Вплив структурних компонентів бактерій та глутаргіну на функціональну активність природних кілерів in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив структурних компонентів бактерій та глутаргіну на функціональну активність природних кілерів in vitro

лімфоцит бактеріальний вірусний захворювання

Анотація

Салманова О.М. Вплив структурних компонентів бактерій та глутаргіну на функціональну активність природних кілерів in vitro. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Луганський державний медичний університет. - Луганськ, 2006.

Дисертація присвячена встановленню in vitro механізмів впливу структурних компонентів бактерій і глутаргіну на функціональну активність природних кілерів. Вперше вивчена цитотоксична активність природних кілерів під впливом різних концентрацій пептидогліканів і тейхоєвих кислот золотавого стафілокока і ліпополісахаридів палички синього гною; показано, що структурні компоненти бактерій дозозалежно впливають на цитотоксичність природних кілерів - малі дози стимулюють її, а великі - пригнічують.

Досліджена продукція фактора некрозу пухлини-, г-інтерферону, інтерлейкінів-1в, -2, -4 і -6 природними кілерами, стимульована бактеріальними компонентами різних концентрацій; встановлена пряма залежність секреції від діючої дози і виду бактеріального компонента. Встановлено особливості змін у системі циклічних нуклеотидів, активності перекисного окиснення ліпідів та системи антиоксидантного захисту в природних кілерах, які виникають після дії різних доз і видів бактеріальних структурних компонентів. Встановлено спроможність бактеріальних компонентів посилювати експресію маркерів апоптозу - CD38 і CD95 на поверхні природних кілерів. Встановлено позитивний вплив глутаргіну на функціональну і метаболічну активність природних кілерів, підданих дії різних концентрацій структурних компонентів бактерій. Отримані дані впроваджені в навчальний процес 2-х кафедр медичних вузів України.

Аннотация

Салманова О.Н. Влияние структурных компонентов бактерий и глутаргина на функциональную активность естественных киллеров in vitro. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Луганский государственный медицинский университет. - Луганск, 2006.

Диссертация посвящена установлению in vitro механизмов влияния структурных компонентов бактерий и глутаргина на функциональную активность естественных киллеров. Объектом исследования послужили естественные киллеры периферической крови человека in vitro. Были использованы следующие методы исследования: бактериологические (выделение и идентификация бактериальных культур от больных; выделение пептидогликанов, тейхоевых кислот и липополисахаридов), иммунологические (выделение естественных киллеров из периферической крови, определение индекса цитотоксичности, концентраций интерлейкинов, интерферона и фактора некроза опухоли, циклических и адениловых нуклеотидов в естественных киллерах), морфологические (окраска акридином оранжевым), биохимические (метод проточной цитометрии, определение малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, каталазы, супероксиддисмутазы, лактатдегидрогеназы), статистические (метод вариационной статистики).

Впервые изучена цитотоксическая активность естественных киллеров под влиянием разных концентраций пептидогликанов и тейхоевых кислот золотистого стафилококка и липополисахаридов палочки синего гноя; показано, что структурные компоненты бактерий дозозависимо влияют на цитотоксичность естественных киллеров - малые дозы стимулируют ее, а большие - угнетают. Исследована продукция фактора некроза опухоли-, г-интерферона, интерлейкинов-1в, -2, -4 и -6 естественными киллерами, стимулированная бактериальными компонентами разных концентраций; установлена прямая зависимость секреции от действующей дозы и вида бактериального компонента. Установлены особенности изменений в системе циклических нуклеотидов, активности перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты в естественных киллерах, которые возникают после действия разных доз и видов бактериальных структурных компонентов. Установлена способность бактериальных компонентов усиливать экспрессию маркеров апоптоза - CD38 и CD95 на поверхности естественных киллеров. Установлено положительное влияние глутаргина на функциональную и метаболическую активность естественных киллеров, подвергнутых действию разных концентраций структурных компонентов бактерий. Рекомендовано использование глутаргина, а также пептидогликанов, тейхоевых кислот золотистого стафилококка и липополисахаридов палочки синего гноя в малых действующих концентрациях (до 10 мкг/л) для клинических исследований по стимуляции функциональной активности естественных киллеров. Полученные данные внедрены в учебный процесс 2-х кафедр медицинских вузов Украины.

Ключевые слова: бактерии, структурные компоненты, глутаргин, естественные киллеры, активность.

Summary

Salmanova O.N. Influence of bacterial structural components and glutargin on the functional activity of natural killers in vitro. - Manuscript.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of medical sciences on speciality 14.03.04 - pathological physiology. - Lugansk State Medical University. - Lugansk, 2006.

The thesis is dedicated to the establishment in vitro of the mechanisms of bacterial structural components and glutargin influence on the functional activity of natural killers. For the first time the cytotoxic activity of natural killers under the influence of different concentrations of Staphylococcus aureus peptidoglycans and teichoic acids and Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharides is investigated; it is shown, that bacterial structural components have the dose-dependent influence on cytotoxicity of natural killers - small dozes stimulate it, and high one - suppress. Production of the tumor necrosis factor , г interferon, interleukins 1?, 2, 4 and 6 by natural killers, stimulated by bacterial components of different concentration is studied; direct dependence of secretion on the doze and the kind of bacterial component is shown. Features of changes in system of cyclic nucleotides, activity of lipid peroxidation and antioxidant defense system in natural killers after action of different dozes and kinds of bacterial structural components are established. The ability of bacterial components to strengthen the apoptic markers expression CD38 and CD95 on the surface of natural killers is established. The positive influence of glutargin is established on the functional and metabolic activity of the natural killers treated with different concentrations of bacterial structural components. The obtained data are used in educational process of 2 departments of medical universities of Ukraine.

