проліферацію тотипотентних бластомерів миші, ізольованих від 2-, 4- та 8-клітинних зародків, до 8-10 клітин з утворенням колоній ЕС-подібного типу. Зі збільшенням кількості мітотичних циклів у культурі відбувається зменшення потенцій ізольованих тотипотентних бластомерів до розвитку.

10.Для пасування культур клітин ембріонального походження рекомендується проводити дезагрегацію клітин шляхом піпетування у розчині 0,05% трипсину - 0,02% ЕДТА при постійному мікроскопічному контролі.

11.Для підвищення ефективності проліферації у культурі ізольованих тотипотентних бластомерів їх культивування рекомендується проводити на фідерному шарі ембріональних фібробластів миші у середовищі ДМЕМ + FCS, збагаченому глютаміном.

12.Для отримання культури ембріональних фібробластів миші рекомендується проводити трипсинізацію ембріонального матеріалу у розчині 0,25% трипсину - 0,2% ЕДТА протягом 10 хвилин з подальшим культивуванням отриманої суспензії у середовищі ДМЕМ з підвищеними концентраціями глюкози та глютаміну до 2 мг/мл кожної речовини.

13.Розроблені технологічні підходи, а також накопичений ілюстративний матеріал можуть бути використані в учбових курсах з біотехнології, гістології та біології розвитку ссавців вищих учбових закладів.

14.Яковлева М.И., Щербак Е.В., Гордиенко Н.А. Проблемы и перспективы использования эмбриональных стволовых клеток в медицине // Медицина сьогодні і завтра. - 2004. - №2. - С. 75 - 76.

15.Яковлєва М.І., Щербак О.В. Деякі аспекти культивування поза організмом доімплантаційних ембріонів мишей з метою отримання плюрипотентних клітин // НТБ Ін-ту Біології тварин УААН. - Львів. - 2004.- В. 5. - № 3. - С. 226 - 228.

16.Щербак О.В., Яковлєва М.І. Культивування ембріонів миші для отримання клітин-попередників ЕСК // Тез. ІІ Всеукр. наук.-практ. конф. „Біотехнологія. Освіта. Наука». - Львів. - 2004. - С. 110.

17.Яковлєва М.І., Щербак О.В. Удосконалення умов і середовищ для отримання та культивування тотипотентних клітин мишей // НТБ. - № 89. - Х.: ІТ УААН. - 2005. - С. 172 - 177.

18.Стрельников Л.С., Яковлева М.И., Щербак Е.В., Стрилец О.П. Использование биотехнологических методов для создания трансплантантов органов человека // Мат. VІ Націон. з'їзду фармацевтів України „Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України». - Х.: НФаУ. - 2005. - С. 368 - 369.

19.Яковлєва М.І., Щербак О.В. Отримання культури первинних ембріональних фібробластів миші // Наукові вісті НТУ України. - „КПІ». - 2005. - № 6 (44). - С. 139 - 142.

20.Медведовская М.И., Щербак Е.В. Получение тотипотентных клеток мыши для использования в целях современных биотехнологий // Мат. ІІ Міжнародн. наук.-практ. конф. „Сучасні наукові дослідження - `2006». - Дніпропетровськ: Наука і освіта. - 2006.- Т. 20. - С. 8 - 10.

21.Медведовська М.І., Щербак О.В. Отримання та культивування ЕС-подібних клітин мишей // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. - Львів. - Т. 8. - № 2 (29). - Частина 2. - 2006. - С. 96 - 101.

22.Medvedovska M.I. Embryoid bodies formation as an initial stage of ES-like cells differentiation in mice // Матеріали ІІІ Міжнародної науково-практичної конференції „Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика -`2006». - Дніпропетровськ: Наука і освіта. - 2006. - Т. 2. - С. 49 - 51.

23.Медведовська М.І. Вплив умов культивування на розвиток in vitro бластомерів, отриманих від ранніх ембріонів миші // Науковий вісник ЛНАВМ ім. С.З. Гжицького. - Львів. - Т. 8. - № 3 (30). - Частина 2. - 2006. - С. 102 - 108.

Размещено на Allbest.ru