Keywords: bacteria, structural components, glutargin, natural killers, activity.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Природні клітини-кілери (ПК-клітини) - унікальна субпопуляція лімфоцитів, яка здатна спонтанно, без попередньої сенсибілізації антигеном, убивати злоякісні та заражені мікроорганізмами, а також деякі інші типи клітин (Зак К.П. та ін., 1992; Dam J. et Mariuzza R.A., 2003). ПК-клітини перешкоджають росту злоякісних пухлин, розвитку вірусних захворювань, здійснюють імунологічний нагляд за раковими клітинами - елімінуючи їх, а також відіграють важливу роль у регуляції багатьох імунних реакцій - особливо продукції імуноглобулінів, а також кровотворення завдяки спроможності цих клітин секретувати інтерферони (ІФН), інтерлейкіни (ІЛ) та ін. (Biron C.A., 1997; Jewett A. et al., 2006).

За умов постійного впливу на організм людини різних шкідливих факторів, що особливо актуально у великих промислових регіонах з високим техногенним забрудненням навколишнього середовища, має місце збільшення захворюваності на пухлини, бактеріальні та вірусні інфекції. Зазначені хвороби у своєму патогенезі тісно пов'язані з імунодефіцитним станом, який супроводжується, поряд з іншими негативними змінами, пригніченням системи ПК-клітин (Дріянська В.Є., 1998; Филатова С.В. та ін., 2002; Лоскутова І.В., 2004).

Одним з найбільш важливих аспектів дослідження природного імунітету, зокрема, системи ПК-клітин, є вивчення факторів, її контролюючих. У цьому відношенні найбільш вивченими є ІЛ, ІФН, простагландіни, а також кортикостероїди, гормони тимусу та ін. В експериментах на тваринах встановлено, що на функціональну активність ПК-клітин впливають не тільки живі мікроорганізми, але й їх деривати - мурамілпептиди, ліпополісахариди (ЛПС), токсини (Рубан Т.В. та ін., 2001; Muller-Alouf H. et al., 2004). Структурні компоненти бактерій мають широкий спектр біологічної активності, стимулюючи або пригнічуючи функціональну активність ПК-клітин, нейтрофілів і моноцитів, зокрема секрецію зазначеними клітинами ІЛ-1, -2, -4, -10, -12, -15, -18, фактора некрозу пухлини- (ФНП-), ІФН та інших біологічно активних речовин (Казімірко Н.К. та ін., 2005; Tarkkanen J. et al., 2006). Водночас, багато аспектів впливу структурних компонентів бактерій на ізольовану культуру ПК-клітин залишаються недослідженими: недостатньо вивчений дозозалежний вплив бактеріальних компонентів на функціональну активність, внутрішньоклітинний метаболізм і експресію мембранних рецепторів.

Відомо, що універсальними месенджерами всіх біохімічних внутрішньоклітинних реакцій є система аденозинових (цАМФ) і гуанозинових (цГМФ) циклічних нуклеотидів (Гайдаш І.С. та ін., 2001). Від їх внутрішньоклітинного вмісту та, взаємного співвідношення, як і від вмісту і співвідношення аденілових нуклеотидів (аденозинтрифосфорної кислоти - АТФ, аденозиндифосфорної кислоти - АДФ і аденозинмонофосфорної кислоти - АМФ), а також ізоферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ) залежать як швидкість біохімічних процесів, так і функціональна активність клітин, у тому числі і ПК-клітин. Зміни в системах циклічних і аденілових нуклеотидів мають значення в реалізації апоптозу.

Поряд із системами циклічних і аденілових нуклеотидов, а також з ізоферментами ЛДГ, істотно впливає на функціонування клітин стан клітинних мембран, який регулюється активністю процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) і системою антиоксидантного захисту (АОЗ) (Іоффе І.В., 2004). Посилення ПОЛ ініціюється гіпоксією, ендогенними та екзогенними токсинами, у тому числі і бактеріального походження. Істотним потенціалом, який активує ПОЛ, володіють структурні компоненти бактерій - пептидоглікани, тейхоєві кислоти (ТК) і ЛПС. Активність ПОЛ регулюється системою АОЗ, зокрема, її ключовими ферментами каталазою (КТ) і супероксиддисмутазою (СОД). Надмірна активація ПОЛ і недостатність АОЗ спроможні викликати деструкцію клітинних мембран і призвести до загибелі клітини за допомогою активації апоптозної програми. Дотепер дозозалежний вплив структурних компонентів бактерій на систему циклічних і аденілових нуклеотидов, стан процесів ПОЛ, системи АОЗ та активність апоптозу в ПК-клітинах та інших імуноцитах вивчений недостатньо (Казімірко Н.К. та ін., 2000; Гайдаш І.С. та ін., 2001).

Широке використання в лікуванні соматичної і інфекційної патології антибіотиків, а при лікуванні злоякісних новоутворень - цитостатичної хіміотерапії, які збільшують імунодепресивний стан і метаболічні порушення, у тому числі і в імунокомпетентних клітинах, обумовило необхідність пошуку нових методів імунореабілітації (Кирпичникова Г.И. та ін., 1997; Антіпова С.В., 2004). В останні роки для лікування бактеріальних і вірусних захворювань стали використовувати новий український препарат глутаргін, який є дипептидом L-глутаміну і L-аргиніну та має антиоксидантну, детоксикуючу дію, позитивно впливає на метаболізм клітин різних органів і тканин (Бабак О.Я., 2003; Романюк Б.П. та Мещеряков О.С., 2004). У той же час, у науковій літературі інформація про вплив глутаргіну на систему ПК-клітин, як інтактних, так і підданих впливу структурних компонентів бактерій, відсутня.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом наукової роботи кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (ЛДМУ) № 0198U005713 «Запалення як наслідок дії бактерій».

Мета роботи: Встановити in vitro механізми впливу структурних компонентів бактерій і глутаргіну на функціональну активність ПК-клітин.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

Вивчити цитотоксичну активність ПК-клітин під впливом різних концентрацій структурних компонентів бактерій (пептидогліканів, ТК та ЛПС).

Дослідити продукцію ФНП-, г-ІФН, ІЛ-1в, -2, -4 і -6 ПК-клітинами при дії на них різних концентрацій бактеріальних пептидогліканів, ТК і ЛПС.

Вивчити зміни внутрішньоклітинного вмісту в ПК-клітинах циклічних і аденілових нуклеотидів, ізоферментів ЛДГ, активності ПОЛ і системи АОЗ.

Вивчити в ПК-клітинах експресію маркерів апоптозу - рецепторів СD38 і CD95 під дією різних концентрацій бактеріальних пептидогліканів, ТК і ЛПС.

Вивчити вплив глутаргіну на цитотоксичну, секреторну і метаболічну активність ПК-клітин, які були піддані дії різних концентрацій бактеріальних пептидогліканів, ТК і ЛПС.

Об'єкт дослідження: ПК-клітини периферійної крові людини in vitro.

Предмет дослідження: механізми впливу структурних компонентів бактерій (пептидогліканів, ТК і ЛПС) і глутаргіну на функціональну активність ПК-клітин in vitro.

Методи дослідження: бактеріологічні (виділення та ідентифікація бактеріальних культур від хворих; виділення пептидогліканів, ТК і ЛПС), імунологічні (виділення ПК-клітин з периферійної крові, визначення індексу цитотоксичності (ІЦ), концентрацій ІЛ, ІФН і ФНП-, циклічних і аденілових нуклеотидів у ПК-клітинах, клітин з маркерами CD38 та CD95), морфологічні (фарбування акридином оранжевим), біохімічні (метод проточної цитометрії, визначення малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК), КТ, СОД, ЛДГ), статистичні (метод варіаційної статистики).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчена цитотоксична активність ПК-клітин під впливом різних концентрацій пептидогліканів, ТК і ЛПС. Структурні компоненти бактерій дозозалежно впливають на цитотоксичність - малі дози стимулюють її, а великі - пригнічують. Досліджена продукція ФНП-, г-ІФН, ІЛ-1в, -2, -4 і -6 ПК-клітинами, стимульована бактеріальними компонентами різних концентрацій; встановлена пряма залежність секреції від діючої дози і виду бактеріального компонента. Встановлені особливості змін у системі циклічних нуклеотидів, активності ПОЛ і системи АОЗ в ПК-клітинах, які виникають при дії різних доз і видів бактеріальних структурних компонентів. Встановлено спроможність бактеріальних компонентів посилювати експресію маркерів апоптозу - CD38 і CD95 на поверхні ПК-клітин. Показано позитивний вплив глутаргіну на функціональну і метаболічну активність ПК-клітин, підданих дії різних концентрацій пептидогліканів, ТК і ЛПС.

Практичне значення отриманих результатів. Глутаргін, а також пептидоглікани, ТК і ЛПС в малих діючих концентраціях (до 10 мкг/л) можуть бути використані для клінічних досліджень із стимуляції функціональної активності ПК-клітин. Отримані дані використовуються в навчальному процесі кафедр патофізіології і мікробіології ЛДМУ МОЗ України, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми наукового дослідження, постановка мети, задач і обговорення одержаних результатів, планування роботи були здійснені разом із науковим керівником професором І.С. Гайдашем. Авторкою самостійно проведений: патентно-інформаційний пошук за допомогою бази даних «Medline», аналіз літератури за темою дисертації, виконана експериментальна частина роботи, зокрема, виділення та ідентифікація золотавого стафілокока і палички синього гною, екстракція пептидогліканів, ТК і ЛПС із клітинної стінки; імунологічні, біохімічні, морфологічні дослідження, написані всі розділи дисертації та автореферат. Допомога у наданні клінічного матеріалу для виділення та ідентифікації бактерій була здійснена лікарями-травматологами Луганського обласного остеомієлітичного центру МОЗ України.

Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації були викладені та обговорені на: Республіканській науковій конференції молодих вчених та студентів «Актуальні проблеми клінічної імунології, алергології та генетики» (Луганськ, 2001 р.), 97-му з'їзді Анатомічного товариства Німеччини (Галл, 2002 р.), науковій конференції «Треті читання ім. В.В. Підвисоцького» (Одеса, 2004 р.), IV Національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Чернівці, 2004 р.), а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів в 2001-2006 рр.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових статей (2 - одноосібні) та 3 тез в часописах та збірках, які відповідають вимогам ВАК України та надруковані згідно вимог, викладених в пункті 3 Постанови ВАК України від 15 січня 2003 р. за № 7-05/1.

Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 137 сторінках комп'ютерного набору (5,0 авторських аркушів) та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 22 таблицями. Список літератури включає 181 джерело вітчизняних та іноземних авторів.

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Протягом 2000-2002 рр. нами було проведене бактеріологічне обстеження 89 хворих (вік 20-40 років) на хронічний травматичний остеомієліт кісток гомілки на фоні дефекту м'яких тканин над кістковою порожниною з вираженим склерозом кісткового ложа. Хворі знаходились на лікуванні в Луганському обласному остеомієлітичному центрі МОЗ України.

У хворих під час оперативних втручань забирали патологічний матеріал, поміщали його в середовище 199 і транспортували в бактеріологічну лабораторію кафедри мікробіології ЛДМУ. В лабораторії проводили виділення чистої культури та ідентифікацію стафілококів і паличок синього гною за морфологічними, тінкториальними, культуральними і біохімічними властивостями, а також за основними ознаками патогенності згідно з наказом МОЗ СРСР № 535 від 22.04.1985 р. з використанням діагностичних наборів «Стафітест-16» і «Ентеротест-16» (фірма Мікро-Ла-Тест, АТ «Лахема», Чехія).

Пептидоглікани одержували з клітинної стінки золотавого стафілокока за методом Peterson P. K. та ін. ТК екстрагували з клітинної стінки золотавого стафілокока 10 % трихлороцтовою кислотою. Препарати ЛПС одержували з паличок синього гною водно-феноловою екстракцією. Використовували такі робочі концентрації пептидогліканів, ТК і ЛПС (мкг/л): 10,0; 50,0 і 100,0.

Виділення ПК-клітин здійснювали за методом A. Boyum з периферійної крові 15 практично здорових чоловіків і 15 жінок у віці від 20 до 40 років, які постійно мешкали в м. Луганську. Клітинну суспензію доводили до концентрації 3_*10⁶ клітин/мл і використовували у всіх дослідах. Визначення функціональної активності ПК-клітин проводили фотоелектрокалориметричним методом.

Визначення концентрацій ФНП-б, г-ІФН, ІЛ-1в, -2, -4, -6 проводили в супернатантах ПК-клітин імуноферментним методом. Вивчення потенційної апоптогенної активності пептидогліканів, ТК і ЛПС відносно ПК-клітин проводили двома методами проточної цитометрії і морфологічним методом. Експресію молекул CD38 і СD95 на поверхні ПК-клітин вивчали методом непрямої імунної флуоресценції з використанням моноклональних антитіл виробництва НВЦ «Медбіоспектр» (Москва, РФ). Визначали МДА, ДК, активність КТ і СОД в супернатантах ПК-клітин. Визначення вмісту цАМФ і цГМФ у ПК-клітинах проводили радіоімунним методом з використанням тест-систем фірми Amersham (Великобританія). Визначення аденілових нуклеотидів (АМФ, АДФ, АТФ) у ПК-клітинах проводили за методом Conh, Carter C.E. Енергетичний заряд (ЕЗ) вираховували за формулою: ЕЗ = АТФ/(АДФ+АМФ). Вивчення загальної активності ЛДГ та її ізоферментного спектра (ЛДГ1-5) проводили за допомогою електрофорезу в гелі. Виділяли анодні (аеробні) фракції - ЛДГ1 і ЛДГ2, проміжну - ЛДГ3 і катодні (анаеробні) - ЛДГ4 і ЛДГ5. Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Результати дослідження та їх аналіз. Вплив компонентів бактерій на цитотоксичну активність ПК-клітин. Встановлено, що пептидоглікани, ТК і ЛПС істотно впливали на цитотоксичну активність ПК-клітин. Якщо при стимуляції культури ПК-клітин ЛПС в концентрації 10,0 мкг/л ІЦ ПК-клітин перевищував показник референтної норми в 2,9 рази, то при використанні концентрації ЛПС 50,0 мкг/л кратність збільшення ІЦ склала 2,07 рази, а при концентрації 100,0 мкг/л - 1,39 рази (р0,05 в усіх випадках порівняно з референтною нормою). Пептидоглікани в концентрації 10,0 мкг/л викликали збільшення показника ІЦ ПК-клітин проти норми в 2,4 рази, тоді як при концентраціях 50,0 мкг/л і 100,0 мкг/л ІЦ перевищував норму в 1,7 і 1,2 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках). У порівнянні з пептидогліканами і ЛПС, ТК менш значно впливали на цитотоксичну активність ПК-клітин. Так, при концентрації ТК 10,0 мкг/л збільшення ІЦ ПК-клітин склало 1,6 рази проти норми, що було вірогідно нижче аналогічних показників при використанні пептидогліканів і ЛПС. При концентрації ТК 50,0 мкг/л і 100,0 мкг/л кратність збільшення ІЦ ПК-клітин у порівнянні з нормою склала, відповідно, 1,44 і 1,2 рази (р0,05 в обох випадках).

Вплив компонентів бактерій на секреторну активність ПК-клітин. Найбільш активну стимуляцію секреції ФНП- і г-ІФН ПК-клітинами викликали ЛПС: при їх концентрації 10,0 мкг/л рівень секреції ФНП- зростав проти норми в 2,05 рази, при 50,0 мкг/л - у 2,62 рази, при 100,0 мкг/л - у 3,38 рази; для г-ІФН кратність збільшення склала, відповідно, 2,08, 2,27 і 3,17 рази (р0,05 в усіх випадках). Аналогічна динаміка змін секреторної активності ПК-клітин зареєстрована під впливом пептидогліканів: при концентрації 10,0 мкг/л секреція ФНП- збільшувалась проти норми в 1,9 рази, при 50,0 мкг/л - у 2,5 рази, при 100,0 мкг/л - у 3,2 рази. Для г-ІФН кратність збільшення секреції склала, відповідно, 2,1, 3,5 і 4,1 разів. ТК менш значно стимулювали секреторну активність ПК-клітин: при концентрації 10,0 мкг/л рівень секреції ФНП- перевищував показник норми в 1,67 рази, при 50,0 мкг/л і 100,0 мкг/л - у 2,24 і в 2,57 рази відповідно (р0,05 у усіх випадках). Для г-ІФН кратність збільшення секреції склала, відповідно, 1,63, 2,0 і 2,64 рази (р0,05 відносно референтної норми в усіх випадках).

Встановлено, що пептидоглікани, ТК і ЛПС істотно впливали на секрецію ПК-клітинами ІЛ-1в, -2, -4 і -6, при цьому виразність секреції знаходилась в залежності від концентрації того або іншого компонента бактерій, а також від його видової приналежності. Найбільш активними виявились ЛПС, а секреторна реакція ПК-клітин на вплив ТК в усіх випадках була менш значною порівняно з використанням у якості стимулу пептидогліканів.

Вплив компонентів бактерій на систему циклічних нуклеотидів ПК-клітин. Стимуляція культури ПК-клітин ЛПС в концентрації 10,0 мкг/л супроводжувалась збільшенням вмісту цАМФ у 1,22 рази проти норми, а цГМФ - у 1,15 рази (р0,05 в обох випадках). Зазначені зміни супроводжувалися невірогідним збільшенням коефіцієнта цАМФ/цГМФ. При концентрації ЛПС 50,0 мкг/л вміст цАМФ у ПК-клітинах зріс проти норми в 1,38 рази (р0,05), вміст цГМФ істотно від норми не відрізнявся, коефіцієнт цАМФ/цГМФ зростав в 1,47 рази (р0,05). Використання ЛПС у концентрації 100,0 мкг/л викликало збільшення в ПК-клітинах цАМФ у 1,46 рази порівняно з нормою, а також у 1,63 рази - зниження рівня цГМФ, у результаті чого співвідношення цАМФ/цГМФ збільшувалося проти норми в 2,35 рази (р0,05).

Пептидоглікани в концентрації 10,0 мкг/л викликали в ПК-клітинах збільшення цАМФ у 1,16 рази проти норми, а цГМФ - у 1,31 рази; при концентрації 50,0 мкг/л коефіцієнт цАМФ/цГМФ проти норми зріс у 1,19 рази (р0,05), рівні цАМФ і цГМФ збільшились в 1,29 і в 1,08 разів відповідно; при 100,0 мкг/л кратність збільшення цАМФ склала 1,51 рази, коефіцієнта цАМФ/цГМФ - 1,75 рази (р0,05 в обох випадках).

ТК також впливали на систему циклічних нуклеотидів ПК-клітин, проте цей вплив був помітно менш вираженим порівняно з таким для пептидогліканів і, особливо, для ЛПС.

Вплив компонентів бактерій на енергетичний обмін ПК-клітин. Найбільш глибокі зміни в аденіловій системі ПК-клітин зареєстровані при використанні високих концентрацій ЛПС, найменші зміни - при використанні малих концентрацій ТК. Інкубація суспензії ПК-клітин з пептидогліканами в концентрації 10,0 мкг/л призводила до зниження ЕЗ в 1,24 рази (р0,05); 50,0 мкг/л - в 1,41 рази; 100,0 мкг/л - в 1,78 рази проти норми та у 1,43 і 1,26 рази проти аналогічних показників при використанні, відповідно, пептидогліканів у концентраціях 10,0 і 50,0 мкг/л. При обробці суспензії ПК-клітин ТК в концентрації 10,0 мкг/л зниження показника ЕЗ склало 8,5 % (р>0,05), 50,0 мкг/л - 1,24 рази; 100,0 мкг/л - 1,52 рази (р0,05) порівняно з нормою. Вплив на суспензію ПК-клітин розчином ЛПС в концентрації 10,0 мкг/л викликав зниження ЕЗ проти норми в 1,35 рази, 50,0 мкг/л - в 1,59 рази, 100,0 мкг/л - в 2,1 рази (р0,05 в усіх випадках).

При впливі на суспензію ПК-клітин розчином ТК у дозі 10,0 мкг/л виявилось, що загальна активність ЛДГ у клітинах була вірогідно вищою (у 1,25 рази) порівняно з аналогічним показником норми, але значущих змін у ізоферментному спектрі ЛДГ виявлено не було. При концентрації ТК 50,0 мкг/л загальна активність ЛДГ перевищувала норму в 1,35 рази (р0,05), при цьому питома вага ЛДГ3 і ЛДГ4+5 перевищувала норму в 1,19 рази (р0,05). Після взаємодії ПК-клітин з ТК у концентрації 100,0 мкг/л активність загальної ЛДГ виявилась вищою норми в 1,43 рази та зареєстроване статистично значуще збільшення ЛДГ3 і ЛДГ4+5 (відповідно, у 1,37 і 1,33 разів).

Контакт пептидогліканів у дозі 10,0 мкг/л із суспензією ПК-клітин викликав збільшення активності загальної ЛДГ у 1,36 рази (р0,05) проти норми і вірогідне збільшення ЛДГ4+5 і ЛДГ3. Використання концентрації 50,0 мкг/л викликало збільшення активності загальної ЛДГ у у 1,49 рази проти норми, кратність зниження ЛДГ1+2 склала 1,14 рази (р>0,05), а збільшення ЛДГ4+5 - 1,31 рази (р0,05). При взаємодії ПК-клітин з пептидогліканами в концентрації 100,0 мкг/л мало місце збільшення загальної активності ЛДГ у 1,68 рази, зниження ЛДГ1+2 у 1,21 рази (р0,05) і збільшення ЛДГ3 і ЛДГ4+5 у 1,67 і 1,46 рази відповідно (р0,05 в обох випадках).

При використанні концентрації ЛПС 10,0 мкг/л загальна активність ЛДГ у ПК-клітинах зростала проти норми в 1,41 рази (р0,05), вірогідно знижувалась питома вага ЛДГ1+2 і збільшувалась частка ЛДГ3 і ЛДГ4+5 (у 1,16, 1,62 і 1,15 разів, відповідно, проти норми). При 50,0 мкг/л загальна активність ЛДГ збільшилася в 1,6 рази порівняно з нормою, питома вага ЛДГ1+2 знизилась в 1,26 рази, збільшилась частка ЛДГ3 і ЛДГ4+5 у 1,85 і 1,76 разів відповідно (р0,05 у віх випадках). При концентрації 100,0 мкг/л активність ЛДГ перевищувала норму в 1,78 рази, відзначено зниження ЛДГ1+2 у 1,35 рази і збільшення ЛДГ3 і ЛДГ4+5 у 1,98 і 1,76 разів відповідно (р0,05 у усіх випадках).

Вплив компонентів бактерій на ПОЛ і систему АОЗ ПК-клітин. Встановлено, що вплив на клітинну суспензію ПК-клітин пептидогліканами в концентрації 10,0 мкг/л призводив до збільшення внутрішньоклітинного вмісту ДК та МДА в 1,70 і 1,42 рази проти норми (р0,05 в обох випадках), а активність КТ і СОД істотних відмінностей від відповідних показників норми не мала. При концентрації 50,0 мкг/л вміст ДК і МДА зростав у 2,10 і 1,96 рази відповідно, активність КТ виявилась нижчою норми в 1,22 рази, а СОД - в 1,37 рази (р0,05 в обох випадках); при 100,0 мкг/л кратність збільшення МДА проти аналогічного показника норми склала 3,14 рази, ДК - 3,55 рази, активність КТ була зниженою відносно норми в 1,48 рази, СОД - у 1,76 рази (р0,05 в обох випадках). Аналогічно впливали на процеси ПОЛ і систему АОЗ ТК, але ступінь виразності зазначеного впливу в порівнянні з таким для пептидогліканів був помітно нижчим. Найбільш виражено негативно впливали на процеси ПОЛ й активність системи АОЗ ЛПС. При концентрації ЛПС 10,0 мкг/л продукція ДК збільшувалася проти норми в 2,0 рази, проти аналогічних концентрацій пептидогліканів і ТК - у 1,17 і 1,43 рази (р0,05 в обох випадках) відповідно. Продукція МДА перевищувала в 1,7 рази показник норми, і в 1,19 і 1,47 рази - показники при впливі на ПК-клітини пептидогліканами і ТК відповідно (р0,05 у усіх випадках). При внесенні в суспензію ПК-клітин ЛПС у дозі 50,0 мкг/л рівень ДК підвищувався проти норми в 2,42 рази, МДА - у 2,4 рази, активність КТ і СОД знижувалась проти норми в 1,39 і 1,59 рази відповідно (р0,05 в усіх випадках). Під впливом концентрації ЛПС 100 мкг/л продукція ДК зростала проти норми в 3,87 рази, МДА - у 3,36 рази, активність КТ і СОД знижувалася в 1,79 і 2,32 рази відповідно.

Вплив компонентів бактерій на експресію маркерів апоптозу на поверхні ПК-клітин. Внесення в суспензію ПК-клітин ТК у концентрації 10,0 мкг/л супроводжувалося збільшенням частоти експресії молекул CD38 у 1,57 рази проти норми, а молекул CD95 - у 1,55 рази (р<0,05 в обох випадках). При використанні ТК у дозі 50,0 мкг/л кратність збільшення CD38-клітин склала 2,05 рази, а для CD95 - 2,14 рази, при дозі 100,0 мкг/л - 2,35 і 2,4 рази відповідно. При використанні пептидоглікану в дозі 10,0 мкг/л експресія CD38-молекул була в 1,88 рази вищою порівняно з нормою (р0,05), для CD95-молекул - у 1,81 рази (р0,05); в дозі 50,0 мкг/л - відповідно, в 2,35 та 2,48 рази; в дозі 100,0 мкг/л - в 2,85 і 3,4 рази відповідно.

Концентрація ЛПС 10,0 мкг/л збільшувала експресію CD38-молекул проти норми в 2,15 рази, CD95-молекул - в 1,93 рази (р0,05 в обох випадках); 50,0 мкг/л - у 2,67 і 2,88 рази; 100,0 мкг/л - в 3,32 і 4,07 рази відповідно.

Вплив глутаргіну на функціональну активність інтактних ПК-клітин. Інкубація ПК-клітин з глутаргіном сприяла підвищенню ІЦ у 1,75 рази порівняно з показником норми. У той же час, не виявлено статистично вірогідної стимуляції глутаргіном секреторної функції ПК-клітин: секреція ФНП- і г-ІФН збільшувалась проти норми, відповідно, у 1,14 і 1,11 рази (р>0,05 в обох випадках). Під впливом глутаргіну відбувалось істотне збільшення внутрішньоклітинного вмісту цГМФ при відносному зниженні рівня цАМФ, внаслідок чого показник цАМФ/цГМФ знизився в 1,78 рази відносно норми. Глутаргін викликав зниження концентрації ДК у 1,52 рази та МДА - у 1,39 рази, підвищення активності КТ в 1,26 рази і СОД у 1,48 рази. Контакт суспензії ПК-клітин із глутаргіном супроводжувався зниженням частоти ідентифікації клітин з фенотипом CD38 і CD95 в 3,08 і у 3,1 рази.

Вплив глутаргіну на цитотоксичну і секреторну активність ПК-клітин, підданих дії структурних компонентів бактерій. Незалежно від діючої дози пептидогліканів, абсолютні показники ІЦ ПК-клітин при використанні глутаргіну були вірогідно вищими таких у контрольних групах. Подібні зміни ІЦ ПК-клітин були зареєстровані також при впливі на культури дослідної і контрольних груп ТК та ЛПС.

Попередня обробка суспензії ПК-клітин розчином глутаргіну не впливала на секрецію ФНП- і г-ІФН. Незалежно від виду структурних компонентів бактерій і їх концентрацій, секреторна активність ПК-клітин в дослідних групах вірогідних розходжень з аналогічними показниками контрольних груп не мала. Не виявлено також статистично значущого впливу глутаргіну на секрецію ПК-клітинами ІЛ-1в, -2, -4 і -6.

Вплив глутаргіну на систему циклічних нуклеотидів та енергетичний метаболізм ПК-клітин, підданих дії структурних компонентів бактерій. Найбільший ефект глутаргіну зареєстрований у випадках наступного впливу на ПК-клітини ТК: при концентраціях 10,0, 50,0 і 100,0 мкг/л співвідношення цАМФ/цГМФ коливалося в діапазоні 3,0-3,3 у.о., що тільки в останньому випадку було вірогідно вище норми. Позитивний вплив глутаргіну на систему циклічних нуклеотидов ПК-клітин зареєстрований також при впливі на останні пептидогліканів і ЛПС.

Глутаргін вірогідно не впливав на метаболізм макроергічних сполук у ПК-клітинах, підданих дії структурних компонентів бактерій: відзначене несуттєве збільшення АТФ, деяке зниження вмісту АДФ і АМФ, що не сприяло значущому поліпшенню ЕЗ. В усіх варіантах дослідів ЕЗ ПК-клітин різко відрізнявся від показника норми убік його зменшення.

Відзначено позитивний вплив глутаргіну на загальну активність та ізоферментний склад ЛДГ у ПК-клітинах, підданих дії пептидогліканів, ТК і ЛПС. Загальна активність ЛДГ у ПК-клітинах, попередньо оброблених розчином глутаргіну, була після впливу структурними компонентами бактерій вірогідно нижчою порівняно з групами зіставлення, проте перевищувала показник норми. Вплив глутаргіну на ізоферментний склад ЛДГ полягав в переважному зниженні ЛДГ3 і ЛДГ4+5, проте в ряді дослідів зазначені зміни були невірогідними порівняно з групами зіставлення.

Вплив глутаргіну на ПОЛ і систему АОЗ ПК-клітин, підданих дії структурних компонентів бактерій. Встановлено, що клітинна культура ПК-клітин, попередньо оброблена розчином глутаргіну та в наступному піддана дії пептидогліканів, ТК і ЛПС, відповідає на даний вплив значно меншою активацією процесів ПОЛ при більш високій активності ферментів АОЗ.

Абсолютні показники коефіцієнта ПОЛ/АОЗ у всіх серіях експерименту в дослідній групі були вірогідно вищими аналогічних показників у контрольній групі, але при високих концентраціях структурних компонентів бактерій коефіцієнт ПОЛ/АОЗ навіть у дослідній групі перевищував показник норми.

Вплив глутаргіну на експресію маркерів апоптозу ПК-клітинами, підданими дії структурних компонентів бактерій. Встановлено, що глутаргін знижував експресію маркерів апоптозу - молекул CD38 і CD95 на поверхні ПК-клітин, підданих дії структурних компонентів бактерій. Найбільше пригнічення експресії маркерів апоптозу відзначено в дослідній групі при впливі на культури ПК-клітин ТК.

В міру збільшення діючих концентрацій структурних компонентів бактерій частоти ідентифікації ПК-клітин з фенотипами CD38+ і СD95+ у дослідній групі зростали, перевищуючи показники норми, проте в порівнянні з аналогічними частотами в контрольній групі вони були вірогідно нижчими.

Висновки

У дисертації дане теоретичне обгрунтування дозозалежного впливу структурних компонентів бактерій (пептидогліканів, ТК і ЛПС) на функціональну активність і метаболізм ПК-клітин периферійної крові людини in vitro, а також доведена позитивна дія глутаргіну на функцію і метаболічні процеси в ПК-клітинах, яка нівелює або повністю усуває вплив бактеріальних компонентів.

Пептидоглікани, ТК і ЛПС в малих концентраціях (10,0 мкг/л) стимулюють in vitro цитотоксичну активність ПК-клітин людини, тоді як високі концентрації (50,0 мкг/л і 100,0 мкг/л) пригнічують її. Найбільшим стимулюючим потенціалом відносно цитотоксичної активності ПК-клітин володіють малі діючі концентрації ЛПС палички синього гною, найменшим - малі концентрації ТК золотавого стафілокока. Всі бактеріальні компоненти в концентрації 100,0 мкг/л пригнічують цитотоксичну активність ПК-клітин однаково інтенсивно.

Структурні компоненти бактерій стимулюють in vitro секрецію ПК-клітинами ФНП- і г-ІФН. Інтенсивність секреції збільшується в міру підвищення діючої концентрації пептидогліканів, ТК і ЛПС. Найбільшу секрецію г-ІФН викликали пептидоглікани в концентрації 100,0 мкг/л, найбільшу секрецію ФНП- - ЛПС.

Структурні компоненти бактерій викликають зміни в системах циклічних і аденілових нуклеотидів та ізоферментів ЛДГ ПК-клітин in vitro, активують процеси ПОЛ, впливають на активність ферментів системи АОЗ, що виражається в переважанні рівня цАМФ над цГМФ, збільшенні вмісту АДФ і АМФ, загальної активності ЛДГ і частки її анаеробних фракцій; збільшенні кількості метаболітів ПОЛ - ДК і МДА, зниженні активності КТ і СОД. Найбільші зміни метаболічних показників у ПК-клітинах in vitro викликають високі діючі концентрації бактеріальних компонентів.

Структурні компоненти бактерій стимулюють in vitro експресію на поверхні ПК-клітин молекул CD38 і CD95, що свідчить про готовність до реалізації апоптозної програми. Найбільша частота ідентифікації ПК-клітин, які стали на шлях апоптозу, відзначена при впливі на клітини структурними компонентами бактерій у концентрації 100 мкг/л.

Обробка ПК-клітин in vitro 4 % розчином глутаргіну перед їх взаємодією зі структурними компонентами бактерій сприяє підвищенню цитотоксичної активності ПК-клітин, поліпшенню балансу між цАМФ і цГМФ, підвищенню загальної активності і нормалізації ізоферментного складу ЛДГ, пригніченню активності процесів ПОЛ, підвищенню активності ферментів АОЗ (КТ і СОД), зменшенню частоти експресії маркерів готовності до реалізації апоптозної програми CD38 і CD95. Найбільший позитивний ефект глутаргіну має місце при дії на ПК-клітини пептидогліканів, ТК і ЛПС у малих концентраціях. Глутаргін незначно впливає на метаболізм АТФ, АДФ і АМФ у ПК-клітинах, підданих дії структурних компонентів бактерій.

Список наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1.Гайдаш І.С., Флегонтова В.В., Суглобов Є.В., Салманова О.М., Потьомкин Є.І. Апоптозіндукуюча активність пептидогліканів та тейхоєвих кислот грампозитивних збудників гнійно-запальних захворювань у хірургічних хворих // Вестник гигиены и эпидемиологии. - 2001. - Т. 5. - № 1. - С. 70-73. (Здобувач вивчила вплив пептидогліканів і ТК золотавого стафілокока на експресію молекул CD38 і CD95 на поверхні ПК-клітин здорових донорів). (біологічні науки).

2.Рубан Т.В., Салманова О.М., Потьомкін Є.І. Апоптозіндукуюча активність ліпополісахаридів збудників гнійно-запальних захворювань у хірургічних хворих // Збірник наукових праць «Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики». - Київ-Луганськ, 2001. - С. 161-166. (Здобувач вивчила вплив ЛПС грамнегативних умовно-патогенних бактерій на експресію молекул CD38 і CD95 на поверхні ПК-клітин здорових донорів). (біологічні науки).

3.Даценко М.Ф., Суглобов Є.В., Салманова О.М., Потьомкін Є.І., Волянська Н.П. Секреція інтерлейкінів-1в та -6 моноцитами in vitro при експериментальному сепсисі // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О. Можаєва. - 2001. - № 3. - С. 71-73. (Здобувач підготувала аналітичний огляд літератури по впливу структурних компонентів бактерій на секреторну активність моноцитів). (медичні науки).

4.Гайдаш И.С., Флегонтова В.В., Салманова О.Н. Исследование микробного спектра из очагов хронического травматического остеомиелита // Експериментальна і клінічна медицина. - 2004. - № 2. - С.40-42. (Здобувач проводила ідентифікацію до роду і виду золотавих стафілококів і паличок синього гною). (біологічні науки).

5.Казимирко Н.К., Гайдаш И.С., Флегонтова В.В., Шанько В.М., Сафонов Ю.П., Салманова О.Н., Даценко М.Ф. Особенности неспецифической резистентности при хроническом остеомиелите // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - № 2. - Частина 2. - С. 359-361. (Здобувач проводила виділення ПК-клітин з периферійної крові). (зарахована, як фахова з біологічних наук, лист від 27.09.06 р. № 02-77-09/1929).

6.Салманова О.Н. Влияние пептидогликанов, тейхоевых кислот и липополисахаридов на функциональную активность естественных киллеров // Український медичний альманах. - 2006. - № 3. - С. 123-125. (медичні науки).

7.Салманова О.Н. Влияние глутаргина на функциональную активность естественных киллеров, обработанных пептидогликанами, тейхоевыми кислотами и липополисахаридами // Загальна патологія та патологічна фізіологія. - 2006. - № 2. - С. 53-63 (зарахована, як фахова з біологічних наук, лист від 27.09.06 р. № 02-77-09/1929).

8.Казимирко Н.К., Гайдаш И.С., Флегонтова В.В., Шанько В.М., Даценко М.Ф., Салманова О.Н., Сафонов Ю.П. Особенности неспецифической резистентности при хроническом травматическом остеомиелите // Тези доповідей наукової конференції «Треті читання імені В.В. Підвисоцького», 27-29 травня 2004 р. - Одеса, 2004. - С. 41-42.

9.Datsenko M.F., Flegontova V.V., Gaidash I.S., Kasimirko N.K., Ruban A.V., Salmanova O.N., Volyanskaya N.P., Potemkin E.I., Nomerovchenko V.N. Ryzhenko S.A. Morphological features of apoptosis in immune cells during bacterial inflammatory process // Annals of Anatomy. - 2002. - Band 184. - Supplement. - P. 202-203.

10.Flegontova V.V., Gaidash I.S., Kasimirko N.K., Shevchenko M.Yu., Ruban A.V., Salmanova O.N., Potemkin E.I. Morphological signs of apoptosis induced by bacteria - causative agents of inflammatory infections // Annals of Anatomy. - 2002. - Band 184. - Supplement. - P. 210-211.

Размещено на Allbest.ru